使用具有过氧化水解活性的酶生产过酸的制作方法

专利名称：使用具有过氧化水解活性的酶生产过酸的制作方法
本申请是于2006年12月12日提交的第11/638,635号美国专利申请的部分继续申请，所述美国专利申请要求于2005年12月13日提交的第60/750,092号美国临时申请和于2006年10月20日提交的第60/853,065号美国临时申请的优先权。
发明领域 本发明涉及过酸生物合成和原位酶催化领域。具体而言，本发明提供了使用酶的过氧化水解(perhydrolysis)活性产生过酸的方法，所述酶在结构上被鉴定为属于糖酯酶的CE-7家族，包括头孢菌素乙酰水解酶(CAHs；E.C.3.1.1.41)和乙酰木聚糖酯酶(AXEs；E.C.3.1.1.72)。该酶促方法由羧酸酯底物产生过羧酸。此外，本发明还提供了包含通过本文所述方法产生的过酸的消毒制剂。

背景技术：
过酸组合物已报道是有效的抗微生物剂。针对不希望有的微生物生长使硬质表面、肉制品、活植物组织和医疗器材清洁、消毒和/或卫生处理的方法已得到描述(美国专利6,545,047；美国专利6,183,807；美国专利6,518,307；美国专利申请公布20030026846；和美国专利5,683,724)。也已报道过酸在制备用于衣物洗涤剂应用的漂白组合物中是有用的(美国专利3,974,082；美国专利5,296,161；和美国专利5,364,554)。
过酸可以通过羧酸和过氧化氢的化学反应进行制备(参见“OrganicPeroxides”，Daniel Swern编辑，第1卷，第313-516页；Wiley Interscience，New York，1971)。该反应通常由强无机酸例如浓硫酸催化。过氧化氢与羧酸的反应是平衡反应，并且过酸的产生通过使用过量浓度的过氧化物和/或羧酸，或通过去除水而得到促进。关于用于过酸产生的化学反应存在几个缺点a)用于促进过酸产生的高浓度羧酸在使用含过酸溶液时可以导致不希望有的气味，2)过酸随着时间的过去在溶液中时常是不稳定的，并且溶液中的过酸浓度在使用前的贮存期间降低，和3)由于使用浓硫酸作为催化剂该制剂通常是强酸性的。
克服过酸化学生产的缺点的一种方法是使用酶催化剂代替强酸催化剂。酶催化剂的使用允许在使用和/或应用时快速产生过酸，从而避免了与过酸溶液贮存和随着时间的过去过酸浓度变化相关的问题。一般用于经由与过氧化氢的直接化学反应来产生过酸的高浓度的羧酸不是过酸的酶促生产所需的，其中酶催化的反应可以使用浓度比化学反应中一般使用的浓度低得多的羧酸酯作为底物。酶反应可以跨越广泛范围的pH来进行，取决于在给定pH下的酶活性和稳定性，并且取决于在给定pH下对于过氧化水解的底物特异性。
酯酶、脂肪酶和一些蛋白酶具有催化烷基酯水解以生成相应的羧酸的能力(式1)。
式1脂肪酶、酯酶或 蛋白酶 R1COOR2+H2O→R1COOH+HOR2 某些酯酶、蛋白酶和脂肪酶还显示出过氧化水解活性，催化来自烷基酯的过酸合成(式2)。
式2 脂肪酶、酯酶或 蛋白酶 R1COOR2+H2O2→R1COOOH+HOR2 O.Kirk等人(Biocatalysis，1165-77(1994))研究了水解酶(脂肪酶、酯酶和蛋白酶)催化酰基底物与过氧化氢的过氧化水解以形成过氧羧酸，并且报道过氧化水解在水系统中以非常低的效率进行。此外，他们发现脂肪酶和酯酶使过羧酸降解成相应的羧酸和过氧化氢。他们还发现蛋白酶在水中既不降解羧酸酯也不催化羧酸酯的过氧化水解。作者得出结论，酯酶、脂肪酶和蛋白酶一般不适于在水环境中催化简单酯类例如辛酸甲酯和三辛酸甘油酯(trioctanoin)的过氧化水解。
美国专利3,974,082描述了通过使待漂白的材料与水溶液接触来生产用于衣物洗涤剂应用的漂白组合物，所述水溶液包含释放氧的无机过氧化合物、酰基烷基酯和能够使该酯水解的酯酶或脂肪酶。
美国专利5,364,554描述了用于使用蛋白酶、过氧化氢来源和优选地在化学上不能过氧化水解的酯底物在水溶液中原位生成过酸的活化氧化剂系统。还公开了漂白方法和形成过酸的方法。
美国专利5,296,161描述了在包含一种或多种特定酯酶和脂肪酶、过氧化氢来源和适于在漂白组合物中使用的官能化酯底物的水溶液中生产过酸。然而，产生的过酸浓度一般不足以用于在许多商业消毒应用中使用。
用于使用酶催化剂由相应的羧酸酯制备过酸的大部分已知方法不能产生和积聚浓度高至足以在各种应用中有效消毒的过酸。近期已报道，几种蛋白酶和脂肪酶组合原位产生浓度适于用作消毒剂和/或商业漂白剂的过酸(例如过乙酸)(参见共同拥有的美国专利申请11/413,246和11/588,523；引入本文作为参考)。然而，仍需要鉴定能够原位产生过酸的另外的过氧化水解酶(perhydrolase)。
美国专利4,444,886描述了具有酯水解酶活性(描述为“甘油二乙酸酯酶(acetinase)”)的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株(ATCC31954TM)，其具有用于水解具有含2-8个碳原子的酰基的甘油酯的高特异性。美国专利4,444,886没有描述、讨论或预测这种菌株的酯水解酶活性具有对于羧酸酯(包括甘油酯)的过氧化水解酶活性。
待解决的问题是提供原位酶促生成浓度适于在各种消毒应用和/或漂白应用中使用的过酸的方法。优选地，用于生成过酸组合物的底物应当是相对无毒和价廉的，例如羧酸酯，特别是单酰基甘油、二酰基甘油和三酰基甘油，其中酰基具有1-8个碳原子，以及乙酰化糖。
发明简述 所述问题已通过下述发现得到解决在结构上属于CE-7酯酶家族的酶(例如头孢菌素C脱乙酰酶[CAHs]和乙酰木聚糖酯酶[AXEs])表现出用于将羧酸酯(在过氧的无机来源例如过氧化氢存在下)转化成浓度足以用作消毒剂和/或漂白剂的过酸的显著过氧化水解活性。该系统通过产生高浓度过酸而又不需要高浓度过氧而实现效率。
过氧化水解酶的具体实例来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(ATCC 31954TM)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)BE1010(Payne andJackson，J.Bacteriol.1732278-2282(1991))，枯草芽孢杆菌ATCC6633TM(U.S.6,465,233)，枯草芽孢杆菌ATCC 29233TM；地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)ATCC 14580TM(Rey等人，genome Biol.，5(10)article77(2004))，热纤梭菌(Clostridium thermocellum)ATCC 27405TM(Copeland等人，

ZP 00504991，B.pumilus PS213(Degrassi等人，Microbiology，1461585-1591(2000))，和那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)(

AAB70869.1)。
本文所描述的每一本发明过氧化水解酶享有保守结构特征(即保守特征基序(signature Motif))以及与其他α/β-水解酶(例如可商购获得的脂肪酶；参见比较实施例26和28)相比具有优异的过氧化水解活性，使得该独特的酶家族特别适于原位生成浓度足以用作消毒剂和/或漂白剂的过酸。适用于本发明方法的过氧化水解酶可通过在糖酯酶CE-7家族内发现的保守特征基序来鉴定。
在本发明的一个方面，提供了方法，包括用于由羧酸酯生产过氧羧酸的方法，所述方法包括 a)提供一组反应成分，所述成分包括 1)选自下列的羧酸酯 i)具有以下结构的酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R2＝C1-C10直链或支链烷基、链烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH 并且n＝1-10；和 ii)具有以下结构的甘油酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R3和R4各自为H或R1C(O)；以及 iii)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖的乙酰化糖； 2)过氧源；以及 3)具有过氧化水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包括酶，当使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO2比对时，所述酶包含特征基序，所述特征基序包含 i)在氨基酸位置118-120的RGQ基序； ii)在氨基酸位置179-183的GXGSG基序；和 iii)在氨基酸位置298-299的HE基序；和 b)在合适的含水反应条件下将所述反应成分组合，由此产生过氧羧酸。
在本发明的另一个方面，提供了方法，包括使用酶促产生的过氧酸组合物消毒硬质表面或无生命物体的方法，所述方法包括 a)提供一组反应成分，所述成分包括 1.选自下列的底物 i)具有以下结构的酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R2＝C1-C10直链或支链烷基、链烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH 并且n＝1-10；和 ii)具有以下结构的甘油酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R3和R4各自为H或R1C(O)； iii)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖的乙酰化糖； 2)过氧源；以及 3)具有过氧化水解活性的酶催化剂，其中当使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO2比对时，所述酶催化剂包含特征基序，所述特征基序包含 i)在氨基酸位置118-120的RGQ基序； ii)在氨基酸位置179-183的GXGSG基序；和 iii)在氨基酸位置298-299的HE基序；和 b)在合适的含水反应条件下将所述反应成分组合，由此形成过氧羧酸产物； c)任选将所述过氧羧酸产物稀释；以及 d)将所述硬质表面或无生命物体与在步骤b)或步骤c)中产生的过氧羧酸接触，由此将所述表面或所述无生命物体消毒。
在本发明的另一个方面，提供了系统，包括产生过氧羧酸的系统，所述系统包括 a)选自下列的底物 1)具有以下结构的酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R2＝C1-C10直链或支链烷基、链烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH 并且n＝1-10；和 2)具有以下结构的甘油酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R3和R4各自为H或R1C(O)；以及 3)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖的乙酰化糖； 以及 b)过氧源；以及 c)具有过氧化水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包括酶，当使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO2比对时，所述酶具有特征基序，所述特征基序包含 i)在氨基酸位置118-120的RGQ基序； ii)在氨基酸位置179-183的GXGSG基序；和 iii)在氨基酸位置298-299的HE基序。
在本发明的另一个方面，提供了制剂，所述制剂包含 a)包含酶催化剂和羧酸酯的第一混合物，所述酶催化剂包含具有CE-7特征基序的过氧化水解酶，所述羧酸酯选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它们的混合物；所述第一混合物任选包含选自下列的另外组分无机或有机缓冲剂、腐蚀抑制剂、润湿剂、以及它们的组合；以及 b)包含过氧源和水的第二混合物，所述第二混合物任选还包含螯合剂。
在本发明的另一个方面，提供了制剂，所述制剂包含 a)包含酶催化剂和乙酰化糖的第一混合物，所述酶催化剂包含具有CE-7特征基序的过氧化水解酶，所述乙酰化糖选自乙酰化单糖、乙酰化二糖、乙酰化多糖以及它们的组合，所述第一混合物任选还包含无机或有机缓冲剂、腐蚀抑制剂和润湿剂；以及 b)包含过氧源和水的第二混合物，所述第二混合物任选包含螯合剂。
在其他方面，可以将上述第一和第二混合物合并以用于生产过氧羧酸。在另一个方面，可将上述第一和第二混合物合并以形成消毒制剂。
本发明的另一个方面是重组大肠杆菌(Escherichia coli)细胞，所述细胞包含katE中的破坏(disruption)和katG中的破坏，条件是所述宿主细胞不是大肠杆菌(Escherichia coli)UM2。在另一个方面，包含katE中的破坏和katG中的破坏的重组大肠杆菌宿主细胞源自大肠杆菌菌株MG1655。在另一个方面，大肠杆菌宿主细胞或菌株产生或包含至少一种具有过氧化水解酶活性的酶。在另一个方面，所述酶能够使用或者产生过氧化氢。
具有在本发明方法中使用的过氧化水解活性的酶催化剂可以是非存活完整细胞、透化的完整细胞、微生物细胞提取物的一种或多种细胞成分、部分纯化的酶和纯化的酶的形式。酶催化剂可以是未固定或固定的，包括但不限于固定在不溶性固体载体中或其上，与可溶性聚合物(例如，低分子量聚乙二醇(PEG))共价附着，和在空心纤维筒中作为可溶性酶固定。
在本发明的另一个方面，提供了降低硬质表面或无生命物体上的微生物群体浓度的方法，所述方法包括将由上述方法产生的过酸组合物与所述硬质表面或无生命物体接触，由此使存活微生物群体的浓度降低至少3-log，优选地至少4-log，更优选地至少5-log，并且最优选地至少6-log。在另一个方面，在与待处理的表面或无生命物体接触前，通过上述方法产生的过酸组合物可以任选稀释至所需有效浓度。
附图简述

图1(组a-c)是本发明过氧化水解酶的CLUSTALW比对。每一种过氧化水解酶在结构上被归类为糖酯酶家族7(CE-7)，并且共享一些保守域。已经鉴定了几个保守基序(加下划线)，它们一起形成CE-7糖酯酶的特征基序。另外的基序(LXD；SEQ ID NO2的氨基酸残基267-269)也加了下划线，并且可用于进一步表征特征基序。
生物序列简述 下面的序列遵照37C.F.R.以下序列遵照C.F.R.1.821-1.825(“Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequencesand/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules”(对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则))，并且符合World Intellectual Property Organization(世界知识产权组织，WIPO)ST.25标准(1998)以及欧洲专利公约(EPC)和专利合作条约(PCT)的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及行政指令的第208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式均遵照37C.F.R.§1.822中列出的规则。
随同在光盘上提供了序列表。随同在光盘上提供了序列表。包含序列表的光盘的内容依照37CFR 1.52(e)在此引入作为参考。
SEQ ID NO1是来自枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM的头孢菌素C脱乙酰酶(cah)编码区的核酸序列。
SEQ ID NO2是来自枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM的头孢菌素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO3和4是用于PCR扩增来自枯草芽孢杆菌物种的过氧化水解酶基因以构建pSW186、pSW187、pSW188和pSW190的引物。
SEQ ID NO5是来自枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168(B.subtilissubsp.subtilis str.168)的头孢菌素C脱乙酰酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO6是来自枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168(B.subtilissubsp.subtilis str.168)的头孢菌素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列，并且与来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)BE1010的头孢菌素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列相同。
SEQ ID NO7是来自枯草芽孢杆菌ATCC 6633TM的头孢菌素乙酰酯酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO8是来自枯草芽孢杆菌ATCC 6633TM的头孢菌素乙酰酯酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO9是来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)ATCC 14580TM的头孢菌素C脱乙酰酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO10是来自地衣芽孢杆菌ATCC 14580TM的头孢菌素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO11是来自短小芽孢杆菌(B.pumilus)PS213的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO12是来自短小芽孢杆菌PS213的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO13是来自热纤梭菌(Clostridium thermocellum)ATCC27405TM的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO14是来自热纤梭菌ATCC 27405TM的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO15是来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO16是来自那不勒斯栖热袍菌的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO17是来自海栖热袍菌(Thermotoga Maritima)MSB8的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO18是来自海栖热袍菌MSB8的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO19是来自热厌氧芽孢杆菌属(Thermoanaerobacteriumsp.)物种JW/SL YS485的乙酰木聚糖酯酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO20是来自热厌氧芽孢杆菌属物种JW/SL YS485的乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO21是来自芽孢杆菌属(Bacillus sp)物种NRRL B-14911的头孢菌素C脱乙酰酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO22是来自芽孢杆菌属物种NRRL B-14911的头孢菌素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO23是来自喜盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)C-125的头孢菌素C脱乙酰酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO24是来自喜盐芽孢杆菌C-125的头孢菌素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO25是来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16的头孢菌素C脱乙酰酶编码区的核酸序列。
SEQ ID NO26是来自克劳氏芽孢杆菌KSM-K16的头孢菌素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO27和28是用于PCR扩增来自枯草芽孢杆菌物种的过氧化水解酶基因以构建pSW194和pSW189的引物。
SEQ ID NO29是克隆到pSW194内的PCR产物的核酸序列。
SEQ ID NO30是克隆到pSW189内的PCR产物的核酸序列。
SEQ ID NO31是克隆到pSW190内的枯草芽孢杆菌ATCC 29233TM头孢菌素C脱乙酰酶(cah)基因的核酸序列。
SEQ ID NO32是枯草芽孢杆菌ATCC 29233TM头孢菌素C脱乙酰酶(CAH)的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO33和34是用于PCR扩增地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)ATCC 14580TM头孢菌素C脱乙酰酶基因以构建pSW191的引物， SEQ ID NO35和36是用于PCR扩增热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)ATCC 27405TM乙酰木聚糖酯酶基因以构建pSW193的引物。
SEQ ID NO37和38是用于PCR扩增短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)PS213乙酰木聚糖酯酶编码序列(

AJ249957)以构建pSW195的引物。
SEQ ID NO39和40是用于PCR扩增那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)乙酰木聚糖酯酶基因(

58632)以构建pSW196的引物。
SEQ ID NO41是在质粒pSW196中的那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶基因的经密码子最优化的变型的核酸序列。
SEQ ID NO42是卡那霉素抗性基因的核酸序列。
SEQ ID NO43是质粒pKD13的核酸序列。
SEQ ID NO44和45是用于产生编码卡那霉素基因的PCR产物的引物，所述卡那霉素基因的侧翼是与katG大肠杆菌(E.coli)MG1655中的katG过氧化氢酶基因具有同源性的区域。所述产物用于破坏内源性katG基因。
SEQ ID NO46是编码卡那霉素抗性基因的PCR产物的核酸序列，所述卡那霉素抗性基因的侧翼是与大肠杆菌MG1655中的katG过氧化氢酶基因具有同源性的区域。所述产物用于破坏内源性katG基因。
SEQ ID NO47是大肠杆菌MG1655中的katG过氧化氢酶基因的核酸序列。
SEQ ID NO48是大肠杆菌MG1655中的katG过氧化氢酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO49是质粒pKD46的核酸序列。
SEQ ID NO50和51是用于证实katG基因破坏的引物。
SEQ ID NO52是质粒pCP20的核酸序列。
SEQ ID NO53和54是用于产生编码卡那霉素基因的PCR产物的引物，所述卡那霉素基因的侧翼是与大肠杆菌MG1655中的katE过氧化氢酶基因具有同源性的区域。所述产物用于破坏内源性katE基因。
SEQ ID NO55是编码卡那霉素抗性基因的PCR产物的核酸序列，所述卡那霉素抗性基因的侧翼是与大肠杆菌MG1655中的katE过氧化氢酶基因具有同源性的区域。所述产物用于破坏内源性katE基因。
SEQ ID NO56是大肠杆菌MG1655中的katE过氧化氢酶基因的核酸序列。
SEQ ID NO57是大肠杆菌MG1655中的katE过氧化氢酶的推导氨基酸序列。
SEQ ID NO58和59是用于证实以下菌株中的katE基因破坏的引物单剔除菌株大肠杆菌MG1655ΔkatE，和双剔除菌株大肠杆菌MG1655ΔkatGΔkatE，后者在本文中称为大肠杆菌KLP18。
SEQ ID NO60是编码氨基酸序列SEQ ID NO12的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)PS213的经密码子最优化的变型的核酸序列。
SEQ ID NO61是包含SEQ ID NO2的氨基酸残基118-299的区域的氨基酸序列。
发明详述 所述问题已通过下述发现得到解决属于CE-7糖酯酶家族的酶表现出用于将羧酸酯底物转化成过酸的显著过氧化水解活性。该家族的在结构上相关的酶可用于产生具有用于消毒和/或漂白应用的高效率的过酸浓缩物。
在本公开中，使用了大量术语和缩写。除非另有具体说明，应用下述定义。
如本文所使用，术语“包含”意指如权利要求中提及的所述特征、整数、步骤或成分的存在，但它不预先排除一种或多种其他特征、整数、步骤、成分或其组的存在或添加。
如本文所使用，修饰本发明的成分或反应物的量或使用的术语“约”是指可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化在真实世界中用于制备浓缩物或使用溶液的一般测量和液体处理操作；这些操作中非故意的误差；用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等等。术语“约”还包括由于对于起因于特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。
如本文所使用，术语“过酸”与过氧酸(peroxyacid)、过氧羧酸(peroxycarboxylic acid)、过氧酸(peroxy acid)、过羧酸(percarboxylicacid)和过氧性酸(peroxoic acid)同义。
如本文所使用，术语“过乙酸”缩写为“PAA”，并且与过氧乙酸、乙过氧酸(ethaneperoxoic acid)以及CAS登记号79-21-0的所有其他同义词同义。
如本文所使用，术语“甘油一乙酸酯”与甘油单乙酸酯、甘油一醋酸酯和甘油单醋酸酯同义。
如本文所使用，术语“甘油二乙酸酯”与二乙酸甘油酯；甘油二醋酸酯、二醋酸甘油酯以及CAS登记号25395-31-7的所有其他同义词同义。
如本文所使用，术语“甘油三乙酸酯”与三乙酸甘油酯；三醋酸甘油酯；甘油三醋酸酯；1，2，3-三乙酰氧基丙烷、1，2，3-丙三醇三乙酸酯以及CAS登记号102-76-1的所有其他同义词同义。
如本文所使用，术语“甘油一丁酸酯”与一丁酸甘油酯、甘油单丁酸酯和一丁酸甘油基酯同义。
如本文所使用，术语“甘油二丁酸酯”与二丁酸甘油酯和二丁酸甘油基酯同义。
如本文所使用，术语“甘油三丁酸酯”与三丁酸甘油酯、1，2，3-三丁酰基甘油以及CAS登记号60-01-5的所有其他同义词同义。
如本文所使用，术语“甘油一丙酸酯”与一丙酸甘油酯、甘油单丙酸酯和一丙酸甘油基酯同义。
如本文所使用，术语“甘油二丙酸酯”与二丙酸甘油酯和二丙酸甘油基酯同义。
如本文所使用，术语“甘油三丙酸酯”与三丙酸甘油基酯、三丙酸甘油酯、1，2，3-三丙酰基甘油以及CAS登记号139-45-7的所有其他同义词同义。
如本文所使用，术语“乙酸乙酯”与醋酸乙酯、乙酰氧基乙烷、乙酸乙基酯、醋酸乙基酯、乙基乙酸酯以及CAS登记号141-78-6的所有其他同义词同义。
如本文所使用，术语“乳酸乙酯”与乳酸乙基酯以及CAS登记号97-64-3的所有其他同义词同义。
如本文所使用，术语“乙酰化糖”和“乙酰化多糖”是指包含至少一个乙酰基的单糖、二糖和多糖。实例包括但不限于葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙酰化木聚糖、乙酰化木聚糖片段、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛和三-O-乙酰基-葡萄烯糖。
如本文所使用，术语“合适的酶促反应混合物”、“适于原位生产过酸的成分”、“合适的反应成分”和“合适的含水反应混合物”是指其中反应物和酶催化剂发生接触的材料和水。本文提供了合适的含水反应混合物的成分，并且本领域技术人员应当理解适于这种方法的成分变化范围。在一个实施方案中，合适的酶促反应混合物在反应成分组合后原位生产过酸。像这样，反应成分可以作为其中一种或多种反应成分保持分离直至使用的多成分系统提供。用于使多种活性成分组合的系统和装置的设计是本领域已知的，并且一般将取决于个别反应成分的物理形式。例如，多重活性流体(液体-液体)系统一般使用多室分配瓶或二相系统(美国专利申请公开2005/0139608；美国专利5,398,846；美国专利5,624,634；美国专利6,391,840；E.P.专利0807156B1；美国专利申请公开2005/0008526；和PCT公开WO 00/11713A1)，例如在其中所需漂白剂在使反应性流体混合后产生的某些漂白应用中发现的。用于产生过酸的其他形式的多成分系统可以包括但不限于，设计用于一种或多种固体成分或固体-液体成分组合的那些，例如粉剂(例如，许多商购可得的漂白组合物，美国专利5,116,575)、多层片(美国专利6,210,639)、具有多个隔室的水溶性包(美国专利6,995,125)和在水添加后反应的固体凝聚物(美国专利6,319,888)。在一个实施方案中，制剂是作为两个单独混合物提供，由此在将两个混合物合并后产生过氧羧酸。在另一个实施方案中，提供了制剂，所述制剂包含 a)第一混合物，所述第一混合物包含 i)具有过氧化水解酶活性的酶催化剂，所述酶催化剂包含具有CE-7特征基序的酶；以及 ii)羧酸酯底物，所述第一混合物任选包含选自下列的另外组分无机或有机缓冲剂、腐蚀抑制剂、润湿剂、以及它们的组合；以及 b)包含过氧源和水的第二混合物，所述第二混合物任选还包含螯合剂。
在另一个实施方案中，所述第一混合物中的羧酸酯选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯以及它们的组合。在另一个实施方案中，所述第一混合物中的羧酸酯是乙酰化糖。在另一个实施方案中，所述第一混合物中的酶催化剂是固体颗粒。在另一个实施方案中，所述第一混合物是固体片或粉末。
如本文所使用，术语“过氧化水解”定义为所选底物与过氧化物的形成过酸的反应。一般地，无机过氧化物与所选底物在催化剂存在下反应以生成过酸。如本文所使用，术语“化学过氧化水解”包括其中底物(过酸前体)与过氧化氢来源组合的过氧化水解反应，其中过酸在不存在酶催化剂的情况下形成。
如本文所使用，术语“过氧化水解酶活性”是指每单位质量(例如毫克)蛋白、干细胞重量或固定的催化剂重量的催化剂活性。
如本文所使用，“一个酶活性单位”或“一个活性单位”或“U”定义为，在指定温度每分钟产生1μmol过酸产物所需的过氧化水解酶活性的量。
如本文所使用，术语“酶催化剂”和“过氧化水解酶催化剂”是指包含具有过氧化水解活性的酶的催化剂，并且可以是完整微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种细胞成分、部分纯化的酶或纯化的酶的形式。酶催化剂还可以是化学修饰的(例如通过聚乙二醇化(pegylation)或者通过与交联试剂反应来修饰)。还可以使用本领域技术人员众所周知的方法将过氧化水解酶固定在可溶性或不溶性载体上；参见例如“Immobilization of Enzymes and Cells”；Gordon F.Bickerstaff，Editor；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997。如本文所述，具有过氧化水解活性的所有本发明酶在结构上都是酶的糖家族酯酶家族7(CE-7家族)的成员(参见Coutinho，P.M，Henrissat，B.“Carbohydrate-active enzymesan integrated database approach”，“RecentAdvances in Carbohydrate Bioengineering”，H.J.gilbert，g.Davies，B.Henrissat and B.Svensson eds.，(1999)The Royal Society of Chemistry，Cambridge，第3-12页)。
CE-7家族的成员包括头孢菌素C脱乙酰酶(CAHs；E.C.3.1.1.41)和乙酰木聚糖酯酶(AXEs；E.C.3.1.1.72)。CE-7酯酶家族的成员共享保守特征基序(Vincent等人，J.Mol.Biol.，330593-606(2003))。包含CE-7特征基序和/或基本上类似结构的过氧化水解酶都适用于本发明。用于鉴定基本上类似生物分子的方法是本领域众所周知的(例如序列比对方案、核酸杂交、保守特征基序的存在等)。在一个方面，本发明方法中的酶催化剂包含与本文提供的序列具有至少40％、优选至少50％、更优选至少60％、甚至更优选至少70％、更加优选至少80％、更加优选至少90％的同一性，并且最优选至少95％氨基酸同一性的基本上类似的酶。本发明还提供了编码本发明CE-7糖酯酶的核酸分子。在另一个实施方案中，用于本发明方法的过氧化水解酶催化剂由在严格条件下与一个本发明核酸分子杂交的核酸分子编码。
如本文所使用，术语“头孢菌素C脱乙酰酶”和“头孢菌素C乙酰基水解酶”是指催化头孢菌素例如头孢菌素C和7-氨基头孢烷酸的脱乙酰作用的酶(E.C.3.1.1.41)(Mitsushima等人，同上)。如本文所述，提供了具有显著过氧化水解活性的几种头孢菌素C脱乙酰酶。
如本文所使用，“乙酰木聚糖酯酶”是指催化乙酰木聚糖以及其他乙酰化糖的脱乙酰作用的酶(E.C.3.1.1.72；AXEs)。如本文所述，提供了具有显著过氧化水解酶活性的归类为乙酰木聚糖酯酶的几种酶。
如本文所使用，术语“枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(ATCC31954TM)”是指具有国际保藏登记号ATCC 31954TM的保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的细菌细胞。已报道枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM具有能够水解具有2-8个碳酰基的甘油酯，特别是甘油二乙酸酯的酯水解酶(“甘油二乙酸酯酶”)活性(美国专利4,444,886；全文引入本文以供参考)。如本文所描述的，已从枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM中分离出具有显著过氧化水解酶活性的酶，并且作为SEQ ID NO2提供。分离的酶的氨基酸序列与由

登记号BAA01729.1提供的头孢菌素C脱乙酰酶具有100％的氨基酸同一性。
如本文所使用，术语“枯草芽孢杆菌BE1010”是指如由Payne和Jackson(J.Bacteriol.1732278-2282(1991))报道的枯草芽孢杆菌菌株。枯草芽孢杆菌BE1010是在编码枯草杆菌蛋白酶和中性蛋白酶的基因中具有染色体缺失的衍生枯草芽孢杆菌枯草亚种(subtilis)菌株BR151(ATCC33677TM)。如本文所述，已从枯草芽孢杆菌AB.subtilis BE1010中分离出了具有显著过氧化水解酶活性的酶，并且作为SEQ ID NO6提供。分离的酶的氨基酸序列与由枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168中报道的头孢菌素C脱乙酰酶(Kunst等人，同上)具有100％的氨基酸同一性。
如本文所使用，术语“枯草芽孢杆菌ATCC 29233TM”是指具有国际保藏登记号ATCC 31954TM的保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的枯草芽孢杆菌菌株。如本文所描述，已从枯草芽孢杆菌ATCC 29233TM中分离出和测序了具有显著过氧化水解酶活性的酶，并且作为SEQ IDNO32提供。
如本文所使用，术语“热纤梭菌(Clostridium thermocellum)ATCC27405TM”是指具有国际保藏登记号ATCC 27405TM的保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的热纤梭菌菌株。来自热纤梭菌(C.thermocellum)ATCC 27405TM的具有过氧化水解酶活性的酶的氨基酸序列作为SEQ ID NO14提供。
如本文所使用，术语“枯草芽孢杆菌ATCC 6633TM”是指具有国际保藏登记号ATCC 6633TM的保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的细菌细胞。已有报道枯草芽孢杆菌ATCC 6633TM具有头孢菌素乙酰水解酶活性(美国专利6,465,233)。来自枯草芽孢杆菌ATCC 6633TM的具有过氧化水解酶活性的酶的氨基酸序列作为SEQ ID NO8提供。
如本文所使用，术语“地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC14580TM”是指具有国际保藏登记号ATCC 14580TM的保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的细菌细胞。已有报道地衣芽孢杆菌ATCC14580TM具有头孢菌素乙酰水解酶活性。来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)ATCC 14580TM的具有过氧化水解酶活性的酶的氨基酸序列作为SEQ ID NO10提供。
如本文所使用，术语“短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)PS213”是指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的细菌细胞(

AJ249957)。来自短小芽孢杆菌PS213的具有过氧化水解酶活性的酶的氨基酸序列作为SEQ ID NO12提供。
如本文所使用，术语“那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)”是指据报道具有乙酰木聚糖酯酶活性的那不勒斯栖热袍菌菌株(

58632)。来自那不勒斯栖热袍菌的具有过氧化水解酶活性的酶的氨基酸序列作为SEQ ID NO16提供。
如本文所使用，“分离的核酸分子”和“分离的核酸片段”将可互换使用，并且是指单链或双链的，任选含有合成的、非天然的或改变了的核苷酸碱基的RNA或DNA聚合物。DNA聚合物形式的分离的核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段构成。
术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单位。在本文中使用下列缩写来表示具体氨基酸 三字母 单字母 氨基酸 缩写 缩写 丙氨酸 AlaA 精氨酸 ArgR 天冬酰胺 AsnN 天冬氨酸 AspD 半胱氨酸 CysC 谷氨酰胺 GlnQ 谷氨酸 GluE 甘氨酸 GlyG 组氨酸 HisH 异亮氨酸 IleI 亮氨酸 LeuL 赖氨酸 LysK 甲硫氨酸 MetM 苯基丙氨酸 PheF 脯氨酸 ProP 丝氨酸 SerS 苏氨酸 ThrT 色氨酸 TrpW 酪氨酸 TyrY 缬氨酸 ValV 任何氨基酸或如本文中所定义 XaaX 如本文所使用，“基本上相似的”是指其中一个或多个核苷酸碱基中的改变导致一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失，但不影响由DNA序列编码的蛋白质的功能性质(即过氧化水解活性)的核酸分子。如本文所使用，“基本上相似的”还指具有与本文报道的序列有至少40％、优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、更加优选至少80％、更加优选至少90％、最优选至少95％同一性的氨基酸序列的酶，其中所得到的酶保留功能性质(即，过氧化水解活性)。“基本上相似”还可以指由在严格条件下与本文报道的核酸分子杂交的核酸分子编码的具有过氧化水解活性的酶。因此应当理解，本发明包含了超过具体的示例性序列。
例如，本领域众所周知的是，在给定位点处导致产生化学上等价的氨基酸但不影响编码蛋白质的功能性质的基因中的改变是常见的。为了本发明的目的，取代定义为在下述5组之一内的交换 1.小的脂族非极性残基或稍微极性的残基Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)； 2.极性的、带负电荷的残基和它们的酰胺Asp、Asn、Glu、Gln； 3.极性的、带正电荷的残基His、Arg、Lys； 4.大的脂族非极性残基Met，Leu，Ile，Val(Cys)；以及 5.大的芳族残基Phe、Tyr、Trp。
因此，关于氨基酸丙氨酸，一种疏水性氨基酸的密码子，可以被编码另一个疏水性更弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性更强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)取代。类似地，导致用一个带负电荷的残基替换另一个带负电荷的残基(例如天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换另一个带正电荷的残基(例如赖氨酸替换精氨酸)的改变也可以预期产生功能上等价的产物。在许多情况下，导致蛋白质分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化也预期不改变蛋白质的活性。
所提议的修饰中的每一种完全在本领域常规技术内，如编码产物的生物活性保留的测定。此外，技术人员认识到本发明包括基本上相似的序列。在一个实施方案中，基本上相似的序列由其在严格条件下(0.1×SSC，0.1％SDS，65℃且用2×SSC，0.1％SDS洗涤，随后为0.1×SSC，0.1％SDS，65℃)与本文例示的序列杂交的能力限定。在一个实施方案中，本发明包括由在严格条件下与本文报道的核酸分子杂交的分离核酸分子编码的具有过氧化水解酶活性的酶。在优选的实施方案中，本发明包括由在严格条件下与具有选自下列的核酸序列的核酸分子杂交的分离核酸分子编码的具有过氧化水解酶活性的酶SEQ ID NO1，SEQ IDNO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41和SEQ ID NO60。
如本文所用，当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的第一个分子可以退火至另一分子时，核酸分子“可杂交”至另一核酸分子，例如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交和洗涤条件是众所周知的，并且在Sambrook，J.和Russell，D.，T.“Molecular CloningA LaboratoryManual”，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor(2001)中举例说明。温度和离子强度条件确定了杂交的“严格性”。可以调节严格条件以筛选中度相似的分子例如来自远缘生物的同源序列)，到筛选高度相似的分子例如从近缘生物复制功能性酶的基因。杂交后洗涤通常决定严格条件。一组优选的条件采用一系列如下洗涤开始采用6×SSC、0.5％SDS在室温下持续洗涤15分钟，然后再使用2×SSC、0.5％SDS在45℃下洗涤30分钟，最后使用0.2×SSC、0.5％SDS在50℃下重复洗涤30分钟两次。更优选的一组条件采用更高的温度，其中洗涤与上述洗涤相同，不同的是最后两次在0.2×SSC、0.5％SDS中洗涤30分钟时的温度被增加到60℃。另一组优选的严格杂交条件为0.1×SSC，0.1％SDS，65℃且用2×SSC，0.1％SDS洗涤，随后为与本文例示序列的0.1×SSC，0.1％SDS，65℃的最终洗涤。
杂交需要两种核酸含有互补序列，但是取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适严格性取决于核酸的长度和互补的程度，所述长度和互补程度是本领域内所熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。对于长度超过100个核苷酸的杂交体，已经推导出了用于计算Tm的公式(请参见Sambrook和Russell，同上)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook和Russell，同上)。在一个方面，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，关于可杂交核酸的最低限度长度为长度至少约15个核苷酸，更优选长度至少约20个核苷酸，更加优选长度至少30个核苷酸，更加优选长度至少300个核苷酸，最优选长度至少800个核苷酸。此外，技术人员将认识到，可根据需要根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液盐浓度。
如本文所使用，术语“同一性百分比”是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较而确定。在本领域中，“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间序列关联的程度。根据具体情况，它由这些序列的序列串之间的匹配程度确定。“同一性”和“相似性”可容易地通过已知方法计算出来，所述的方法包括但不限于以下文献中所描述的那些“ComputationalMolecular Biology”(Lesk，A.M.，ed.)Oxford UniversityPress，NY(1988)；“BiocomputingInformatics andgenome Projects”(Smith，D.W.，ed.)Academic Press，NY(1993)；“Computer Analysis ofSequence Data，Part I”(Griffin，A.M.，和Griffin，H.g.，eds.)Humana Press，NJ(1994)；“Sequence Analysis inMolecular Biology”(von Heinje，g.，ed.)Academic Press(1987)；and“Sequence Analysis Primer”(Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.)Stockton Press，NY(1991)。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和同一性百分比计算可以使用LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTARInc.，Madison，WI)的Megalign程序，Vector NTI v.7.0(Informax，Inc.，Bethesda，MD)的AlignX程序，或EMBOSS Open SoftwareSuite(EMBL-EBI；Rice等人，Trends ingenetics16，(6)pp276-277(2000))来进行。序列的多重比对可以使用Clustal比对法(即CLUSTALW；例如1.83版本)(Higgins和Sharp，CABIOS，5151-153(1989)；Higgins等人，NucleicAcids Res.224673-4680(1994)；和Chenna等人，Nucleic Acids Res31(13)3497-500(2003))，得自EuropeanMolecular Biology Laboratory viathe European Bioinformatics Institute)使用缺省参数来进行。有关CLUSTALW蛋白比对的合适参数包括缺口存在罚分(GAP Existencepenalty)＝15，缺口延长(gAP extension)＝0.2，矩阵(matrix)＝gonnet(例如Gonnet250)，蛋白ENDGAP＝-1，蛋白GAPDIST＝4，和KTUPLE＝1。在一个实施方案中，采取默认设定使用快速或缓慢比对，其中缓慢比对是优选的。或者，使用CLUSTALW方法(1.83版本)的参数还可以进行改进，以还使用KTUPLE＝1，缺口罚分(GAP PENALTY)＝10，缺口延长(gAP extension)＝1，矩阵(matrix)＝BLOSUM(例如BLOSUM64)，窗口(WINDOW)＝5，以及TOP DIAGONALS SAVED＝5。
在本发明的一个方面，合适的分离核酸分子(本发明的分离多核苷酸)编码多肽，所述多肽具有与本文所报道的氨基酸序列有至少约50％，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％同一性的氨基酸序列。本发明的合适的核酸分子不仅具有上述同源性，而且通常还编码具有约300至约340个氨基酸、更优选约310至约330个氨基酸、最优选约318个氨基酸的多肽。
如本文所使用，术语“特征基序”、“CE-7特征基序”和“标志性基序”是指具有限定活性的酶家族所共享的保守结构。特征基序还可用于限定和/或鉴定对于限定底物家族具有类似酶活性的在结构上相关的酶家族。特征基序还可以是一个邻接氨基酸序列或者是一起形成特征基序的非邻接保守基序的集合。保守继续通常用氨基酸序列表示。如本文所述，本发明过氧化水解酶属于CE-7糖酯酶家族。该酶家族可通过特征基序的存在来限定(Vincent等人，同上)。如本文所定义的，CE-7酯酶的特征基序包含3个保守基序(相对于参考序列SEQ ID NO2的残基位置编号) a)Arg118-Gly119-Gln120； b)Gly179-Xaa180-Ser181-Gln182-Gly183；和 c)His298-Glu299。
在氨基酸残基位置180的Xaa通常是甘氨酸或丙氨酸。属于催化三联体的氨基酸残基以粗体表示。
对于CE-7糖酯酶家族内的保守基序的进一步分析表明存在另外的保守基序(在SEQ ID NO2的氨基酸位置267-269上的LXD)，其可以进一步限定属于CE-7糖酯酶家族的过氧化水解酶(图1a-c)。在另一个实施方案中，上面限定的特征基序包括如下所定义的第四个保守基序 Leu267-Xaa268-Asp269； 在氨基酸残基位置268的Xaa通常是异亮氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸。所述第四个基序包括属于催化三联体(Ser181-Asp269-His298)的天冬氨酸残基(粗体)。
可使用多种众所周知的通用比对算法(即序列分析软件)来比对代表具有过氧化水解酶活性的酶的两个或多个氨基酸序列，以确定酶是否包含本发明特征基序。将比对序列与参考序列(SEQ ID NO2)进行比较以确定特征基序的存在。在一个实施方案中，采用参考氨基酸序列(在本文中用作过氧化水解酶序列(SEQ ID NO2)，来自枯草芽孢杆菌ATCC31954TM)的CLUSTAL比对(CLUSTALW)被用于鉴定属于CE-7酯酶家族的过氧化水解酶。保守氨基酸残基的相对编号是基于参考氨基酸序列的残基编号，以说明比对序列内的少量插入或缺失(例如少于5个氨基酸)。
可用于鉴定包含本发明特征基序的序列(当与参考序列比较时)的其他适当算法的实例包括但不限于Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48，443-453(1970)；一种通用比对工具)和Smith-Waterman(J.Mol.Biol.147195-197(1981)；一种局部使用的比对工具)。在一个实施方案中，使用默认参数来进行Smith-Waterman比对。合适的默认参数的实例包括使用BLOSUM62评分矩阵(scoring Matrix)，其采用缺口开放罚分(GAP open penalty)＝10和缺口延长罚分(GAP extension penalty)＝0.5。
本文中例举的过氧化水解酶当中的总体同一性百分比的比较表明，与SEQ ID NO2具有小至42％同一性的酶(同时保留特征基序)表现出显著过氧化水解酶活性，并且在结构上归类为CE-7糖酯酶。在一个实施方案中，本发明过氧化水解酶包括这样的酶，所述酶包含本发明特征基序，并且与SEQ ID NO2具有至少40％，优选至少42％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，还甚至更优选至少70％，甚至更优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性。
或者，包括含有保守基序(即SEQ ID NO2的氨基酸残基118-299；单独作为SEQ ID NO63提供)的区域的邻接氨基酸序列可用于鉴定CE-7糖酯酶家族成员。在另一个实施方案中，合适的过氧化水解酶是这样的酶，其具有过氧化水解酶活性，并且与SEQ ID NO61具有至少40％，优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选80％，甚至更优选90％，最优选至少95％的氨基酸同一性。
如本文所使用，“密码子简并性”是指遗传密码允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下变化的性质。因此，本发明涉及编码氨基酸序列的所有或基本部分的任何核酸分子，所述氨基酸序列编码本发明微生物多肽。技术人员非常了解在使用核苷酸密码子确定给定氨基酸时特定宿主细胞显示出的“密码子偏好性”。因此，在合成基因以改善其在宿主细胞中的表达时，希望设计基因以使得其密码子使用频率接近宿主细胞中优选的密码子使用频率。
如本文所使用，“合成的基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸构件装配而成。将这些构件进行连接并退火以形成基因节段，该基因节段随后在酶促作用下装配而构建成完整的基因。与DNA序列有关的“化学合成”是指在体外对组分核苷酸进行装配。可以采用完善建立的方法来完成DNA的手工化学合成，或者可使用许多种可商业获得的机器的其中一种来完成自动化学合成。因此，基于最优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏倚，可以定制基因用以最优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员会理解成功的基因表达的可能性。优选的密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因(其中序列信息可获得)的检测。
如本文所使用，“基因”是指能够表达特定蛋白质的核酸分子，其包括编码序列前的调控序列(5′非编码序列)和编码序列后的调控序列(3′非编码序列)。“天然基因”是指天然存在的具有其自己的调节序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的调节序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含源于不同来源的调节序列和编码序列，或者包含源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调节序列和编码序列。“内源性基因”指位于生物的基因组内它的天然位置的天然基因。“外来”基因指正常情况下不存在于宿主生物体中，而是通过基因转移导入宿主生物体内的基因。外来基因可以包含插入到非天然生物体内的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是通过转化方法导入基因组内的基因。
如本文所使用，“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，其可影响转录、RNA加工或稳定性，或者相关编码序列的翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
如本文所使用，“启动子”是指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可以整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。导致基因在大部分时间内表达的启动子通常称为“组成型启动子”。还应当进一步认识到，由于在大多数情况下调节序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
如本文所使用，“3′非编码序列”是指位于编码序列下游且包括能够影响mRNA加工或基因表达的多腺苷酸化识别序列(通常限于真核生物)和其他序列编码调节信号的DNA序列。多腺苷酸化信号通常特征在于影响多聚腺苷酸片(通常限于真核生物)给mRNA前体3′末端的添加。
如本文所使用，术语“可操作地连接”是指单个核酸分子上的核酸序列的结合，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义的取向可操作地连接至调节序列。
如本文所使用，术语“表达”是指源于本发明的核酸分子的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
在本文所用的，术语“转化”指将核酸分子转移至宿主生物体的基因组内，从而导致基因稳定遗传。在本发明中，宿主细胞的基因组包括染色体和染色体外(例如，质粒)基因。含有转化核酸分子的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。
如本文所使用，术语“质粒”、“载体”和“盒”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA分子的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组进一种独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3′末端非翻译序列一起引入细胞中。“转化盒”指含有外来基因并且除了该外来基因外还含有有利于转化特定宿主细胞转化的元件的特定载体。“表达盒”是指包含外来基因并且除该外来基因以外还具有使得该基因在外来宿主中的表达增强的元件的特定载体。
如本文所使用，术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。一般的序列分析软件将包括但不限于，GCG程序套件(Wisconsin Package Version 9.0，genetics Computergroup(GCG)，Madison，WI)，BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul et al.，J.Biol.215403-410(1990)和DNASTAR(DNASTAR，Inc.1228S.Park St.Madison，WI 53715USA)，CLUSTALW(例如1.83版本；Thompson等人，NucleicAcids Research，22(22)4673-4680(1994)，以及合并Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methodsgenome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.编辑Suhai，Sandor.PublisherPlenum，New York，NY)，Vector NTI(Informax，Bethesda，MD)和Sequencher版本4.05。在本专利申请案的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，除非另外指明，否则分析结果将基于所参考程序的“默认值”。如本文所使用，“缺省值”将意指当第一次初始化时软件最初装载的由软件制造商设定的任何值或参数组。
如本文所使用，术语“生物污染物”是指包括但不限于微生物、孢子、病毒、朊病毒颗粒、以及它们的混合物的一种或多种不需要的和/或病原性的生物。本发明方法产生用于减少和/或消除存活的生物污染物存在的有效浓度的至少一种过羧酸。在一个优选实施方案中，微生物污染物是存活的病原微生物。
如本文所使用，术语“消毒”是指为了破坏或阻止生物微生物生长的过程。如本文所使用，术语“消毒剂”是指通过破坏、中和或抑制生物污染物生长的试剂。消毒剂通常用于处理无生命物体或表面。如本文所使用，术语“防腐剂”是指抑制携带疾病的微生物生长的化学试剂。在该实施方案的一个方面，生物污染物是致病微生物。
如本文所使用，术语“杀病毒剂”是指抑制或破坏病毒的试剂，并且与“杀病毒试剂(viricide)”同义。过酸可以具有杀病毒活性。可适用于本发明的本领域已知的一般供选择的杀病毒剂包括例如醇类、醚类、氯仿、甲醛、酚类、β-丙内酯、碘、氯、汞盐、羟胺、环氧乙烷、乙二醇、季铵化合物、酶和洗涤剂。
如本文所使用，术语“杀生物剂”是指灭活或破坏微生物，一般是广谱的化学试剂。显示出灭活或破坏微生物的能力的试剂描述为具有“杀生物”活性。过酸可以具有杀生物活性。可适用于本发明的本领域已知的一般供选择的杀生物剂包括例如氯、二氧化氯、氯异氰尿酸酯、次氯酸盐、臭氧、丙烯醛、胺类、氯化酚类化合物、铜盐、有机硫化合物和季铵盐。
如本文所使用，短语“最小杀生物浓度”是指对于特定接触时间在目标微生物的存活群体中将产生所需致命的、不可逆的减少的杀生物试剂的最小浓度。效力可以通过处理后存活微生物中的log10减少进行度量。在一个方面，处理后存活微生物中的目标减少是至少3-log减少，更优选至少4-log减少，最优选至少5-log减少。在另一个方面，最小杀生物浓度是存活微生物细胞中的至少6-log减少。
如本文所使用，术语“过氧源”和“过氧的来源”是指当在水溶液中时，能够提供浓度为约1mM或更高的过氧化氢的化合物，包括但不限于过氧化氢、过氧化氢加合物(例如脲-过氧化氢加合物(过氧化脲))、过硼酸盐和过碳酸盐。如本文所描述，在反应成分组合后，由含水反应混合物中的过氧化合物提供的过氧化氢浓度最初为至少1mM。在一个实施方案中，含水反应混合物中的过氧化氢浓度为至少10mM。在另一个实施方案中，含水反应混合物中的过氧化氢浓度为至少100mM。在另一个实施方案中，含水反应混合物中的过氧化氢浓度为至少200mM。在另一个实施方案中，含水反应混合物中的过氧化氢浓度为500mM或更高。在另一个实施方案中，含水反应混合物中的过氧化氢浓度为1000mM或更高。含水反应混合物中过氧化氢与酶底物例如甘油三酸酯(H2O2∶底物)的摩尔比可以是约0.002-20，优选约0.1-10，最优选约0.5-5。
用于由羧酸酯和过氧化氢来酶催化制备过酸的合适的反应条件 在本发明的一个方面，提供了生产包含过酸的含水混合物的方法，所述方法包括在具有过氧化水解活性的酶催化剂存在下将羧酸酯与无机过氧化物反应，所述无机过氧化物不限于过氧化氢、过硼酸钠或过碳酸钠。在一个实施方案中，酶催化剂包含具有属于CE-7糖酯酶家族的结构的过氧化水解酶。在另一个实施方案中，过氧化水解酶催化剂在结构上归类为头孢菌素C脱乙酰酶。在另一个实施方案中，过氧化水解酶催化剂在结构上归类为乙酰木聚糖酯酶。
在一个实施方案中，过氧化水解酶催化剂包括酶，所述酶具有过氧化水解活性，并且当使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO2比对时，所述酶具有特征基序，所述特征基序包括 a)在氨基酸残基118-120上的RGQ基序； b)在氨基酸残基179-183上的GXSQG基序；和 c)在氨基酸残基298-299上的HE基序。
在另一个实施方案中，当使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO2比对时，特征基序还包括第四个保守基序，该保守基序定义为在氨基酸残基267-269上的LXD基序。
在另一个实施方案中，过氧化水解酶催化剂包含具有本发明特征基序，并且与SEQ ID NO2具有至少40％氨基酸同一性的酶。
在另一个实施方案中，过氧化水解酶催化剂包含选自下列的具有过氧化水解酶活性的酶SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16和SEQ IDNO32。
在另一个实施方案中，过氧化水解酶催化剂包含这样的酶，该酶与如SEQ ID NO61所限定的邻接特征基序具有至少40％的氨基酸同一性，其中上述保守基序(例如RGQ、GXSQG和HE，以及任选LXD)被保留。
在另一个实施方案中，过氧化水解酶催化剂包含这样的酶，该酶具有由核酸分子编码的氨基酸序列，所述核酸分子在严格杂交条件下与选自下列的核酸序列杂交SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ IDNO31，SEQ ID NO41和SEQ ID NO60。
在另一个实施方案中，过氧化水解酶催化剂包含具有选自下列的氨基酸序列的酶SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ IDNO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16和SE ID NO32，其中所述酶可具有一个或多个添加、缺失或取代，只要特征基序被保留，并且过氧化水解酶活性得以保留。
合适的羧酸酯具有选自下列的式 a)具有以下式的酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R2＝C1-C10直链或支链烷基、链烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH，并且n＝1-10； b)具有以下式的甘油酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R3和R4各自为H或R1C(O)；以及 c)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖的乙酰化糖。
在一个优选的实施方案中，乙酰化糖包括乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖。在另一个实施方案中，乙酰化糖选自乙酰化木聚糖、乙酰化木聚糖片段、乙酰化木糖(例如木糖四乙酸酯)、乙酰化葡萄糖(例如葡萄糖五乙酸酯)、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛和三-O-乙酰基-葡萄烯糖，以及乙酰化纤维素。在一个优选的实施方案中，乙酰化糖选自β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛和三-O-乙酰基-葡萄烯糖，以及乙酰化纤维素。这样，乙酰化糖可以是用于通过本发明方法(即在过氧源存在下)产生过羧酸的合适的底物。
在另一个方面，羧酸酯选自乙酸乙酯、乳酸甲酯、乳酸乙酯、乙醇酸甲酯、乙醇酸乙酯、甲氧基乙酸甲酯、甲氧基乙酸乙酯、3-羟基丁酸甲酯、3-羟基丁酸乙酯、2-乙酰基柠檬酸三乙酯、葡萄糖五乙酸酯、葡糖酸内酯、甘油酯(例如甘油单酯、二酯和三酯)例如甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯(二丙酸甘油酯)、甘油三丙酸酯(1，2，3-三丙酰基甘油)、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯(二丁酸甘油酯)、甘油三丁酸酯(1，2，3-三丁酰基甘油)、乙酰化糖、以及它们的混合物。在另一个方面，在另一个方面，羧酸酯底物选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯。在另外一个方面，羧酸酯底物选自甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯。在一个优选的方面，羧酸酯是选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它们的混合物的甘油酯。
羧酸酯以在酶催化的过氧化水解后足以产生所需过酸浓度的浓度存在于反应混合物中。羧酸酯无需完全溶解于反应混合物中，但具有足够的溶解性，以允许通过过氧化水解酶催化剂将酯转化成相应的过酸。羧酸酯以反应混合物的0.05重量％至40重量％的浓度存在于反应混合物中，优选以反应混合物的0.1重量％至20重量％的浓度，和更优选以反应混合物的0.5重量％至10重量％的浓度存在于反应混合物中。
过氧源可以包括但不限于过氧化氢、过氧化氢加合物(例如脲-过氧化氢加合物(过氧化脲))、过硼酸盐和过碳酸盐。反应混合物中过氧化合物的浓度可以为0.0033重量％至约50重量％，优选0.033重量％至约40重量％，更优选0.33重量％至约30重量％。
许多过氧化水解酶催化剂(完整细胞、透化的完整细胞和部分纯化的完整细胞提取物)已报道具有过氧化氢酶活性(EC 1.11.1.6)。过氧化氢酶催化过氧化氢转化成氧和水。在一个方面，过氧化水解催化剂缺乏过氧化氢酶活性。在另一个方面，向反应混合物中添加过氧化氢酶抑制剂。过氧化氢酶抑制剂的实例包括但不限于叠氮化钠和硫酸羟胺。本领域技术人员可以根据需要调整过氧化氢酶抑制剂的浓度。过氧化氢酶抑制剂的浓度一般为0.1mM至约1M；优选为约1mM至约50mM；更优选为约1mM至约20mM。在一个方面，叠氮化钠浓度一般为约20mM至约60mM，而硫酸羟胺的浓度一般为约0.5mM至约30mM，优选约10mM。
在另一个实施方案中，酶催化剂缺乏显著的过氧化氢酶活性或被改造以降低或消除过氧化氢酶活性。宿主细胞中的过氧化氢酶活性可以通过使用众所周知的技术破坏负责过氧化氢酶活性的基因的表达而得到下调或消除，所述技术包括但不限于转座子诱变、RNA反义表达、靶向诱变和随机诱变。在一个优选的实施方案中，编码内源性过氧化氢酶活性的基因被下调或破坏(即剔除)。如本文所使用，“破坏的”基因是其中由修饰基因编码的蛋白的活性和/或功能不再存在的基因。破坏基因的方法是本领域众所周知的，并且包括但不限于对基因进行插入、删除或突变，只要相应蛋白的活性和/或功能不再存在即可。在另一个优选的实施方案中，生产宿主是大肠杆菌生产宿主，其包含选自katG(SEQ IDNO47)和katE(SEQ ID NO56)的破坏的过氧化氢酶基因。在另一个实施方案中，生产宿主是大肠杆菌菌株，其包含katg1和katE过氧化氢酶基因中的下调和/或破坏。本文提供了包含katG和katE的双破坏的大肠杆菌菌株(参见实施例15；大肠杆菌菌株KLP18)。
证实了对于过氧化水解酶的大规模(10-L和更大)生产，与过氧化氢酶阴性菌株UM2(大肠杆菌Genetic Stock Center#7156，Yale University，New Haven CT)相比，所构建的过氧化氢酶阴性大肠杆菌菌株KLP18(katG和katE双剔除)(实施例15)是优良的宿主，这是通过在发酵罐条件下的生长而确定的(实施例17-19)。虽然KLP18和UM2都是过氧化氢酶阴性菌株，但是已知UM2具有多种营养缺陷，因此需要富含酵母提取物和蛋白胨的培养基。甚至当采用富含培养基进行发酵时，UM2的生长也不佳，并且达到有限的最大细胞密度(OD)。相反，KLP18没有专门的营养需求，并且在单独的无机培养基中或者采用另外的酵母提取物都生长至高细胞密度(实施例20)。
含水反应混合物中催化剂的浓度依赖于催化剂的具体催化活性，并且进行选择以获得所需反应速率。过氧化水解反应中的催化剂的重量一般为0.0005mg至10mg/mL反应总体积，优选为0.010mg至2.0mg/mL。还可以使用本领域技术人员众所周知的方法将催化剂固定在可溶性或不溶性载体上；参见例如，“Immobilization of Enzymes and Cells”；Gordon F.Bickerstaff，Editor；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997。固定化催化剂的使用允许在后续反应中回收和重新使用催化剂。酶催化剂可以是完整微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物、部分纯化或纯化的酶、以及它们的混合物的形式。
在一个方面，通过羧酸酯的化学过氧化水解和酶促过氧化水解的组合产生的过酸浓度足以提供在所需pH下用于漂白或消毒的有效浓度的过酸。在另一个方面，本方法提供了酶和酶底物的组合以产生所需有效浓度的过酸，其中在不存在添加的酶的情况下，产生的过酸浓度显著较低。尽管在许多情况下通过无机过氧化物与酶底物的直接化学反应可能存在酶底物的基本化学过氧化水解，但产生的过酸浓度可能不足以在所需应用中提供有效浓度的过酸，并且通过向反应混合物中添加合适的过氧化水解酶催化剂达到了过酸总浓度的显著增加。
通过至少一种羧酸酯的过氧化水解所产生的过酸(例如过乙酸)的浓度是在过氧化水解反应起始的10分钟内、优选5分钟内至少约20ppm，优选至少100ppm，更优选至少约200ppm过酸，更优选至少300ppm，更优选至少500ppm，更优选至少700ppm，更优选至少约1000ppm过酸，最优选至少2000ppm过酸。包含过酸的产物混合物可以任选用水或主要包含水的溶液稀释，以产生具有所需较低浓度的过酸的混合物。在一个方面，产生所需过酸浓度需要的反应时间不超过约2小时，优选不超过约30分钟，更优选不超过约10分钟，最优选在约5分钟或更少时间内。在其他方面，在组合所述反应成分后的约5分钟至约168小时内，或者在组合所述反应成分后的约5分钟至约48小时内，或约5分钟至2小时内，或其中的任何此类时间间隔，将被一定浓度微生物群体污染的硬质表面或无生命物体与按照本文描述的方法形成的过酸接触。
选择反应温度以控制反应速率和酶催化剂活性的稳定性。反应温度可以是仅高于反应混合物的凝固点(大约0℃)至约75℃，反应温度的优选范围为约5℃至约55℃。
包含过酸的最终反应混合物的pH是约2至约9，优选约3至约8，更优选约5至约8，甚至更优选约6至约8，还甚至更优选约6.5至约7.5。在另一个实施方案中，反应混合物的pH是酸性的(pH＜7)。反应和最终反应混合物的pH可以通过添加合适的缓冲剂来加以控制，所述缓冲剂包括但不限于磷酸盐、焦磷酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐或柠檬酸盐。当采用时，缓冲剂的浓度通常为0.1mM至1.0M，优选为1mM至300mM，最优选为10mM至100mM。
在另一个方面，酶促过氧化水解产物可以包含提供所需功能性的另外的成分。这些另外的成分包括但不限于缓冲剂、洗涤剂助剂、增稠剂、乳化剂、表面活性剂、润湿剂、抗腐蚀剂(例如苯并三唑)、酶稳定剂和过氧化物稳定剂(例如金属离子螯合剂)。许多另外的成分是洗涤剂工业中众所周知的(参见例如美国专利5,932,532；在此引入作为参考)。乳化剂的实例包括聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。增稠剂的实例包括但不限于

RD、玉米淀粉、PVP、


聚山梨醇酯20、PVA和卵磷脂。缓冲系统的实例包括但不限于磷酸二氢钠/磷酸氢二钠；氨基磺酸/三乙醇胺；柠檬酸/三乙醇胺；酒石酸/三乙醇胺；琥珀酸/三乙醇胺；和乙酸/三乙醇胺。表面活性剂的实例包括但不限于a)非离子表面活性剂例如环氧乙烷或环氧丙烷的嵌段共聚物，乙氧基化或丙氧基化直链和支链伯醇和仲醇，以及脂族氧化膦，b)阳离子表面活性剂例如季铵化合物，特别是具有与氮原子结合的C8-C20烷基，并且该氮原子还与3个C1-C2烷基结合的季铵化合物，c)阴离子表面活性剂例如烷基羧酸(例如，C8-C20脂肪酸)、烷基膦酸盐、链烷磺酸盐(例如十二烷基硫酸钠“SDS”)或直链或支链烷基苯磺酸盐、烯烃磺酸盐和d)两性和两性离子表面活性剂例如氨基羧酸、氨基二羧酸和烷基甜菜碱(alkybetaine)以及它们的混合物。另外的成分可以包括芳香剂、染料和过氧化氢稳定剂(例如金属螯合剂例如1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸(

2010，Solutia Inc.，St.Louis，MO和乙二胺四乙酸(EDTA))、

SL、

0520、

0531、酶活性稳定剂(例如聚乙二醇(PEG))和洗涤剂助剂。
使用过氧化水解酶催化剂原位生产过酸 头孢菌素C脱乙酰酶(E.C.3.1.1.41；系统命名头孢菌素C乙酰水解酶；CAHs)是具有能够将头孢菌素例如头孢菌素C、7-氨基头孢烷酸(cephalosporanic acid)和7-(噻吩-2-乙酰氨基)头孢烷酸上的乙酰基酯键水解的能力的酶(Abbott，B.和Fukuda，D.，Appl.Microbiol.30(3)413-419(1975))。CAH属于在结构上相关的酶的较大家族，该家族称为糖酯酶家族7(CE-7；参见Coutinho，P.M.，Henrissat，B.“Carbohydrate-active enzymesan integrated database approach”，“RecentAdvances in Carbohydrate Bioengineering”，H.J.gilbert，g.Davies，B.Henrissat和B.Svensson eds.，(1999)The Royal Society of Chemistry，Cambridge，pp.3-12.) CE-7家族包括CAH和乙酰木聚糖酯酶(AXEs；E.C.3.1.1.72)。CE-7家族成员共享共同结构基序，并且是非常与众不同的，因为它们通常对于乙酰化木糖型低聚糖(xylooliogsaccharide)和头孢菌素C都表现出酯水解活性，这意味着CE-7家族代表一类具有针对一定范围小底物的多功能脱乙酰酶活性的蛋白(Vincent等人，J.Mol.Biol.，330593-606(2003))。Vincent等人描述了在该家族成员之间的结构类似性，并且限定了CE-7家族的特征序列基序。
在植物、真菌(例如顶头孢霉(Cephalosporidium acremonium))，酵母(例如，红冬孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(Rhodotorulaglutinis))和细菌例如热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacteriumsp.)物种；地中海拟无枝菌酸菌(Norcardia lactamdurans)，和芽孢杆菌属(Bacillus)的各个成员中发现了CE-7家族的成员(Politino等人，Appl.Environ.Microbiol.，63(12)4807-4811(1997)；Sakai等人，J.Ferment.Bioeng.8553-57(1998)；Lorenz，W.和Wiegel，J.，J.Bacteriol1795436-5441(1997)；Cardoza等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，54(3)406-412(2000)；Mitshushima等人，同上，Abbott，B.和Fukuda，D.，Appl.Microbiol.30(3)413-419(1975)；Vincent等人，同上，Takami等人，NAR，28(21)4317-4331(2000)；Rey等人，genome Biol.，5(10)article77(2004)；Degrassi等人，Microbiology.，1461585-1591(2000)；美国专利6,645,233；美国专利5,281,525；美国专利5,338,676；和WO 99/03984。与SEQ ID NO2具有显著同源性的CE-7糖酯酶家族成员的不完全列表在表1中提供。
表1与SEQ ID NO2具有显著同源性的CE-7酶的实例


本发明过氧化水解酶是CE-7糖酯酶家族的所有成员。如Vincent等人(同上)所述，该家族成员共享作为该家族特征的共同特征基序。本发明过氧化水解酶的CLUSTALW比对表明所有成员都属于CE-7糖酯酶家族(图1a-c)。表2提供了本发明过氧化水解酶之间的总体氨基酸同一性百分比的比较。
表2过氧化水解酶之间的氨基酸同一性百分比1 1＝通过使用BLOSUM62的blast2seq比对确定的同一性百分比，缺口开放(gap open)＝11，缺口延长(gAP extension)＝1，x_drop＝0，预期(expect)＝10，并且字长(wordsize)＝3。Tatiana A.Tatusova，Thomas L.Madden(1999)，“Blast 2sequences-a new tool forcomparing protein and nucleotide sequences”，FEMSMicrobiol Lett。174247-250 虽然在总体氨基酸同一性百分比方面观察到了差异(即热纤梭菌ATCC 27405TM过氧化水解酶；SEQ ID NO14与枯草芽孢杆菌ATCC31954TM过氧化水解酶；SEQ ID NO2仅具有57％的氨基酸同一性，而那不勒斯栖热袍菌过氧化水解酶(SEQ ID NO16)与SEQ ID NO2仅具有42％的同一性)，但是每一种本发明过氧化水解酶都具有CE-7特征基序。因此，本发明过氧化水解酶催化剂是在结构上被归类为属于CE-7糖酯酶家族的酶。每一种本发明过氧化水解酶都包含CE-7特征(标志性)基序。
Vincent等人(同上)分析了CE-7酯酶的结构，并且已经鉴定了作为该家族标志的几个高度保守基序。如图1所示，高度保守基序(在图1中加下划线的；相对于SEQ ID NO2的位置编号)包括Arg118-Gly119-Gln120(RGQ)、Gly179-Xaa180-Ser181-Gln182-Gly183(GXSQG)和His298-Glu299(HE)。此外，图1示出了可用于进一步表征特征基序的另外一个高度保守的Lys267-Xaa268-Asp269(LXD)基序。所有编号都是相对于参考序列(枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM过氧化水解酶；SEQ ID NO2)的编号。
在一个实施方案中，合适的过氧化水解酶可以由sCE-7特征基序的存在来鉴定(Vincent等人，同上)。在一个优选的实施方案中，针对枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM过氧化水解酶(SEQ ID NO2；即用于相对氨基酸位置编号的参考序列)，使用CLUSTALW比对来鉴定包含CE-7特征基序的过氧化水解酶。根据SEQ ID NO2的氨基酸残基编号，CE-7特征基序包括 如下所定义的3个保守基序 a)Arg118-Gly119-Gln120； b)Gly179-Xaa180-Ser181-Gln182-Gly183；和 c)His298-Glu299。
在氨基酸残基位置180的Xaa通常是甘氨酸或丙氨酸。属于催化三联体的氨基酸残基以粗体表示。
对CE-7糖酯酶家族内的保守基序的进一步分析表明，存在另外一个可进一步限定属于CE-7糖酯酶家族的过氧化水解酶的保守基序(在SEQ ID NO2的氨基酸位置267-269的LXD)(图1a-c)。在另一个实施方案中，上面限定的特征基序包括如下所定义的第四个保守基序 Leu267-Xaa268-Asp269。
在氨基酸残基位置268的Xaa通常是异亮氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸。所述第四个基序包括属于催化三联体(Ser181-Asp269-His298)的天冬氨酸残基(粗体)。
可使用多种众所周知的通用比对算法(即序列分析软件)来比对两个或多个氨基酸序列(代表具有过氧化水解酶活性的酶)，以确定本发明特征基序的存在(例如，CLUSTALW或Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.，48443-453(1970))。将比对序列与参考序列(SEQ ID NO2)进行比较。在一个实施方案中，采用参考氨基酸序列(如在本文中使用的CAH序列(SEQ ID NO2)，来自枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM)的CLUSTAL比对(CLUSTALW)被用于鉴定属于CE-7酯酶家族的过氧化水解酶。保守氨基酸残基的相对编号是基于参考氨基酸序列的残基编号，以说明比对序列内的少量插入或缺失(5个氨基酸或更少)。
本文中例举的过氧化水解酶当中的总同一性百分比的比较表明，与SEQ ID NO2具有小至42％同一性的酶(同时保留特征基序)表现出显著过氧化水解酶活性，并且在结构上归类为CE-7糖酯酶。在一个实施方案中，本发明过氧化水解酶包括这样的酶，所述酶包含本发明特征基序，并且与SEQ ID NO2具有至少40％，优选至少42％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，还甚至更优选至少70％，甚至更优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的氨基酸同一性。
所有本发明过氧化水解酶都包含如表3中所示的上述特征基序。
表3在具有过氧化水解酶活性的本发明酶中发现的保守基序。
a＝由Vincent等人，同上定义的用于限定特征基序的保守基序。
b＝用于进一步限定Vincent等人，同上定义的特征基序的在本文中鉴定的另一个基序。
或者，包含4个保守基序(RGQ、GXSQG、LXD和HE；SEQ ID NO2的氨基酸残基118-299)的邻接特征基序(SEQ ID NO61)也可用作邻接特征基序来鉴定CE-7糖酯酶(图1a-c)。这样，期望具有过氧化水解酶活性的合适的酶还可以鉴定为，与SEQ ID NO61(将在CE-7糖酯酶中发现的4个保守基序加下划线)具有至少40％，优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选80％，甚至更优选90％，最优选至少95％的氨基酸同一性。
RGQQSSEDTSISLHGHALGWMTKGILDKDTYYYRGVYLDAVRALEVIS SFDEVDETRIGVTGGSQGGGLTIAAAALSDIPKAAVADYPYLSNFERAIDVALEQPYLEINSFFRRNGSPETEVQAMKTLSYFDIMNLADRVKVPVLMSIGLIDKVTPPSTVFAAYNHLETEKELKVYRYFGHE(SEQID NO61) 表4中提供了使用邻接特征序列针对具有过氧化水解酶活性的本发明CE-7酯酶的比较。使用采用默认参数的BLASTP。
表4具有过氧化水解活性的各种CE-7糖酯酶相对于邻接特征序列(SEQ ID NO61)的氨基酸同一性百分比 或者，还可以使用与全长的一种或多种本发明过氧化水解酶相比的氨基酸同一性百分比。因此，具有过氧化水解酶活性的合适的酶与SEQID NO2具有至少40％，优选至少42％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，还甚至更优选至少70％，甚至更优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的氨基酸同一性。在另一个实施方案中，合适的过氧化水解酶催化剂包含选自下列的氨基酸序列SEQ ID NO2，SEQID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，和SEQ ID NO32。
合适的过氧化水解酶还可以包括相对于一种本发明过氧化水解酶(例如SEQ ID NOs 2、6、8、10、12、14、16和32)具有一个或多个缺失、取代和/或插入的酶。如表3所示，具有过氧化水解酶活性的CE-7糖酯酶共享小至42％的总体氨基酸同一性。基于本发明实施例中提供的数据，具有属于CE-7糖酯酶家族的过氧化水解酶活性的另外的酶可具有甚至更低的同一性百分比，只要酶保留保守特征基序即可。这样，缺失、取代和/或插入的数目可以改变，只要在酶内其相对位置发现保守特征基序即可(见表2)。
此外，根据在相应核酸序列内发现的结构类似性来鉴定合适的酶是本领域技术人员众所周知的。可使用杂交序列来鉴定类似基因序列。因此，本发明合适的过氧化水解酶催化剂包括由在严格条件下与具有选自下列的核酸序列的核酸分子杂交的核酸分子编码的氨基酸序列1，SEQID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
本发明方法使用属于CE-7家族糖酯酶的酶的过氧化水解酶活性，在含水反应条件下原位产生工业上有用的、有效浓度的过酸。在一个实施方案中，具有过氧化水解酶活性的酶在结构和功能上归类为头孢菌素C脱乙酰酶(CAH)。在另一个实施方案中，具有过氧化水解酶活性的酶在结构和功能上归类为乙酰木聚糖酯酶(AXE)。
产生的过酸是具有相当反应性的，并且在浓度方面一般是随着时间的过去而降低。这样，可能希望使各种反应成分保持分离，特别是对于液体制剂。在一个方面，使过氧化氢来源与底物或过氧化水解酶催化剂分离，优选地与两者分离。这可以使用各种技术，包括但不限于使用多隔室分室分配器(美国专利4,585,150)，以及在使用时将过氧化水解酶催化剂与无机过氧化物和本发明底物在物理上组合以起始含水酶促过氧化水解反应来实现。在接触用于目标处理的表面和/或物体之前，过氧化水解酶催化剂可以任选固定在反应室主体内或与包含过酸的反应产物分离(例如过滤等)。过氧化水解酶催化剂可以为液体基质或固体形式(即粉末化的，片)或包埋在固体基质内，所述固体基质随后与底物混合以起始酶促过氧化水解反应。在一个进一步的方面，过氧化水解酶催化剂可以包含在可溶性或多孔性小袋内，所述小袋可以加入含水底物基质中以起始酶促过氧化水解。在另一个进一步方面，将包含酶催化剂的粉末悬浮在底物(例如甘油三乙酸酯)中，并且在使用时与在水中的过氧源混合。
用于测定过酸和过氧化氢浓度的HPLC测定方法。
在本发明方法中，可使用各种分析方法来分析反应物和产物，包括但不限于滴定、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、质谱法(MS)、毛细管电泳法(CE)、U.Karst等人描述的分析方法(Anal.Chem.，69(17)3623-3627(1997))，以及如本文实施例中描述的2，2’-连氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸盐(ABTS)分析(S.Minning，等人，AnalyticaChimica Acta 378293-298(1999)和WO 2004/058961A1)。
过酸的最小杀生物浓度的测定 由J.gabrielson等人(J.Microbiol.Methods 5063-73(2002))描述的方法可用于测定过酸或过氧化氢和酶底物的最小杀生物浓度(MBC)。该测定方法基于XTT还原抑制，其中XTT((2，3-二[2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基]-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑鎓，内盐，单钠盐)是氧化还原染料，其通过在490nm或450Mn处测量的光密度(OD)中的变化来指示微生物的呼吸活性。然而，存在可用于检测消毒剂和杀菌剂活性的各种其他方法，包括但不限于存活平板计数、直接显微计数、干重、浊度测量、吸光度和生物发光(参见例如Brock，Semour S.，“Disinfection，Sterilization，and Preservation”，第5版本，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，PA，USA；2001). 酶促制备的过酸组合物的用途 根据本发明方法生产的酶催化剂产生的过酸可以在各种硬质表面/无生命物体应用中用于降低微生物、真菌、朊病毒相关和病毒污染物的浓度，例如下述的净化医疗器械(例如内窥镜)、纺织品(例如衣服、地毯)、食物制剂表面、食物贮存和食物包装设备、用于食品包装的材料、鸡孵化场和生长设施、动物围栏和具有微生物和/或杀病毒活性的用过的加工水。酶产生的过酸可以在设计为灭活朊病毒(例如某些蛋白酶)以另外提供杀生物活性的制剂中使用。在一个优选方面，本发明过酸组合物作为用于不可高压灭菌的医疗器械和食物包装设备的消毒剂是特别有用的。因为含过酸的制剂可以使用GRAS或食物级别成分(酶、酶底物、过氧化氢和缓冲剂)进行制备，所以酶产生的过酸还可以用于动物兽体、肉、水果和蔬菜的净化，或用于预制食物的净化。酶产生的过酸可以引入产物内，所述产物的最终形式是粉末、液体、凝胶、薄膜、固体或气溶胶。酶产生的过酸可以稀释至仍提供有效净化的浓度。
通过使表面或物体与通过本发明方法生产的产物接触，包含有效浓度的过酸的组合物可以用于消毒被病原微生物污染物污染(或怀疑被污染)的表面和/或物体。如本文所使用，“接触”是指使包含有效浓度的过酸的消毒组合物放置与怀疑被致病实体污染的表面或无生命物体接触足以清洁和消毒的一段时间。接触包括对怀疑被一定浓度微生物群体污染的表面或无生命物体喷雾、处理、浸没、冲刷、倾泻在其上或其内、混合、组合、涂抹、覆盖、施加、附着或以其他方式给予包含有效浓度过酸的过酸溶液或组合物，或形成有效浓度过酸的溶液或组合物。可将消毒剂组合物与清洁组合物合并以提供清洁和消毒。或者，可以将清洁剂(例如表面活性剂或洗涤剂)掺入到制剂内以在单一组合物中提供清洁和消毒。
包含有效浓度过酸的组合物还可以包含至少一种另外的抗微生物剂、朊病毒降解蛋白酶组合、杀病毒剂、杀孢子剂或杀生物剂。当用于清洁和消毒被病原微生物、孢子、病毒、真菌和/或朊病毒污染(或怀疑被污染)的表面和/或物体时，这些试剂与通过本发明方法产生的过酸的组合可以提供增加的和/或协同效应。合适的抗微生物剂包括羧酸酯(例如对羟基苯甲酸烷基酯和肉桂酸烷基酯)，磺酸(例如十二烷基苯磺酸)，碘化合物或活性卤素化合物(例如，元素卤素，卤素氧化物(例如NaOCl、HOCl、HOBr、ClO2)，碘，卤间化物(interhalides)(例如，一氯化碘、二氯化碘、三氯化碘、四氯化碘、氯化溴、一溴化碘或二溴化碘)，多卤化物，次氯酸盐，次氯酸，次溴酸盐，次溴酸，氯和溴乙内酰脲，二氧化氯和亚氯酸钠)，有机过氧化物，包括过氧化苯甲酰、过氧化烷基苯甲酰、臭氧、单态氧发生器、以及它们的混合物，酚衍生物(例如邻苯基苯酚、邻苄基对氯苯酚、叔戊基苯酚和羟基苯甲酸C1-C6烷基酯)、季铵化合物(例如氯化烷基二甲基苄基铵、氯化二烷基二甲基铵、以及它们的混合物)，和此类抗微生物剂的混合物，其量足以提供所需微生物保护程度。抗微生物剂的有效量包括约0.001重量％至约60重量％抗微生物剂、约0.01重量％至约15重量％的抗微生物剂或约0.08重量％至约2.5重量％的抗微生物剂。
在一个方面，当应用于部位上和/或部位处时，通过本方法形成的过酸可用于降低存活微生物污染物(例如，存活微生物群体)的浓度。如本文所使用，本发明“部位”包含适合于消毒或漂白的部分或全部靶表面。靶表面包括可能潜在被微生物、病毒、真菌、朊病毒或其组合污染的所有表面。非限制性实例包括在食物或饮料工业中发现的设备表面(例如罐、传送机、地板、排水管、冷却器、致冷机、设备表面、墙壁、阀、带、管、排水管、接头、裂缝其组合等)；建筑物表面(例如墙壁、地板和窗户)；非食物工业相关管和排水管，包括水处理设施、池和矿泉以及发酵罐；医院或兽医诊所表面(例如墙壁、地板、床、设备(例如内窥镜)、医院/兽医或其他医疗保健设施中穿着的衣物，包括衣服、刷、鞋和其他医院或兽医表面)；餐馆表面；浴室表面；盥洗室；衣物和鞋；用于家畜的畜舍或马房表面，所述家畜是例如家禽、牛、奶牛、羊、马和猪；用于家禽或用于虾的孵化场；以及药物或生物药物表面(例如药物或生物药物制造设备，药物或生物药物成分，药物或生物药物赋形剂)。另外的硬质表面还包括食品，例如牛肉、家禽、猪肉、蔬菜、水果、海鲜、其组合等。部位还可以包括吸水材料例如受感染的亚麻制品或其他纺织品。部位还包括收获的植物或植物产品，包括种子、球茎、根茎、水果和蔬菜、生长植物，和特别是农作物生长植物，包括谷类、叶菜类和沙拉农作物、根菜类、豆类、浆果类、柑橘类水果和硬水果。
硬质表面材料的非限制性实例是金属(例如钢、不锈钢、铬、钛、铁、铜、黄铜、铝及其合金)，矿物质(例如混凝土)，聚合物和塑料(例如聚烯烃，例如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(甲基)丙烯酸酯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚(丙烯腈、丁二烯、苯乙烯)、聚(丙烯腈、丁二烯)、丙烯腈丁二烯；聚酯例如聚对苯二甲酸乙二醇酯；和聚酰胺例如尼龙)。另外的表面包括砖、瓦、陶器、瓷器、木材、乙烯树脂(vinyl)、油毡和地毯。
重组微生物表达 本发明序列的基因和基因产物可以在异源宿主细胞中，特别是在微生物宿主细胞中产生。用于表达本发明基因和核酸分子的优选异源宿主细胞是微生物宿主，其可以在真菌或细菌家族内发现，并且在宽范围的温度、pH值和溶剂耐受力下生长。例如，预期任何细菌、酵母和丝状真菌可以适当地充当本发明核酸分子表达的宿主。过氧化水解酶可以在细胞内、细胞外或者在细胞内和细胞外的组合表达，其中与用于回收通过细胞内表达产生的蛋白的方法相比，细胞外表达使得能够更容易地从发酵产物中回收所需蛋白。转录、翻译和蛋白质生物合成装置相对于用于产生细胞生物质的细胞原料保持不变；无论如何功能基因将得到表达。宿主菌株的实例包括但不限于细菌、真菌或酵母物种例如曲霉菌属(Aspergillus)、木霉菌属(Trichoderma)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、法夫酵母属(Phaffia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、耶氏酵母属(Yarrowia)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、单胞发酵菌属(Zymomonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、赤杆菌属(Erythrobacter)、绿菌属(Chlorobium)、色菌属(Chromatium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、纤维粘菌属(Cytophaga)、红杆菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacteria)、分支杆菌属(Mycobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、假平胞菌属(Sphingomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯菌属(Methylosinus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、产碱菌属(Alcaligenes)、集胞藻属(Synechocystis)、聚球藻属(Synechococcus)、鱼腥藻属(Anabaena)、硫杆菌属(Thiobacillus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和粘球菌属(Myxococcus)物种。在一个实施方案中，在一个实施方案中，细菌宿主菌株包括埃希氏菌属、芽孢杆菌属和假单胞菌属物种。在一个优选的实施方案中，细菌宿主细胞是大肠杆菌。
大规模的微生物生长和功能基因表达可以使用宽范围的简单或复杂的碳水化合物、有机酸和醇或饱和烃，例如在光合或化能自养宿主的情况下甲烷或二氧化碳，氮、磷、硫、氧、碳或任何痕量微量营养素，包括小无机离子的形式和量。生长速度的调节可以通过给培养物添加或不添加一般不视为营养素或能量来源的特定调节分子来进行。
用于转化合适的宿主细胞的载体或盒是本领域众所周知的。一般地，载体或盒包含指导相关基因转录和翻译的序列、可选标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含含有转录起始控制的基因5′区域和控制转录终止的DNA片段3′区域。最优选的是当2个控制区都来源于与转化的宿主细胞同源和/或对生产宿主是天然的基因，尽管这样的控制区无需是这样来源的。
可用于驱动本发明头孢菌素C脱乙酰酶编码区在所需宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有很多，并且是本领域技术人员熟悉的。基本上能够驱动这些基因的任何启动子都适于本发明，包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(可用于在糖酵母属(Saccharomyces)中的表达)；AOX1(可用于在毕赤酵母菌属中的表达)；和lac、ara、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac和trc(可用于在大肠杆菌中表达)以及可用于在芽孢杆菌属物种中表达的amy、apr、npr启动子和各种噬菌体启动子。
终止控制区也可以来源于对优选宿主细胞是天然的各种基因。在一个实施方案中，转录控制区的包括是任选的。在另一个实施方案中，嵌合基因包括来源于优选宿主细胞的终止控制区。
工业生产 可以应用各种培养方法以产生本发明过氧化水解酶催化剂。例如，由重组微生物宿主过量表达的特定基因产物的大规模生产可以通过分批和连续培养方法来生产。
经典的分批培养方法是封闭系统，其中培养基的组成在培养开始时设定并且在培养过程期间不进行人工改变。因此，在培养过程开始时，用所需的一种或多种生物接种培养基，并且不向系统中进一步添加任何物质可以发生生长或代谢活性。然而，通常来说，“分批”培养是指碳源的添加是成批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批系统中，代谢产物和生物质组成持续改变直至培养结束时。在分批培养物内，细胞缓慢通过静态延缓期到达高速生长对数期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不加以处理，稳定期的细胞将最终死亡。在某些系统中对数期中的细胞通常负责最终产物或中间产物的批量生成。在其他系统中可以获得稳定或指数后期生成。
标准分批式系统的一种变型是补料-分批系统。补料-分批培养方法也适用于本发明，并且包括典型的分批式系统，不同的是随着培养进程递增地添加底物。在代谢产物往往抑制细胞的代谢作用，以及其中期望培养基中具有有限量的底物时，补料-分批式系统是有用的。补料-分批式系统中的实际底物浓度难于测量，并根据一些可测量因素(例如pH、溶解的氧以及废气例如CO2的分压)进行评估。分批和补料-分批培养方法在本领域内是常用的且众所周知，并且实例可见于如下文献Thomas D.Brock，“BiotechnologyA Textbook ofIndustrialMicrobiology”，第二版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989)和Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36227(1992)。
所需产物的商业生产也可以用连续培养来实现。连续培养是一种开放式系统，其中将设定好的培养基连续加入到生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。或者，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养素，并且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可以使用广泛多样的由天然和/或合成材料组成的固体载体来进行。
连续或半连续培养允许调节影响细胞生长或最终产物浓度的一种因素或任何数目的因素。例如，一种方法将以固定的速率维持限制性营养物质(例如碳源或氮水平)并且允许所有其它参数适度。在其他系统中影响生长的许多因素可以连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力维持稳态生长条件，并且因此由于培养基取出的细胞丧失必须针对培养基中的细胞生长速度进行平衡。对于连续培养过程调节营养素和生长因子的方法以及用于使产物形成速度达到最大的技术是工业微生物学领域众所周知的，并且各种方法由Brock，同上所述。
本发明中的发酵培养基必须含有合适的碳底物。合适的底物可包括但不限于单糖，例如葡萄糖和果糖；二糖，例如乳糖或蔗糖；多糖，例如淀粉、纤维素或它们的混合物；以及来自可再生原料的未纯化混合物，例如干酪乳清渗透物、玉米浆、甜菜糖蜜及大麦麦芽。此外，碳底物还可以是一碳底物例如二氧化碳、甲烷或甲醇(例如，当宿主细胞是甲基营养微生物时)。-类似地，假丝酵母属的多种物种将会代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.，153485-489(1990))。因此，设想本发明中所利用的碳源可涵盖各种含碳底物并且将仅受限于生物体的选择。
申请人:特别将所有引用的参考文献的完整内容引入本公开内容中。此外，当一个数量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，它应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围均意在包括其端点，以及位于该范围内的所有整数和分数，除非另行指出。当定义一个范围时，不希望将本发明的范围限定于所列举的具体数值。
一般方法 提供下述实施例以证实本发明的优选方面。本领域技术人员应当理解，下述实施例中公开的技术代表由本发明人发现在本发明的实践中良好发挥作用的技术，并且因此可以视为构成关于其实践的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以在公开的具体实施方案中进行许多改变并且仍获得相同或相似结果。
除非另有说明，所有试剂和材料均得自DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)、TCI America(Portland，OR)、RocheDiagnostics Corporation(Indianapolis，IN)或Sigma/Aldrich ChemicalCompany(St.Louis，MO)。
说明书中的下述缩写对应如下的测量单位、技术、性质或化合物“sec”或“s”是指秒，“min”是指分钟，“h”或“hr”是指小时，“μμL”是指微升，“mL”是指毫升，“L”是指升，“mM”是指毫摩尔浓度，“M”是指摩尔浓度，“mmol”是指毫摩尔，“ppm”是指每百万份数，“wt”是指重量，“wt％”是指重量百分比，“g”是指克，“μμg”是指微克，“g”是指重力，“HPLC”是指高效液相层析法，“dd H2O”是指蒸馏和去离子水，“dcw”是指细胞干重，“ATCC”或

是指美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，“U”是指过氧化水解酶活性单位，“rpm”是指每分钟转数，并且“EDTA”是指乙二胺四乙酸。
实施例1 枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM的生长和细胞提取物的制备 将干燥培养物悬浮于5ML营养肉汤(DIFCO；0003-01-6)中，并且在30℃培养3天，来将枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM培养物恢复活力。Fo培养第3天后，将等分试样的培养物在胰酪胨大豆(trypticase soy)琼脂培养平板(Becton，Dickinson，and Company；Franklin Lakes，NJ)上进行划线，并且在35℃培养24小时。将几个单个菌落刮到1微升接种环(Becton Dickinson；目录#220215)上，并且转移到50ML乳杆菌属Lactobacillus MRS肉汤(Hardy Diagnostics，Santa Maria，CA；目录#C5931)内。然后将培养物在30℃和200rpm搅拌速度下生长12小时。生长12小时后，将2ML培养物转移到包含100MLMRS肉汤的无挡板的500mL摇瓶内，用于在30℃和200rpm搅拌速度下生长12-14小时。然后通过在5℃以15,000×g离心25分钟来收获细胞，并且将所得细胞糊贮存于-80℃。
对于细胞提取物制备，将0.9g细胞糊以25重量％(细胞干重)悬浮于包含二硫苏糖醇(1mM)和EDTA(1mM)的0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中。使细胞悬浮液2次通过具有16,000psi工作压力的弗氏压碎器。然后将粗提取物以20,000×g离心以去除细胞碎片，产生用于可溶性总蛋白测定的澄清细胞提取物(Bicinchoninic Acid Kit for ProteinDetermination，Sigma Aldrich，Sigma目录#BCA 1-KT)，然后在-80℃冷冻和贮存。
实施例2 枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM半纯化的细胞提取物的过氧化水解活性的测定 将1.0mL等分试样的枯草芽孢杆菌(ATCC 31954TM)细胞提取物(10Mg总蛋白/mL，如实施例1中所述制备)用等体积的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)进行稀释，并通过100,000分子量截留(Molecular WeightCutoff)(MWCO)Centricon膜装置(Millipore Corp，Bedford，MA)进行过滤。所得到的滤液(半纯化的细胞提取物)包含用于可溶性总蛋白测定(Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination，Sigma目录#BCA1-KT)的1.5Mg总蛋白/mL，并且该滤液的测定指出没有可测量的过氧化氢酶活性。
将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(250mM)、过氧化氢(2.5M)和0.100ML半纯化的细胞提取物(0.15Mg提取总蛋白)的1mL反应混合物于25℃混合。对照反应通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换半纯化的细胞提取物来进行，以测定在不存在添加的半纯化细胞提取物的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过氧化水解而产生的过乙酸的浓度。
根据由Karst等人描述的方法来进行反应混合物中过乙酸浓度的测定。在10分钟和30分钟时取出等分试样(0.250ML)的反应混合物，并且使用

MC-滤器装置(30,000标称分子量极限(NormalMolecular Weight Limit)(NMWL)，Millipore目录#UFC3LKT 00)通过在12,000rpm下离心2分钟进行过滤；通过过滤去除等分试样的蛋白质成分来终止反应。将等分试样(0.100ML)的所得到的滤液转移至包含0.300Ml去离子水的1.5mL螺旋瓶盖HPLC瓶(Agilent Technologies，Palo Alto，CA；#5182-0715)中，然后加入0.100ML 20mMMTS(甲基对甲苯基硫)在乙腈中的溶液，将瓶盖上盖子，使内容物短暂混合，然后在约25℃于不存在光的情况下培养10分钟。随后向每个瓶中添加0.400ML乙腈和0.100ML三苯基膦(TPP，40mM)在乙腈中的溶液，再次将瓶盖上盖子，并且使所得溶液混合，并且在约25℃下于不存在光的情况下培养30分钟。随后向每个管形瓶中添加0.100ML 10mM N，N-二乙基-间甲苯甲酰胺(DEET；HPLC外标)，并且如下所述通过HPLC分析所得到的溶液。在10分钟和30分钟内产生的过乙酸浓度列举于表5中。
HPLC方法 Supelco Discovery C8柱(10cm×4.0mm，5μm)(cat.#569422-U)w/前置柱Supelco Supelguard Discovery C8(Sigma-Aldrich；目录#59590-U)；10微升注射体积；采用CH3CN(Sigma-Aldrich；#270717)和去离子H2O以1.0ML/min和室温进行梯度洗脱 时间(分钟秒) (％CH3CN) 0:00 40 3:00 40 3:10 100 4:00 100 4:10 40 7:00(停止) 40 表5在枯草芽孢杆菌(ATCC 31954TM)半纯化细胞提取物的存在或不存在下，通过甘油三乙酸酯(250mM)和过氧化氢(2.5M)于pH 6.5反应产生的过乙酸(PAA)。

实施例3 来自枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM细胞提取物的半纯化酶的过氧化水解活性 如实施例1中所述进行枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM生长和提取物制备，除了粗提取物不进行离心。将粗提取物用冷正丙醇(-20℃)进行分级处理。将包含无细胞提取物的烧瓶在冰浴中搅拌15分钟，随后滴加(以防止提取物凝固)正丙醇(-20℃)至40％(v/v)的浓度。将所得到的提取物/丙醇混合物在冰浴中搅拌30分钟，随后以12,000×g下于5℃离心10分钟，并将上清液放回到烧瓶中并置于冰浴内。在搅拌下向上清液中缓慢加入另外的正丙醇-20℃)至60％(v/v)的浓度，并且如上所述在冰浴中将所得到的混合物搅拌30分钟，然后离心。将来自该第二个级份的团块保存于冰上，并将上清液放回到烧瓶中并置于冰浴内。在搅拌下向上清液中缓慢加入冷正丙醇至80％(v/v)的浓度，并且如上所述将混合物搅拌30分钟且离心。将来自60-80％级份的团块保存于冰上。将来自40-60％(v/v)正丙醇级份和60-80％(v/v)正丙醇级份的团块溶解于最小量的0.05M磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中，并且测定所得溶液的可溶性总蛋白(Bicinchoninic Acid Kit for ProteinDetermination，目录#BCA1-KT)，随后冷冻和贮存于-80℃。
将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(250mM)、过氧化氢(1.0M)和来自细胞提取物的40-60％(v/v)或60-80％(v/v)正丙醇级份(如上所述制备的)的0.10Mg/mL可溶性总蛋白的1mL反应混合物于25℃进行混合。对照反应通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)替换包含半纯化酶的细胞提取物的正丙醇级份来进行，以测定在不存在添加的半纯化酶的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过氧化水解所产生的过乙酸浓度。使用实施例2中描述的操作在5分钟和30分钟时测定反应混合物的过乙酸，并且将通过添加的酶产生的过乙酸浓度列于表6中。
表6。在枯草芽孢杆菌(ATCC 31954TM)半纯化细胞提取物的存在或不存在下，通过甘油三乙酸酯(250mM)和过氧化氢(1.0M)于pH 6.5反应所产生的过乙酸(PAA)。

实施例4 来自枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM细胞提取物的具有过氧化水解活性的头孢菌素C脱乙酰酶的鉴定 将实施例3中描述的40-60％正丙醇级份的0.1ML样品(500μg总蛋白)在室温下与等体积的2×非变性(天然)样品缓冲液(Invitrogen)混合，并装载到1.5mM 8-16％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺mini-凝胶(2D凝胶；Invitrogen)的制备样品孔内。天然凝胶电泳使用Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Invitrogen)在125V下操作90分钟。电泳后，制备凝胶用于使用pH指示剂溴百里酚蓝的原位酯酶活性测定。
将凝胶用去离子水洗涤10分钟×2，并且进行缓慢机械混合。然后使用10mM磷酸盐缓冲液将凝胶洗涤10分钟。除去磷酸盐缓冲液后，使包含665μL饱和溴百里酚蓝(溶于水中)的50ML 10mM磷酸盐缓冲液与凝胶一起培养10分钟，然后添加1ML纯甘油三乙酸酯(SigmaAldrich)。在培养10分钟内，在凝胶上146kD处出现指示酯酶活性的1个黄色条带。
从凝胶中切下酯酶阳性条带，并且转移到50ML聚丙烯圆锥形管(Falcon)内。伴随轻轻混合的2-5ML去离子水洗涤后，从凝胶切片中取出黄色的溴百里酚蓝斑点。然后在轻轻混合下将凝胶切片用0.9ML 2×Novex Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液加100μL 10×NuPAGE还原剂(Invitrogen)处理30分钟。样品处理后，使用热水浴将凝胶切片和样品缓冲液于85℃培养5分钟。随后从培养管中取出凝胶切片，并且小心地置于1.5mM 8-16％Tris-GlyMini-凝胶的单个制备孔中。小心地排除气泡并且与成层凝胶直接接触。将在去离子水中制备的250-300μL温0.5％琼脂糖溶液加到制备孔内后，原位固定凝胶切片。将单个分子标记泳道装载15μL

Plus2预染色MW标记(Invitrogen)。
凝胶切片的电泳在30V下操作30分钟，用于将蛋白质从凝胶切片电洗脱到平板凝胶内。电压随后经过10分钟从30V斜线上升至125V，随后为在125V进行90分钟的操作。电泳后，如XCell IITM印迹手册(Invitrogen)中所述将分离的蛋白条带印迹到PVDF膜上，并且印迹缓冲液是10mM CAPS，pH 11.0。电泳印迹操作在25V下在转移装置的夹套中于室温用冰水操作2小时。
转移后，将PVDF膜用ProBlot染色溶液(Applied Biosystems，FosterCity，CA)染色1分钟，随后用甲醇∶水(50∶50)脱色。鉴定6个蛋白质条带并且各自进行N-末端测序。

氨基酸序列数据库的Blast搜索后，具有酯酶相关序列同源性的唯一条带鉴定为条带1，并且17个N-末端氨基酸调用与枯草芽孢杆菌头孢菌素C脱乙酰酶(

BAA01729；Mitsushima等人，同上；美国专利5,528,152；和美国专利5,338,676)具有100％的氨基酸同一性。
实施例5 来自枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM的过氧化水解酶的克隆和表达 使用

DNA纯化系统(Gentra Systems，Minneapolis MN)从枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM分离出基因组DNA。通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的引物，从基因组DNA扩增过氧化水解酶基因。将所得到的核酸产物(SEQ ID NO1)亚克隆到pTrcHis2-

(Invitrogen，Carlsbad CA)内，以产生鉴定为pSW186的质粒。还通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ IDNO27和SEQ ID NO28的引物，从基因组DNA扩增过氧化水解酶基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO29)用限制酶PstI和XbaI切开，并且亚克隆到pUC19中的PstI与XbaI位点之间，以产生鉴定为pSW194质粒。使用质粒pSW186和pSW194来转化大肠杆菌TOP10(Invitrogen，CarlsbadCA)、大肠杆菌MG1655(ATCC 47076TM)、大肠杆菌UM2(大肠杆菌geneticStock Center#7156，Yale University，New Haven CT)和大肠杆菌KLP18(见实施例15)以产生分别鉴定为TOP10/pSW186、MG1655/pSW186、UM2/pSW186、KLP18/pSW186、TOP10/pSW194、MG1655/pSW194、UM2/pSW194和KLP18/pSW194的菌株。将TOP10/pSW186、MG1655/pSW186、UM2/pSW186、KLP18/pSW186、TOP10/pSW194、MG1655/pSW194、UM2/pSW194和KLP18/pSW194在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD600nm＝0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在20-40％总可溶性蛋白的过氧化水解酶的表达。
实施例6 来自枯草芽孢杆菌BE1010的过氧化水解酶的克隆和表达 使用

DNA纯化系统(Gentra Systems)从枯草芽孢杆菌BE1010(Payne和Jackson 1991J.Bacteriol.1732278-2282)分离出基因组DNA。通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的引物，从基因组DNA扩增过氧化水解酶基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO5)亚克隆到pTrcHis2-

(Invitrogen)内，以产生鉴定为pSW187的质粒。还通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO27和SEQ ID NO28的引物，从基因组DNA扩增过氧化水解酶基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO30)用限制酶PstI和XbaI切开，并且亚克隆到pUC19中的PstI与XbaI位点之间，以产生鉴定为pSW189的质粒。使用质粒pSW187和pSW189来转化大肠杆菌TOP10(Invitrogen)、大肠杆菌MG1655(ATCC 47076TM)、大肠杆菌UM2(大肠杆菌genetic Stock Center#7156，Yale University，New Haven CT)和大肠杆菌KLP18(见实施例15)以产生分别鉴定为TOP10/pSW187，MG1655/pSW187，UM2/pSW187，KLP18/pSW187，TOP10/pSW189，MG1655/pSW189，UM2/pSW189和KLP18/pSW19的菌株。将TOP10/pSW187、MG1655/pSW187、UM2/pSW187、KLP18/pSW187、TOP10/pSW189、MG1655/pSW189、UM2/pSW189和KLP18/pSW189在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD600nm＝0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在20-40％总可溶性蛋白的过氧化水解酶的表达。
实施例7 来自枯草芽孢杆菌ATCC 6633Tm的过氧化水解酶的克隆和表达 使用

DNA纯化系统从枯草芽孢杆菌ATCC 6633TM分离出基因组DNA。通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的引物，从基因组DNA扩增过氧化水解酶基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO7)亚克隆到pTrcHis2-

内，以产生鉴定为pSW188的质粒。使用质粒pSW188来转化大肠杆菌MG1655(ATCC 47076TM)和大肠杆菌UM2(大肠杆菌genetic Stock Center#7156，Yale University，New Haven CT)以产生分别鉴定为MG1655/pSW188和UM2/pSW188的菌株。将MG1655/pSW188和UM2/pSW188在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD600nm＝0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在20-40％总可溶性蛋白的过氧化水解酶的表达。
实施例8 来自枯草芽孢杆菌ATCC 29233TM的过氧化水解酶的克隆和表达 使用

DNA纯化系统从枯草芽孢杆菌ATCC 29233TM分离出基因组DNA。通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的引物，从基因组DNA扩增过氧化水解酶基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO31)亚克隆到pTrcHis2-

内，以产生鉴定为pSW190的质粒。使用质粒pSW190来转化大肠杆菌MG1655(ATCC 47076TM)、大肠杆菌UM2(大肠杆菌genetic Stock Center#7156，Yale University，New Haven CT)和大肠杆菌KLP18(见实施例15)以产生分别鉴定为MG1655/pSW190、UM2/pSW190和KLP18/pSW190的菌株。将MG1655/pSW190、UM2/pSW190和KLP18/pSW190在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD600nm＝0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在20-40％总可溶性蛋白的过氧化水解酶的表达。
实施例9 来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC 14580TM的过氧化水解酶的克隆和表达 使用

DNA纯化系统从地衣芽孢杆菌ATCC 14580TM分离出基因组DNA。通过PCR(94℃05分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO33和SEQ ID NO34的引物，从基因组DNA扩增过氧化水解酶基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO9)亚克隆到pTrcHis2-

内，以产生鉴定为pSW191的质粒。使用质粒pSW191来转化大肠杆菌MG1655(ATCC 47076TM)、大肠杆菌UM2(大肠杆菌genetic Stock Center#7156，Yale University，New Haven CT)、大肠杆菌PIR1(Invitrogen，Carlsbad CA)和大肠杆菌KLP 18(见实施例15)以产生分别鉴定为MG1655/pSW191、UM2/pSW191、PIR1/pSW191和KLP18/pSW191的菌株。将MG1655/pSW191、UM2/pSW191、PIR1/pSW191和KLP18/pSW191在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD600nm＝0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在20-40％总可溶性蛋白的过氧化水解酶的表达。
实施例10 来自热纤梭菌(Clostridia thermocellum)ATCC 27405TM的过氧化水解酶的克隆和表达 使用

DNA纯化系统从热纤梭菌ATCC 27405TM分离出基因组DNA。通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO35和SEQ ID NO36的引物，从基因组DNA扩增过氧化水解酶基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO13)亚克隆到pTrcHis2-

内，以产生鉴定为pSW193的质粒。使用质粒pSW193来转化大肠杆菌MG1655(ATCC 47076TM)、大肠杆菌UM2(大肠杆菌genetic Stock Center#7156，Yale University，New Haven CT)和大肠杆菌KLP18(见实施例15)以产生分别鉴定为MG1655/pSW193、UM2/pSW193和KLP18/pSW193的菌株。将MG1655/pSW193、UM2/pSW193和KLP18/pSW193在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD600nm＝0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在20-40％总可溶性蛋白的过氧化水解酶的表达。
实施例11 来自短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)PS213的过氧化水解酶的克隆和表达 使用对于在大肠杆菌中表达最优化的密码子(DNA 2.0，Menlo ParkCA)来合成如在

(登录号#AJ249957)中报道的来自短小芽孢杆菌PS213的编码乙酰木聚糖酯酶的基因(axel)。然后通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ IDNO37和SEQ ID NO38的引物来扩增该基因。将所得核酸产物(SEQ IDNO60)亚克隆到pTrcHis2-

(Invitrogen，Carlsbad CA)内，以产生鉴定为pSW195的质粒。使用质粒pSW195来转化大肠杆菌MG1655(ATCC47076TM)、大肠杆菌UM2(大肠杆菌genetic Stock Center#7156，YaleUniversity，New Haven CT)和大肠杆菌KLP18(见实施例15)以产生分别鉴定为MG1655/pSW195、UM2/pSW195和KLP18/pSW195的菌株。将MG1655/pSW195、UM2/pSW195和KLP18/pSW195在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD600nm＝0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在20-40％总可溶性蛋白的过氧化水解酶的表达。
实施例12 来自那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的过氧化水解酶的克隆和表达 使用对于在大肠杆菌中表达最优化的密码子(DNA 2.0，Menlo ParkCA)来合成如在

(登录号#58632)中报道的来自那不勒斯栖热袍菌的编码乙酰木聚糖酯酶基因。然后通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO39和SEQ ID NO40的引物来扩增该基因。将所得核酸产物(SEQ ID NO41)亚克隆到pTrcHis2-

内，以产生鉴定为pSW196的质粒。使用质粒pSW196来转化大肠杆菌MG1655(ATCC 47076TM)、大肠杆菌UM2(大肠杆菌genetic Stock Center#7156，Yale University，New Haven CT)和大肠杆菌KLP18(见实施例15)以产生分别鉴定为MG1655/pSW196、UM2/pSW196和KLP18/pSW196的菌株。将MG1655/pSW196、UM2/pSW196和KLP18/pSW196在LB培养基中于37℃在摇动下生长直至OD600nm＝0.4-0.5，这时加入IPTG至最终浓度为1mM，并且继续培养2-3小时。通过离心收获细胞，并且进行SDS-PAGE以证实在20-40％总可溶性蛋白的过氧化水解酶的表达。
实施例13 katG过氧化氢酶破坏的大肠杆菌菌株的构建 通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO44和SEQ ID NO45的引物来从质粒pKD13(SEQ ID NO43)扩增卡那霉素抗性基因(kan；SEQ ID NO42)，以产生鉴定为SEQ ID NO46的PCR产物。katG核酸序列作为SEQ IDNO47提供，提供，并且相应的氨基酸序列是SEQ ID NO48。用温度敏感性质粒pKD46(SEQ ID NO49)转化大肠杆菌MG1655(ATCC 47076TM)，所述质粒含有λ-Red重组酶基因(Datsenko和Wanner，2000，PNAS USA976640-6645)，并且在LB-amp平板上于30℃选择24小时。通过电穿孔(BioRadgene Pulser，0.2cm比色杯，2.5kV，200W，25uF)将MG1655/pKD46用50-500ng PCR产物转化，并且在LB-kan平板上于37℃选择24小时。将几个菌落划线到LB-kan平板上，并且在42℃培养过夜以让pKD46质粒熟化。检查菌落以证实kanR/ampS表型。使用

DNA纯化系统从几个菌落分离出基因组DNA，并且使用鉴定为SEQ ID NO50和SEQ ID NO51的引物，通过PCR检查，以证实katG基因的破坏。将几个katG-破坏的菌株用温度敏感性质粒pCP20(SEQ ID NO52)转化，所述质粒含有用于切除kan基因的FLP重组酶，并且在LB-amp平板上于37℃选择24小时。将几个菌落划线到LB平板上，并且在42℃培养过夜以让pCP20质粒熟化。检查两个菌落以证实kanS/ampS表型，并且称为MG1655KatG1和MG1655KatG2。
实施例14 katE过氧化氢酶破坏的大肠杆菌菌株的构建 通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO53和SEQ ID NO54的引物来从质粒pKD13(SEQ ID NO43)扩增卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO42)以产生鉴定为SEQ ID NO55的PCR产物。katE核酸序列作为SEQ ID NO56提供，并且相应的氨基酸序列是SEQ ID NO57。用温度敏感性质粒pKD46(SEQ ID NO49)转化大肠杆菌MG1655(ATCC 47076TM)，所述质粒含有λ-Red重组酶基因，并且在LB-amp平板上于30℃选择24小时。通过电穿孔(BioRadgene Pulser，0.2cm比色杯，2.5kV，200W，25uF)将MG1655/pKD46用50-500ng PCR产物转化，并且在LB-kan平板上于37℃选择24小时。将几个菌落划线到LB-kan平板上，并且在42℃培养过夜以让pKD46质粒熟化。检查菌落以证实kanR/ampS表型。使用PUREGENE DNA纯化系统从几个菌落分离出基因组DNA，并且使用鉴定为SEQ ID NO58和SEQ ID NO59的引物，通过PCR检查，以证实katE基因的破坏。将几个katE-破坏的菌株用温度敏感性质粒pCP20(SEQID NO52)转化，所述质粒含有用于切除kan基因的FLP重组酶，并且在LB-amp平板上于37℃选择24小时。将几个菌落划线到LB平板上，并且在42℃培养过夜以让pCP20质粒熟化。检查两个菌落以证实kanS/ampS表型，并且称为MG1655KatE1和MG1655KatE2。
实施例15 katG过氧化氢酶和katE过氧化氢酶破坏的大肠杆菌菌株(KLP18)的构建 通过PCR(94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，70℃1分钟，30个循环)，使用鉴定为SEQ ID NO53和SEQ ID NO54的引物来从质粒pKD13(SEQ ID NO43)扩增卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO42)以产生鉴定为SEQ ID NO55的PCR产物。用温度敏感性质粒pKD46(SEQ IDNO49)转化大肠杆菌MG1655 KatG1(实施例13)，所述质粒含有λ-Red重组酶基因，并且在LB-amp平板上于30℃选择24小时。通过电穿孔(BioRadgene Pulser，0.2cm比色杯，2.5kV，200W，25uF)将MG1655KatG1/pKD46用50-500ng PCR产物转化，并且在LB-kan平板上于37℃选择24小时。将几个菌落划线到LB-kan平板上，并且在42℃培养过夜以让pKD46质粒熟化。检查菌落以证实kanR/ampS表型。使用

DNA纯化系统从几个菌落分离出基因组DNA，并且使用鉴定为SEQ ID NO58和SEQ ID NO59的引物，通过PCR检查，以证实katE基因的破坏。将几个katE-破坏的菌株(ΔkatE)用温度敏感性质粒pCP20(SEQ ID NO52)转化，所述质粒含有用于切除kan基因的FLP重组酶，并且在LB-amp平板上于37℃选择24小时。将几个菌落划线到LB平板上，并且在42℃培养过夜以让pCP20质粒熟化。检查两个菌落以证实kanS/ampS表型，并且称为MG1655KatG1KatE18.1和MG1655KatG1KatE23。MG1655KatG1KatE18.1指定为大肠杆菌KLP18。
实施例16 评估过氧化水解酶分子质量 将来自表达得自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和热纤梭菌的过氧化水解酶基因的大肠杆菌KLP18，一种过氧化氢酶双剔除的大肠杆菌MG1655的摇瓶生长物的细胞团悬浮在含有二硫苏糖醇(1mM)的2.2ML0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中。将每个细胞悬浮液通过具有16,000psi(～110.3MPa)的工作压力的French压力机两次。将粗提取物以20,000×g离心以除去细胞碎屑，获得澄清粗提取物，分析其总可溶性蛋白(Bicinchoninic Acid Kit[BCA]for Protein Determination，SigmaAldrich，BCA1-KT)。
将含有20μg总蛋白的澄清化的粗提取物(5μL)在室温与等体积的2×非变性(天然)样本缓冲液(Invitrogen)混合，并且加载到1.5mM×10孔4-12％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺小凝胶(Invitrogen)的样本孔内，向两个单独的孔内加载7.5μL NATIVEMARKTM Unstained Protein Standard(Invitrogen)。使用Tris-甘氨酸流动缓冲液(Invitrogen)在125V进行天然凝胶电泳105分钟。电泳后，使用pH指示剂溴百里酚蓝原位进行凝胶的酯酶活性测定。
在缓慢机械混合下，将凝胶用去离子水洗涤10Min×2。然后在缓慢机械混合下，将凝胶用10mM pH 7.0磷酸盐缓冲液洗涤10分钟。除去磷酸盐缓冲液之后，将含有400μL饱和溴百里酚蓝水溶液的30ML10mM pH 7.0磷酸盐缓冲液与凝胶培养10分钟，然后加入1ML纯净的甘油三乙酸酯(Tessenderlo Fine Chemicals；Staffordshire，UK)。在培养2分钟内，在活性过氧化水解酶位点形成了黄色条带。所有枯草芽孢杆菌物种和地衣芽孢杆菌都具有在约216kDa分子质量的强条带。热纤梭菌表现出在约432kDa的强主要条带以及在约576kDa的次要条带，这表明了酯酶活性。通过在与条带相邻的凝胶中打小孔来将所有条带标记。在缓慢机械混合下将凝胶用去离子水洗涤10Min×2以除去酯酶活性色斑。然后在缓慢机械混合下将凝胶用10mM pH 7.0磷酸盐缓冲液洗涤10分钟以准备进行蛋白染色。加入考马斯蓝(Coomassie blue)染色剂以覆盖凝胶。缓慢机械混合5分钟后，倾析出考马斯蓝，并且用40ML去染液(de-stain)(10％乙酸、30％甲醇、60％去离子水)替换。去染后，估测活性区域的分子质量。结果总结于表7中。
表7过氧化水解酶分子质量的评估
实施例17 表达枯草芽孢杆菌BE1010过氧化水解酶的大肠杆菌UM2/pSW187的发酵 通过向2L摇瓶中加入包含LBMiller培养基(DIFCO)的0.5L接种培养基来制备发酵罐接种培养物。将培养基的pH调节至6.8，并且在摇瓶中灭菌。灭菌后，加入1ML氨苄青霉素贮备液(25Mg/mL)。给接种培养基接种1mL大肠杆菌UM2/pSW187在20％甘油中的培养物，并且在36℃以300rpm培养。将接种培养物以大约1-2OD550转移到14L发酵罐(Braun)中，所述发酵罐在35℃包含8L培养基，所述培养基含有KH2PO4(3.50g/L)、FeSO4七水合物(0.05g/L)、MgSO4七水合物(2.0g/L)、柠檬酸钠二水合物(1.90g/L)、酵母提取物(Ambrex 695，5.0g/L)、Biospumex153K消泡剂(0.25ML/L，Cognis Corporation)、NaCl(1.0g/L)、CaCl2二水合物(10g/L)和NIT痕量元素溶液(10ML/L)。所述痕量因素溶液含有柠檬酸一水合物(10g/L)、MnSO4水合物(2g/L)、NaCl(2g/L)、FeSO4七水合物(0.5g/L)、ZnSO4七水合物(0.2g/L)、CuSO4五水合物(0.02g/L)和NaMoO4二水合物(0.02g/L)。灭菌后的加入包括60g补料分批溶液(见下文)和16.0ML氨苄青霉素贮备液(25Mg/mL)。所述补料分批溶液含有2.4kg 60％w/w葡萄糖、0.6L 25g/L酵母提取物和50g/L Bacto蛋白胨(DIFCO)。当葡萄糖浓度降至低于0.5g/L时，开始葡萄糖进料，以0.3g/分钟开始，并且每小时分别逐渐提高至0.35、0.40、0.47和0.53g/分钟；之后速度保持恒定。监测培养基中的葡萄糖浓度，并且如果浓度超过0.1g/L，则降低加入速度或者暂时停止加入。在OD550＝7时，通过加入16ML IPTG(0.5M)来开始诱导。将温度控制在36℃，并且充气固定在2slpm(每分钟标准升数)，以400rpm进行搅拌。将pH控制在6.8；使用NH4OH(29％w/w)和H2SO4(20％w/v)来进行pH控制。头部压力为0.5巴。在加入IPTG之后8小时，通过离心来收获细胞。
实施例18 表达枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM过氧化水解酶的大肠杆菌UM2/pSW186或表达地衣芽孢杆菌ATCC 14580TM过氧化水解酶的大肠杆菌UM2/pSW191的发酵 使用表达枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM过氧化水解酶的大肠杆菌UM2/pSW186或表达地衣芽孢杆菌ATCC 14580TM过氧化水解酶的大肠杆菌UM2/pSW191，如实施例17所述制备接种培养物。发酵培养基是LBMiller(25g/L，DIFCO)。灭菌后的加入包括50g葡萄糖溶液(50％w/w)和16.0ML氨苄青霉素贮备液(25Mg/mL)。使用葡萄糖(50％w/w)用于补料分批发酵。当萄萄糖浓度降至低于0.5g/L时，以0.3g/分钟的恒定速度开始葡萄糖进料。监测培养基中的葡萄糖浓度，并且如果浓度超过0.1g/L，则降低加入速度或者暂时停止加入。在OD550＝2时，通过加入16ML IPTG(0.5M)来开始诱导。将温度控制在36℃，并且充气固定在2slpm，以400rpm进行搅拌。将pH控制在6.8；使用NH4OH(29％w/w)和H2SO4(20％w/v)进行pH控制。头部压力为0.5巴。在加入IPTG之后8小时，通过离心来收获细胞。
实施例19 表达枯草芽孢杆菌BE1010过氧化水解酶的大肠杆菌KLP18/PSW189或表达地衣芽孢杆菌ATCC 14580TM过氧化水解酶的大肠杆菌KLP18/PSW191的发酵 通过向2L摇瓶中加入0.5L接种培养基来制备发酵罐接种培养物，所述培养基含有酵母提取物(Amberx 695，5.0g/L)、K2HPO4(10.0g/L)、KH2PO4(7.0g/L)、柠檬酸钠二水合物(1.0g/L)、(NH4)2SO4(4.0g/L)、MgSO4七水合物(1.0g/L)和柠檬酸铁铵(0.10g/L)。将培养基的pH调节至6.8，并且将培养基在摇瓶中灭菌。灭菌后的加入包括葡萄糖(50wt％，10.0ML)和1ML氨苄青霉素(25Mg/mL)贮备液。给接种培养基接种1mL大肠杆菌KLP18/PSW189或KLP18/PSW191在20％甘油中的培养物，并且在35℃和300rpm培养。将接种培养物以约1-2OD550转移到14L发酵罐(Braun)中，所述发酵罐在35℃包含8L培养基，所述培养基含有KH2PO4(3.50g/L)、FeSO4七水合物(0.05g/L)、MgSO4七水合物(2.0g/L)、柠檬酸钠二水合物(1.90g/L)、酵母提取物(Ambrex 695，5.0g/L)、Biospumex153K消泡剂(0.25ML/L，Cognis Corporation)、NaCl(1.0g/L)、CaCl2二水合物(10g/L)和NIT痕量元素溶液(10ML/L)。所述痕量因素溶液含有柠檬酸一水合物(10g/L)、MnSO4水合物(2g/L)、NaCl(2g/L)、FeSO4七水合物(0.5g/L)、ZnSO4七水合物(0.2g/L)、CuSO4五水合物(0.02g/L)和NaMoO4二水合物(0.02g/L)。灭菌后的加入包括葡萄糖溶液(50％w/w，80.0g)和氨苄青霉素(25Mg/mL)贮备液(16.00ML)。使用葡萄糖溶液(50％w/w)用于分批补料。当葡萄糖浓度降至低于0.5g/L时，开始葡萄糖进料，以0.31g进料/分钟开始，并且每小时分别逐渐提高至0.36、0.42、0.49、0.57、0.66、0.77、090、1.04、1.21、1.41、1.63g/分钟；之后速度保持恒定。监测培养基中的葡萄糖浓度，并且如果浓度超过0.1g/L，则降低加入速度或者暂时停止加入。对于大肠杆菌KLP18/PSW191，在OD550＝80时，通过加入16ML IPTG(0.5M)来开始诱导，对于大肠杆菌KLP 18/PSW189，生长较慢，在OD550＝56时开始诱导。将溶解氧(DO)浓度控制在25％空气饱和度。首先通过叶轮搅拌速度(400至1400rpm)，然后通过充气速度(2至10slpm)来控制DO。将pH控制在6.8。使用NH4OH(29％w/w)和H2SO4(20％w/v)进行pH控制。头部压力为0.5巴。在加入IPTG之后16小时，通过离心来收获细胞。
实施例20 大肠杆菌KLP18与大肠杆菌UM2作为发酵宿主用于过氧化水解酶生产的比较 使用大肠杆菌KLP18(实施例15)来产生转化体(实施例5、8、9和10)，按照实施例19中描述的方法让所述转化体在多个10L发酵中生长。将这些运转的最终OD与按照实施例17和18中描述的发酵方法运转的产生表达这些相同过氧化水解酶的大肠杆菌UM2转化体(实施例5、8、9和10)的发酵进行比较。表8总结了用UM2和KLP 18作为宿主的10-L发酵运转，并且证明了与UM2相比，KLP18具有优异的性能。
表8。

实施例21 在大肠杆菌转化体中表达的枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM过氧化水解酶的评估 将在实施例5中描述的3种转化体大肠杆菌TOP10/pSW186、大肠杆菌MG1655/pSW186和大肠杆菌UM2/pSW186在包含具有氨苄青霉素(100μg/mL)的Miller’s LB肉汤(50ML；Mediatech，Inc，Herndon，VA)的无挡板的摇瓶中，于35-37℃在200rpm搅拌下生长14-16小时。这3种转化体过夜生长后，通过在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的新鲜Miller’s LB肉汤内制备每种培养物的1∶100稀释，将每种培养物进行传代培养。于35-37℃在200rpm搅拌下生长3小时后，通过添加IPTG至1mM的终浓度来诱导每种培养物。在相同条件下另外生长3小时后，通过以26,000×g下于5℃离心20分钟收获来自每种培养物的细胞糊。将每种转化体的细胞提取物根据实施例1中描述的操作进行制备，不同之处是用于制备25wt％湿细胞悬浮液的提取缓冲液由0.05M磷酸钾(pH 7.0)和1mM二硫苏糖醇组成。
包含在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中的甘油三乙酸酯(250mM)、过氧化氢(1.0M)和来自3种细胞提取物(如上所述制备)之一的50μg提取总蛋白的单独1mL反应于25℃进行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取总蛋白溶液来进行对照反应，以测定在不存在添加的提取蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过氧化水解而产生的过乙酸浓度。第二组对照反应使用由未转化的大肠杆菌TOP 10、大肠杆菌MG1655和大肠杆菌UM2的提取物制备的50μg提取总蛋白来进行，以测定在不存在表达的过氧化水解酶的情况下由每种菌株产生的过酸的本底水平。反应混合物中的过乙酸浓度(表9)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。
表9在大肠杆菌TOP10/pSW186、大肠杆菌MG1655/pSW186和大肠杆菌UM2/pSW186的细胞提取物存在下，通过甘油三乙酸酯(250mM)和过氧化氢(1.0M)于pH 6.5的反应产生的过乙酸(PAA)。

实施例22 表达枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM过氧化水解酶的大肠杆菌TOP10/pSW186提取物的过氧化水解活性 按照实施例21中描述的方法，使用大肠杆菌TOP 10/pSW186转化体提取物来运行单独的1.0ML甘油三乙酸酯过氧化水解反应，以在反应中提供下列总蛋白浓度之一每一反应中196μg/mL、98μg/mL、49μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.0μg/mL或1.5μg/mL总蛋白浓度(表10)。
表10在包含甘油三乙酸酯(250mM)和过氧化氢(1.0M)于pH6.5的反应中，过乙酸(PAA)浓度对于来源于大肠杆菌TOP10/pSW186转化体提取物的总蛋白浓度的依赖性。

实施例23 表达枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM过氧化水解酶的大肠杆菌UM2/pSW186提取物的过氧化水解活性 在包含在磷酸盐缓冲液(Pi，100mM、200mM或300mM)中的甘油三乙酸酯(40mM或100mM)、过氧化氢(40mM或100mM)和提取总蛋白(0.1Mg/mL或1.0Mg/mL)的1.0ML过氧化水解反应(如实施例21中所述进行)中，使用大肠杆菌UM2/pSW186转化体提取物(20Mg总蛋白/mL提取物，如实施例21中所述制备)，每一反应于pH 6.5或7.5在25℃进行(表11)。
表11使用来源于大肠杆菌UM2/pSW186转化体提取物的过氧化水解酶，在pH 6.5或7.5下过乙酸(PAA)浓度对甘油三乙酸酯和过氧化氢浓度的依赖性。

实施例24 在来源于枯草芽孢杆菌BE1010的大肠杆菌转化体中表达的过氧化水解酶的评估 将在实施例6中描述的大肠杆菌TOP10/pSW187、大肠杆菌MG1655/pSW187和大肠杆菌UM2/pSW187转化体在包含具有氨苄青霉素(100μg/mL)的Miller’s LB肉汤(50ML；Mediatech，Inc.，Herndon，VA)的无挡板的摇瓶中，于35-37℃在200rpm搅拌下生长14-16小时。这3种转化体过夜生长后，通过在包含氨苄青霉素(100μg/mL)的新鲜Miller’s LB肉汤内制备每种培养物的1∶100稀释，将每种培养物进行传代培养。于35-37℃在200rpm搅拌下生长3小时后，通过添加IPTG至1mM的终浓度来诱导每种培养物。在相同条件下另外生长3小时后，通过以26,000×g下于5℃离心20分钟收获来自每种培养物的细胞糊。将每种转化体的细胞提取物根据实施例1中描述的操作进行制备，不同之处是用于制备25wt％湿细胞悬浮液的提取缓冲液由0.05M磷酸钾(pH7.0)和1mM二硫苏糖醇组成。
将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(250mM)、过氧化氢(1.0M)和50μg提取总蛋白的单独1.0Ml反应于25℃使用每种转化体提取物来运行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取总蛋白溶液来进行对照反应，以测定通过甘油三乙酸酯由过氧化氢的化学过氧化水解产生的过乙酸浓度。第二组对照反应使用由未转化的大肠杆菌TOP10、大肠杆菌MG1655和大肠杆菌UM2的提取物制备的50μg提取总蛋白来进行，以测定在不存在表达的过氧化水解酶的情况下由每种菌株生产的过酸的本底水平。反应混合物中的过乙酸浓度(表12)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。
表12在大肠杆菌TOP 10/pSW187、大肠杆菌MG1655/pSW187和大肠杆菌UM2/pSW187的细胞提取物的存在下，通过甘油三乙酸酯(250mM)与过氧化氢(1.0M)于pH 6.5的反应产生的过乙酸(PAA)。

实施例25 评估在大肠杆菌转化体中表达的过氧化水解酶 如实施例5、6、7、8、9、10、18和19中所述制备转化体。将每种转化体的细胞提取物根据实施例1中描述的操作进行制备，不同之处是用于制备25wt％湿细胞悬浮液的提取缓冲液由0.05M磷酸钾(pH7.0)和1mM二硫苏糖醇组成。
将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(250mM)、过氧化氢(1.0M)和50μg提取总蛋白的单独1mL反应于25℃运行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取总蛋白溶液来进行对照反应，以测定在不存在添加的提取蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过氧化水解而产生的过乙酸浓度。第二组对照反应使用由未转化的大肠杆菌TOP10、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌UM2和大肠杆菌KLP18的提取物制备的50μg提取总蛋白来进行，以测定在不存在表达的过氧化水解酶的情况下由每种菌株产生的过酸的本底水平。反应混合物中的过乙酸浓度(表13)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。
表13在得自大肠杆菌TOP10、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌UM2、大肠杆菌PIR2和大肠杆菌KLP18的转化体细胞提取物的50μg总提取蛋白/mL存在下，通过甘油三乙酸酯(250mM)和过氧化氢(1.0M)于pH6.5的反应产生的过乙酸(PAA)。


实施例26(比较实施例) 评估市售脂肪酶的过氧化水解 在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(250mM)、过氧化氢(1.0M)和50μg脂肪酶的单独1mL反应于25℃进行。不采用市售脂肪酶来进行对照反应，以测定在不存在添加的脂肪酶下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过氧化水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度(表14)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。市售脂肪酶得自Sigma/Aldrich Chemical Company(St.Louis，MO)，BioCatalytics(Pasadena，CA)，Meito Sangyo Co.(Nagoya，Japan)，AmanoEnzymes(Lombard，IL)，Novozymes(Franklinton，NC)，Valley Research(South Bend，IN)和Enzyme Development Corporation(

NewYork，NY)。
表14在50μg/mL市售脂肪酶存在下通过甘油三乙酸酯(250mM)与过氧化氢(1.0M)于pH 6.5的反应产生的过乙酸(PAA)。



实施例27 评估在大肠杆菌转化体中表达的过氧化水解酶 按照实施例21中描述的方法制备表达过氧化水解酶的转化体的细胞提取物。将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(105mM)、过氧化氢(78mM)和1Mg或2Mg来自细胞提取物(如上所述制备的)的提取总蛋白的单独1mL反应在25℃运行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取总蛋白溶液来进行对照反应，以测定在不存在添加的提取蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过氧化水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度(表15)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。
表15在得自大肠杆菌MG1655、大肠杆菌UM2、大肠杆菌PIR2和大肠杆菌KLP18的转化体细胞提取物的1Mg或2Mg总提取蛋白/mL存在下，通过甘油三乙酸酯(105mM)和过氧化氢(78mM)于pH 6.5或7.5的反应产生的过乙酸(PAA)。


实施例28(比较实施例) 评估市售脂肪酶的过氧化水解 将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(105mM)、过氧化氢(78mM)和1Mg市售脂肪酶的单独1mL反应于25℃进行。不采用市售脂肪酶来进行对照反应，以测定在不存在添加的脂肪酶下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过氧化水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度(表16)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。
表16在1Mg/mLmL市售脂肪酶存在下通过甘油三乙酸酯(105mM)与过氧化氢(78mM)于pH 6.5的反应产生的过乙酸(PAA)。

实施例29 具有润湿剂的芽孢杆菌ATCC31954TM过氧化水解酶活性 按照实施例21中描述的方法制备表达枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM过氧化水解酶的大肠杆菌UM2/pSW186转化体的细胞提取物。将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中包含甘油三乙酸酯(105mM)、过氧化氢(78mM)、润湿剂

MSC-NA(混合的短链二丙酸钠；Colonial Chemical Co.)，

2502(一种乙氧基化/丙氧基化基于炔的表面活性剂；Air Products and Chemicals；Utrecht，NL)，

MD-20，

L7650(一种聚环氧烷改性的聚二甲基硅氧烷；Chemtura Corp，Middlebury，CT)或

L8620；一种基于硅氧烷的表面活性剂)和1Mg提取总蛋白的单独1mL反应在25℃运行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取总蛋白溶液来进行对照反应，以测定在不存在添加的提取蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过氧化水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度(表17)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。
表17在得自表达枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM过氧化水解酶的大肠杆菌UM2/pSW186的转化体细胞提取物的1Mg总提取蛋白/mL存在下，通过甘油三乙酸酯(105mM)和过氧化氢(78mM)于pH 7.5的反应产生的过乙酸(PAA)。

实施例30 具有润湿剂的枯草芽孢杆菌BE1010过氧化水解酶活性 按照实施例21中描述的方法制备表达枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM过氧化水解酶的大肠杆菌UM2/pSW187转化体的细胞提取物。将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(105mM)、过氧化氢(78mM)、润湿剂(

17R4(一种聚氧化烯醚表面活性剂；BASF，Mount Olive，NJ)，

L43(一种双官能嵌段共聚物表面活性剂)或

L7650)和1Mg提取总蛋白的单独1mL反应在25℃运行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取总蛋白溶液来进行对照反应，以测定在不存在添加的提取蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过氧化水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度(表18)是根据实施例2中描述的KarstKarst等人的方法测定的。
表18在得自表达枯草芽孢杆菌BE1010过氧化水解酶的大肠杆菌UM2/pSW187的转化体细胞提取物的1Mg总提取蛋白/mL存在下，通过甘油三乙酸酯(105mM)和过氧化氢(78mM)于pH 6.5的反应产生的过乙酸(PAA)。

实施例31 具有润湿剂和螯合剂的过氧化水解酶活性 按照实施例21中描述的方法制备表达枯草芽孢杆菌BE1010过氧化水解酶的大肠杆菌UM2/pSW187转化体的细胞提取物。将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(105mM)、过氧化氢(78mM)、润湿剂(

L7650)、螯合剂(

SL；羟乙磷酸；Solutia Inc.，St.Louis，MO)和1Mg提取总蛋白的单独1mL反应在25℃运行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取总蛋白溶液来进行对照反应，以测定在不存在添加的提取蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过氧化水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度(表19)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。
表19在得自表达枯草芽孢杆菌BE1010过氧化水解酶的大肠杆菌UM2/pSW187的转化体细胞提取物的1Mg总提取蛋白/mL存在下，通过甘油三乙酸酯(105mM)和过氧化氢(78mM)于pH 6.5的反应产生的过乙酸(PAA)。

实施例32 具有润湿剂、螯合剂和腐蚀抑制剂的过氧化水解酶活性 按照实施例21中描述的方法制备表达枯草芽孢杆菌BE1010过氧化水解酶的大肠杆菌UM2/pSW187转化体的细胞提取物。将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(105mM)、过氧化氢(78mM)、润湿剂(

L7650)、螯合剂(

SL)、腐蚀抑制剂(苯并三唑)和1Mg提取总蛋白的单独1mL反应在25℃运行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取总蛋白溶液来进行对照反应，以测定在不存在添加的提取蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过氧化水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度(表20)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。
表20在得自表达枯草芽孢杆菌BE1010过氧化水解酶的大肠杆菌UM2/pSW187的转化体细胞提取物的1Mg总提取蛋白/mL存在下，通过甘油三乙酸酯(105mM)和过氧化氢(78mM)于pH 6.5的反应产生的过乙酸(PAA)。

实施例33 使用固定化枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM或BE1010过氧化水解酶的过乙酸生成 将0.50g

Oxirane酶固定聚合载体(Rohm and Haas，Philadelphia，PA)在5.0ML 0.225M磷酸钠缓冲液(pH 8.0)中的悬浮液于室温在旋转平台上混合24小时，所述缓冲液含有得自大肠杆菌KMP/pSW189(表达枯草芽孢杆菌BE1010过氧化水解酶)或大肠杆菌UM2/pSW186(表达枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM过氧化水解酶)的提取物(如实施例21中所述制备的)的10Mg/mL总可溶性蛋白，然后将悬浮液从固定化的酶中倾析出，用4份40mL体积的磷酸盐缓冲液(50mM，pH65)洗涤，并且在该相同缓冲液中于5℃贮存。在使用之前，将固定化酶通过真空过滤来干燥。
将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油三乙酸酯(250mM)、过氧化氢(1.0M)和1.5Mg/mL或5.0Mg/mL固定化过氧化水解酶(如上所述制备的)的单独1mL反应于25℃进行。进行对照反应以确定在没有添加的固定化酶存在的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过氧化水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度(表21)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。
表21在固定化枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM或BE1010过氧化水解酶存在下通过甘油三乙酸酯(250mM)和过氧化氢(1.0M)于pH 6.5的反应产生的过乙酸(PAA)。

实施例34 使用得自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和热纤梭菌的过氧化水解酶的甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯和甘油一乙酸酯的混合物的过氧化水解 将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油二乙酸酯(118mM)、甘油三乙酸酯(42mM)和甘油一乙酸酯(90mM)、过氧化氢(1.0M)和得自大肠杆菌UM2细胞提取物(如实施例21所述制备的)的含有过氧化水解酶的50μg提取总蛋白的单独1mL反应于25℃进行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取总蛋白溶液来进行对照反应，以测定在不存在添加的提取蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过氧化水解而产生的过乙酸浓度。使用由未转化的大肠杆菌UM2的提取物制备的50μg提取总蛋白来运行第二个对照反应，以确定在没有表达的过氧化水解酶存在的情况下由大肠杆菌菌株产生的过酸本底水平。反应混合物中的过乙酸浓度(表22)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。
表22在得自表达过氧化水解酶的大肠杆菌UM2的转化体细胞提取物的50μμg总提取蛋白/mL存在下，通过甘油二乙酸酯(118mM)、甘油三乙酸酯(42mM)和甘油一乙酸酯(90mM)的混合物与过氧化氢(1.0M)于pH 6.5的反应而产生的过乙酸(PAA)。

实施例35 使用得自枯草芽孢杆菌BE1010的过氧化水解酶的甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯和甘油一乙酸酯的混合物的过氧化水解 将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含甘油二乙酸酯(49.6mM)、甘油三乙酸酯(17.6mM)和甘油一乙酸酯(37.8mM)的混合物、过氧化氢(78mM)和得自细胞提取物(如实施例21所述制备的)的1Mg或2Mg提取总蛋白的单独1mL反应在25℃运行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)替换提取总蛋白溶液来进行对照反应，以测定在不存在添加的提取蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过氧化水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度(表23)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。
表23在得自表达枯草芽孢杆菌BE1010过氧化水解酶的大肠杆菌KLP18/pSW189的转化体细胞提取物的1Mg或2Mg总提取蛋白/mL存在下，通过甘油三乙酸酯(105mM)和过氧化氢(78mM)于pH 6.5的反应而产生的过乙酸(PAA)。

实施例36 通过枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM过氧化水解酶的乙酰化糖的过氧化水解 按照实施例21中描述的方法制备表达枯草芽孢杆菌ATCC 31954过氧化水解酶的大肠杆菌UM2/pSW186转化体的细胞提取物。将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含0.1M乙酰化糖(β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛或三-O-乙酰基-葡萄烯糖(Aldrich))、过氧化氢(100或500mM)、2Mg提取总蛋白的单独1mL反应于25℃运行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取总蛋白溶液来进行对照反应，以测定在不存在添加的提取蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过氧化水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度(表24)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。
表24在得自表达枯草芽孢杆菌ATCC 31954TM过氧化水解酶的大肠杆菌UM2/pSW186的转化体细胞提取物的2Mg总提取蛋白/mL存在下，通过乙酰化糖(100mM)和过氧化氢(100或500mM)于pH 6.5的反应而产生的过乙酸(PAA)。

实施例37 通过枯草芽孢杆菌BE1010过氧化水解酶的乙酰化糖的过氧化水解 按照实施例21中描述的方法制备表达枯草芽孢杆菌BE1010过氧化水解酶的大肠杆菌KLP18/pSW189转化体的细胞提取物。将在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中包含0.1M乙酰化糖(β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯，三-O-乙酰基-D-半乳醛或三-O-乙酰基-葡萄烯糖(Aldrich))、过氧化氢(100或500mM)、2Mg提取总蛋白的单独1mL反应于25℃运行。通过用50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)替换提取总蛋白溶液来进行对照反应，以测定在不存在添加的提取蛋白的情况下，通过甘油三乙酸酯被过氧化氢化学过氧化水解而产生的过乙酸浓度。反应混合物中的过乙酸浓度(表25)是根据实施例2中描述的Karst等人的方法测定的。
表25在得自表达枯草芽孢杆菌BE1010过氧化水解酶的大肠杆菌KLP18/pSW189的转化体细胞提取物的2Mg总提取蛋白/mL存在下，通过乙酰化糖(100mM)和过氧化氢(100或500mM)于pH 6.5的反应而产生的过乙酸(PAA)。


序列表
<110>E.I.duPont de Nemours and Company Inc.
Di Cos imo，Robert
Cooling，Frederick
Gavagan，John
Payne，Mark
<120>使用具有过氧化水解活性的酶生产过酸
<130>CL3345US CIP
<150>US 11/638,635
<151>2006-12-12
<150>US 60/750,092
<151>2005-12-13
<150>US 60/853,065
<151>2006-10-20
<160>61
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>960
<212>DNA
<213>枯草芽孢杆菌ATCC 31954
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(960)
<400>1
atg caa cta ttc gat ctg ccg ctc gac caa ttg caa aca tat aag cct 48
Met Gln Leu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Gln Leu Gln Thr Tyr Lys Pro
1 5 10 15
gaa aaa aca gca ccg aaa gat ttt tct gag ttt tgg aaa ttg tct ttg 96
Glu Lys Thr Ala Pro Lys Asp Phe Ser Glu Phe Trp Lys Leu Ser Leu
20 25 30
gag gaa ctt gca aaa gtc caa gca gaa cct gat tta cag ccg gtt gac144
Glu Glu Leu Ala Lys Val Gln Ala Glu Pro Asp Leu Gln Pro Val Asp
35 40 45
tat cct gct gac gga gta aaa gtg tac cgt ctc acatat aaa agc ttc 192
Tyr Pro Ala Asp Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Lys Ser Phe
50 55 60
gga aac gcc cgc att acc gga tgg tac gcg gtg cct gac aag caa ggc240
Gly Asn Ala Arg Ile Thr Gly Trp Tyr Ala Val Pro Asp Lys Gln Gly
65 70 75 80
ccg cat ccg gcg atc gtg aaa tat cat ggc tac aat gca agc tat gat288
Pro His Pro Ala Ile Val Lys Tyr His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp
85 90 95
ggt gag att cat gaa atg gta aac tgg gca ctc cat ggc tac gcc gca336
Gly Glu Ile His Glu Met Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Ala
100 105 110
ttc ggc atg ctt gtc cgc ggc cag cag agc agc gag gat acg agt att384
Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Ser Ser Glu Asp Thr Ser Ile
115 120 125
tca ctg cac ggt cac gct ttg ggc tgg atg acg aaa gga att ctt gat432
Ser Leu His Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Asp
130 135 140
aaa gat aca tac tat tac cgc ggt gtt tat ttg gac gcc gtc cgc gcg480
Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala
145 150 155 160
ctt gag gtc atc agc agc ttc gac gag gtt gac gaa aca agg atc ggt528
Leu Glu Val Ile Ser Ser Phe Asp Glu Val Asp Glu Thr Arg Ile Gly
165 170 175
gtg aca gga gga agc caa ggc gga ggt tta acc att gcc gca gca gcg576
Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala Ala Ala
180 185 190
ctg tca gac att cca aaa gcc gcg gtt gcc gat tat cct tat tta agc624
Leu Ser Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser
195 200 205
aac ttc gaa cgg gcc att gat gtg gcg ctt gaa cag ccg tac ctt gaa672
Asn Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu
210 215 220
atc aat tcc ttc ttc aga aga aat ggc agc ccg gaa aca gaa gtg cag720
Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Gly Ser Pro Glu Thr Glu Val Gln
225 230 235 240
gcg atg aag aca ctt tca tat ttc gat att atg aat ctc gct gac cga768
Ala Met Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala Asp Arg
245 250 255
gtg aag gtg cct gtc ctg atg tca atc ggc ctg att gac aag gtc acg816
Val Lys Val Pro Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Ile Asp Lys Val Thr
260 265 270
ccg ccg tcc acc gtg ttt gcc gcc tac aat cat ttg gaa aca gag aaa864
Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Glu Lys
275 280 285
gag ctg aag gtg tac cgc tac ttc gga cat gag tat atc cct gct ttt912
Glu Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Tyr Ile Pro Ala Phe
290 295 300
caa acg gaa aaa ctt gct ttc ttt aag cag cat ctt aaa ggc tga taa960
Gln Thr Glu Lys Leu Ala Phe Phe Lys Gln His Leu Lys Gly
305 310 315
<210>2
<211>318
<212>PRT
<213>枯草芽孢杆菌ATCC 31954
<400>2
Met Gln Leu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Gln Leu Gln Thr Tyr Lys Pro
1 5 10 15
Glu Lys Thr Ala Pro Lys Asp Phe Ser Glu Phe Trp Lys Leu Ser Leu
20 25 30
Glu Glu Leu Ala Lys Val Gln Ala Glu Pro Asp Leu Gln Pro Val Asp
35 40 45
Tyr Pro Ala Asp Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Lys Ser Phe
50 55 60
Gly Asn Ala Arg Ile Thr Gly Trp Tyr Ala Val Pro Asp Lys Gln Gly
65 70 75 80
Pro His Pro Ala Ile Val Lys Tyr His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp
85 90 95
Gly Glu Ile His Glu Met Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Ala
100 105 110
Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Ser Ser Glu Asp Thr Ser Ile
115 120 125
Ser Leu His Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Asp
130 135 140
Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala
145 150 155 160
Leu Glu Val Ile Ser Ser Phe Asp Glu Val Asp Glu Thr Arg Ile Gly
165 170 175
Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala Ala Ala
180 185 190
LeuSer Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser
195 200 205
Asn Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu
210 215 220
Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Gly Ser Pro Glu Thr Glu Val Gln
225 230 235 240
Ala Met Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala Asp Arg
245 250 255
Val Lys Val Pro Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Ile Asp Lys Val Thr
260 265 270
Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Glu Lys
275 280 285
Glu Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Tyr Ile Pro Ala Phe
290 295 300
Gln Thr Glu Lys Leu Ala Phe Phe Lys Gln His Leu Lys Gly
305 310 315
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
atgcaactat tcgatctgcc gctc24
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
ttatcagcct ttaagatgct gcttaa 26
<210>5
<211>957
<212>DNA
<213>枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168
<400>5
atgcaactat tcgatctgcc gctcgaccaa ttgcaaacat ataagcctga aaaaacagca 60
ccgaaagatt tttctgagtt ttggaaattg tctttggagg aacttgcaaa agtccaagca 120
gaacctgatt tacagccggt tgactatcct gctgacggag taaaagtgta ccgtctcaca 180
tataaaagct tcggaaacgc ccgcattacc ggatggtacg cggtgcctga caaggaaggc 240
ccgcatccgg cgatcgtgaa atatcatggc tacaatgcaa gctatgatgg tgagattcat 300
gaaatggtaa actgggcact ccatggctac gccacattcg gcatgcttgt ccgcggccag 360
cagagcagcg aggatacgag tatttcaccg cacggtcacg ctttgggctg gatgacgaaa 420
ggaattcttg ataaagatac atactattac cgcggtgttt atttggacgc cgtccgcgcg 480
cttgaggtca tcagcagctt cgacgaggtt gacgaaacaa ggatcggtgt gacaggagga 540
agccaaggcg gaggtttaac cattgccgca gcagcgctgt cagacattcc aaaagccgcg 600
gttgccgatt atccttattt aagcaacttc gaacgggcca ttgatgtggc gcttgaacag 660
ccgtaccttg aaatcaattc cttcttcaga agaaatggca gcccggaaac agaagtgcag 720
gcgatgaaga cactttcata tttcgatatt atgaatctcg ctgaccgagt gaaggtgcct 780
gtcctgatgt caatcggcct gattgacaag gtcacgccgc cgtccaccgt gtttgccgcc 840
tacaatcatt tggaaacaaa gaaagagctg aaggtgtacc gctacttcgg acatgagtat 900
atccctgctt ttcaaactga aaaacttgct ttctttaagc agcatcttaa aggctga 957
<210>6
<211>318
<212>PRT
<213>枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168
<400>6
Met Gln Leu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Gln Leu Gln Thr Tyr Lys Pro
1 5 10 15
Glu Lys Thr Ala Pro Lys Asp Phe Ser Glu Phe Trp Lys Leu Ser Leu
20 25 30
Glu Glu Leu Ala Lys Val Gln Ala Glu Pro Asp Leu Gln Pro Val Asp
35 40 45
Tyr Pro Ala Asp Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Lys Ser Phe
50 55 60
Gly Asn Ala Arg Ile Thr Gly Trp Tyr Ala Val Pro Asp Lys Glu Gly
65 70 75 80
Pro His Pro Ala Ile Val Lys Tyr His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp
85 90 95
Gly Glu Ile His Glu Met Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Thr
100 105 110
Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Ser Ser Glu Asp Thr Ser Ile
115 120 125
Ser Pro His Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Asp
130 135 140
Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala
145 150 155 160
Leu Glu Val Ile Ser Ser Phe Asp Glu Val Asp Glu Thr Arg Ile Gly
165 170 175
Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala Ala Ala
180 185 190
Leu Ser Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser
195 200 205
Asn Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu
210 215 220
Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Gly Ser Pro Glu Thr Glu Val Gln
225 230 235 240
Ala Met Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala Asp Arg
245 250 255
Val Lys Val Pro Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Ile Asp Lys Val Thr
260 265 270
Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Lys Lys
275 280 285
Glu Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Tyr Ile Pro Ala Phe
290 295 300
Gln Thr Glu Lys Leu Ala Phe Phe Lys Gln His Leu Lys Gly
305 310 315
<210>7
<211>957
<212>DNA
<213>枯草芽孢杆菌ATCC 6633
<400>7
atgcaactat tcgatctgcc gctcgaccaa ttgcaaacgt ataagcctga aaaaacaaca 60
ccgaacgatt tttctgagtt ttggaaatcg tctttggacg aacttgcgaa agtcaaagca 120
gcacctgatt tacagctggt tgattatcct gctgatggag tcaaggtgta ccgcctcaca 180
tataaaagct tcggaaacgc ccgcattacc ggatggtacg cagtgcctga caaggaagga 240
ccgcatccgg cgatcgtcaa atatcatggc tacaacgcta gctatgacgg tgagattcat 300
gaaatggtaa actgggcgct ccacggttac gccgcattcg gcatgctagt ccgcggccag 360
cagagcagcg aggatacgag tatttctcca catggccatg ctttgggctg gatgacgaaa 420
ggaatccttg ataaagatac atactattac cggggcgttt atttggacgc tgtccgcgcg 480
cttgaggtca tcagcagctt tgacgaagtt gacgaaacaa gaatcggtgt gacaggcgga 540
agccaaggag gcggcttaac cattgccgca gccgctctgt cagacattcc aaaagccgcg 600
gttgccgatt atccttattt aagcaacttt gaacgggcca ttgatgtggc gcttgaacag 660
ccgtaccttg aaatcaattc cttctttaga agaaatggaa gcccggaaac ggaagagaag 720
gcgatgaaga cactttcata tttcgatatt atgaatctcg ctgaccgagt gaaggtccct 780
gtcctgatgt cgatcggtct gattgacaag gtcacgccgc cgtccaccgt gtttgccgca 840
tacaaccact tggagacaga gaaagagctc aaagtgtacc gctacttcgg gcatgagtat 900
atccctgcct ttcaaacaga aaaacttgct ttctttaagc agcatcttaa aggctga 957
<210>8
<211>318
<212>PRT
<213>枯草芽孢杆菌ATCC 6633
<400>8
Met Gln Leu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Gln Leu Gln Thr Tyr Lys Pro
1 5 10 15
Glu Lys Thr Thr Pro Asn Asp Phe Ser Glu Phe Trp Lys Ser Ser Leu
20 25 30
Asp Glu Leu Ala Lys Val Lys Ala Ala Pro Asp Leu Gln Leu Val Asp
35 40 45
Tyr Pro Ala Asp Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Lys Ser Phe
50 55 60
Gly Asn Ala Arg Ile Thr Gly Trp Tyr Ala Val Pro Asp Lys Glu Gly
65 70 75 80
Pro His Pro Ala Ile Val Lys Tyr His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp
85 90 95
Gly Glu Ile His Glu Met Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Ala
100 105 110
Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Ser Ser Glu Asp Thr Ser Ile
115 120 125
Ser Pro His Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Asp
130 135 140
Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala
145 150 155 160
Leu Glu Val Ile Ser Ser Phe Asp Glu Val Asp Glu Thr Arg Ile Gly
165 170 175
Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala Ala Ala
180 185 190
Leu Ser Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser
195 200 205
Asn Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu
210 215 220
Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Gly Ser Pro Glu Thr Glu Glu Lys
225 230 235 240
Ala Met Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala Asp Arg
245 250 255
Val Lys Val Pro Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Ile Asp Lys Val Thr
260 265 270
Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Glu Lys
275 280 285
Glu Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Tyr Ile Pro Ala Phe
290 295 300
Gln Thr Glu Lys Leu Ala Phe Phe Lys Gln His Leu Lys Gly
305 310 315
<210>9
<211>957
<212>DNA
<213>地衣芽孢杆菌ATCC 14580
<400>9
atgcagcagc cttatgatat gccgcttgaa cagctttatc agtataaacc tgaacggacg 60
gcaccggccg attttaaaga gttctggaag ggttcattgg aggaattggc aaatgaaaaa 120
gcgggaccgc agcttgaacc gcatgaatat ccggctgacg gggtaaaagt ctactggctt 180
acatacagaa gcatcggggg agcgcgaatt aaaggctggt acgcagtacc cgaccgccaa 240
gggcctcatc ctgcgatcgt caaataccac ggctataacg caagctatga cggagacatt 300
cacgatattg tcaattgggc tcttcacggc tatgcggcat tcggtatgct ggtccgcgga 360
cagaacagca gtgaagatac agagatctct catcacggac atgtacccgg ctggatgaca 420
aaaggaatcc tcgatccgaa aacatattac tacagagggg tctatttaga tgccgtacga 480
gcagtcgaag tggtcagcgg ttttgctgaa gtcgatgaaa agcggatcgg ggtgatcggg 540
gcaagccaag gaggcgggct ggccgtcgcg gtttcggcgc tgtccgatat tccaaaagca 600
gccgtgtcag aataccctta tttaagcaat tttcaacgag cgatcgatac agcgatcgac 660
cagccatatc tcgaaatcaa ctcctttttc agaagaaaca ccagtccgga tattgagcag 720
gcggccatgc ataccctgtc ttatttcgat gtcatgaacc ttgcccaatt ggtcaaagcg 780
accgtactca tgtcgatcgg actggttgac accatcactc cgccatccac cgtctttgcg 840
gcttacaatc acttggaaac ggataaagaa ataaaagtgt accgttattt tggacacgaa 900
tacatcccgc cgttccaaac cgaaaagctg gcgtttctga gaaagcatct gaaataa 957
<210>10
<211>318
<212>PRT
<213>地衣芽孢杆菌ATCC 14580
<400>10
Met Gln Gln Pro Tyr Asp Met Pro Leu Glu Gln Leu Tyr Gln Tyr Lys
1 5 10 15
Pro Glu Arg Thr Ala Pro Ala Asp Phe Lys Glu Phe Trp Lys Gly Ser
20 25 30
Leu Glu Glu Leu Ala Asn Glu Lys Ala Gly Pro Gln Leu Glu Pro His
35 40 45
Glu Tyr Pro Ala Asp Gly Val Lys Val Tyr Trp Leu Thr Tyr Arg Ser
50 55 60
Ile Gly Gly Ala Arg Ile Lys Gly Trp Tyr Ala Val Pro Asp Arg Gln
65 70 75 80
Gly Pro His Pro Ala Ile Val Lys Tyr His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr
85 90 95
Asp Gly Asp Ile His Asp Ile Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala
100 105 110
Ala Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Asn Ser Ser Glu Asp Thr Glu
115 120 125
Ile Ser His His Gly His Val Pro Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu
130 135 140
Asp Pro Lys Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg
145 150 155 160
Ala Val Glu Val Val Ser Gly Phe Ala Glu Val Asp Glu Lys Arg Ile
165 170 175
Gly Val lle Gly Ala Ser Gln Gly Gly Gly Leu Ala Val Ala Val Ser
180 185 190
Ala Leu Ser Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ser Glu Tyr Pro Tyr Leu
195 200 205
Ser Asn Phe Gln Arg Ala Ile Asp Thr Ala Ile Asp Gln Pro Tyr Leu
210 215 220
Glu Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Thr Ser Pro Asp Ile Glu Gln
225 230 235 240
Ala Ala Met His Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Val Met Asn Leu Ala Gln
245 250 255
Leu Val Lys Ala Thr Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Val Asp Thr Ile
260 265 270
Thr Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Asp
275 280 285
Lys Glu Ile Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Tyr Ile Pro Pro
290 295 300
Phe Gln Thr Glu Lys Leu Ala Phe Leu Arg Lys His Leu Lys
305 310 315
<210>11
<211>963
<212>DNA
<213>短小芽孢杆菌
<400>11
atgcaattgt tcgatttatc actagaagag ctaaaaaaat ataaaccaaa gaaaacagca 60
cgtcctgatt tctcagactt ttggaagaaa tcgctcgaag aactgcgcca agtggaggca 120
gagccaacac ttgaatctta tgactatcca gtgaaaggcg tcaaggtgta ccgcctgacg 180
tatcaaagct ttggacattc taaaattgaa ggcttttatg ctgtgcctga tcaaactggt 240
ccgcatccag cgctcgttcg ttttcatggc tataatgcca gctatgacgg cggcattcac 300
gacatcgtca actgggcgct gcacggctat gcaacatttg gtatgctcgt ccgcggtcaa 360
ggtggcagtg aagacacatc agtgacacca ggcgggcatg cattagggtg gatgacaaaa 420
ggcattttat cgaaagatac gtactattat cgaggcgttt atctagatgc tgttcgtgca 480
cttgaagtca ttcagtcttt ccccgaagta gatgaacacc gtatcggcgt gatcggtgga 540
agtcaggggg gtgcgttagc gattgcggcc gcagcccttt cagacattcc aaaagtcgtt 600
gtggcagact atccttactt atcaaatttt gagcgtgcag ttgatgttgc cttggagcag 660
ccttatttag aaatcaattc atactttcgc agaaacagtg atccgaaagt ggaggaaaag 720
gcatttgaga cattaagcta ttttgattta atcaatttag ctggatgggt gaaacagcca 780
acattgatgg cgatcggtct gattgacaaa ataaccccac catctactgt gtttgcggca 840
tacaaccatt tagaaacaga taaagacctg aaagtatatc gctattttgg acacgagttt 900
atccctgctt ttcaaacaga gaagctgtcc tttttacaaa agcatttgct tctatcaaca 960
taa 963
<210>12
<211>320
<212>PRT
<213>短小芽孢杆菌
<400>12
Met Gln Leu Phe Asp Leu Ser Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Lys Pro
1 5 10 15
Lys Lys Thr Ala Arg Pro Asp Phe Ser Asp Phe Trp Lys Lys Ser Leu
20 25 30
Glu Glu Leu Arg Gln Val Glu Ala Glu Pro Thr Leu Glu Ser Tyr Asp
35 40 45
Tyr Pro Val Lys Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Gln Ser Phe
50 55 60
Gly His Ser Lys Ile Glu Gly Phe Tyr Ala Val Pro Asp Gln Thr Gly
65 70 75 80
Pro His Pro Ala Leu Val Arg Phe His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp
85 90 95
Gly Gly Ile His Asp Ile Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Thr
100 105 110
Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gly Gly Ser Glu Asp Thr Ser Val
115 120 125
Thr Pro Gly Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Ser
130 135 140
Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala
145 150 155 160
Leu Glu Val Ile Gln Ser Phe Pro Glu Val Asp Glu His Arg Ile Gly
165 170 175
Val Ile Gly Gly Ser Gln Gly Gly Ala Leu Ala Ile Ala Ala Ala Ala
180 185 190
Leu Ser Asp Ile Pro Lys Val Val Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser
195 200 205
Asn Phe Glu Arg Ala Val Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu
210 215 220
Ile Asn Ser Tyr Phe Arg Arg Asn Ser Asp Pro Lys Val Glu Glu Lys
225 230 235 240
Ala Phe Glu Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Leu Ile Asn Leu Ala Gly Trp
245 250 255
Val Lys Gln Pro Thr Leu Met Ala Ile Gly Leu Ile Asp Lys Ile Thr
260 265 270
Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Asp Lys
275 280 285
Asp Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Phe Ile Pro Ala Phe
290 295 300
Gln Thr Glu Lys Leu Ser Phe Leu Gln Lys His Leu Leu Leu Ser Thr
305 310 315 320
<210>13
<211>963
<212>DNA
<213>热纤梭菌ATCC 27405
<400>13
atggcacaat tatatgatat gcctttggag gaattaaaaa aatataagcc tgcgcttaca 60
aaacagaaag attttgatga gttttgggaa aaaagcctta aagagctggc tgaaattcct120
ttaaaatatc aacttatacc ttatgatttt ccggcccgga gggtaaaagt tttcagagtt180
gaatatcttg gttttaaagg tgcaaatatt gaagggtggc ttgccgttcc cgagggagaa240
gggttgtatc ccgggcttgt acagtttcac ggatacaact gggcgatgga tggatgtgtt300
cccgatgtgg taaattgggc tttgaatgga tatgccgcat ttcttatgct tgttcgggga360
cagcagggaa gaagcgtgga caatattgtg cccggcagcg gtcatgcttt gggatggatg420
tcgaaaggta ttttgtcacc ggaggaatat tattatagag gagtatatat ggatgcggtt 480
cgtgctgttg aaattttggc ttcgcttcct tgtgtggatg aatcgagaat aggagtgaca 540
gggggcagcc agggtggagg acttgcactg gcggtggctg ctctgtccgg cataccgaaa 600
gttgcagccg tgcattatcc gtttctggca cattttgagc gtgccattga cgttgcgccg 660
gacggccctt atcttgaaat taacgaatat ttaagaagaa acagcggtga agaaatagaa 720
agacaggtaa agaaaaccct ttcctatttt gatatcatga atcttgctcc ccgtataaaa 780
tgccgtactt ggatttgcac tggtcttgtg gatgagatta ctcctccgtc aacggttttt 840
gcagtgtaca atcacctcaa atgcccaaag gaaatttcgg tattcagata ttttgggcat 900
gaacatatgc caggaagcgt tgaaatcaag ctgaggatac ttatggatga gctgaatccg 960
taa963
<210>14
<211>320
<212>PRT
<213>热纤梭菌ATCC 27405
<400>14
Met Ala Gln Leu Tyr Asp Met Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Lys
1 5 10 15
Pro Ala Leu Thr Lys Gln Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Glu Lys Ser
20 25 30
Leu Lys Glu Leu Ala Glu Ile Pro Leu Lys Tyr Gln Leu Ile Pro Tyr
35 40 45
Asp Phe Pro Ala Arg Arg Val Lys Val Phe Arg Val Glu Tyr Leu Gly
50 55 60
Phe Lys Gly Ala Asn Ile Glu Gly Trp Leu Ala Val Pro Glu Gly Glu
65 70 75 80
Gly Leu Tyr Pro Gly Leu Val Gln Phe His Gly Tyr Asn Trp Ala Met
85 90 95
Asp Gly Cys Val Pro Asp Val Val Asn Trp Ala Leu Asn Gly Tyr Ala
100 105 110
Ala Phe Leu Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Gly Arg Ser Val Asp Asn
115 120 125
Ile Val Pro Gly Ser Gly His Ala Leu Gly Trp Met Ser Lys Gly Ile
130 135 140
Leu Ser Pro Glu Glu Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Met Asp Ala Val
145 150 155 160
Arg Ala Val Glu Ile Leu Ala Ser Leu Pro Cys Val Asp Glu Ser Arg
165 170 175
Ile Gly Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Ala Leu Ala Val
180 185 190
Ala Ala Leu Ser Gly Ile Pro Lys Val Ala Ala Val His Tyr Pro Phe
195 200 205
Leu Ala His Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Pro Asp Gly Pro Tyr
210 215 220
Leu Glu Ile Asn Glu Tyr Leu Arg Arg Asn Ser Gly Glu Glu Ile Glu
225 230 235 240
Arg Gln Val Lys Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala
245 250 255
Pro Arg Ile Lys Cys Arg Thr Trp Ile Cys Thr Gly Leu Val Asp Glu
260 265 270
Ile Thr Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Val Tyr Asn His Leu Lys Cys
275 280 285
Pro Lys Glu Ile Ser Val Phe Arg Tyr Phe Gly His Glu His Met Pro
290 295 300
Gly Ser Val Glu Ile Lys Leu Arg Ile Leu Met Asp Glu Leu Asn Pro
305 310 315 320
<210>15
<211>978
<212>DNA
<213>那不勒斯栖热袍菌
<400>15
atggccttct tcgatatgcc ccttgaggaa ctgaaaaagt accggcctga aaggtacgag60
gagaaagatt tcgatgagtt ctggagggaa acacttaaag aaagcgaagg attccctctg120
gatcccgtct ttgaaaaggt ggactttcat ctcaaaacgg ttgaaacgta cgatgttact180
ttctctggat acagggggca gagaataaag ggctggcttc ttgttccgaa gttggcggaa240
gaaaagcttc catgcgtcgt gcagtacata ggttacaatg gtggaagggg ttttccacac300
gactggctgt tctggccgtc aatgggttac atctgttttg tcatggacac cagggggcag360
ggaagcggct ggatgaaggg agacacaccg gattaccctg agggtccagt cgatccacag420
taccccggat tcatgacgag gggcattctg gatccgggaa cctattacta caggcgagtc480
ttcgtggatg cggtcagggc ggtggaagca gccatttcct tcccgagagt ggattccagg540
aaggtggtgg tggccggagg cagtcagggt gggggaatcg cccttgcggt gagtgccctg600
tcgaacaggg tgaaggctct gctctgcgat gtgccgtttc tgtgccactt cagaagggcc660
gtgcaacttg tcgacacaca cccatacgtg gagatcacca acttcctcaa aacccacagg720
gacaaagagg agattgtttt cagaacactt tcctacttcg atggtgtgaa ctttgcagca780
agggcaaagg tgcccgccct gttttccgtt gggctcatgg acaccatctg tcctccctcg840
acggtcttcg ccgcttacaa ccactacgcc ggtccaaagg agatcagaat ctatccgtac900
aacaaccacg aaggtggagg ttctttccag gcaattgagc aggtgaaatt cttgaagaga960
ctatttgagg aaggctag 978
<210>16
<211>325
<212>PRT
<213>那不勒斯栖热袍菌
<400>16
Met Ala Phe Phe Asp Met Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro
1 5 10 15
Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Arg Glu Thr Leu
20 25 30
Lys Glu Ser Glu Gly Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Lys Val Asp
35 40 45
Phe His Leu Lys Thr Val Glu Thr Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr
50 55 60
Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Ala Glu
65 70 75 80
Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg
85 90 95
Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys
100 105 110
Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Met Lys Gly Asp
115 120 125
Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Gly Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe
130 135 140
Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Gly Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val
145 150 155 160
Phe Val Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ile Ser Phe Pro Arg
165 170 175
Val Asp Ser Arg Lys Val Val Val Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly
180 185 190
Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Asn Arg Val Lys Ala Leu Leu
195 200 205
Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val
210 215 220
Asp Thr His Pro Tyr Val Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg
225 230 235 240
Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val
245 250 255
Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Val Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu
260 265 270
Met Asp Thr Ile Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His
275 280 285
Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu
290 295 300
Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Ile Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Arg
305 310 315 320
Leu Phe Glu Glu Gly
325
<210>17
<211>978
<212>DNA
<213>海栖热袍菌MSB8
<400>17
atggccttct tcgatttacc actcgaagaa ctgaagaaat atcgtccaga gcggtacgaa 60
gagaaagact tcgatgagtt ctgggaagag acactcgcag agagcgaaaa gttcccctta 120
gaccccgtct tcgagaggat ggagtctcac ctcaaaacag tcgaagcgta cgatgtcacc 180
ttctccggat acaggggaca gaggatcaaa gggtggctcc ttgttccaaa actggaagaa 240
gaaaaacttc cctgcgttgt gcagtacata ggatacaacg gtggaagagg attccctcac 300
gactggctgt tctggccttc tatgggttac atatgtttcg tcatggatac tcgaggtcag 360
ggaagcggct ggctgaaagg agacacaccg gattaccctg agggtcccgt tgaccctcag 420
tatccaggat tcatgacaag aggaatactg gatcccagaa cttactacta cagacgagtc 480
ttcacggacg ctgtcagagc cgttgaagct gctgcttctt ttcctcaggt agatcaagaa 540
agaatcgtga tagctggagg cagtcagggt ggcggaatag cccttgcggt gagcgctctc 600
tcaaagaaag caaaggctct tctgtgcgat gtgccgtttc tgtgtcactt cagaagagca 660
gtacagcttg tggatacgca tccatacgcg gagatcacga actttctaaa gacccacaga 720
gacaaggaag aaatcgtgtt caggactctt tcctatttcg atggagtgaa cttcgcagcc 780
agagcgaaga tccctgcgct gttttctgtg ggtctcatgg acaacatttg tcctccttca 840
acggttttcg ctgcctacaa ttactacgct ggaccgaagg aaatcagaat ctatccgtac 900
aacaaccacg agggaggagg ctctttccaa gcggttgaac aggtgaaatt cttgaaaaaa 960
ctatttgaga aaggctaa978
<210>18
<211>325
<212>PRT
<213>海栖热袍菌MSB8
<400>18
Met Ala Phe Phe Asp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro
1 5 10 15
Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Glu Glu Thr Leu
20 25 30
Ala Glu Ser Glu Lys Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Arg Met Glu
35 40 45
Ser His Leu Lys Thr Val Glu Ala Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr
50 55 60
Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Glu Glu
65 70 75 80
Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg
85 90 95
Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys
100 105 110
Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Leu Lys Gly Asp
115 120 125
Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Gly Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe
130 135 140
Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val
145 150 155 160
Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ala Ser Phe Pro Gln
165 170 175
Val Asp Gln Glu Arg Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly
180 185 190
Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Leu Leu
195 200 205
Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val
210 215 220
Asp Thr His Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg
225 230 235 240
Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val
245 250 255
Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu
260 265 270
Met Asp Asn Ile Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Tyr
275 280 285
Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu
290 295 300
Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Val Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Lys
305 310 315 320
Leu Phe Glu Lys Gly
325
<210>19
<211>963
<212>DNA
<213>热厌氧芽孢杆菌属
<400>19
atgggacttt tcgacatgcc attacaaaaa cttagagaat acactggtac aaatccatgc 60
cctgaagatt tcgatgagta ttggaatagg gctttagatg agatgaggtc agttgatcct 120
aaaattgaat tgaaagaaag tagctttcaa gtatcctttg cagaatgcta tgacttgtac 180
tttacaggtg ttcgtggtgc cagaattcat gcaaagtata taaaacctaa gacagaaggg 240
aaacatccag cgttgataag atttcatgga tattcgtcaa attcaggcga ctggaacgac 300
aaattaaatt acgtggcggc aggcttcacc gttgtggcta tggatgtaag aggtcaagga 360
gggcagtctc aagatgttgg cggtgtaact gggaatactt taaatgggca tattataaga 420
gggctagacg atgatgctga taatatgctt ttcaggcata ttttcttaga cactgcccaa 480
ttggctggaa tagttatgaa catgccagaa gttgatgaag atagagtggg agtcatggga 540
ccttctcaag gcggagggct gtcgttggcg tgtgctgcat tggagccaag ggtacgcaaa 600
gtagtatctg aatatccttt tttatctgac tacaagagag tttgggactt agaccttgca 660
aaaaacgcct atcaagagat tacggactat ttcaggcttt ttgacccaag gcatgaaagg 720
gagaatgagg tatttacaaa gcttggatat atagacgtta aaaaccttgc gaaaaggata 780
aaaggcgatg tcttaatgtg cgttgggctt atggaccaag tatgtccgcc atcaactgtt 840
tttgcagcct acaacaacat acagtcaaaa aaagatataa aagtgtatcc tgattatgga 900
catgaaccta tgagaggatt tggagattta gcgatgcagt ttatgttgga actatattca 960
taa963
<210>20
<211>320
<212>PRT
<213>热厌氧芽孢杆菌属.
<400>20
Met Gly Leu Phe Asp Met Pro Leu Gln Lys Leu Arg Glu Tyr Thr Gly
1 5 10 15
Thr Asn Pro Cys Pro Glu Asp Phe Asp Glu Tyr Trp Asn Arg Ala Leu
20 25 30
Asp Glu Met Arg Ser Val Asp Pro Lys Ile Glu Leu Lys Glu Ser Ser
35 40 45
Phe Gln Val Ser Phe Ala Glu Cys Tyr Asp Leu Tyr Phe Thr Gly Val
50 55 60
Arg Gly Ala Arg Ile His Ala Lys Tyr Ile Lys Pro Lys Thr Glu Gly
65 70 75 80
Lys His Pro Ala Leu Ile Arg Phe His Gly Tyr Ser Ser Asn Ser Gly
85 90 95
Asp Trp Asn Asp Lys Leu Asn Tyr Val Ala Ala Gly Phe Thr Val Val
100 105 110
Ala Met Asp Val Arg Gly Gln Gly Gly Gln Ser Gln Asp Val Gly Gly
115 120 125
Val Thr Gly Asn Thr Leu Asn Gly His Ile Ile Arg Gly Leu Asp Asp
130 135 140
Asp Ala Asp Asn Met Leu Phe Arg His Ile Phe Leu Asp Thr Ala Gln
145 150 155 160
Leu Ala Gly Ile Val Met Asn Met Pro Glu Val Asp Glu Asp Arg Val
165 170 175
Gly Val Met Gly Pro Ser Gln Gly Gly Gly Leu Ser Leu Ala Cys Ala
180 185 190
Ala Leu Glu Pro Arg Val Arg Lys Val Val Ser Glu Tyr Pro Phe Leu
195 200 205
Ser Asp Tyr Lys Arg Val Trp Asp Leu Asp Leu Ala Lys Asn Ala Tyr
210 215 220
Gln Glu Ile Thr Asp Tyr Phe Arg Leu Phe Asp Pro Arg His Glu Arg
225 230 235 240
Glu Asn Glu Val Phe Thr Lys Leu Gly Tyr Ile Asp Val Lys Asn Leu
245 250 255
Ala Lys Arg Ile Lys Gly Asp Val Leu Met Cys Val Gly Leu Met Asp
260 265 270
Gln Val Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Asn Ile Gln
275 280 285
Ser Lys Lys Asp Ile Lys Val Tyr Pro Asp Tyr Gly His Glu Pro Met
290 295 300
Arg Gly Phe Gly Asp Leu Ala Met Gln Phe Met Leu Glu Leu Tyr Ser
305 310 315 320
<210>21
<211>1023
<212>DNA
<213>芽孢杆菌属NRRL B-14911
<400>21
atgaggacgg ttcctgctcc tgtttttttg gagaggagtg gggagatgaa cctttttgat 60
atgccccttg aggagctgca gcattacaag cctgcccaga ccaggcagga tgattttgag 120
tcattctgga aaaagcggat tgaggagaac agtcaatatc cgctgaatat agaagtaatg 180
gagcgggttt atccggttcc gggagtgaga gtatatgata tttattttga cgggttccgg 240
aattcccgca tccatggggt gtatgttact ccagaaactc cgggagcgga cactcctgcg 300
gcagtgattt ttcacggcta taactggaac acgctgcagc cgcattacag cttcaagcac 360
gtgattcagg ggattcctgt actgatggtg gaggtgcggg gacaaaatct cttgtctcca 420
gatagaaatc attatgggaa tggaggtccg ggaggctgga tgacactcgg cgtgatggat 480
cccgatcaat attattacag cctggtatat atggactgct tccgcagcat tgatgctgtc 540
agggaactgt cgaggaagag aagtgtgttt gtggaaggcg gaagccaggg aggtgcactg 600
gcgattgccg cagccgccct gcaggatgac atcctgcttg cactcgccga catccctttt 660
ctcacccatt tcaagcgttc cgtggagctt tcctcggatg gaccgtatca ggagatttcc 720
cactacttca aagttcatga tcctcttcat caaacggaag agcaggtata tcagacgctc 780
agctatgtgg actgcatgaa catggccagc atggttgaat gtccagtcct tctttcagcc 840
ggtctggaag acatcgtttg tcccccgtcc agtgcatttg cactgttcaa ccatctcggc 900
gggccaaaag aaatacgggc ctatccggaa tacgcccatg aagtaccggc tgtccatgaa 960
gaggaaaagc tgaagtttat atcttcaagg ctaaaaaata gagaaaagag gtgccggcca 1020
tga1023
<210>22
<211>340
<212>PRT
<213>芽孢杆菌属NRRL B-14911
<400>22
Met Arg Thr Val Pro Ala Pro Val Phe Leu Glu Arg Ser Gly Glu Met
1 5 10 15
Asn Leu Phe Asp Met Pro Leu Glu Glu Leu Gln His Tyr Lys Pro Ala
20 25 30
Gln Thr Arg Gln Asp Asp Phe Glu Ser Phe Trp Lys Lys Arg Ile Glu
35 40 45
Glu Asn Ser Gln Tyr Pro Leu Asn Ile Glu Val Met Glu Arg Val Tyr
50 55 60
Pro Val Pro Gly Val Arg Val Tyr Asp Ile Tyr Phe Asp Gly Phe Arg
65 70 75 80
Asn Ser Arg Ile His Gly Val Tyr Val Thr Pro Glu Thr Pro Gly Ala
85 90 95
Asp Thr Pro Ala Ala Val Ile Phe His Gly Tyr Asn Trp Asn Thr Leu
100 105 110
Gln Pro His Tyr Ser Phe Lys His Val Ile Gln Gly Ile Pro Val Leu
115 120 125
Met Val Glu Val Arg Gly Gln Asn Leu Leu Ser Pro Asp Arg Asn His
130 135 140
Tyr Gly Asn Gly Gly Pro Gly Gly Trp Met Thr Leu Gly Val Met Asp
145 150 155 160
Pro Asp Gln Tyr Tyr Tyr Ser Leu Val Tyr Met Asp Cys Phe Arg Ser
165 170 175
Ile Asp Ala Val Arg Glu Leu Ser Arg Lys Arg Ser Val Phe Val Glu
180 185 190
Gly Gly Ser Gln Gly Gly Ala Leu Ala Ile Ala Ala Ala Ala Leu Gln
195 200 205
Asp Asp Ile Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ile Pro Phe Leu Thr His Phe
210 215 220
Lys Arg Ser Val Glu Leu Ser Ser Asp Gly Pro Tyr Gln Glu Ile Ser
225 230 235 240
His Tyr Phe Lys Val His Asp Pro Leu His Gln Thr Glu Glu Gln Val
245 250 255
Tyr Gln Thr Leu Ser Tyr Val Asp Cys Met Asn Met Ala Ser Met Val
260 265 270
Glu Cys Pro Val Leu Leu Ser Ala Gly Leu Glu Asp Ile Val Cys Pro
275 280 285
Pro Ser Ser Ala Phe Ala Leu Phe Asn His Leu Gly Gly Pro Lys Glu
290 295 300
Ile Arg Ala Tyr Pro Glu Tyr Ala His Glu Val Pro Ala Val His Glu
305 310 315 320
Glu Glu Lys Leu Lys Phe Ile Ser Ser Arg Leu Lys Asn Arg Glu Lys
325 330 335
Arg Cys Arg Pro
340
<210>23
<211>960
<212>DNA
<213>喜盐芽孢杆菌C-125
<400>23
ttagagatca gataaaaatt gaaaaatccg atcacgatgg cctggcaaat cttcgtgagc 60
aaagtctgga tataactcga tactttttgt cgtcgtgagt ttgttataca tggcaaattg 120
tgtagacggc gggcaaaccg tatccattaa cccaacagca agtaagactt ctccctttac 180
gagtggagca agatgctgaa tatcaatata gcctagcttc gtaaagattt cagcctcacg 240
tcggtgctgt ggatcaaagc gacgaaaata cgtttgcaat tcgtcataag ctttctcggc 300
taaatccatc tcccatacgc gttggtaatc gctaaggaaa ggataaacag gagctacctt 360
tttaattttc ggttccaaag ccgcacaagc aatcgctaag gcccctcctt gtgaccaacc 420
tgtcactgcc acgcgctctt catcgacttc aggaaggttc atcacaatgt tggcaagctg 480
agccgtatca agaaacacat gacggaacaa taattgatca gcattatcat cgagtccgcg 540
tattatatga ccggaatgag tattcccctt cacgcctcct gtgtcttcag acaagcctcc 600
ttgcccgcga acgtccattg caagaacaga atatccgagg gctgcgtaat gaagtaaacc 660
cgtccattcc cccgcattca tcgtatatcc gtgaaaatga ataaccgccg ggtgtgtccc 720
gctcgtgtgt cttgggcgca cgtattttgc gtgaattcta gcacccctaa cccctgtaaa 780
atataggtgg aagcattctg catacgtggt ttgaaaatca ctcggtatga gctctacgtt 840
tggatttacc tttctcatct cttgtaaagc acgatcccaa tactcagtaa agtcatctgg 900
ctttggatta cgtcccatgt actcttttaa ttcggttaac ggcatgtcta ttagtggcat 960
<210>24
<211>319
<212>PRT
<213>喜盐芽孢杆菌C-125
<400>24
Met Pro Leu Ile Asp Met Pro Leu Thr Glu Leu Lys Glu Tyr Met Gly
1 5 10 15
Arg Asn Pro Lys Pro Asp Asp Phe Thr Glu Tyr Trp Asp Arg Ala Leu
20 25 30
Gln Glu Met Arg Lys Val Asn Pro Asn Val Glu Leu Ile Pro Ser Asp
35 40 45
Phe Gln Thr Thr Tyr Ala Glu Cys Phe His Leu Tyr Phe Thr Gly Val
50 55 60
Arg Gly Ala Arg Ile His Ala Lys Tyr Val Arg Pro Arg His Thr Ser
65 70 75 80
Gly Thr His Pro Ala Val Ile His Phe His Gly Tyr Thr Met Asn Ala
85 90 95
Gly Glu Trp Thr Gly Leu Leu His Tyr Ala Ala Leu Gly Tyr Ser Val
100 105 110
Leu Ala Met Asp Val Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ser Glu Asp Thr Gly
115 120 125
Gly Val Lys Gly Asn Thr His Ser Gly His Ile Ile Arg Gly Leu Asp
130 135 140
Asp Asn Ala Asp Gln Leu Leu Phe Arg His Val Phe Leu Asp Thr Ala
145 150 155 160
Gln Leu Ala Asn Ile Val Met Asn Leu Pro Glu Val Asp Glu Glu Arg
165 170 175
Val Ala Val Thr Gly Trp Ser Gln Gly Gly Ala Leu Ala Ile Ala Cys
180 185 190
Ala Ala Leu Glu Pro Lys Ile Lys Lys Val Ala Pro Val Tyr Pro Phe
195 200 205
Leu Ser Asp Tyr Gln Arg Val Trp Glu Met Asp Leu Ala Glu Lys Ala
210 215 220
Tyr Asp Glu Leu Gln Thr Tyr Phe Arg Arg Phe Asp Pro Gln His Arg
225 230 235 240
Arg Glu Ala Glu Ile Phe Thr Lys Leu Gly Tyr Ile Asp Ile Gln His
245 250 255
Leu Ala Pro Leu Val Lys Gly Glu Val Leu Leu Ala Val Gly Leu Met
260 265 270
Asp Thr Val Cys Pro Pro Ser Thr Gln Phe Ala Met Tyr Asn Lys Leu
275 280 285
Thr Thr Thr Lys Ser Ile Glu Leu Tyr Pro Asp Phe Ala His Glu Asp
290 295 300
Leu Pro Gly His Arg Asp Arg Ile Phe Gln Phe Leu Ser Asp Leu
305 310 315
<210>25
<211>954
<212>DNA
<213>克劳氏芽孢杆菌KSM-K16
<400>25
atgccattag tcgatatgcc gttgcgcgag ttgttagctt atgaaggaat aaaccctaaa 60
ccagcagatt ttgaccaata ctggaaccgg gccaaaacgg aaattgaagc gattgatccc 120
gaagtcactc tagtcgaatc ttctttccag tgttcgtttg caaactgtta ccatttctat 180
tatcgaagcg ctggaaatgc aaaaatccat gcgaaatacg tacagccaaa agcaggggag 240
aagacgccag cagtttttat gttccatggg tatggggggc gttcagccga atggagcagc 300
ttgttaaatt atgtagcggc gggtttttct gttttctata tggacgtgcg tggacaaggt 360
ggaacttcag aggatcctgg gggcgtaagg gggaatacat ataggggcca cattattcgc 420
ggcctcgatg ccgggccaga cgcacttttt taccgcagcg ttttcttgga caccgtccaa 480
ttggttcgtg ctgctaaaac attgcctcac atcgataaaa cacggcttat ggccacaggg 540
tggtcgcaag ggggcgcctt aacgcttgcc tgtgctgccc ttgttcctga aatcaagcgt 600
cttgctccag tatacccgtt tttaagcgat tacaagcgag tgtggcaaat ggatttagcg 660
gttcgttcgt ataaagaatt ggctgattat ttccgttcat acgatccgca acataaacgc 720
catggcgaaa tttttgaacg ccttggctac atcgatgtcc agcatcttgc tgaccggatt 780
caaggagatg tcctaatggg agttggttta atggatacag aatgcccgcc gtctacccaa 840
tttgctgctt ataataaaat aaaggctaaa aaatcgtatg agctctatcc tgattttggc 900
catgagcacc ttccaggaat gaacgatcat atttttcgct ttttcactag ttga954
<210>26
<211>317
<212>PRT
<213>克劳氏芽孢杆菌KSM-K16
<400>26
Met Pro Leu Val Asp Met Pro Leu Arg Glu Leu Leu Ala Tyr Glu Gly
1 5 10 15
Ile Asn Pro Lys Pro Ala Asp Phe Asp Gln Tyr Trp Asn Arg Ala Lys
20 25 30
Thr Glu Ile Glu Ala Ile Asp Pro Glu Val Thr Leu Val Glu Ser Ser
35 40 45
Phe Gln Cys Ser Phe Ala Asn Cys Tyr His Phe Tyr Tyr Arg Ser Ala
50 55 60
Gly Asn Ala Lys Ile His Ala Lys Tyr Val Gln Pro Lys Ala Gly Glu
65 70 75 80
Lys Thr Pro Ala Val Phe Met Phe His Gly Tyr Gly Gly Arg Ser Ala
85 90 95
Glu Trp Ser Ser Leu Leu Asn Tyr Val Ala Ala Gly Phe Ser Val Phe
100 105 110
Tyr Met Asp Val Arg Gly Gln Gly Gly Thr Ser Glu Asp Pro Gly Gly
115 120 125
Val Arg Gly Asn Thr Tyr Arg Gly His Ile Ile Arg Gly Leu Asp Ala
130 135 140
Gly Pro Asp Ala Leu Phe Tyr Arg Ser Val Phe Leu Asp Thr Val Gln
145 150 155 160
Leu Val Arg Ala Ala Lys Thr Leu Pro His Ile Asp Lys Thr Arg Leu
165 170 175
Met Ala Thr Gly Trp Ser Gln Gly Gly Ala Leu Thr Leu Ala Cys Ala
180 185 190
Ala Leu Val Pro Glu Ile Lys Arg Leu Ala Pro Val Tyr Pro Phe Leu
195 200 205
Ser Asp Tyr Lys Arg Val Trp Gln Met Asp Leu Ala Val Arg Ser Tyr
210 215 220
Lys Glu Leu Ala Asp Tyr Phe Arg Ser Tyr Asp Pro Gln His Lys Arg
225 230 235 240
His Gly Glu Ile Phe Glu Arg Leu Gly Tyr Ile Asp Val Gln His Leu
245 250 255
Ala Asp Arg Ile Gln Gly Asp Val Leu Met Gly Val Gly Leu Met Asp
260 265 270
Thr Glu Cys Pro Pro Ser Thr Gln Phe Ala Ala Tyr Asn Lys Ile Lys
275 280 285
Ala Lys Lys Ser Tyr Glu Leu Tyr Pro Asp Phe Gly His Glu His Leu
290 295 300
Pro Gly Met Asn Asp His Ile Phe Arg Phe Phe Thr Ser
305 310 315
<210>27
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>27
taactgcagt aaggaggaat aggacatgcaactattcgat ctgccgctc49
<210>28
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>28
tgatctagat tatcagcctt taagatgctg cttaa 35
<210>29
<211>994
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>29
taactgcagt aaggaggaat aggacatgca actattcgat ctgccgctcg accaattgca 60
aacatataag cctgaaaaaa cagcaccgaa agatttttct gagttttgga aattgtcttt120
ggaggaactt gcaaaagtcc aagcagaacc tgatttacag ccggttgact atcctgctga180
cggagtaaaa gtgtaccgtc tcacatataa aagcttcgga aacgcccgca ttaccggatg 240
gtacgcggtg cctgacaagc aaggcccgca tccggcgatc gtgaaatatc atggctacaa 300
tgcaagctat gatggtgaga ttcatgaaat ggtaaactgg gcactccatg gctacgccgc 360
attcggcatg cttgtccgcg gccagcagag cagcgaggat acgagtattt cactgcacgg 420
tcacgctttg ggctggatga cgaaaggaat tcttgataaa gatacatact attaccgcgg 480
tgtttatttg gacgccgtcc gcgcgcttga ggtcatcagc agcttcgacg aggttgacga 540
aacaaggatc ggtgtgacag gaggaagcca aggcggaggt ttaaccattg ccgcagcagc 600
gctgtcagac attccaaaag ccgcggttgc cgattatcct tatttaagca acttcgaacg 660
ggccattgat gtggcgcttg aacagccgta ccttgaaatc aattccttct tcagaagaaa 720
tggcagcccg gaaacagaag tgcaggcgat gaagacactt tcatatttcg atattatgaa 780
tctcgctgac cgagtgaagg tgcctgtcct gatgtcaatc ggcctgattg acaaggtcac 840
gccgccgtcc accgtgtttg ccgcctacaa tcatttggaa acagagaaag agctgaaggt 900
gtaccgctac ttcggacatg agtatatccc tgcttttcaa acggaaaaac ttgctttctt 960
taagcagcat cttaaaggct gataatctag atca 994
<210>30
<211>994
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>30
taactgcagt aaggaggaat aggacatgca actattcgat ctgccgctcg accaattgca 60
aacatataag cctgaaaaaa cagcaccgaa agatttttct gagttttgga aattgtcttt 120
ggaggaactt gcaaaagtcc aagcagaacc tgatttacag ccggttgact atcctgctga 180
cggagtaaaa gtgtaccgtc tcacatataa aagcttcgga aacgcccgca ttaccggatg 240
gtacgcggtg cctgacaagg aaggcccgca tccggcgatc gtgaaatatc atggctacaa 300
tgcaagctat gatggtgaga ttcatgaaat ggtaaactgg gcactccatg gctacgccac 360
attcggcatg cttgtccgcg gccagcagag cagcgaggat acgagtattt caccgcacgg 420
tcacgctttg ggctggatga cgaaaggaat tcttgataaa gatacatact attaccgcgg 480
tgtttatttg gacgccgtcc gcgcgcttga ggtcatcagc agcttcgacg aggttgacga 540
aacaaggatc ggtgtgacag gaggaagcca aggcggaggt ttaaccattg ccgcagcagc 600
gctgtcagac attccaaaag ccgcggttgc cgattatcct tatttaagca acttcgaacg 660
ggccattgat gtggcgcttg aacagccgta ccttgaaatc aattccttct tcagaagaaa 720
tggcagcccg gaaacagaag tgcaggcgat gaagacactt tcatatttcg atattatgaa 780
tctcgctgac cgagtgaagg tgcctgtcct gatgtcaatc ggcctgattg acaaggtcac 840
gccgccgtcc accgtgtttg ccgcctacaa tcatttggaa acaaagaaag agctgaaggt 900
gtaccgctac ttcggacatg agtatatccc tgcttttcaa actgaaaaac ttgctttctt 960
taagcagcat cttaaaggct gataatctag atca 994
<210>31
<211>960
<212>DNA
<213>枯草芽孢杆菌ATCC 29233
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(960)
<400>31
atg caa cta ttc gat ctg ccg ctc gac caa ttg caa aca tat aag cct 48
Met Gln Leu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Gln Leu Gln Thr Tyr Lys Pro
1 5 10 15
gaa aaa aca gca ccg aaa gat ttt tct gag ttt tgg aaa ttg tct ttg 96
Glu Lys Thr Ala Pro Lys Asp Phe Ser Glu Phe Trp Lys Leu Ser Leu
20 25 30
gag gaa ctt gca aaa gtc caa gca gaa cct gat cta cag ccg gtt gac144
Glu Glu Leu Ala Lys Val Gln Ala Glu Pro Asp Leu Gln Pro Val Asp
35 40 45
tat cct gct gac gga gta aaa gtg tac cgt ctc aca tat aaa agc ttc192
Tyr Pro Ala Asp Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Lys Ser Phe
50 55 60
gga aac gcc cgc att acc gga tgg tac gcg gtg cct gac aag caa ggc240
Gly Asn Ala Arg Ile Thr Gly Trp Tyr Ala Val Pro Asp Lys Gln Gly
65 70 75 80
ccg cat ccg gcg atc gtg aaa tat cat ggc tac aat gca agc tat gat288
Pro His Pro Ala Ile Val Lys Tyr His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp
85 90 95
ggt gag att cat gaa atg gta aac tgg gca ctc cat ggc tac gcc gca336
Gly Glu Ile His Glu Met Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Ala
100 105 110
ttc ggc atg ctt gtc cgc ggc cag cag agc agc gag gat acg agt att384
Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Ser Ser Glu Asp Thr Ser Ile
115 120 125
tca ccg cac ggt cac gct ttg ggc tgg atg acg aaa gga att crt gat432
Ser Pro His Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Asp
130 135 140
aaa gat aca tac tat tac cgc ggt gtt tat ttg gac gcc gtc cgc gcg480
Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala
145 150 155 160
ctt gag gtc atc agc agc ttc gac gag gtt gac gaa aca agg atc ggt528
Leu Glu Val Ile Ser Ser Phe Asp Glu Val Asp Glu Thr Arg Ile Gly
165 170 175
gtg aca gga gga agc caa ggc gga ggt tta acc att gcc gca gca gcg576
Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala Ala Ala
180 185 190
ctg tca gac att cca aaa gcc gcg gtt gcc gat tat cct tat tta agc624
Leu Ser Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser
195 200 205
aac ttc gaa cgg gcc att gat gtg gcg ctt gaa cag ccg tac ctt gaa672
Asn Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu
210 215 220
atc aat tcc ttc ttc aga aga aat ggc agc ccg gaa aca gaa gtg cag720
Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Gly Ser Pro Glu Thr Glu Val Gln
225 230 235 240
gcg atg aag aca ctt tca tat ttc gat att atg aat ctc gct gac cga768
Ala Met Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala Asp Arg
245 250 255
gtg aag gtg cct gtc ctg atg tca atc ggc ctg att gac aag gtc acg816
Val Lys Val Pro Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Ile Asp Lys Val Thr
260 265 270
ccg cca tcc acc gtg ttt gcc gcc tac aat cat ttg gaa aca gag aaa864
Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Glu Lys
275 280 285
gag ctg aag gtg tac cgc tac ttc gga cat gag tat atc cct gct ttt912
Glu Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Tyr Ile Pro Ala Phe
290 295 300
caa acg gaa aaa ctt gct ttc ttt aag cag cat ctt aaa ggc tga taa960
Gln Thr Glu Lys Leu Ala Phe Phe Lys Gln His Leu Lys Gly
305 310 315
<210>32
<211>318
<212>PRT
<213>枯草芽孢杆菌ATCC 29233
<400>32
Met Gln Leu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Gln Leu Gln Thr Tyr Lys Pro
1 5 10 15
Glu Lys Thr Ala Pro Lys Asp Phe Ser Glu Phe Trp Lys Leu Ser Leu
20 25 30
Glu Glu Leu Ala Lys Val Gln Ala Glu Pro Asp Leu Gln Pro Val Asp
35 40 45
Tyr Pro Ala Asp Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Lys Ser Phe
50 55 60
Gly Asn Ala Arg Ile Thr Gly Trp Tyr Ala Val Pro Asp Lys Gln Gly
65 70 75 80
Pro His Pro Ala Ile Val Lys Tyr His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp
85 90 95
Gly Glu Ile His Glu Met Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Ala
100 105 110
Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Ser Ser Glu Asp Thr Ser Ile
115 120 125
Ser Pro His Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Asp
130 135 140
Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala
145 150 155 160
Leu Glu Val Ile Ser Ser Phe Asp Glu Val Asp Glu Thr Arg Ile Gly
165 170 175
Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala Ala Ala
180 185 190
Leu Ser Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser
195 200 205
Asn Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu
210 215 220
Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Gly Ser Pro Glu Thr Glu Val Gln
225 230 235 240
Ala Met Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala Asp Arg
245 250 255
Val Lys Val Pro Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Ile Asp Lys Val Thr
260 265 270
Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Glu Lys
275 280 285
Glu Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Tyr Ile Pro Ala Phe
290 295 300
Gln Thr Glu Lys Leu Ala Phe Phe Lys Gln His Leu Lys Gly
305 310 315
<210>33
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>33
atgcagcagc cttatgatgt gccg24
<210>34
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>34
ttatttcaga tgctttctca gaaac 25
<210>35
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>35
atggcacaat tatatgatat gcctttg 27
<210>36
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>36
ttacggattc agctcatcca taagtatc 28
<210>37
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>37
atgcagctgt ttgacctgag cctg 24
<210>38
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>38
ttaggtggac agcagcaggt gcttttg27
<210>39
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>39
atggctttct ttgacatgcc gctg24
<210>40
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>40
ttagccttct tcgaacaggc gtttcag 27
<210>41
<211>978
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>41
atggctttct ttgacatgcc gctggaagaa ctgaaaaagt accgtccgga acgttacgag 60
gaaaaagact ttgacgaatt ttggcgcgaa accctgaaag aatccgaggg tttcccactg120
gacccggtat ttgaaaaagt tgacttccac ctgaagaccg tcgaaactta cgacgtcacc180
ttcagcggtt atcgtggcca gcgtatcaaa ggttggctgc tggtaccgaa actggcggaa240
gagaaactgc cgtgtgttgt tcagtacatt ggttacaacg gtggccgtgg tttcccgcac300
gactggctgt tctggccgtc tatgggttac atctgcttcg ttatggacac ccgtggtcag360
ggtagcggtt ggatgaaggg tgatactccg gactacccgg aaggtccggt ggacccgcag420
tacccgggct tcatgacgcg cggcatcctg gatcctggca cctattacta ccgtcgtgtg480
tttgtcgatg ccgtgcgcgc cgttgaagcc gctatcagct tcccacgcgt cgattctcgt540
aaagtggtag ttgctggtgg ctctcaaggt ggcggcattg cactggcagt ttccgcgctg600
tccaaccgtg ttaaagccct gctgtgcgat gttccgttcc tgtgccactt ccgtcgtgcg660
gtacagctgg tggacaccca cccgtacgta gaaattacga acttcctgaa aacccatcgt720
gataaagaag agatcgtatt ccgtaccctg tcttactttg atggcgttaa ttttgcggct780
cgtgcaaaag taccggcgct gttcagcgta ggtctgatgg acactatttg tccgccgtct840
accgtattcg cagcctacaa ccactacgct ggtccgaaag aaatccgcat ctacccgtac900
aacaaccacg aaggtggtgg ttctttccag gcaatcgaac aggttaaatt cctgaaacgc960
ctgttcgaag aaggctaa 978
<210>42
<211>795
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>42
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg180
caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa480
gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt780
gacgagttct tctaa 795
<210>43
<211>3434
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pKD13
<400>43
agattgcagc attacacgtc ttgagcgatt gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta 60
tactttctag agaataggaa cttcggaata ggaacttcaa gatcccctta ttagaagaac 120
tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc 180
acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg ggtagccaac 240
gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag 300
cggccatttt ccaccatgat attcggcaag caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc 360
tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga 420
tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc 480
tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc 540
cgccgcattg catcagccat gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg 600
agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg 660
tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg 720
tcctgcagtt cattcagggc accggacagg tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc 780
tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca 840
tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca 900
atcatgcgaa acgatcctca tcctgtctct tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag 960
atccttggcg gcaagaaagc catccagttt actttgcagg gcttcccaac cttaccagag1020
ggcgccccag ctggcaattc cggttcgctt gctgtccata aaaccgccca gtctagctat1080
cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc1140
cagatagccc agtagctgac attcatccgg ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc1200
tacgtgttcc gcttccttta gcagcccttg cgccctgagt gcttgcggca gcgtgagctt1260
caaaagcgct ctgaagttcc tatactttct agagaatagg aacttcgaac tgcaggtcga1320
cggatccccg gaattaattc tcatgtttga cagcttatca ctgatcagtg aattaatggc1380
gatgacgcat cctcacgata atatccgggt aggcgcaatc actttcgtct ctactccgtt1440
acaaagcgag gctgggtatt tcccggcctt tctgttatcc gaaatccact gaaagcacag1500
cggctggctg aggagataaa taataaacga ggggctgtat gcacaaagca tcttctgttg1560
agttaagaac gagtatcgag atggcacata gccttgctca aattggaatc aggtttgtgc1620
caataccagt agaaacagac gaagaagcta gctttgcact ggattgcgag gctttgccat1680
ggctaattcc catgtcagcc gttaagtgtt cctgtgtcac tgaaaattgc tttgagaggc1740
tctaagggct tctcagtgcg ttacatccct ggcttgttgt ccacaaccgt taaaccttaa1800
aagctttaaa agccttatat attctttttt ttcttataaa acttaaaacc ttagaggcta1860
tttaagttgc tgatttatat taattttatt gttcaaacat gagagcttag tacgtgaaac1920
atgagagctt agtacgttag ccatgagagc ttagtacgtt agccatgagg gtttagttcg1980
ttaaacatga gagcttagta cgttaaacat gagagcttag tacgtgaaac atgagagctt2040
agtacgtact atcaacaggt tgaactgcgg atcttgcggc cgcaaaaatt aaaaatgaag2100
ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat2160
cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc2220
cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat2280
accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag2340
ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg2400
ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc2460
tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca 2520
acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg 2580
tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc 2640
actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta 2700
ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc 2760
aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg 2820
ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc 2880
cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc 2940
aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat 3000
actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag 3060
cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc 3120
ccgaaaagtg ccacctgcat cgatggcccc ccgatggtag tgtggggtct ccccatgcga 3180
gagtagggaa ctgccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt 3240
cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg 3300
gatttgaacg ttgcgaagca acggcccgga gggtggcggg caggacgccc gccataaact 3360
gccaggcatc aaattaagca gaaggccatc ctgacggatg gcctttttgc gtggccagtg 3420
ccaagcttgc atgc3434
<210>44
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>44
atgagcacgt cagacgatat ccataacacc acagccactg gcaaatgccc gttccatcag60
gtgtaggctg gagctgcttc80
<210>45
<211>82
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>45
taacagcagg tcgaaacggt cgaggttcat cactttcacc catgccgcca cgaagtcttt60
attccgggga tccgtcgacc tg 82
<210>46
<211>1424
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>46
taacagcagg tcgaaacggt cgaggttcat cactttcacc catgccgcca cgaagtcttt60
attccgggga tccgtcgacc tgcagttcga agttcctatt ctctagaaag tataggaact 120
tcagagcgct tttgaagctc acgctgccgc aagcactcag ggcgcaaggg ctgctaaagg 180
aagcggaaca cgtagaaagc cagtccgcag aaacggtgct gaccccggat gaatgtcagc 240
tactgggcta tctggacaag ggaaaacgca agcgcaaaga gaaagcaggt agcttgcagt 300
gggcttacat ggcgatagct agactgggcg gttttatgga cagcaagcga accggaattg 360
ccagctgggg cgccctctgg taaggttggg aagccctgca aagtaaactg gatggctttc 420
ttgccgccaa ggatctgatg gcgcagggga tcaagatctg atcaagagac aggatgagga 480
tcgtttcgca tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag 540
aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc 600
cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg 660
aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc 720
gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg 780
ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct 840
gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg 900
aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat 960
ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc 1020
atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg 1080
gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc 1140
tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct 1200
gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat 1260
cgccttcttg acgagttctt ctaataaggg gatcttgaag ttcctattcc gaagttccta 1320
ttctctagaa agtataggaa cttcgaagca gctccagcct acacctgatg gaacgggcat 1380
ttgccagtgg ctgtggtgtt atggatatcg tctgacgtgc tcat 1424
<210>47
<211>2181
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2181)
<400>47
atg agc acg tca gac gat atc cat aac acc aca gcc act ggc aaa tgc 48
Met Ser Thr Ser Asp Asp Ile His Asn Thr Thr Ala Thr Gly Lys Cys
1 5 10 15
ccg ttc cat cag ggc ggt cac gac cag agt gcg ggg gcg ggc aca acc 96
Pro Phe His Gln Gly Gly His Asp Gln Ser Ala Gly Ala Gly Thr Thr
20 25 30
act cgc gac tgg tgg cca aat caa ctt cgt gtt gac ctg tta aac caa144
Thr Arg Asp Trp Trp Pro Asn Gln Leu Arg Val Asp Leu Leu Asn Gln
35 40 45
cat tct aat cgt tct aac cca ctg ggt gag gac ttt gac tac cgc aaa192
His Ser Asn Arg Ser Asn Pro Leu Gly Glu Asp Phe Asp Tyr Arg Lys
50 55 60
gaa ttc agc aaa tta gat tac tac ggc ctg aaa aaa gat ctg aaa gcc240
Glu Phe Ser Lys Leu Asp Tyr Tyr Gly Leu Lys Lys Asp Leu Lys Ala
65 70 75 80
ctg ttg aca gaa tct caa ccg tgg tgg cca gcc gac tgg ggc agt tac288
Leu Leu Thr Glu Ser Gln Pro Trp Trp Pro Ala Asp Trp Gly Ser Tyr
85 90 95
gcc ggt ctg ttt att cgt atg gcc tgg cac ggc gcg ggg act tac cgt336
Ala Gly Leu Phe Ile Arg Met Ala Trp His Gly Ala Gly Thr Tyr Arg
100 105 110
tca atc gat gga cgc ggt ggc gcg ggt cgt ggt cag caa cgt ttt gca384
Ser Ile Asp Gly Arg Gly Gly Ala Gly Arg Gly Gln Gln Arg Phe Ala
115 120 125
ccg ctg aac tcc tgg ccg gat aac gta agc ctc gat aaa gcg cgt cgc 432
Pro Leu Asn Ser Trp Pro Asp Asn Val Ser Leu Asp Lys Ala Arg Arg
130 135 140
ctg ttg tgg cca atc aaa cag aaa tat ggt cag aaa atc tcc tgg gcc 480
Leu Leu Trp Pro Ile Lys Gln Lys Tyr Gly Gln Lys Ile Ser Trp Ala
145 150 155 160
gac ctg ttt atc ctc gcg ggt aac gtg gcg cta gaa aac tcc ggc ttc528
Asp Leu Phe Ile Leu Ala Gly Asn Val Ala Leu Glu Asn Ser Gly Phe
165 170 175
cgt acc ttc ggt ttt ggt gcc ggt cgt gaa gac gtc tgg gaa ccg gat576
Arg Thr Phe Gly Phe Gly Ala Gly Arg Glu Asp Val Trp Glu Pro Asp
180 185 190
ctg gat gtt aac tgg ggt gat gaa aaa gcc tgg ctg act cac cgt cat624
Leu Asp Val Asn Trp Gly Asp Glu Lys Ala Trp Leu Thr His Arg His
195 200 205
ccg gaa gcg ctg gcg aaa gca ccg ctg ggt gca acc gag atg ggt ctg672
Pro Glu Ala Leu Ala Lys Ala Pro Leu Gly Ala Thr Glu Met Gly Leu
210 215 220
att tac gtt aac ccg gaa ggc ccg gat cac agc ggc gaa ccg ctt tct720
Ile Tyr Val Asn Pro Glu Gly Pro Asp His Ser Gly Glu Pro Leu Ser
225 230 235 240
gcg gca gca gct atc cgc gcg acc ttc ggc aac atg ggc atg aac gac768
Ala Ala Ala Ala Ile Arg Ala Thr Phe Gly Asn Met Gly Met Asn Asp
245 250 255
gaa gaa acc gtg gcg ctg att gcg ggt ggt cat acg ctg ggt aaa acc816
Glu Glu Thr Val Ala Leu Ile Ala Gly Gly His Thr Leu Gly Lys Thr
260 265 270
cac ggt gcc ggt ccg aca tca aat gta ggt cct gat cca gaa gct gca864
His Gly Ala Gly Pro Thr Ser Asn Val Gly Pro Asp Pro Glu Ala Ala
275 280 285
ccg att gaa gaa caa ggt tta ggt tgg gcg agc act tac ggc agc ggc912
Pro Ile Glu Glu Gln Gly Leu Gly Trp Ala Ser Thr Tyr Gly Ser Gly
290 295 300
gtt ggc gca gat gcc att acc tct ggt ctg gaa gta gtc tgg acc cag960
Val Gly Ala Asp Ala Ile Thr Ser Gly Leu Glu Val Val Trp Thr Gln
305 310 315 320
acg ccg acc cag tgg agc aac tat ttc ttc gag aac ctg ttc aag tat1008
Thr Pro Thr Gln Trp Ser Asn Tyr Phe Phe Glu Asn Leu Phe Lys Tyr
325 330 335
gag tgg gta cag acc cgc agc ccg gct ggc gca atc cag ttc gaa gcg1056
Glu Trp Val Gln Thr Arg Ser Pro Ala Gly Ala Ile Gln Phe Glu Ala
340 345 350
gta gac gca ccg gaa att atc ccg gat ccg ttt gat ccg tcg aag aaa1104
Val Asp Ala Pro Glu Ile Ile Pro Asp Pro Phe Asp Pro Ser Lys Lys
355 360 365
cgt aaa ccg aca atg ctg gtg acc gac ctg acg ctg cgt ttt gat cct1152
Arg Lys Pro Thr Met Leu Val Thr Asp Leu Thr Leu Arg Phe Asp Pro
370 375 380
gag ttc gag aag atc tct cgt cgt ttc ctc aac gat ccg cag gcg ttc1200
Glu Phe Glu Lys Ile Ser Arg Arg Phe Leu Asn Asp Pro Gln Ala Phe
385 390 395 400
aac gaa gcc ttt gcc cgt gcc tgg ttc aaa ctg acg cac agg gat atg1248
Asn Glu Ala Phe Ala Arg Ala Trp Phe Lys Leu Thr His Arg Asp Met
405 410 415
ggg ccg aaa tct cgc tac atc ggg ccg gaa gtg ccg aaa gaa gat ctg1296
Gly Pro Lys Ser Arg Tyr Ile Gly Pro Glu Val Pro Lys Glu Asp Leu
420 425 430
atc tgg caa gat ccg ctg ccg cag ccg atc tac aac ccg acc gag cag1344
Ile Trp Gln Asp Pro Leu Pro Gln Pro Ile Tyr Asn Pro Thr Glu Gln
435 440 445
gac att atc gat ctg aaa ttc gcg att gcg gat tct ggt ctg tct gtt1392
Asp Ile Ile Asp Leu Lys Phe Ala Ile Ala Asp Ser Gly Leu Ser Val
450 455 460
agt gag ctg gta tcg gtg gcc tgg gca tct gct tct acc ttc cgt ggt1440
Ser Glu Leu Val Ser Val Ala Trp Ala Ser Ala Ser Thr Phe Arg Gly
465 470 475 480
ggc gac aaa cgc ggt ggt gcc aac ggt gcg cgt ctg gca tta atg ccg1488
Gly Asp Lys Arg Gly Gly Ala Asn Gly Ala Arg Leu Ala Leu Met Pro
485 490 495
cag cgc gac tgg gat gtg aac gcc gca gcc gtt cgt gct ctg cct gtt1536
Gln Arg Asp Trp Asp Val Asn Ala Ala Ala Val Arg Ala Leu Pro Val
500 505 510
ctg gag aaa atc cag aaa gag tct ggt aaa gcc tcg ctg gcg gat atc1584
Leu Glu Lys Ile Gln Lys Glu Ser Gly Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ile
515 520 525
ata gtg ctg gct ggt gtg gtt ggt gtt gag aaa gcc gca agc gcc gca1632
Ile Val Leu Ala Gly Val Val Gly Val Glu Lys Ala Ala Ser Ala Ala
530 535 540
ggt ttg agc att cat gta ccg ttt gcg ccg ggt cgc gtt gat gcg cgt1680
Gly Leu Ser Ile His Val Pro Phe Ala Pro Gly Arg Val Asp Ala Arg
545 550 555 560
cag gat cag act gac att gag atg ttt gag ctg ctg gag cca att gct1728
Gln Asp Gln Thr Asp Ile Glu Met Phe Glu Leu Leu Glu Pro Ile Ala
565 570 575
gac ggt ttc cgt aac tat cgc gct cgt ctg gac gtt tcc acc acc gag1776
Asp Gly Phe Arg Asn Tyr Arg Ala Arg Leu Asp Val Ser Thr Thr Glu
580 585 590
tca ctg ctg atc gac aaa gca cag caa ctg acg ctg acc gcg ccg gaa1824
Ser Leu Leu Ile Asp Lys Ala Gln Gln Leu Thr Leu Thr Ala Pro Glu
595 600 605
atg act gcg ctg gtg ggc ggc atg cgt gta ctg ggt gcc aac ttc gat1872
Met Thr Ala Leu Val Gly Gly Met Arg Val Leu Gly Ala Asn Phe Asp
610 615 620
ggc agc aaa aac ggc gtc ttc act gac cgc gtt ggc gta ttg agc aat1920
Gly Ser Lys Asn Gly Val Phe Thr Asp Arg Val Gly Val Leu Ser Asn
625 630 635 640
gac ttc ttc gtg aac ttg ctg gat atg cgt tac gag tgg aaa gcg acc1968
Asp Phe Phe Val Asn Leu Leu Asp Met Arg Tyr Glu Trp Lys Ala Thr
645 650 655
gac gaa tcg aaa gag ctg ttc gaa ggc cgt gac cgt gaa acc ggc gaa2016
Asp Glu Ser Lys Glu Leu Phe Glu Gly Arg Asp Arg Glu Thr Gly Glu
660 665 670
gtg aaa ttt acg gcc agc cgt gcg gat ctg gtg ttt ggt tct aac tcc2064
Val Lys Phe Thr Ala Ser Arg Ala Asp Leu Val Phe Gly Ser Asn Ser
675 680 685
gtc ctg cgt gcg gtg gcg gaa gtt tac gcc agt agc gat gcc cac gag2112
Val Leu Arg Ala Val Ala Glu Val Tyr Ala Ser Ser Asp Ala His Glu
690 695 700
aag ttt gtt aaa gac ttc gtg gcg gca tgg gtg aaa gtg atg aac ctc2160
Lys Phe Val Lys Asp Phe Val Ala Ala Trp Val Lys Val Met Asn Leu
705 710 715 720
gac cgt ttc gac ctg ctg taa2181
Asp Arg Phe Asp Leu Leu
725
<210>48
<211>726
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>48
Met Ser Thr Ser Asp Asp Ile His Asn Thr Thr Ala Thr Gly Lys Cys
1 5 10 15
Pro Phe His Gln Gly Gly His Asp Gln Ser Ala Gly Ala Gly Thr Thr
20 25 30
Thr Arg Asp Trp Trp Pro Asn Gln Leu Arg Val Asp Leu Leu Asn Gln
35 40 45
His Ser Asn Arg Ser Asn Pro Leu Gly Glu Asp Phe Asp Tyr Arg Lys
50 55 60
Glu Phe Ser Lys Leu Asp Tyr Tyr Gly Leu Lys Lys Asp Leu Lys Ala
65 70 75 80
Leu Leu Thr Glu Ser Gln Pro Trp Trp Pro Ala Asp Trp Gly Ser Tyr
85 90 95
Ala Gly Leu Phe Ile Arg Met Ala Trp His Gly Ala Gly Thr Tyr Arg
100 105 110
Ser Ile Asp Gly Arg Gly Gly Ala Gly Arg Gly Gln Gln Arg Phe Ala
115 120 125
Pro Leu Asn Ser Trp Pro Asp Asn Val Ser Leu Asp Lys Ala Arg Arg
130 135 140
Leu Leu Trp Pro Ile Lys Gln Lys Tyr Gly Gln Lys Ile Ser Trp Ala
145 150 155 160
Asp Leu Phe Ile Leu Ala Gly Asn Val Ala Leu Glu Asn Ser Gly Phe
165 170 175
Arg Thr Phe Gly Phe Gly Ala Gly Arg Glu Asp Val Trp Glu Pro Asp
180 185 190
Leu Asp Val Asn Trp Gly Asp Glu Lys Ala Trp Leu Thr His Arg His
195 200 205
Pro Glu Ala Leu Ala Lys Ala Pro Leu Gly Ala Thr Glu Met Gly Leu
210 215 220
Ile Tyr Val Asn Pro Glu Gly Pro Asp His Ser Gly Glu Pro Leu Ser
225 230 235 240
Ala Ala Ala Ala Ile Arg Ala Thr Phe Gly Asn Met Gly Met Asn Asp
245 250 255
Glu Glu Thr Val Ala Leu Ile Ala Gly Gly His Thr Leu Gly Lys Thr
260 265 270
His Gly Ala Gly Pro Thr Ser Asn Val Gly Pro Asp Pro Glu Ala Ala
275 280 285
Pro Ile Glu Glu Gln Gly Leu Gly Trp Ala Ser Thr Tyr Gly Ser Gly
290 295 300
Val Gly Ala Asp Ala Ile Thr Ser Gly Leu Glu Val Val Trp Thr Gln
305 310 315 320
Thr Pro Thr Gln Trp Ser Asn Tyr Phe Phe Glu Asn Leu Phe Lys Tyr
325 330 335
Glu Trp Val Gln Thr Arg Ser Pro Ala Gly Ala Ile Gln Phe Glu Ala
340 345 350
Val Asp Ala Pro Glu Ile Ile Pro Asp Pro Phe Asp Pro Ser Lys Lys
355 360 365
Arg Lys Pro Thr Met Leu Val Thr Asp Leu Thr Leu Arg Phe Asp Pro
370 375 380
Glu Phe Glu Lys Ile Ser Arg Arg Phe Leu Asn Asp Pro Gln Ala Phe
385 390 395 400
Asn Glu Ala Phe Ala Arg Ala Trp Phe Lys Leu Thr His Arg Asp Met
405 410 415
Gly Pro Lys Ser Arg Tyr Ile Gly Pro Glu Val Pro Lys Glu Asp Leu
420 425 430
Ile Trp Gln Asp Pro Leu Pro Gln Pro Ile Tyr Asn Pro Thr Glu Gln
435 440 445
Asp Ile Ile Asp Leu Lys Phe Ala Ile Ala Asp Ser Gly Leu Ser Val
450 455 460
Ser Glu Leu Val Ser Val Ala Trp Ala Ser Ala Ser Thr Phe Arg Gly
465 470 475 480
Gly Asp Lys Arg Gly Gly Ala Asn Gly Ala Arg Leu Ala Leu Met Pro
485 490 495
Gln Arg Asp Trp Asp Val Asn Ala Ala Ala Val Arg Ala Leu Pro Val
500 505 510
Leu Glu Lys Ile Gln Lys Glu Ser Gly Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ile
515 520 525
Ile Val Leu Ala Gly Val Val Gly Val Glu Lys Ala Ala Ser Ala Ala
530 535 540
Gly Leu Ser Ile His Val Pro Phe Ala Pro Gly Arg Val Asp Ala Arg
545 550 555 560
Gln Asp Gln Thr Asp Ile Glu Met Phe Glu Leu Leu Glu Pro Ile Ala
565 570 575
Asp Gly Phe Arg Asn Tyr Arg Ala Arg Leu Asp Val Ser Thr Thr Glu
580 585 590
Ser Leu Leu Ile Asp Lys Ala Gln Gln Leu Thr Leu Thr Ala Pro Glu
595 600 605
Met Thr Ala Leu Val Gly Gly Met Arg Val Leu Gly Ala Asn Phe Asp
610 615 620
Gly Ser Lys Asn Gly Val Phe Thr Asp Arg Val Gly Val Leu Ser Asn
625 630 635 640
Asp Phe Phe Val Asn Leu Leu Asp Met Arg Tyr Glu Trp Lys Ala Thr
645 650 655
Asp Glu Ser Lys Glu Leu Phe Glu Gly Arg Asp Arg Glu Thr Gly Glu
660 665 670
Val Lys Phe Thr Ala Ser Arg Ala Asp Leu Val Phe Gly Ser Asn Ser
675 680 685
Val Leu Arg Ala Val Ala Glu Val Tyr Ala Ser Ser Asp Ala His Glu
690 695 700
Lys Phe Val Lys Asp Phe Val Ala Ala Trp Val Lys Val Met Asn Leu
705 710 715 720
Asp Arg Phe Asp Leu Leu
725
<210>49
<211>6329
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pKD46
<400>49
catcgattta ttatgacaac ttgacggcta catcattcac tttttcttca caaccggcac 60
ggaactcgct cgggctggcc ccggtgcatt ttttaaatac ccgcgagaaa tagagttgat 120
cgtcaaaacc aacattgcga ccgacggtgg cgataggcat ccgggtggtg ctcaaaagca 180
gcttcgcctg gctgatacgt tggtcctcgc gccagcttaa gacgctaatc cctaactgct 240
ggcggaaaag atgtgacaga cgcgacggcg acaagcaaac atgctgtgcg acgctggcga 300
tatcaaaatt gctgtctgcc aggtgatcgc tgatgtactg acaagcctcg cgtacccgat 360
tatccatcgg tggatggagc gactcgttaa tcgcttccat gcgccgcagt aacaattgct 420
caagcagatt tatcgccagc agctccgaat agcgcccttc cccttgcccg gcgttaatga 480
tttgcccaaa caggtcgctg aaatgcggct ggtgcgcttc atccgggcga aagaaccccg 540
tattggcaaa tattgacggc cagttaagcc attcatgcca gtaggcgcgc ggacgaaagt 600
aaacccactg gtgataccat tcgcgagcct ccggatgacg accgtagtga tgaatctctc 660
ctggcgggaa cagcaaaata tcacccggtc ggcaaacaaa ttctcgtccc tgatttttca 720
ccaccccctg accgcgaatg gtgagattga gaatataacc tttcattccc agcggtcggt 780
cgataaaaaa atcgagataa ccgttggcct caatcggcgt taaacccgcc accagatggg 840
cattaaacga gtatcccggc agcaggggat cattttgcgc ttcagccata cttttcatac 900
tcccgccatt cagagaagaa accaattgtc catattgcat cagacattgc cgtcactgcg 960
tcttttactg gctcttctcg ctaaccaaac cggtaacccc gcttattaaa agcattctgt1020
aacaaagcgg gaccaaagcc atgacaaaaa cgcgtaacaa aagtgtctat aatcacggca1080
gaaaagtcca cattgattat ttgcacggcg tcacactttg ctatgccata gcatttttat1140
ccataagatt agcggatcct acctgacgct ttttatcgca actctctact gtttctccat1200
acccgttttt ttgggaattc gagctctaag gaggttataa aaaatggata ttaatactga1260
aactgagatc aagcaaaagc attcactaac cccctttcct gttttcctaa tcagcccggc1320
atttcgcggg cgatattttc acagctattt caggagttca gccatgaacg cttattacat1380
tcaggatcgt cttgaggctc agagctgggc gcgtcactac cagcagctcg cccgtgaaga1440
gaaagaggca gaactggcag acgacatgga aaaaggcctg ccccagcacc tgtttgaatc1500
gctatgcatc gatcatttgc aacgccacgg ggccagcaaa aaatccatta cccgtgcgtt1560
tgatgacgat gttgagtttc aggagcgcat ggcagaacac atccggtaca tggttgaaac1620
cattgctcac caccaggttg atattgattc agaggtataa aacgaatgag tactgcactc1680
gcaacgctgg ctgggaagct ggctgaacgt gtcggcatgg attctgtcga cccacaggaa1740
ctgatcacca ctcttcgcca gacggcattt aaaggtgatg ccagcgatgc gcagttcatc1800
gcattactga tcgttgccaa ccagtacggc cttaatccgt ggacgaaaga aatttacgcc1860
tttcctgata agcagaatgg catcgttccg gtggtgggcg ttgatggctg gtcccgcatc1920
atcaatgaaa accagcagtt tgatggcatg gactttgagc aggacaatga atcctgtaca1980
tgccggattt accgcaagga ccgtaatcat ccgatctgcg ttaccgaatg gatggatgaa2040
tgccgccgcg aaccattcaa aactcgcgaa ggcagagaaa tcacggggcc gtggcagtcg2100
catcccaaac ggatgttacg tcataaagcc atgattcagt gtgcccgtct ggccttcgga2160
tttgctggta tctatgacaa ggatgaagcc gagcgcattg tcgaaaatac tgcatacact2220
gcagaacgtc agccggaacg cgacatcact ccggttaacg atgaaaccat gcaggagatt2280
aacactctgc tgatcgccct ggataaaaca tgggatgacg acttattgcc gctctgttcc2340
cagatatttc gccgcgacat tcgtgcatcg tcagaactga cacaggccga agcagtaaaa2400
gctcttggat tcctgaaaca gaaagccgca gagcagaagg tggcagcatg acaccggaca2460
ttatcctgca gcgtaccggg atcgatgtga gagctgtcga acagggggat gatgcgtggc2520
acaaattacg gctcggcgtc atcaccgctt cagaagttca caacgtgata gcaaaacccc2580
gctccggaaa gaagtggcct gacatgaaaa tgtcctactt ccacaccctg cttgctgagg2640
tttgcaccgg tgtggctccg gaagttaacg ctaaagcact ggcctgggga aaacagtacg2700
agaacgacgc cagaaccctg tttgaattca cttccggcgt gaatgttact gaatccccga 2760
tcatctatcg cgacgaaagt atgcgtaccg cctgctctcc cgatggttta tgcagtgacg2820
gcaacggcct tgaactgaaa tgcccgttta cctcccggga tttcatgaag ttccggctcg2880
gtggtttcga ggccataaag tcagcttaca tggcccaggt gcagtacagc atgtgggtga2940
cgcgaaaaaatgcctggtac tttgccaact atgacccgcg tatgaagcgt gaaggcctgc 3000
attatgtcgt gattgagcgg gatgaaaagt acatggcgag ttttgacgag atcgtgccgg3060
agttcatcga aaaaatggac gaggcactgg ctgaaattgg ttttgtattt ggggagcaat3120
ggcgatgacg catcctcacg ataatatccg ggtaggcgca atcactttcg tctactccgt3180
tacaaagcga ggctgggtat ttcccggcct ttctgttatc cgaaatccac tgaaagcaca3240
gcggctggct gaggagataa ataataaacg aggggctgta tgcacaaagc atcttctgtt3300
gagttaagaa cgagtatcga gatggcacat agccttgctc aaattggaat caggtttgtg3360
ccaataccag tagaaacaga cgaagaatcc atgggtatgg acagttttcc ctttgatatg3420
taacggtgaa cagttgttct acttttgttt gttagtcttg atgcttcact gatagataca3480
agagccataa gaacctcaga tccttccgta tttagccagt atgttctcta gtgtggttcg3540
ttgtttttgc gtgagccatg agaacgaacc attgagatca tacttacttt gcatgtcact3600
caaaaatttt gcctcaaaac tggtgagctg aatttttgca gttaaagcat cgtgtagtgt3660
ttttcttagt ccgttacgta ggtaggaatc tgatgtaatg gttgttggta ttttgtcacc3720
attcattttt atctggttgt tctcaagttc ggttacgaga tccatttgtc tatctagttc3780
aacttggaaa atcaacgtat cagtcgggcg gcctcgctta tcaaccacca atttcatatt3840
gctgtaagtg tttaaatctt tacttattgg tttcaaaacc cattggttaa gccttttaaa3900
ctcatggtag ttattttcaa gcattaacat gaacttaaat tcatcaaggc taatctctat3960
atttgccttg tgagttttct tttgtgttag ttcttttaat aaccactcat aaatcctcat4020
agagtatttg ttttcaaaag acttaacatg ttccagatta tattttatga atttttttaa4080
ctggaaaaga taaggcaata tctcttcact aaaaactaat tctaattttt cgcttgagaa4140
cttggcatag tttgtccact ggaaaatctc aaagccttta accaaaggat tcctgatttc4200
cacagttctc gtcatcagct ctctggttgc tttagctaat acaccataag cattttccct4260
actgatgttc atcatctgag cgtattggtt ataagtgaac gataccgtcc gttctttcct4320
tgtagggttt tcaatcgtgg ggttgagtag tgccacacag cataaaatta gcttggtttc4380
atgctccgtt aagtcatagc gactaatcgc tagttcattt gctttgaaaa caactaattc4440
agacatacat ctcaattggt ctaggtgatt ttaatcacta taccaattga gatgggctag4500
tcaatgataa ttactagtcc ttttcctttg agttgtgggt atctgtaaat tctgctagac4560
ctttgctgga aaacttgtaa attctgctag accctctgta aattccgcta gacctttgtg4620
tgtttttttt gtttatattc aagtggttat aatttataga ataaagaaag aataaaaaaa4680
gataaaaagaatagatccca gccctgtgta taactcacta ctttagtcag ttccgcagta 4740
ttacaaaagg atgtcgcaaa cgctgtttgc tcctctacaa aacagacctt aaaaccctaa4800
aggcttaagt agcaccctcg caagctcggt tgcggccgca atcgggcaaa tcgctgaata4860
ttccttttgt ctccgaccat caggcacctg agtcgctgtc tttttcgtga cattcagttc4920
gctgcgctca cggctctggc agtgaatggg ggtaaatggc actacaggcg ccttttatgg4980
attcatgcaa ggaaactacc cataatacaa gaaaagcccg tcacgggctt ctcagggcgt5040
tttatggcgg gtctgctatg tggtgctatc tgactttttg ctgttcagca gttcctgccc5100
tctgattttc cagtctgacc acttcggatt atcccgtgac aggtcattca gactggctaa5160
tgcacccagt aaggcagcgg tatcatcaac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc5220
acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa5280
ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta5340
ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt5400
tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 5460
tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 5520
gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 5580
tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 5640
tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 5700
ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 5760
tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 5820
ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 5880
gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 5940
ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 6000
cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 6060
ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 6120
ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 6180
gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 6240
ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 6300
gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctg6329
<210>50
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>50
aacaatatgt aagatctcaa ctatc25
<210>51
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>51
cagacatgag agatccagtg tgtag25
<210>52
<211>9332
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pCP20
<400>52
gagacacaac gtggctttgt tgaataaatc gaacttttgc tgagttgaag gatcagatca60
cgcatcttcc cgacaacgca gaccgttccg tggcaaagca aaagttcaaa atcaccaact 120
ggtccaccta caacaaagct ctcatcaacc gtggctccct cactttctgg ctggatgatg 180
gggcgattca ggcctggtat gagtcagcaa caccttcttc acgaggcaga cctcagcgcc 240
acaggtgcgg ttgctggcgc taaccgtttt tatcaggctc tgggaggcag aataaatgat 300
catatcgtca attattacct ccacggggag agcctgagca aactggcctc aggcatttga 360
gaagcacacg gtcacactgc ttccggtagt caataaaccg gtaaaccagc aatagacata 420
agcggctatt taacgaccct gccctgaacc gacgaccggg tcgaatttgc tttcgaattt 480
ctgccattca tccgcttatt atcacttatt caggcgtagc aaccaggcgt ttaagggcac 540
caataactgc cttaaaaaaa ttacgccccg ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat 600
tcattaagca ttctgccgac atggaagcca tcacaaacgg catgatgaac ctgaatcgcc 660
agcggcatca gcaccttgtc gccttgcgta taatatttgc ccatggtgaa aacgggggcg 720
aagaagttgt ccatattggc cacgtttaaa tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg 780
gctgagacga aaaacatatt ctcaataaac cctttaggga aataggccag gttttcaccg 840
taacacgcca catcttgcga atatatgtgt agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca 900
ctccagagcg atgaaaacgt ttcagtttgc tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca 960
ctatcccata tcaccagctc accgtctttc attgccatac ggaattccgg atgagcattc 1020
atcaggcggg caagaatgtg aataaaggcc ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg 1080
gtctttaaaa aggccgtaat atccagctga acggtctggt tataggtaca ttgagcaact 1140
gactgaaatg cctcaaaatg ttctttacga tgccattggg atatatcaac ggtggtatat 1200
ccagtgattt ttttctccat tttagcttcc ttagctcctg aaaatctcga taactcaaaa 1260
aatacgcccg gtagtgatct tatttcatta tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga 1320
tcaacgtctc attttcgcca aaagttggcc cagggcttcc cggtatcaac agggacacca 1380
ggatttattt attctgcgaa gtgatcttcc gtcacaggta tttattcggc gcaaagtgcg 1440
tcgggtgatg ctgccaactt actgatttag tgtatgatgg tgtttttgag gtgctccagt 1500
ggcttctgtt tctatcagct gtccctcctg ttcagctact gacggggtgg tgcgtaacgg1560
caaaagcacc gccggacatc agcgcttgtt tcggcgtggg tatggtggca ggccccgtgg1620
ccgggggact gttgggcgcc tgtagtgcca tttaccccca ttcactgcca gagccgtgag1680
cgcagcgaac tgaatgtcac gaaaaagaca gcgactcagg tgcctgatgg tcggagacaa1740
aaggaatatt cagcgatttg cccgagcttg cgagggtgct acttaagcct ttagggtttt1800
aaggtctgtt ttgtagagga gcaaacagcg tttgcgacat ccttttgtaa tactgcggaa1860
ctgactaaag tagtgagtta tacacagggc tgggatctat tctttttatc tttttttatt1920
ctttctttat tctataaatt ataaccactt gaatataaac aaaaaaaaca cacaaaggtc1980
tagcggaatt tacagagggt ctagcagaat ttacaagttt tccagcaaag gtctagcaga2040
atttacagat acccacaact caaaggaaaa ggactagtaa ttatcattga ctagcccatc2100
tcaattggta tagtgattaa aatcacctag accaattgag atgtatgtct gaattagttg2160
ttttcaaagc aaatgaacta gcgattagtc gctatgactt aacggagcat gaaaccaagc2220
taattttatg ctgtgtggca ctactcaacc ccacgattga aaaccctaca aggaaagaac2280
ggacggtatc gttcacttat aaccaatacg ttcagatgat gaacatcagt agggaaaatg2340
cttatggtgt attagctaaa gcaaccagag agctgatgac gagaactgtg gaaatcagga2400
atcctttggt taaaggcttt gagattttcc agtggacaaa ctatgccaag ttctcaagcg2460
aaaaattaga attagttttt agtgaagaga tattgcctta tcttttccag ttaaaaaaat2520
tcataaaata taatctggaa catgttaagt cttttgaaaa caaatactct atgaggattt2580
atgagtggtt attaaaagaa ctaacacaaa agaaaactca caaggcaaat atagagatta2640
gccttgatga atttaagttc atgttaatgc ttgaaaataa ctaccatgag tttaaaaggc2700
ttaaccaatg ggttttgaaa ccaataagta aagatttaaa cacttacagc aatatgaaat2760
tggtggttga taagcgaggc cgcccgactg atacgttgat tttccaagtt gaactagata2820
gacaaatgga tctcgtaacc gaacttgaga acaaccagat aaaaatgaat ggtgacaaaa 2880
taccaacaac cattacatca gattcctacc tacataacgg actaagaaaa acactacacg2940
atgctttaac tgcaaaaatt cagctcacca gttttgaggc aaaatttttg agtgacatgc3000
avaagtaagta tgatctcaat ggttcgttct catggctcac gcaaaaacaa cgaaccacac3060
tagagaacat actggctaaa tacggaagga tctgaggttc ttatggctct tgtatctatc3120
agtgaagcat caagactaac aaacaaaagt agaacaactg ttcaccgtta catatcaaag3180
ggaaaactgt ccatatgcac agatgaaaac ggtgtaaaaa agatagatac atcagagctt3240
ttacgagttt ttggtgcatt taaagctgtt caccatgaac agatcgacaa tgtaacagat3300
gaacagcatg taacacctaa tagaacaggt gaaaccagta aaacaaagca actagaacat3360
gaaattgaac acctgagaca acttgttaca gctcaacagt cacacataga cagcctgaaa3420
caggcgatgc tgcttatcga atcaaagctg ccgacaacac gggagccagt gacgcctccc3480
gtggggaaaa aatcatggca attctggaag aaatagcgcc tgtttcgttt caggcaggtt3540
atcagggagt gtcagcgtcc tgcggttctc cggggcgttc
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.由羧酸酯生产过氧羧酸的方法，所述方法包括
a)提供一组反应成分，所述成分包括
1)选自下列的底物
i)具有以下结构的酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R2＝C1-C10直链或支链烷基、链烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH
并且n＝1-10；和
ii)具有以下结构的甘油酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R3和R4各自为H或R1C(O)；以及
iii)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖的乙酰化糖；
2)过氧源；以及
3)具有过氧化水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包括酶，所述酶包含使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO2比对的特征基序，所述特征基序包含
i)在SEQ ID NO2的氨基酸位置118-120的RGQ基序；
ii)在SEQ ID NO2的氨基酸位置179-183的GXSQG基序；和
iii)在SEQ ID NO2的氨基酸位置298-299的HE基序；和
b)在合适的含水反应条件下将所述反应成分组合，由此产生过氧羧酸。
2.权利要求1的方法，其中当使用CLUSTALW与参考序列SEQ IDNO2比对时，所述酶的特征基序还包括在氨基酸位置267-269的LXD基序。
3.权利要求1的方法，其中所述酶与SEQ ID NO2具有至少40％的氨基酸同一性。
4.权利要求3的方法，其中所述酶包含选自下列的氨基酸序列SEQID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，和SEQ ID NO32或者通过对所述氨基酸序列取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而衍生的具有过氧化水解酶活性的基本上类似的酶。
5.权利要求1的方法，其中所述酶包含由在严格条件下杂交的核酸分子编码的氨基酸序列，所述核酸分子具有选自下列的核酸序列的核酸分子SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
6.权利要求5的方法，其中所述酶选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ IDNO16，和SEQ ID NO32。
7.权利要求6的方法，其中所述酶由核酸分子编码，所述核酸分子具有选自下列的核酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ IDNO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
8.权利要求1的方法，其中过氧羧酸在将反应成分组合后约5分钟至约2小时内以至少20ppm的浓度生成。
9.权利要求1的方法，其中所述乙酰化糖选自葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙酰化木聚糖、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛、和三-O-乙酰基-葡萄烯糖
10.权利要求1的方法，其中所生成的过氧羧酸选自过乙酸、过丙酸、过丁酸、过乳酸、过乙醇酸、过甲氧基乙酸、过-β-羟基丁酸、以及它们的混合物。
11.权利要求10的方法，其中所生成的过氧羧酸是过乙酸。
12.使用酶促产生的过氧羧酸组合物消毒硬质表面或无生命物体的方法，所述方法包括
a)提供一组反应成分，所述成分包括
1)选自下列的底物
i)具有以下结构的酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R2＝C1-C10直链或支链烷基、链烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH
并且n＝1-10；和
ii)具有以下结构的甘油酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R3和R4各自为H或R1C(O)；
iii)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖的乙酰化糖；
2)过氧源；以及
3)具有过氧化水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包含使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO2比对的特征基序，所述特征基序包含
i)在SEQ ID NO2的氨基酸位置118-120的RGQ基序；
ii)在SEQ ID NO2的氨基酸位置179-183的GXSQG基序；和
iii)在SEQ ID NO2的氨基酸位置298-299的HE基序；
b)在合适的含水反应条件下将所述反应成分组合，由此形成过氧羧酸产物；
a)任选将所述过氧羧酸产物稀释；以及
b)使所述硬质表面或无生命物体与在步骤b)或步骤c)中所产生的过氧羧酸接触，由此将所述表面或所述无生命物体消毒。
13.权利要求12的方法，其中当使用CLUSTALW与参考序列SEQID NO2比对时，酶的特征基序还包括在氨基酸位置267-269的LXD基序。
14.权利要求12的方法，其中所述酶与SEQ ID NO2具有至少40％的氨基酸同一性。
15.权利要求14的方法，其中所述酶包含选自下列的氨基酸序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ IDNO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，和SEQ ID NO32或者通过对所述氨基酸序列取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而衍生的具有过氧化水解酶活性的基本上类似的酶。
16.权利要求12的方法，其中所述酶包含由核酸分子编码的氨基酸序列，所述核酸分子在严格条件下与具有选自下列的序列的核酸分子杂交SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQ IDNO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
17.权利要求16的方法，其中所述酶选自SEQ ID NO2，SEQ IDNO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，和SEQ ID NO32。
18.权利要求17的方法，其中所述酶由核酸分子编码，所述核酸分子具有选自下列的核酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQIDNO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
19.权利要求12的方法，其中过氧羧酸在将反应成分组合后约5分钟至约2小时内以至少20ppm的浓度生成。
20.权利要求12的方法，其中所述乙酰化糖选自葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙酰化木聚糖、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛、和三-O-乙酰基-葡萄烯糖。
21.权利要求12的方法，其中所生成的过氧羧酸选自过乙酸、过丙酸、过丁酸、过乳酸、过乙醇酸、过甲氧基乙酸、过-β-羟基丁酸、以及它们的混合物。
22.权利要求21的方法，其中所生成的过氧羧酸是过乙酸。
23.权利要求12的方法，其中所述硬质表面或无生命物体选自罐、传送机、地板、排水沟、管道、冷却器、致冷机、设备表面、墙壁、阀、带、接头、窗户、水处理设施、池、矿泉、发酵罐、药物或生物药物制造设备、药物或生物药物成分、药物或生物药物赋形剂、衣服、医疗设备、牙科设备、外科手术设备、内窥镜、腹腔镜、刷、鞋、烹饪表面、食品制备表面、浴室表面、盥洗室、家畜、牛、奶牛、羊、马、猪、牛肉、家禽、猪肉、蔬菜、水果、海鲜、以及它们的组合。
24.权利要求12的方法，其中所述甘油酯底物选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、以及它们的混合物。
25.权利要求12的方法，其中所述乙酰化糖选自葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙酰化木聚糖、乙酰化木聚糖片段、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛、和三-O-乙酰基-葡萄烯糖。
26.权利要求12的方法，其中所生成的过氧羧酸选自过乙酸、过丙酸、过丁酸、过乳酸、过乙醇酸、过甲氧基乙酸、过-β-羟基丁酸、以及它们的混合物。
27.权利要求26的方法，其中所述过氧羧酸是过乙酸。
28.权利要求12的方法，其中使所述硬质表面或无生命物体在组合所述反应成分后约5分钟至约168小时内与步骤b)或步骤c)中所生成的过氧羧酸接触。
29.权利要求28的方法，其中使所述硬质表面或无生命物体在组合所述反应成分后约5分钟至约48小时内与步骤b)或步骤c)中所生成的过氧羧酸接触。
30.权利要求29的方法，其中使所述硬质表面或无生命物体在组合所述反应成分后约5分钟至约2小时内与步骤b)或步骤c)中所生成的过氧羧酸接触。
31.权利要求12的方法，其中所述硬质表面或无生命物体上的存活生物污染物的浓度降低至少3-log。
32.权利要求31的方法，其中所述硬质表面或无生命物体上的存活生物污染物的浓度降低至少5-log。
33.权利要求1或权利要求12的方法，其中所述酶催化剂是选自微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物、部分纯化的酶、和纯化的酶的形式。
34.权利要求33的方法，其中所述酶催化剂缺乏过氧化氢酶活性。
35.权利要求34的方法，其中所述酶催化剂是缺乏过氧化氢酶活性的重组大肠杆菌菌株。
36.权利要求35的方法，其中所述重组大肠杆菌菌株包含破坏的选自下列的催化剂基因katE、katG以及katE和katG两者。
37.通过权利要求1的方法生产的消毒剂或漂白组合物。
38.过氧羧酸生成系统，所述系统包括
a)选自下列的底物
1)具有以下结构的酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R2＝C1-C10直链或支链烷基、链烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH
并且n＝1-10；和
2)具有以下结构的甘油酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R3和R4各自为H或R1C(O)；以及
3)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖、和乙酰化多糖的乙酰化糖；以及
b)过氧源；以及
c)具有过氧化水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包括酶，所述酶具有使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO2比对的特征基序，所述特征基序包含
i)在SEQ ID NO2的氨基酸位置118-120的RGQ基序；
ii)在SEQ ID NO2的氨基酸位置179-183的GXSQG基序；和
iii)在SEQ ID NO2的氨基酸位置298-299的HE基序。
39.权利要求38的过氧羧酸生成系统，其中当使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO2比对时，酶的特征基序还包括在氨基酸位置267-269的LXD基序。
40.权利要求39的过氧羧酸生成系统，其中所述酶与SEQ ID NO2具有至少40％的氨基酸同一性。
41.权利要求38或权利要求37的过氧羧酸生成系统，其中所述酶包含选自下列的氨基酸序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，和SEQID NO32或者通过对所述氨基酸序列取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而衍生的具有过氧化水解酶活性的基本上类似的酶。
42.权利要求38的过氧羧酸生成系统，其中所述酶包含由核酸分子编码的氨基酸序列，所述核酸分子在严格条件下与具有选自下列的序列的核酸分子杂交SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQID NO7，SEQ IDNO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
43.权利要求42的过氧羧酸生成系统，其中所述酶选自SEQ IDNO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，和SEQ ID NO32。
44.权利要求43的方法，其中所述酶由核酸分子编码，所述核酸分子具有选自下列的核酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQIDNO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
45.权利要求38的过氧羧酸生成系统，其中将该组反应成分在含水反应条件下组合以原位形成过氧羧酸。
46.权利要求38的过氧羧酸生成系统，其中所述反应成分还包含一种或多种选自下列的成分一种或多种螯合剂、一种或多种润湿剂、一种或多种腐蚀抑制剂、以及它们的组合。
47.权利要求38的过氧羧酸生成系统，其中所述过氧羧酸是过乙酸。
48.权利要求38的过氧羧酸生成系统，其中所述反应成分在试剂盒中提供。
49.制剂，所述制剂包含
a)包含酶催化剂和羧酸酯的第一混合物，所述酶催化剂包含具有CE-7特征基序的过氧化水解酶，所述羧酸酯选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它们的混合物；所述第一混合物任选包含选自下列的另外组分无机或有机缓冲剂、腐蚀抑制剂、润湿剂、以及它们的组合；以及
b)包含过氧源和水的第二混合物，所述第二混合物任选还包含螯合剂。
50.权利要求49的制剂，其中所述酶催化剂呈固体颗粒形式。
51.权利要求49的制剂，其中所述制剂包括用于分开贮存和组合所述第一混合物与所述第二混合物的装置。
52.权利要求51的制剂，其中所述用于分开贮存的装置包括容器，所述容器在单个容器或两个分开的容器中包含两个分开的隔室。
53.权利要求51的制剂，其中所述第一混合物包含在水溶性包中。
54.通过将权利要求49的第一混合物与第二混合物组合生成过氧羧酸而产生的消毒制剂。
55.权利要求54的消毒制剂，其中所述消毒制剂还包含不存在于所述第一混合物或所述第二混合物中的另外量的水。
56.制剂，所述制剂包含
a)包含酶催化剂和乙酰化糖的第一混合物，所述酶催化剂包含具有CE-7特征基序的过氧化水解酶，所述乙酰化糖选自乙酰化单糖、乙酰化二糖、乙酰化多糖、以及它们的组合，所述第一混合物任选还包含无机或有机缓冲剂、腐蚀抑制剂、和润湿剂；以及
b)包含过氧源和水的第二混合物，所述第二混合物任选包含螯合剂。
57.权利要求56的制剂，其中所述第一混合物呈固体片或粉末的形式。
58.权利要求56的制剂，其中所述制剂包括用于分开贮存和组合所述第一混合物与所述第二混合物的装置。
59.权利要求58的制剂，其中所述用于分开贮存的装置包括容器，所述容器在单个容器或两个分开的容器中包含两个分开的隔室。
60.权利要求59的制剂，其中所述第一混合物包含在水溶性包中。
61.通过将权利要求56的第一混合物与第二混合物组合生成过氧羧酸而产生的消毒制剂。
62.权利要求61的消毒制剂，其中所述消毒制剂还包含不存在于所述第一混合物或所述第二混合物中的另外量的水。
63.重组大肠杆菌细胞，所述细胞包含katE中的破坏和katG中的破坏，条件是所述宿主细胞不是大肠杆菌UM2。
64.权利要求63的重组大肠杆菌宿主细胞，其中所述细胞来源于大肠杆菌菌株MG1655。
65.权利要求64的重组大肠杆菌宿主细胞，所述细胞还包含能够利用或者产生过氧化氢的酶。
66.权利要求65的重组大肠杆菌宿主细胞，其中所述细胞还包含至少一种具有过氧化水解酶活性的酶。
67.权利要求66的重组大肠杆菌宿主细胞，其中所述至少一种具有过氧化水解酶活性的酶包含CE-7糖酯酶特征基序。
权利要求
1.由羧酸酯生产过氧羧酸的方法，所述方法包括
a)提供一组反应成分，所述成分包括
1)选自下列的羧酸酯
i)具有以下结构的酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R2＝C1-C10直链或支链烷基、链烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH
并且n＝1-10；和
ii)具有以下结构的甘油酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R3和R4各自为H或R1C(O)；以及
iii)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖的乙酰化糖；
2)过氧源；以及
3)具有过氧化水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包括酶，当使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO2比对时，所述酶包含特征基序，所述特征基序包含
i)在氨基酸位置118-120的RGQ基序；
ii)在氨基酸位置179-183的GXGSG基序；和
iii)在氨基酸位置298-299的HE基序；和
b)在合适的含水反应条件下将所述反应成分组合，由此产生过氧羧酸。
2.权利要求1的方法，其中当使用CLUSTALW与参考序列SEQ IDNO2比对时，所述酶的特征基序还包括在氨基酸位置267-269的LXD基序。
3.权利要求1的方法，其中所述酶与SEQ ID NO2具有至少40％的氨基酸同一性。
4.权利要求3的方法，其中所述酶包含选自下列的氨基酸序列SEQID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，和SEQ ID NO32或者通过对所述氨基酸序列取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而衍生的具有过氧化水解酶活性的基本上类似的酶。
5.权利要求1的方法，其中所述酶包含由在严格条件下杂交的核酸分子编码的氨基酸序列，所述核酸分子具有选自下列的核酸序列的核酸分子SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
6.权利要求5的方法，其中所述酶选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ IDNO16，和SEQ ID NO32。
7.权利要求6的方法，其中所述酶由核酸分子编码，所述核酸分子具有选自下列的核酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ IDNO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
8.权利要求1的方法，其中过氧羧酸在将反应成分组合后约5分钟至约2小时内以至少20ppm的浓度生成。
9.权利要求1的方法，其中所述乙酰化糖选自葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙酰化木聚糖、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛、和三-O-乙酰基-葡萄烯糖。
10.权利要求1的方法，其中所生成的过氧羧酸选自过乙酸、过丙酸、过丁酸、过乳酸、过乙醇酸、过甲氧基乙酸、过-β-羟基丁酸、以及它们的混合物。
11.权利要求10的方法，其中所生成的过氧羧酸是过乙酸。
12.使用酶促产生的过氧羧酸组合物消毒硬质表面或无生命物体的方法，所述方法包括
a)提供一组反应成分，所述成分包括
1)选自下列的底物
i)具有以下结构的酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R2＝C1-C10直链或支链烷基、链烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH
并且n＝1-10；和
ii)具有以下结构的甘油酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R3和R4各自为H或R1C(O)；
iii)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖和乙酰化多糖的乙酰化糖；
2)过氧源；以及
3)具有过氧化水解活性的酶催化剂，其中当使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO2比对时，所述酶催化剂包含特征基序，所述特征基序包含
i)在氨基酸位置118-120的RGQ基序；
ii)在氨基酸位置179-183的GXGSG基序；和
iii)在氨基酸位置298-299的HE基序；
b)在合适的含水反应条件下将所述反应成分组合，由此形成过氧羧酸产物；
c)任选将所述过氧羧酸产物稀释；以及
d)使所述硬质表面或无生命物体与在步骤b)或步骤c)中产生的过氧羧酸接触，由此将所述表面或所述无生命物体消毒。
13.权利要求12的方法，其中当使用CLUSTALW与参考序列SEQID NO2比对时，酶的特征基序还包括在氨基酸位置267-269的LXD基序。
14.权利要求12的方法，其中所述酶与SEQ ID NO2具有至少40％的氨基酸同一性。
15.权利要求14的方法，其中所述酶包含选自下列的氨基酸序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ IDNO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，和SEQ ID NO32或者通过对所述氨基酸序列取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而衍生的具有过氧化水解酶活性的基本上类似的酶。
16.权利要求12的方法，其中所述酶包含由核酸分子编码的氨基酸序列，所述核酸分子在严格条件下与具有选自下列的序列的核酸分子杂交SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41和SEQ ID NO60。
17.权利要求16的方法，其中所述酶选自SEQ ID NO2，SEQ IDNO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQID NO16，和SEQ ID NO32。
18.权利要求17的方法，其中所述酶由核酸分子编码，所述核酸分子具有选自下列的核酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQIDNO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
19.权利要求12的方法，其中所述过氧羧酸在将反应成分组合后约5分钟至约2小时内以至少20ppm的浓度生成。
20.权利要求12的方法，其中所述乙酰化糖选自葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙酰化木聚糖、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛、和三-O-乙酰基-葡萄烯糖。
21.权利要求12的方法，其中所生成的过氧羧酸选自过乙酸、过丙酸、过丁酸、过乳酸、过乙醇酸、过甲氧基乙酸、过-β-羟基丁酸、以及它们的混合物。
22.权利要求21的方法，其中所生成的过氧羧酸是过乙酸。
23.权利要求12的方法，其中所述硬质表面或无生命物体选自罐、传送机、地板、排水沟、管道、冷却器、致冷机、设备表面、墙壁、阀、带、接头、窗户、水处理设施、池、矿泉、发酵罐、药物或生物药物制造设备、药物或生物药物成分、药物或生物药物赋形剂、衣服、医疗设备、牙科设备、外科手术设备、内窥镜、腹腔镜、刷、鞋、烹饪表面、食品制备表面、浴室表面、盥洗室、家畜、牛、奶牛、羊、马、猪、牛肉、家禽、猪肉、蔬菜、水果、海鲜、以及它们的组合。
24.权利要求12的方法，其中所述甘油酯底物选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、以及它们的混合物。
25.权利要求12的方法，其中所述乙酰化糖选自葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙酰化木聚糖、乙酰化木聚糖片段、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛、和三-O-乙酰基-葡萄烯糖。
26.权利要求12的方法，其中所生成的过氧羧酸选自过乙酸、过丙酸、过丁酸、过乳酸、过乙醇酸、过甲氧基乙酸、过-β-羟基丁酸、以及它们的混合物。
27.权利要求26的方法，其中所生成的过氧羧酸是过乙酸。
28.权利要求12的方法，其中使所述硬质表面或无生命物体在组合所述反应成分后约5分钟至约168小时内与步骤b)或步骤c)中生成的过氧羧酸接触。
29.权利要求28的方法，其中使所述硬质表面或无生命物体在组合所述反应成分后约5分钟至约48小时内与步骤b)或步骤c)中所生成的过氧羧酸接触。
30.权利要求29的方法，其中使所述硬质表面或无生命物体在组合所述反应成分后约5分钟至约2小时内与步骤b)或步骤c)中所生成的过氧羧酸接触。
31.权利要求12的方法，其中所述硬质表面或无生命物体上的存活生物污染物的浓度降低至少3-log。
32.权利要求31的方法，其中所述硬质表面或无生命物体上的存活生物污染物的浓度降低至少5-log。
33.权利要求1或权利要求12的方法，其中所述酶催化剂是选自微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物、部分纯化的酶、和纯化的酶的形式。
34.权利要求33的方法，其中所述酶催化剂缺乏过氧化氢酶活性。
35.权利要求34的方法，其中所述酶催化剂是缺乏过氧化氢酶活性的重组大肠杆菌菌株。
36.权利要求35的方法，其中所述重组大肠杆菌菌株包含破坏的选自下列的催化剂基因katE、katG以及katE与katG两者。
37.通过权利要求1的方法生产的消毒剂或漂白组合物。
38.过氧羧酸生成系统，所述系统包括
a)选自下列的底物
1)具有以下结构的酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R2＝C1-C10直链或支链烷基、链烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH2CH2-O)nH或(CH2CH(CH3)-O)nH
并且n＝1-10；和
2)具有以下结构的甘油酯
其中R1＝任选被羟基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7直链或支链烷基，并且R3和R4各自为H或R1C(O)；以及
3)选自乙酰化单糖、乙酰化二糖、和乙酰化多糖的乙酰化糖；以及
b)过氧源；以及
c)具有过氧化水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包括酶，当使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO2比对时，所述酶具有特征基序，所述特征基序包含
i)在氨基酸位置118-120的RGQ基序；
ii)在氨基酸位置179-183的GXGSG基序；和
iii)在氨基酸位置298-299的HE基序。
39.权利要求38的过氧羧酸生成系统，其中当使用CLUSTALW与参考序列SEQ ID NO2比对时，所述酶的特征基序还包括在氨基酸位置267-269的LXD基序。
40.权利要求39的过氧羧酸生成系统，其中所述酶与SEQ ID NO2具有至少40％的氨基酸同一性。
41.权利要求38或权利要求37的过氧羧酸生成系统，其中所述酶包含选自下列的氨基酸序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，和SEQID NO32或者通过对所述氨基酸序列取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而衍生的具有过氧化水解酶活性的基本上类似的酶。
42.权利要求38的过氧羧酸生成系统，其中所述酶包含由核酸分子编码的氨基酸序列，所述核酸分子在严格条件下与具有选自下列的序列的核酸分子杂交SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQID NO7，SEQ IDNO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
43.权利要求42的过氧羧酸生成系统，其中所述酶选自SEQ IDNO2，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，和SEQ ID NO32。
44.权利要求43的方法，其中所述酶由核酸分子编码，所述核酸分子具有选自下列的核酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO5，SEQIDNO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO31，SEQ ID NO41，和SEQ ID NO60。
45.权利要求38的过氧羧酸生成系统，其中将该组反应成分在含水反应条件下组合以原位形成过氧羧酸。
46.权利要求38的过氧羧酸生成系统，其中所述反应成分还包含一种或多种选自下列的成分一种或多种螯合剂、一种或多种润湿剂、一种或多种腐蚀抑制剂、以及它们的组合。
47.权利要求38的过氧羧酸生成系统，其中所述过氧羧酸是过乙酸。
48.权利要求38的过氧羧酸生成系统，其中所述反应成分在试剂盒中提供。
49.制剂，所述制剂包含
a)包含酶催化剂和羧酸酯的第一混合物，所述酶催化剂包含具有CE-7特征基序的过氧化水解酶，所述羧酸酯选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它们的混合物；所述第一混合物任选包含选自下列的另外组分无机或有机缓冲剂、腐蚀抑制剂、润湿剂、以及它们的组合；以及
b)包含过氧源和水的第二混合物，所述第二混合物任选还包含螯合剂。
50.权利要求49的制剂，其中所述酶催化剂呈固体颗粒形式。
51.权利要求49的制剂，其中所述制剂包括用于分开贮存和组合所述第一混合物与所述第二混合物的装置。
52.权利要求51的制剂，其中所述用于分开贮存的装置包括容器，所述容器在单个容器或两个分开的容器中包含两个分开的隔室。
53.权利要求51的制剂，其中所述第一混合物包含在水溶性包中。
54.通过将权利要求49的第一混合物与第二混合物组合生成过氧羧酸而产生的消毒制剂。
55.权利要求54的消毒制剂，其中所述消毒制剂还包含不存在于所述第一混合物或所述第二混合物中的另外量的水。
56.制剂，所述制剂包含
a)包含酶催化剂和乙酰化糖的第一混合物，所述酶催化剂包含具有CE-7特征基序的过氧化水解酶，所述乙酰化糖选自乙酰化单糖、乙酰化二糖、乙酰化多糖、以及它们的组合，所述第一混合物任选还包含无机或有机缓冲剂、腐蚀抑制剂、和润湿剂；以及
b)包含过氧源和水的第二混合物，所述第二混合物任选包含螯合剂。
57.权利要求56的制剂，其中所述第一混合物呈固体片或粉末的形式。
58.权利要求56的制剂，其中所述制剂包括用于分开贮存和组合所述第一混合物与所述第二混合物的装置。
59.权利要求58的制剂，其中所述用于分开贮存的装置包括容器，所述容器在单个容器或两个分开的容器中包含两个分开的隔室。
60.权利要求59的制剂，其中所述第一混合物包含在水溶性包中。
61.通过将权利要求56的第一混合物与第二混合物组合生成过氧羧酸而产生的消毒制剂。
62.权利要求61的消毒制剂，其中所述消毒制剂还包含不存在于所述第一混合物或所述第二混合物中的另外量的水。
63.重组大肠杆菌细胞，所述细胞包含katE中的破坏和katG中的破坏，条件是所述宿主细胞不是大肠杆菌UM2。
64.权利要求63的重组大肠杆菌宿主细胞，其中所述细胞来源于大肠杆菌菌株MG1655。
65.权利要求64的重组大肠杆菌宿主细胞，所述细胞还包含能够利用或者产生过氧化氢的酶。
66.权利要求65的重组大肠杆菌宿主细胞，其中所述细胞还包含至少一种具有过氧化水解酶活性的酶。
67.权利要求66的重组大肠杆菌宿主细胞，其中所述至少一种具有过氧化水解酶活性的酶包含CE-7糖酯酶特征基序。
全文摘要
提供了用于由羧酸酯生产过氧羧酸的方法。更具体地讲，在具有过氧化水解活性的酶催化剂存在下使羧酸酯与无机过氧化氢例如过氧化氢反应。基于保守结构特征，本发明过氧化水解酶催化剂被归类为糖酯酶家族7(CE-7)的成员。此外，还提供了包含通过本发明所述方法产生的过酸的消毒制剂。
文档编号C12P7/62GK101558161SQ200780045718
公开日2009年10月14日 申请日期2007年5月2日 优先权日2006年12月12日
发明者R·迪科西莫, J·E·加瓦根, M·S·佩恩, F·B·库林三世 申请人:纳幕尔杜邦公司