专利名称：：抗微生物肽作为对虾中细菌感染抗性标志物的用途的制作方法抗微生物肽作为对坏中细菌感染抗性标志物的用途本发明涉及编码抗微生物肽之基因的转录物作为对虾对细菌感染之抗性的标志物的用途。对虾的7JC产养殖涉及热带、亚热带和温带的许多国家。主要—吏用了9种对坏凡纳滨对坏(丄Zto/7e"fle"syfl""fl附"，太平洋白坏)，这是最广泛4吏用的品种；细角滨对坏(丄.s&/Zn^n:s，太平洋蓝坏)；来自大西洋的三个品种，包括白滨对奸(丄.s"^ras，大西洋白坏)、南方滨对虾(Z.sc/i附/故'，南方白奸)和保罗美对奸(i^r/"/i/7ew"^/s/wHz/e/w/s，圣保罗坏)；以及短^勾对奸(Pe/ifl^Mssem/sii/cflrt/s，绿虎坏)、斑节对奸(E柳owo^wi，，累、虎奸)、中国明对坏(i^W/iera/7eWfl^SCA/"CWS/S，肉坏)和日本嚢对蚱(Mflra/pe/iflmsy"/70w/cws,车坏(Kurumaprawn))。在其水产养殖中的一个主要问题是由感染性疾病引起的，主要是病毒或细菌来源的感染性疾病。就细菌致病性而言，已描述的主要感染原属于弧菌科(WZw》鼎c^^)(VANDENBERGHE等，Appl.Environ.Microbiol.,65:2592-7，1999)。尽管弧菌一般被认为是共栖或共生的细菌，但许多菌种在某些环境条件下也可能对奸产生致病性。在研究最广泛的菌种中，值得一提的是对虾弧菌(/7^Ifle/"V^),它对幼虫、幼奸和成年奸均有致病性，并且是奸的弧菌感染模型中最普遍使用的。此外，这种致病性弧菌是与名为"综合征93"的循环致死相关的主要病因，该病出现于1993年，其在生长期影响了新喀里多尼亚孵化场(MERMOUD等，Aquaculture，323-335,1998)。已经广泛使用抗生素作为预防剂和治疗剂来处理孵化场水域中的动物。由于出现了抗性细菌，也由于抗生素可能导致环境失衡，因此其应用目前已出现了问题。人们已提出了新的预防方法来控制疾病，例如使用会对孵化场中的动物存活及生长具有有益效果的益生菌，或者使用免疫刺激剂，例如来自酵母或来自细菌的(3-葡聚糖或多糖。因为缺乏记忆性的免疫系统，所以不可能将脊推动物中使用的免疫接种法用于曱壳动物中。在甲壳动物中，针对感染的防御是基于先天免疫应答，其主要参与者是血细胞，特别地，它们产生多种抗微生物肽。在对虾中，迄今最为熟知的抗微生物肽属于对虾素(penaeidin)家族(BACHERE等，Immunol.,Rev.,198:149-68，2004)。目前已鉴定的对虾素被分为三个亚类，分别称为PEN2、PEN3和PEN4(GUEGUEN等，Dev.Comp.Immunol.,30:283-8,2006)，PEN3亚类就数量而言是最有代表性的。在奸中还鉴定出了其他抗微生物多肽。例如，值得一提的是在斑节对奸血细胞cDNA文库中鉴定到的鲎抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharidefactor,ALF)同源物(SOMBOONWIWAT等，Dev.Comp.Immunol"29:841-51，2005)，以及在多个对虾品种的EST中鉴定到的溶菌酶同源物和11.5kDa抗孩i生物蛋白(称为crustin)同源物(GROSS等，Dev.Comp.Immunol.,25:565-77，2001;SUPUNGUL等，Mar.Biotechnol.(NY),4:487-94,2002)。在对奸中，在应答于非致病性物质刺激后或在致病细菌感染过程中对血细胞群的研究以及对对虾素表达的研究(MUNOZ等，Eur.J.Biochem.，269:2678-89，2002;MUNOZ等，CellMol.LifeSci"61:961-72，2004;DESTOUMIEUX等，J.CellSci"113(Pt3):461-9，2000)使得有可能更好地理解该免疫应答的机制。对奸对细菌感染之免疫应答的第一阶段(对应于感染后的最初6或12个小时)的特征为循环血细胞总数减少，以及对虾素相对表达降低。这种降低反映出血细胞向感染部位迁移并在此处裂解及释放对虾素。此第一阶段之后，在感染后24至48小时回复至基础水平。在该免疫应答的第二阶段(对应于感染后48至72小时)，在组织和血浆中都观察到释放的对虾素。此外，在血流和大多数组织中都观察到表达对蚱素的血细胞大幅增加。这种血细胞增加反映了造血作用活化的过程，其产生新的粒状血细胞群(其对虾素转录活性高于成熟血细胞的对虾素转录活性)。对感染抗性动物品系的遗传选择构成了用于使虾生产持续的可能有利的方法。为了实施该方法，期望拥有用于评价或预测动物对感染之抗性水平的标志物。在之前的研究中(DELORGERIL等，Physiol.Genomics,21:174-83,2005),本发明人的团队通过抑制消减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)研究了多种基因在用对蚱弧菌进行实验性感染之前和感染过程中的表达，此研究在感染后存活的坏中进行。他们这样鉴定了多种基因，其中尤其是编码抗微生物肽(例如对虾素國2(丄/^vPEN2)和对虾素-3(丄/te^PEN3)、溶菌酶以及富含脯氨酸和半胱氨酸的隐窝素(cryptdin)样肽)的基因。另一方面，在该SSH文库中未鉴定到编码在虾血细胞中正常表达的其他抗微生物肽(即crustin和抗LPS因子(ALF))的基因。还在感染后存活和未存活的坏中研究了这些基因在感染过程中的转录水平。编码对虾素-3、溶菌酶以及富含脯氨酸和半胱氨酸的肽的基因转录水平在所有动物中感染开始时均降低，其后仅在感染后存活的动物中提高。由此推断，这三种基因在感染过程中的差异性表达模式可能构成评价虾在感染后存活能力的良好标志物。本发明人着手寻找可用于评估虾对感染的免疫应答及其感染存活的其它标志物。这些研究在细角滨对虾种的两个品系中进行一种(对弧菌具有高抗性)是从在感染性"综合征93"发病后存活的种奸第三代中获得的品系；另一种(称为"对照，，或"未选择"品系)来自在新喀里多尼亚普遍使用的养殖条件下养殖的动物。它们随后成群养殖在波利尼西亚，并且未就感染抗性进行选择。这样，本发明人展示了其应答于弧菌感染的转录i普与该感染后存活具有相关性的其它基因，并且特别地发现了对于一些基因，基础转录水平(即未用病原体感染时的表达水平)也与感染后的存活相关。本发明涉及这些多种基因作为对虾对感染(特别是弧菌病)之抗性的预测标志物。本发明人观察到，在已就其弧菌病抗性进行选择之品系的奸中，溶菌酶和PEN3-1同工型的基础转录水平高于对照品系，而PEN3-2同工型的基础转录水平则低于对照品系。对未选择动物群进行的实验可显示，在感染后存活的动物中PEN3-1同工型、对奸素-2(PEN2)和ALF的平均基础转录水平高于在所述感染后未存活的动物。本发明人还展示了编码下文称为"富甘氨酸肽"之肽的新基因，并显示在感染后存活的动物中该基因的平均基础转录水平低于在感染后未存活的动物。细角滨对虾溶菌酶转录物的cDNA序列在附带的序列表中以编号SEQIDNO:1代表，其还可在GenBank以登记号CV699332获得。序列SEQIDNO:1在其它坏品种中的同源物可在GenBank以如下登记号获得凡纳滨对虾(AF425673)、斑节对虾(AF539466)、中国明对蚱(AY661543)、短沟对坏(AY169675)和日本嚢对坏(AB080238)。细角滨对虾PEN3-1转录物的cDNA序列在附带的序列表中以编号SEQIDNO:2代表，其对应于基因组DNA中发现的序列(GenBank登记号AY351656，针对细角滨对坏)。细角滨对虾PEN3-2转录物的cDNA序列在附带的序列表中以编号SEQIDNO:3代表，其来自于PEN3-1的转录后修饰，包括RNA编辑以及除去数个氨基酸的基序。这两种同工型序列之间的比较示于图1。相同的区域用星号表示，不同的区域用点表示。在该核苷*列中，翻译起始密码子和终止密码子标有下划线。在该多肽序列(SEQIDNO:38和39)中，信号肽标有下划线，富含甘氨酸和脯氨酸的区域以浅灰色突出显示，富含半胱氨酸的区域为深灰色。细角滨对坏中对坏素-2(称为PEN2或PEN2-1)的cDNA序列可在GenBank中以登记号AY351655获得。它还在附带的序列表中以编号SEQIDNO:45代表。细角滨对蚱中抗LPS因子(ALF)的cDNA序列在附带的序列表中以编号SEQIDNO:40代表。细角滨对虾中富甘氨酸肽的cDNA序列在附带的序列表中以编号SEQIDNO:42代表。本发明的一个主题是用于评估对虾群中对致病细菌感染之抗性能力的方法，其特征在于该方法包括对取自测试群中未感染动物之样品的血细胞中的对虾素-3PEN3-1同工型的mRNA进4亍定量。根据本发明方法的一个优选的实施方案，该方法还包括定量测定对蚱素-3PEN3-2同工型的mRNA,并测定PEN3-1同工型/PEN3-2同工型的比值。高于1、优选高于2、更优选高于3的PEN3-1同工型/PEN3-2同工型比值预示着对感染存在高抗性能力。有利地，本发明的方法还包括定量测定以下RNA中的至少一种-对虾素-2(PEN-2)的mRNA;國富甘氨酸蛋白的mRNA;-ALF的mRNA。本发明的另一个主^1用于在对虾群中选择对致病细菌感染具有最佳抗性能力之动物的方法，其特征在于该方法包括对取自测试群中未感染动物之样品的血细胞中的对坏素-3PEN3-l同工型的mRNA进行定量，并选择其中所述mRNA的表达水平最高的动物。根据该方法的一个优选的实施方案，该方法还包括定量测定对虾素-3PEN3-2同工型的mRNA，测定PEN3-1同工型/PEN3-2同工型的比值，并选择该比值最高的动物。有利地，本发明的方法还包括定量测定以下RNA中的至少一种國对坏素画2(PEN-2)的mRNA;-富甘氨酸蛋白的mRNA;-ALF的mRNA，并选择其中对虾素-2之mRNA的表达水平和/或ALF之inRNA的表达水平最高和/或富甘氨酸蛋白之mRNA的表达水平最低的动物。根据本发明方法的一种变型，其用于评价对奸品系对致病细菌感染的抗性能力，其中除了对取自测试品系中未感染动物的血细胞中对奸素-3PEN3-1同工型的mRNA(以及有利地对奸素-3PEN3-2同工型的mRNA)进行定量以外，还包括定量测定以下RNA中的至少一种-溶菌酶的mRNA;-对虾素-3的mRNA。术语"对坏素-3的mRNA"在本文中定义为该基因同工型的所有转录物。根据本发明这一方法变型的一个优选实施方案，测定测试动物中一种或多种上述mRNA的量，并与同一品种虾的对照品系(即，未就对致病细菌的抗性进行选择的品系)未感染动物中同种mRNA的平均量进行比较。对于溶菌酶或PEN3-1同工型来说，高于对照坏的转录物水平预示着对感染的高抗性能力。对于对虾素-3或PEN3-2同工型来说，低于对照虾的转录物水平预示着对感染的高抗性能力。根据本发明这一方法变型的另一优选实施方案，该方法包括在以下至少一对中两个成员的mRNA量之间进行比较-溶菌酶/对虾素-3;-溶菌酶/PEN3-2同工型；國PEN3國1同工型/对坏素-3;-PEN3-1同工型/PEN3-2同工型。溶菌酶/对虾素-3的比值高于1.2、优选高于6.34，同样地溶菌酶/PEN3-2同工型的比值高于0.077、优选高于1.02，PEN3-1同工型/对蚱素-3的比值高于23.09、优选高于46.87，或者PEN3-1同工型/PEN3-2同工型的比值高于1.48、优选高于7.7，则预示着对感染的高抗性能力。本发明还使得可以基于感染过程中多种基因的转录模式来评估对虾中致病细菌感染的结局。除了之前鉴定的对虾素-3、溶菌酶以及富脯氨酸和半胱氨酸肽的转录模式(DELORGERIL等，2005，同上)以外，感染过程中看似与感染结局相关的转录模式还包括对虾素-2、cnistin和PEN3-1同工型的转录模式。对于所有情况而言，所述转录;f莫式均在感染后6至72小时(优选感染后24小时)观察。感染后，就crustin和富脯氨酸及半胱氨酸肽而言，在感染后存活的动物中观察到比未存活动物中更高的转录水平。就crustin而言，该水平在存活动物中与基础转录水平(在感染之前测量)基^目等，但在未存活动物中则明显较低。就富脯氨酸及半胱氨酸肽而言，该水平在存活动物中比基础转录水平略低，但在未存活动物中则明显更低。对于其它基因，基因表,式与动物对感染的抗性之间的相关性取决于测试个体所来源的品系(对照品系或是就其感染抗性进行了选择的品系)。对于溶菌酶、对坏素-3和PEN3-l同工型的情况-在对照品系中，存活奸中感染后的转录水平高于未存活虾；就溶菌酶而言，其在存活动物中等于或高于基础转录水平，而在未存活动物中则明显较低；就对虾素-3而言，其在存活动物中略低于基础转录水平，而在未存活动物中则明显更低；就PEN3-1同工型而言，其在存活动物中等于或高于M转录水平，而在未存活动物中则明显较低；-在经选择品系中，感染后的转录水平在存活虾与未存活虾之间无显著差异。对于对虾素-2的情况-在对照品系中，感染后的转录水平在存活虾与未存活虾之间无显著差异；-在经选择品系中，存活坏中感染后的转录水平高于未存活虾；在存活动物中其与基础转录水平无显著差异，而在未存活动物中则明显较低(至多等于基础水平的60%)。本发明的一个主题是用于在对虾中评估致病细菌感染之结局的方法，其特征在于该方法包括在感染后6至72小时(优选24小时)对取自测试动物的血细胞中的crustin的mRNA进行定量。根据本发明方法的一个优选实施方案，该方法还包括将如上测定的crustin的mRNA量与取自感染前测试动物的血细胞中同种mRNA的量进行比较。crustincDNA序列在附带的序列表中以编号SEQIDNO:4代表。SEQIDNO:4序列在其它奸品种中的同源物可在GenBank中以下列登记号获得凡纳滨对奸(AF430076)、斑节对奸(DW042799)、日本嚢对奸(AB121740)和白滨对坏(AF430079)。0.9至1.1的"感染后crustin的mRNA/感染前crustin的mRNA"比值预示着在感染后存活；相反，小于或等于0.6的"感染后crustin的mRNA/感染前crustin的mRNA"比值则预示着在感染后不存活。适当时，所述方法还包括在感染后6至72小时(优选24小时)对取自测试动物的血细胞中的富脯氨酸及半胱氨酸肽的mRNA进行定量，并有利地将这样测定的mRNA量与感染前取自测试动物的血细胞中同种富脯氨酸及半胱氨酸肽的cDNA序列在附带的序列表中以编号SEQIDNO:5代表。SEQIDNO:5序列在其它坏品种中的同源物可在GenBank中以下列登记号获得凡纳滨对虾(BE188497)和斑节对虾(DT366712)。大于或等于0.7的"感染后富脯氨酸及半胱氨酸肽的mRNA/感染前富脯氨酸及半胱氨酸肽的mRNA"比值预示着在感染后存活；相反，小于或等于0.3的"感染后富脯氨酸及半胱氨酸肽的mRNA/感染前富脯氨酸及半胱氨酸肽的mRNA"比值预示着在感染后不存活。当期望评估其感染结局的动物不属于已就其对致病细菌的抗性进行了选择的品系时，也可以在感染后6至72小时(优选24小时)取自测试动物的血细胞中对以下mRNA中的一种或多种进行定量-溶菌酶的mRNA;-对虾素-3的mRNA;-对奸素-3PEN3-1同工型的mRNA，并有利地将每种所选mRNA的这样测定的量与感染前取自测试动物的血细胞中同种mRNA的量进4亍比较。大于或等于1的"感染后溶菌酶的mRNA/感染前溶菌酶的mRNA"比值预示着在感染后存活；相反，小于0.2的"感染后溶菌酶的mRNA/感染前溶菌酶的mRNA"比值则预示着在感染后不存活。大于或等于0.8的"感染后对虾素-3的mRNA/感染前对虾素-3的mRNA"比值预示着在感染后存活；相反，小于或等于0.5的"感染后对奸素-3的mRNA/感染前对蚱素-3的mRNA"比值则预示着在感染后不存活。大于或等于1的"感染后PEN3-1同工型的mRNA/感染前PEN3-1同工型的mRNA"比值预示着在感染后存活；相反，小于或等于0.2的"感染后PEN3-1同工型的mRNA/感染前PEN3-1同工型的mRNA"比值则预示着在感染后不存活。或者，当期望评估其感染结局的动物属于已就其对致病细菌的抗性进行了选择的品系时，还可以在感染后6至72小时(优选24小时)取自测试动物的血细胞中定量测定对奸素-2的mRNA，并有利地将这样测定的量与感染前取自该测试动物的血细胞中的同种mRNA量进行比较。大于或等于0.8的"感染后对虾素-2的mRNA/感染前对虾素-2的mRNA"比值预示着在感染后存活；相反，小于或等于0.6的"感染后对虾素-2的mRNA/感染前对蚱素-2的mRNA"比值预示着在感染后不存活。特别地，可以实施本发明的方法以评估对奸(特别是细角滨对奸)对弧菌病(特别是对坏弧菌感染)的抗性。可使用本领域技术人员已知的多种RNA定量法来实现本发明(综述参见例如QUERE等，J.Virol.Methods,105(2):189-196,2002;SKULDTECH的专利FR2815043;HUGGETT等,GenesImmun"6(4):279-284,2005;EMRICH等，Me仇odsMol.Biol"191:99-108,2002;POWELL,MethodsMol.Biol"99:297-319,2000;NESS,MethodsMol.Biol"316:13-33，2006;SCHENA等，TrendsBiotechnol"16(7):301-306，1998;RAMSAY,NatBiotechnol.,16(1):40-44,1998)。例如，可以提及的是基于定量RT-PCR(逆转录之后进行聚合酴涟式反应)的多种方法。这些方法的一般原则是，通过PCR对从待测生物样品中提取的mRNA进行逆转录获得的cDNA制备物选择性扩增期望测量其表达的基因(耙基因)，并对所得的扩增产物进行定量。目前最广泛使用的定量RT-PCR方法利用实时PCR技术(综述参见例如VALASEK&REPA,AdvPhysiolEduc,29:151-9,2005),其中通it^扩增反应的指数期测量其形成的荧光来定量测定扩增产物。本发明的主题还包括用于实施本发明方法的试剂盒，其中通过定量RT-PCR来进行转录物的定量。除了扩增反应和检测扩增产物所需的常规緩冲剂和试剂以外，本发明的试剂盒还包含对每种待测mRNA具有特异性的至少一对引物。根据一个实施方案，本发明的试剂盒包含对对虾素-3PEN3-1同工型mRNA具有特异性的引物对，以及对对蚱素-3PEN3-2同工型mRNA具有特异性的引物对。所述试剂盒还可包含选自以下的一对或多对引物-对对虾素-2(PEN-2)的mRNA具有特异性的引物对;-对富甘氨酸蛋白的mRNA具有特异性的引物对；-对ALF的mRNA具有特异性的引物对；-对溶菌酶的mRNA具有特异性的引物对。根据另一实施方案，本发明的试剂盒包含对crustin的mRNA具有特异性的引物对并且有利地还包含对富脯氨酸及半胱氨酸肽的mRNA具有特异性的引物对。优选地，所述试剂盒还包^^对溶菌酶的mRNA具有特异性的引物对和/或对对虾素-3的mRNA具有特异性的引物对和/或对PEN3-1同工型的mRNA具有特异性的引物对。本发明的试剂盒还可包含上述所有引物对，从而使得可以使用该试剂盒来实施本文所述的所有方法。为了实现本发明，还可以使用DNA芯片，也称为生物芯片、微阵列、芯片等(综述参见例LOCKHART&WINZELER,Nature,405:827-36，2000)。DNA芯片的一^Jf、理是在固体支持物的表面(例如玻璃、塑料或尼龙表面)上的多个位点固定探针，所述探针由与期望测量其表达的多种基因(靼基因)互补的多核苷酸组成。对从待测生物样品中提取的mRNA(—般通过逆转录转变为cDNA)进行标记，并使其接触固定于支持物上的探针。对杂交信号的测量使得可以评估待测样品中耙基因mRNA的量。本发明的主题还包括用于实施本发明方法的DNA芯片。根据一个实施方案，本发明的DNA芯片包含对对虾素-3PEN3-1同工型的mRNA具有特异性的探针，以及对对虾素-3PEN3-2同工型的mRNA具有特异性的探针。其还可包含选自以下的一种或多种探针-对对虾素-2(PEN-2)的mRNA具有特异性的探针；-对富甘氨酸蛋白的mRNA具有特异性的探针；-对ALF的mRNA具有特异性的探针；-对溶酶体的mRNA具有特异性的探针。根据另一实施方案，本发明的DNA芯片包含对c賜tin的mRNA具有特异性的探针，并且有利地还包含对富脯氨酸及半胱氨酸肽的mRNA具有特异性的探针。优选地，所述试剂盒还包含对溶菌酶的mRNA具有特异性的探针和/或对对虾素-3的mRNA具有特异性的探针和/或对PEN3-1同工型的mRNA具有特异性的探针。本发明的DNA芯片还可包含所有上述探针，从而使得可以用于实施本发明的所有方法。本发明在下文的进一步描述中将得到更为明确的理解，下文涉及非限制性的实例，表明了对虾血细胞中抗微生物肽的转录水平与所述虾对对虾弧菌感染之抗性之间的相关性。实施例材料和方法动物从IFREMER[FrenchResearchInstituteforExploitationoftheSea,法国海洋开发研究院的新喀里多尼亚实验室(Ifremer，BP2059,98846NoumeaCedex，NewCaledonia,France)获得来自两个奸品系的细角滨对奸幼虫(20-30g)。这些品系之一称为"经选择品系"，由在"综合征93"后存活的动物杂交产生，其孵出后前六个月在有利于对虾弧菌感染的条件下在水箱中伺养(初始密度20-25PL/m2),然后在较低密度(1至2只虾/m2)下饲养存活的动物从而在12月龄时繁殖。另一品系称为"对照品系"，由在"综合征93"发生率极低的"常规"条件下(初始密度2PL/m2)在水箱中饲养的动物杂交产生。在这两个品系中，均通过单独标记动物来控制近交，以防止近亲交配。下述实验中使用的动物取自经选择品系的第3代(G3-选择)和对照品系的第3代(G3-对照)。此外，从大溪地(Tahiti)的IFREMER实验室获得细角滨对蚱幼虫(20-30g)。与生存于恒定存在致病细菌环境下的来自新喀里多尼亚的虾不同，这些动物从未接触过奸致病细菌。实验性感染通过将蚱浸入水箱中含有lxl03CFU/ml(对应于致死剂量的20%(LD20))对坏弧菌菌林AM101的海水中2小时来进行对虾弧菌感染实验(SAULNIER等，Dis,AquaticOrg.,40:109-115,2000)。随后用过滤的海水冲洗动物，并将其转移进100L水箱中。未感染的动物在单独的100L水箱中M。对于用于整体分析的第一类实验性感染来说，将每个虾品系(对照和经选择)的动物分成3组(每组15只虾)，每组置于单独的水箱中。对于每个虾品系，在实验性感染前24小时(-24)收集第一组血淋巴样品，以构成未感染对照；在感染后12小时(+12)和感染后24小时(+24)收集另两组血淋巴样品。用于个体分析的第二类实验性感染的方案示于图2。通过在第三个腹节的角质层下注射有色硅酮对坏进行个体标记。在感染前24小时取出第一个血淋巴样品，在感染后24小时取出第二个样品。在感染后96小时(急性致死期)中死亡之动物的血淋巴样品以及来自在该阶段结束时存活之动物的样品各自进行区分。在通过向腹节中注射有色硅酮对虾群中每个个体进行标记后24小时，通过向每只蚱注射含有"100黑美人弧菌(f肠,/一/)w/('/z〃""/")"(60%致死剂量)的溶液来进行黑美人弧菌感染。RNA分离和实时PCR分才斤才艮据生产商所述方案，使用Trizol试剂(GibcoBRL)(1mS/l()7个细胞)从奸的血细胞中分离总RNA。用DNA酶(TURBODNase,Ambion)处理总RNA,以除去污染的基因组DNA,接着用酴-氯仿抽提以除去DNA酶。根据生产商(Invitrogen)的说明，在20反应体积中，使用SuperscriptII逆转录试剂盒由1pg-悉RNA合成cDNA。在含有lxSYBRGREENMASTERMIX(Qiagen)和0.5fiM每种所用引物的10pl反应体积中，将0.5nl每种逆转录反应物作为实时PCR的模板。<吏用LightCyder(RocheMolecularBiomedicals),如下进4亍每个实时PCR反应95匸卯0s的起始变性步骤，然后扩增靶cDNA(95匸变性15秒、54匸~64"C(取决于所用引物)杂交15秒、72匸延伸15秒的35个循环)。每个反应均一式三份进行。为了确定所用每个引物对的效率，使用5个连续稀释度(103至107个拷贝/jul)的含有相应靼序列之质粒获得标准曲线。实时PCR的结果以与经参考基因(延伸因子la(EF-la，SEQIDNO:41))标准化之相对表达差异的形式来表示，如PFAFFL所述(NucleicAcidsRes.,29:45，2001)。就所测试的基因而言，实时PCR效率为1.87至1.98。由于该效率不精确地等于2.00(代表每个循环的100%扩增效率)，因此使用对效率差异进行修正的方程来计算相对丰度，如PFAFFL(同上，2001)所示。实施例1:在细角滨对虾血细胞的PEN3亚组中分离新的对虾素序列寸吏用来自两个品系中每一品系的15只坏的血细胞的cDNA库，进行第一个实时PCR系列，以比较这两个品系之间Z/te^PEN3肽(GenBankAY351656)转录物的丰度，其中使用以下引物f-GGTTCCCTCCTCCGTCCGCC-3'(SEQIDNO:6>和5'-GTCTTCTCCATCAGCCGGAG-3'(SEQIDNO:7)，效率为1.94，杂交温度为60°C。对PCR产物解链曲线的分析示于图3:图3的图例:经选择的奸品系-:对照奸品系每个峰的对应解链温度在峰上方标出。结果显示，两个解链峰相差近0.5t:。经选择坏品系的PCR产物解链温度似乎高于对照虾品系(分别为86.43士0.06和85.98士0,02，pO.01,LightCycler3.5软件)。依次克隆具有不同解链温度的实时PCR产物，使得表征出294和270个核苷酸的两种cDNA序列(图1A)。在经选择坏品系中鉴定的对应于最高解链温度的序列被鉴定为之前表征的丄&^PEN3序列，下文称为Zi&(VPEN3-1。在对照虾品系中鉴定到的第二种cDNA序列与丄/to印PEN3-1的差异是缺失24个核苷酸以及在该序列另一部分中三个核苦i^。在M^列水平上，丄/to^PEN3-2与PEN3-1的差异是在N端结构域缺失PIGRPFVT8个残基，以及用酪氨酸残基替换了甘氨酸残基(图1B)。由于丄/to(VPEN3-1与丄/to^PEN3-2序列极其相似，因而进行研究以确定它们是由两个不同基因表达还是由单个基因表达。为此，通过PCR扩增血细胞的两种序列——即基因组DNA序列和cDNA序列。构建了用于区分这两种序列的引物对针对Z/te^PEN3-l的P3-1R和P3-1F:[5'-ACCGATAGGCAGGCCCTTCGTGAC-3'(SEQIDNO:8)和5'-CGATAGAGGGCACACGTTGCCW(SEQIDNO:9)，效率为1.85，杂交温度为64。C，以及针对丄/ft^PEN3-2的P3-2R和P3-2F:[5'-GAGACCGATAGGCAGGCCTG-3'(SEQIDNO:10)和5'-CGZWAGAGGGCACACGTTGTAT—3'(SEQIDNO:11)，效率为1.91,杂交温度为64°C。针对/i,'、力，PEN3-1和丄/Y外PEN3-2的这些引物所得PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果分别示于图4A和图4B中。图4的图例gDNA=基因组DNAC-=阴性对照。所用的引物对在两种转录物的示意图上方以箭头标出。如下表示出两种转录物之间的核苷酸差异在￡&印PEN3-1上的阴影矩形和丄/te^PEN3-2上的虚线表示24个核普酸的缺失；在丄/^vPEN3-1上的灰色方形和丄/"tvPEN3-2上的白色方形表示3个核苷酸的改变。无论使用何种引物对，均可>^因组DNA以及从cDNA扩增丄&0;PEN3-1。在这两种情况下，所扩增的片段大小相同，表明不存在内含子(图4A)。对于丄Zte^PEN3-2而言，仅从cDNA中得到了扩增，从基因组DNA中则没有(图4B)。实施例2:在对奸弧菌感染过程中的抗微生物肽基因表达模式为了分析虾的循环血细胞中的抗微生物肽(antimicrobialpeptide,AMP)基因表达，在细角滨对虾中研究了近期研究(MUNOZ等，Cell.Mol.LifeSci.,61:961-972，2004;DELORGERIL等，2005,同上)中描述的AMP(或推定的AMP)的6种cDNA序列。对虾素丄/te^PEN2-1和PEN3的GenBank登记号分别为AY351655和AY351656。溶菌酶和"富半胱氨酸肽，，的GenBank登记号分别为CV699332和CV699287。crustincDNA序列在附带的序列表中以编号SEQIDNO:4表示。ALFcDNA序列在附带的序列表中以编号SEQIDNO:40表示。对经选择品系和对照品系通过实时PCR分析编码AMP、￡/to^PEN2-l和-3、ALF、crustin、溶菌酶和富半胱氨酸肽之基因的表达模式，以研究发生对虾弧菌感染期间的一般性表达状况。使用了下文表1列出的PCR引物(有义及反义)。标出了每对引物特定的杂交温度，以及通过方程E-10[-l/斜率(PFAFFL，2001，同上)计算的PCR效率。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>结果在图5中给出，将相对表勤目对于延伸因子loc进行标准化，根据效率修正的2-AACt法(efficiency-corrected2-AACtmethodXPFAFFL2001,同上)，参考未感染奸(相对表达=1)计算每个值。图5的图例:经选择的坏品系；一对照奸品系。-24=未感染坏+12=感染后12小时+24=感染后24小时在两个坏品系中，ALF、溶菌酶、crustin和富半胱氨酸肽的RNA量似乎在感染过程中发生变化，并且与未感染奸相比发生变化。在感染过程中，仅ALF的表达状况在两个虾品系中显示出差异。具体而言，ALF转录物的量在对照品系中从感染后12小时开始提高(感染后12和24小时的相对提高分别为3x和2.1x),而在经选择奸品系中该提高延迟到感染后24小时(倍数为2.7x)。对于其它AMP，转录物的量在感染后最初12个小时中降低。这对于溶菌酶、crustin和富半胱氨酸肽来说尤为明显，在对照品系中(与未感染虾相比分别相对降低3.2x、3.3x和4.5x)和经选择品系中(与未感染奸相比分别相对降低25x、3.5x和9.1x)都是如此。Crustin转录物和富半胱氨酸肽转录物的降低在感染24小时后倾向于回复至未感染奸中观察到的水平。在两个奸品系中都观察到了这种倾向，但crustin转录物和富半胱氨酸肽转录物在12至24小时之间的提高似乎在经选择品系中(分别相对提高5.8x和9.8x)比在对照品系中(分别相对提高2.5x和2.6x)显著更高。在感染12小时后，在两个品系中均观察到溶菌酶同样的降低；然而，在感染24小时后，经选择虾品系中的溶菌酶转录物丰度比对照虾品系更低。至于对奸素1/"^PEN2-1和PEN3(特别是丄/^vPEN3),其表达在对照品系中仅稍有变化。在经选择品系中，丄/to^PEN2-l和PEN3转录物的量在感染后12小时至24小时之间提高(分别为3.93x和2.73x)。实施例3:确定抗微生物肽1^表达水平与坏品系的感染抗性之间的关系溶菌酶的表达以及对坏素-3的总体表达比较了两个奸品系(经选择和对照)中溶菌酶、丄/"trPEIN3以及两种同工型￡feO;PEN3-l和i:/te^PEN3-2的基础转录水平。如上文材料和方法中所述，使用在感染前24小时取得的血细胞RNA样品库(15只虾的库)通过实时PCR测量感染前24小时转录物的量。为了对溶菌酶转录和i^鄉PEN3的总体转录进行定量，使用上文表1所示的引物。为了具体定量PEN3-1和丄a外PEN3-2的转录，使用实施例1中所述针对丄fe&PEN3-l的引物P3-1R和P3-1F，以及针对Z/to^PEN3-2的引物P3-2R和P3-2F。得自溶菌酶的结果示于图6A,得自丄/,鄉PEN3的结果示于图6B。PEN3-1和丄/t^PEN3-2所得结果在图7中给出。将相对表达水平相对于延伸因子la进行标准化。对于溶菌酶和hYs&PEN3的情况(图6)，结果表示为每个虾品系5或6只坏的平均值士SDV。根据效率修正的2-AACt法(PFAFFL，2001，同上)，参考对照品系组(相对表达=1)来计算每个值。对于丄/fe^PEN3-1和丄/toi^PEN3-2(图7),将相对表达水平相对于EF-1ot进行标准化，并根据效率修正的2-AACt法，参考使用对照品系的第1个PEN3-2值(相对表达=1)来计算每个值。结果表示为从两个蚱库中一式三份测定的平均值士SDV。图6的图例■对照奸品系□经选择的虾品系*两个坏品系之间的统计学差异，p<().05(Student's检验)图7的图例圆丄/te(vPEN3-1转录物□丄/to^PEN3-2转录物这些结果显示了就存活进行过选择之品系的坏以及对照品系奸之间的显著差异。就溶菌酶而言，对照品系奸中血细胞的基础转录水平低于经选择品系的虾。相反，就L/^vPEN3的总体转录而言，对照品系蚱的血细胞中的基础转录水平高于经选择品系的虾。对于l/^vPEN3-l，其基础转录水平在经选择品系的虾的血细胞中比在对照品系坏中高得多。相反，丄zY砂PEN3-2的^5dj转录水平在经选择品系的虾的血细胞中比在对照品系虾中低得多。此外，在经选择品系中，ZiteO;PEN3-l的基础转录水平比PEN3-2高得多，而在对照品系中未观察到PEN3-1与i^YsO;PEN3-2^ftli转录水平之间的差异。实施例4:对蚱弧菌感染过程中抗微生物肽基因表ii^式与虾的个体存活能力之间的关系。在经选择坏品系和对照品系中，在感染后存活或未存活的个体之间比较感染前24小时和感染后24小时的ALF转录物、丄/te^PEN3(PEN3)转录物及其同工型丄/toWPEN3-1和丄/toO;PEN3-2的转录物、丄/to^PEN2-1(PEN-2)转录物、溶菌酶转录物、crustin以及富半胱氨酸肽转录物的量。结果在图8和9中给出。如上所述，通过实时PCR从个体样品(每种条件下5或6只虾)中测定转录物的量，结果表示为这些测量值的平均值。将相对表达水平相对于EF-loc进行标准化。对于ALF、ZitoO;PEN3、丄/te^PEN2-l、溶菌酶、crustin和富半胱氨酸肽(图8)，根据效率修正的2-AACt法，参考未感染组(相对表达=1)计算感染过程中的值。用方括号相连的实验条件显示了统计学差异，p<(U)5(ANOVA检验LSD)。图8的图例□:感染前的量(-24)謹存活的虾中感染后24小时的量(+24S)固未存活的坏中感染后24小时的量(+24NS)。就ALF而言，在两个奸品系中观察到感染后24小时转录物的提高。在对照品系中，与未感染蚱相比，在存活的坏中观察到转录水平的显著差异，而在未存活坏中则没有。相反，在经选择的蚱品系中，与未感染虾相比，在未存活的坏中观察到转录水平的显著差异，而在存活虾中则没有。这两个品系均未显示出存活虾与未存活虾之间的显著差异。就对虾素家族而言，PEN2-1和PEN3转录物在感染后24小时降低。对于ZZ^vPEN3，转录水平的显著差异仅在对照品系的未存活虾与未感染虾之间以及未存活虾与存活虾之间观察到。对于PEN2-1,在两个品系中均观察到显著差异。在对照品系中，在存活坏和未存活虾中均XC察到与未感染虾相比转录物的显著降低。在经选择品系中，在存活奸与未存活奸之间以及在未存活虾与未感染坏之间都观察到显著差异。另一方面，在未感染坏与存活虾之间未观察到显著差异。Crustin和富半胱氨酸肽转录物在两个虾品系中显示出类似的表达状况。在两个品系中，均在未存活奸中观察到与未感染动物相比crustin和富半胱氨酸肽转录物的显著降低，并在存活动物中观察到与未存活动物相比这些转录物的显著提高。对于溶菌酶的情况，在对照品系中，在未存活奸中观察到与未感染奸相比转录物量的大幅降低。在经选择品系中，在存活坏和未存活虾中均观察到与未感染坏相比转录物量的显著降低。对于PEN3-1和丄/^vPEN3-2(图9)，根据效率l务正的2-AACt法，参考所有值的平均值来计算感染过程中的值。图9的图例圆丄&^PEN3-1转录物(P3-l)的相对表达□PEN3画2转录物(P3誦2)的相对表达-24=感染前收集的奸+24S=感染后24小时收集的存活奸+24NS=感染后24小时收集的未存活坏。在对照品系中，仅在感染24小时后在存活虾中观察到h7^VPEN3-1转录物的量与丄/to^PEN3-2转录物的量之间的显著差异。对于未存活的动物，两种转录物Z/te^PEN3-1和l/toO;PEN3-2的量与感染前测量的量相比是极低的。在经选择品系中，无论感染时间如何，均观察到丄toO;PEN3-l与Z/^vPEN3-2的量之间的显著差异。无论是在感染前、24小时时在存活虾中还是在未存活虾中，丄/te^PEN3-1比PEN3-2的丰度都高得多。实施例5:利用DNA芯片分析转录物表达制备了微阵列膜来评价编码细角滨对坏的六种抗微生物肽(ALF、crustin、富甘氨酸肽、hY鄉PEN3-l、溶菌酶、富半胱氨酸肽)的基因转录物的丰度。溶菌酶和"富半胱氨酸肽"的GenBank登记号分别为CV699332和CV699287。PEN3-1和crustincDNA序列在附带的序列表中分别以编号SEQIDNO:2和SEQIDNO:4表示。ALFcDNA在附带的序列表中以编号SEQIDNO:40表示。"富甘氨酸肽"cDNA序列在附带的序列表中以编号SEQIDNO:42表示。制备探针cDNA通过常规PCR扩增编码这六种抗微生物肽的每种基因的cDNA片段(探针cDNA)。使用下文表2列出的PCR引物(有义M义)。标出了每对引物的特定杂交温度，以及所扩增PCR产物的预计大小。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>根据以下终浓度制备PCR混合物1引物混合物、1mMdNTP、1.5mMMgCl2;緩冲液10x至ix;50终体积(QSH20M吏用0.5piTaq。如下进行每个PCR反应首先是97"C15分钟的变性步骤，然后扩增cDNA(97X:变性l分钟，62X:杂交l分钟，72匸延伸l分钟(循环数根据所扩增基因而变化))，最后是72t:10分钟的延伸步骤，并保存于4匸。J吏用"QIAquickPCRPurificationKitProtocol，，试剂盒(Qiagen),根据供应商的推荐，对之前扩增的每种基因的PCR产物进行纯化。j吏用分光光度计测定经扩增并纯化的PCR产物(260和280nm的吸光度比值接近1.8)，以对其进行定量，接着浓缩至100Mg/pl用于膜沉积。膜制备将纯化并浓缩的PCR产物在98C变性10分钟。根据图10所示的组织图示，以100ng/点的比例将PCR产物(探针cDNA)沉积在两片尼龙膜上。图IO的图例=ALF=crustinO=富甘氨酸肽=溶菌酶0=富半胱氨酸肽将膜在室温下干燥15分钟。通过毛细作用，使用0,5MNaOH将膜上沉积的PCR产物再次变性15分钟(两次)。用0.5MTrisHC1，pH7.4将膜中和10分钟(两次)，接着在室温下干燥10分钟。在UV下进行PCR产物的最终固定。随后将膜干燥，以在室温下避光保存。制备耙cDNAcDNA制备物得自从感染后未存活的未选择奸或在感染后存活的经选择坏的血细胞中分离的总RNA。为了获得将在膜上杂交的每个实验条件的cDNA(靶cDNA)，使用与探针cDNA制备中同样的特异性引物对和同样的PCR条件来扩增编码所述六种抗微生物肽之基因中每一种的cDNA。另一方面，引入了地高辛标记的dlJTP(dUTP-DIG)("PCRDIGlabellingmixture",RocheDiagnostics)。膜的杂交和显影在第一步中，将固定有探针cDNA的膜与预杂交緩冲液预杂交45分钟，所述预杂交緩冲液由6xSSC、0,1。/。N-肌氨酸月桂酯、0.02%SDS、1%脱脂乳和1%吐温20组成。在第二步中，将所得的靶d)NA在98X:下变性10分钟，接着置入冰中。将每种靶cDNA沉积到其相应的膜上，并在室温下孵育30分钟。随后用洗涤緩沖液Wl(O.lxSSC,0.1%SDS)将膜剧烈振荡洗涤两次，各1分4中。接着将膜在室温下与450pllxTBS(lOmMTrisHC1，pH7.4;150mMNaCl;0.3%BSA)、1%脱脂乳、2%硫酸葡聚糖(其中含有1/5000稀释的偶联有过氧化物酶的地高辛抗体(Fab))轻柔摇动孵育30分钟。其后用0.5ml1xTBS将膜剧烈振荡洗涤两次，各1分钟。将膜在300显影液(TMB-3，3，，5，5，-四甲基联苯胺——过氧化物酶的比色底物)在黑暗中孵育15分钟。将膜用无菌水(无DNA酶和RNA酶)洗涤5分钟。结果在图11中给出。图11的图例入=与来源于未选择且未存活的虾的靶cDNA杂交的膜；8=与来源于经选择且存活的坏的靶cDNA杂交的膜。结果显示，可在与未选择且未存活坏的靶cDNA杂交(图11A)或与经选择且存活的坏的靶cDNA杂交(图11B)的膜上显现的杂交信号显示了无需任何特殊设备即可区分的模式。与定量PCR的结果一致，五种所分析的肽(crustin、富甘氨酸肽、Z/te^PEN3-l、富半胱氨酸肽和溶菌酶)显示出信号的变化，与从在感染后存活的经选择虾制备的靶标杂交的膜(图11B)上的强度高于与从在感染后未存活的未选择虾中制备的靶标杂交的膜(图IIA)。另一方面，ALF杂交信号在两种膜之间未显示任何差异，因此构成了该实验的阳性对照。实施例6:抗微生物肽基础表达水平与奸对黑美人弧菌感染之抗性之间的关系通过将有色硅酮注入腹节中而对细角滨对虾(56个个体)进行个体标识，接着从腹窦中取出血淋巴样品(200以从其中分离血细胞。在水箱中(用于胁迫后恢复的条件)保存24小时后，通过注射含有"100黑美人弧菌，，(60%致死剂量)的溶液来对虾进行实验性感染。将对死亡率的个体监测进行至感染后96小时(理论上的死亡结束时间)，以区分来自死于感染的奸的样品与来自存活虾的样品43个个体死于感染，13个存活。如上文材料和方法中所述，通过实时PCR测量在感染前24小时取得的样品中ALF、丄/to^PEN3誦1和丄&(vPEN3-2、丄/to07PEN2-1(PEN2)、溶菌酶、crustin、富半胱氨酸肽和富甘氨酸肽基因的基础转录水平。使用上文表l所示引物进行ALF、丄&0;PEN2-1(PEN2)、溶菌酶、crustin和富半胱氨酸肽转录物的定量。为了具体定量￡feO;PEN3-l和丄/f鄉PEN3-2的转录，使用实施例1中所述针对Z^鄉PEN3-1的引物P3-1R和P3-1F以及针对Z&sO;PEN3-2的P3-2R和P3-2F。使用引物SEQIDNO:43(5，-GATGTTCCTGGCGGTGGTC-3，)和SEQIDNO:44(5，-CGTTTTGCTCGGTGCAGTTC-3，)来定量富甘氨酸蛋白的RNA。如之前实验所述，将相对表达水平相对于延伸因子1a进行标准化。在感染后存活的个体(第2组)和未存活个体(第1组)之间比较每种转录物的表达。感染后死亡的蚱(第1组)与感染后存活的虾(第2组)之间表达数据的多变量分析(ANOVA检验)结果在表3中给出。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>对于丄/"7>，PEN3-2的情况，在第1组中观察到该转录物表达的极高的个体间差异。取决于个体，该组中观察到的值从无表达到强表达。另一方面，第2组则仅包括了PEN3-2表达极低的动物。这些结果表明在存活虾与未存活虾之间存在显著差异，并显示有可能根据Zto&PEN3-l、富甘氨酸肽、丄/feitvPEN2和ALF的表达水平以及通过丄/K(VPEN3-1与丄to^PEN3-2的表达比而在两组动物之间进行统计学区分(p值0.05)。因此，编码W^FPEN3-1、丄to^PEN2和ALF的转录物丰度较高是虾能够在感染后存活的特征(平均相对表达分别为3.06比1.88,2.05比1.5以及1,63比1.05),而编码富甘氨酸肽的转录物丰度较高是虾不能在感染后存活的特征(平均相对表达为1.23比1.02)。此外，能够在感染后存活的奸比不能在感染后存活的坏具有更高的丄/^vPEN3-1/Lfe^PEN3-2比值(第1组为1.6x104，第2组为5,3)。权利要求1.用于评估对虾群体抗御致病细菌感染之能力的方法，该方法包括对取自测试群体未感染动物样品的血细胞中对虾素-3PEN3-1同工型的mRNA进行定量。2.权利要求l的方法，该方法还包括定量测定对虾素-3PEN3-2同工型的mRNA，并测定PEN3-1同工型/PEN3-2同工型的比值。3.权利要求1和2中任一项的方法，该方法还包括对以下RNA中的至少一种进行定量-对坏素國2(PEN-2)的mRNA;-富甘氨酸蛋白的mRNA;-ALF的mRNA。4.权利要求1和2中任一项的方法，该方法用于评估对虾品系抗御致病细菌感染的能力，其还包括在取自测试品系未感染动物的血细胞中定量测定以下RNA中的至少一种-溶菌酶的mRNA;-对奸素-3的mRNA。5.权利要求4的方法，该方法还包括将一种或多种所述mRNA的量与同种奸的对照品系未感染动物中同种mRNA的平均量进行比较。6.权利要求4和5中任一项的方法，该方法还包括对以下至少一对中两个成员的mRNA量进行比较-溶菌酶/对奸素-3;-溶菌酶"￡3-2同工型；-PEN3-1同工型/对奸素-3;-PEN3-1同工型/PEN3-2同工型。7.用于评估对虾中致病细菌感染之结局的方法，该方法包括在取自感染后6至72小时之测试动物的血细胞中定量测定crustin的mRNA。8.权利要求7的方法，该方法还包括将crustin的mRNA的量与取自感染前该测试动物的血细胞中同种mRNA的量进行比较。9.权利要求7和8中任一项的方法，该方法还包括在取自感染后6至72小时之测试动物的血细胞中定量测定富脯氨酸及半胱氨酸肽的mRNA,并有利地将这样测定的mRNA量与取自感染前该测试动物的血细胞中同种mRNA的量进行比较。10.权利要求7至9中任一项的方法，该方法还包括在取自感染后6至72小时之测试动物的血细胞中定量测定以下mRNA中的一种或多种-溶菌酶的mRNA;-对坏素-3的mRNA;國对坏素-3PEN3-1同工型的mRNA，并有利地将这样测定的每种所选mRNA的量与取自感染前该测试动物的血细胞中同种mRNA的量进行比较。11.权利要求7至9中任一项的方法，该方法还包括在取自感染后6至72小时之测试动物的血细胞中定量测定对奸素-2的mRNA，并有利地将这样测定的量与取自感染前该测试动物的血细胞中同种mRNA的量进行比较。12.权利要求l至ll中任一项的方法，其中所述对虾属于细角滨对虾(丄.鄉,/ra欲/s)种。13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述感染为弧菌病。14.用于实施权利要求1至13中任一项所定义方法的试剂盒，其中通过定量RT-PCR对所述转录物进行定量，除了扩增反应及检测扩增产物所需的緩沖液和试剂之外，所述试剂盒还包含对每种待测定mRNA具有特异性的至少一对引物。15.权利要求14的试剂盒，该试剂盒包含对对奸素-3PEN3-l同工型的mRNA具有特异性的引物对以^Jt对奸素-3PEN3-2同工型的mRNA具有特异性的引物对。16.权利要求15的试剂盒，该试剂盒还包含选自以下的一对或多对引物画对对虾素画2(PEN画2)的mRNA具有特异性的引物对；-对富甘氨酸蛋白的mRNA具有特异性的引物对；-对ALF的mRNA具有特异性的引物对；-对溶菌酶的mRNA具有特异性的引物对。17.权利要求14至16中任一项的试剂盒，该试剂盒包含对crustin的mRNA具有特异性的引物对以及对富脯氨酸及半胱氨酸肽的mRNA具有特异性的引物对。18.DNA芯片，其包含对对坏素-3PEN3-1同工型的mRNA具有特异性的探针以及对对坏素-3PEN3-2同工型的mRNA具有特异性的探针。19.权利要求18的DNA芯片，该DNA芯片还包舍逸自以下的一种或多种探针-对对虾素-2(PEN-2)的mRNA具有特异性的探针；-对富甘氨酸蛋白的mRNA具有特异性的探针；國对ALF的mRNA具有特异性的探针；-对溶菌酶的mRNA具有特异性的探针。20.权利要求18至19中任一项的DNA芯片，该DNA芯片还包含对crustin的mRNA具有特异性的探针和/或对富脯氨酸及半胱氨酸肽的mRNA具有特异性的探针。全文摘要本发明涉及编码抗微生物肽之基因的转录物用于评估对虾(特别是细角滨对虾)对细菌感染(特别是弧菌病)之抗性的用途。文档编号C12Q1/68GK101553580SQ200780045562公开日2009年10月7日申请日期2007年11月6日优先权日2006年11月7日发明者埃弗利娜·巴谢尔,大卫·皮克马尔,扬妮克·盖冈,朱利安·德洛盖里勒申请人:法国海洋开发研究院(Ifremer)