专利名称：：用于坏死性肠炎的、包含突变的产气荚膜梭菌α毒素抗原的家禽疫苗及生产疫苗的方法用于坏死性肠炎的、包含突变的产气荚膜梭菌a毒素抗原的家禽疫苗及生产疫苗的方法
背景技术：
：产气荚膜梭菌(Cfo欲Wwm/^/n'"gera)("Cp")，一种革兰氏阳性厌氧菌，与许多疾病有关，包括鸡的坏死性肠炎、婴儿猝死综合征、和气性坏疽(Titball等，1999)。坏死性肠炎(NE)是家禽产业中一种严重的、致命的、和流行的疾病(Justin等，2002)，其特征在于急性肠毒血症，导致小肠坏死和高至50%的死亡率，主要是在2-12周龄的鸡和火鸡中。使用抗生素的预防性处理是家禽产业当前用于预防Cp感染的主要方法。由于对抗生素抗性细菌抹的发生的广泛关注，对备选方法存在长期需要。产气荚膜梭菌编码一种定义为a-毒素的外毒素的基因。Cp的a-毒素(cpa)据报导是坏死性肠炎的主要毒力决定因素，诱导使之虛弱的坏死性损害(Logan等，1991)。产气荚膜梭菌A型菌抹是最流行的环境菌抹，而且生成高水平的a-毒素(Ginter等，1996)。a-毒素是370个氨基酸(AA)的锌依赖性磷脂酶C(PLC),其拥有酶和毒素二者的性质(Justin等，2002)。虽然cpa是偏爱磷脂酰胆碱的磷脂酶C(PC-PLC)，但是毒性源自其水解磷脂酰胆碱和鞘磷脂底物的能力，这两种磷脂底物都是真核细胞膜的关键成分(Justin等，2002)。在溶血、坏死、血管透化、和血小板聚集的明显性质外，该毒素对真核细胞代谢引发多种微小效应，包括花生四烯酸级联的激活和蛋白激酶C活性的刺激(Ginter等，1996)。ot-毒素由两个结构域组成，即ot-螺旋的N端结构域和八条链的(3-三明治式C端结构域。N端(AA残基l-246)包含磷脂酶C活性位点和三个相关(associated)锌离子结合位点。C端(AA残基256-370)负责钙依赖性膜结合。它的作用是促进ot-毒素与膜磷脂的相互作用。C端结构域是a-毒素的磷脂识别以及溶血活性所要求的(T池all等，l"9)。已经生成了产气荚膜梭菌a-毒素的片段并测试了独立的功能。在小鼠中，在用毒素的N端(Cpal-249)或C端(Cpa247-370)结构域免疫后，诱导了与全长oc-毒素起交叉反应的抗体。a-毒素的更小片段不诱导交叉反应性抗体。3在体外，抗Cpal-249中和毒素的磷脂酶C活性，但是不中和溶血活性。抗Cpa247-370中和磷脂酶C和溶血活性二者。在N端和C端结构域片段中，只有使用的Cpa247-370的免疫在体内诱导了针对毒素致命效应的保护。另外，使用Cpa247-370的免疫在小鼠模型中提供了针对完整生物体A型产气荚膜梭菌的保护。此研究证实了a-毒素(具体是cpaC端结构域)在气性坏疽中的至关重要作用(Williamson和Titball,1993)。美国专利No.5，851,827(Titball和Williamson)涉及用于在动物中诱导针对产气荚膜梭菌a-毒素的抗体生成的肽和疫苗。这些肽包含a-毒素氨基酸247-370的氨基酸序列，但是缺乏氨基酸l-240之间磷脂酶C和/或鞘磷脂水解活性所必需的表位。进一步提供了针对肽和疫苗生成的抗血清和抗体，特别是单克隆抗体和用于生产它们的杂交瘤细胞系。由产气荚膜梭菌菌抹NCTC8237生成的a-毒素据显示在以下AA位置不同于由大多数自人和小牛分离的产气荚膜梭菌菌抹生成的a-毒素Alal74变成Aspl74;Thrl77变成Alal77;Ser335变成Pro335。然而，这些差异不改变该蛋白质的毒性。另外，自此菌抹衍生的C端结构域疫苗被证明针对来自牛肠产气荚膜梭菌菌株的a-毒素提供保护(Ginter等，1996)。产气荚膜梭菌a-毒素的定点诱变已经成为众多研究的主题以阐明对于此蛋白质的毒性至关重要的氨基酸。Nagahama等(1"5)报告了AAH-68或H-148用G替换的单一点突变(H68G或H148G)导致该毒素的溶血、磷脂酶C、鞘磷脂酶、和致命活性的完全丧失。然而，对野生型a-毒素抗血清的抗原性得到了保留。H148L替代得到了相同的结果。H126G、H136G、或H136A突变显箸降低但未消除毒性。H-46、-207、-212、或-241处的突变显示出对生物学活性没有影响，指明了这些残基对于毒性不是至关重要的。野生型毒素及11-68、-126、和-136处的变异毒素包含两个锌原子。H-148处的变异毒素只拥冇一个锌原子，提示了H-148结合对于a-毒素的活性位点至关重要的一个锌原子，而且与野生型毒素结合的两个锌原子无一与H-68、-126、或-136商己j立(co-ordinated)。Guillouard等(1996)在来自蜡状芽孢杆菌(Bac,7/wce"w)的PC-PLC的晶体结构的基础上进行了一系列定点诱变研究，因为产气荚膜梭菌a-毒素的N端结构域与其完整磷脂酶C高度同源。AA替代D56N、H126S、H68S、H148S、H136S、E152S、H11S、或W1S导致生物学活性的显著降低或完全消除。同样是基于蜡状芽孢杆菌的已知结构，Nagahama等(1997)调查了D-56、D-130、和E-152在产气荚膜梭菌a-毒素的溶血、磷脂酶C(PLC)、和鞘磷脂酶(SMase)活性中的作用。用E、N、G、或S替换a-毒素中的D-56导致溶血、PLC、和SMase活性的完全丧失。D-130处的变异毒素显示出与野生型毒素的生物学活性相比降低大约1OO倍的生物学活性。用G替代E-152引起这些活性的完全丧失，而保留对野生型a-毒素抗血清的抗原性。然而，E152Q或E152D导致毒性的显著降低，但不是完全消除。Martin和Hergenrother(1998)研究了D-55在来自蜡状芽孢杆菌的PC-PLC进行的一般碱催化(generalbasecatalysis)中的作用，该AA位置类似于产气荚膜梭菌a-毒素中的D-56。用L、N、或E进行了替代，其中L导致催化活性的最大降低(野生型的9x1(TV。)。正如根据GenBank提交序列所确定的，可获得的产气荚膜梭菌a-毒素(cpa)序列在牛和哺乳类隔离群中高度保守。许多公众可获得的来自鸡隔离群的DNA序列未延伸入C端结构域中(GenBank登录号AAL85329、AAL85330、AAL85331、AAL85332)。已经公开了来自天鵝的全长a毒素序列(GenBank登录号AF204209)，而且所编码的蛋白质与自菌抹13，人隔离群分离的a毒素(GenBank登录号CLOPLC05)高度分歧(Justin等，2002)。最近，比较了来自产气荚膜梭菌的25种鸡隔离群的cpa的全长蛋白质序列(Sheedy等，2004)，而且发现在氨基酸序列中只有小差异(相对于菌株13标准品的1-6处差异)。本发明部分地关于针对坏死性肠炎(NE)的家禽用疫苗的开发。在导入适宜的突变以消除其毒性后，本发明利用外毒素毒力因子作为疫苗。本发明为NH提供了家禽疫苗。该疫苗利用突变的、全长的、无毒的产气荚膜梭菌(aoW〃W,'wmper/hVgems)(Q)a-毒素外毒素的新型保护性抗原(Mcpa)。此疫苗的效用通过例如鸡中Q挑战(challenge)后NE损害严重程度的降低得到了证明。本文中还披露了用于以巨大数量生产此疫苗的新方法。一种例示性的方法涉及细菌表达系统，优选利用荧光假单胞菌(/^dJwno"fl5//wescem)(P/)的细菌表达系统。发明概述还披露了一种新型的来自Q鸡隔离群的VI型a毒素。附图简述图l显示了自鸡、天鵝、人、和牛宿主分离的多种产气荚膜梭菌a-毒素氨基酸序列的比对。图2是树形图，基于a-毒素的推导氨基酸序列图示了鸡Cp隔离群的序列相关性。图3图示了构建载体中所牵涉的克隆步骤，所述载体用于在大肠杆菌(五.co//)中表达C端带his标签的Mcpa。图4图示了构建载体中所牵涉的克隆步骤，所述载体用于在大肠杆菌ce.co/z)中表达N端带his标签的Mcpa。图5显示了为了在荧光假单胞菌中表达带his标签的Mcpa而构建的构建体的限制性位点。图6是为了在荧光假单胞菌中表达无标签Mcpa而构建的构建体的限制性图谱。图7显示了使用通过阴离子交换层析和洗脱级分的SDS-PAGE进行的纯化，自荧光假单胞菌回收无标签Mcpa。图8展示了纯化后的无标签Mcpa中溶血活性的损失；还显示了由于样品中的残余去污剂引起的溶血的存在。图9显示了纯化后的Mcpa样品中卵磷脂酶活性的缺失。图10是来自一项临床研究的每个处理组的损害评分的马赛克图，用以评估所配制的Mcpa作为皮下疫苗用于针《附表简述表l显示了自鸡分离的Cpa毒素的变异。表2报告了稻和烟草物种中密码子偏爱值，以及用于设计在稻和烟草中都具有最佳表达的基因的平衡偏爱值。表3^l告了Mcpa蛋白质的编码区的密码子组成。表4总结了纯化后的Mcpa样品和对照的溶血活性终点。表5概括了用于在幼鸡中评估Mcpa抗原的临床研究设计。表6报告了来自临床试验的每个处理组的损害评分。6表7包括了损害评分的统计学分析的结果。序列简述SEQIDNO:l是来自产气荚膜梭菌鸡隔离群的天然a毒素编码区的核苷酸序列。SEQIDNO:2是由SEQIDNO:l编码的、来自产气荚膜梭菌鸡隔离群的天然a毒素蛋白质。SEQIDNO:3是为突变型成熟产气荚膜梭菌a毒素的植物优化编码区的核苷酸序列。SEQIDNO:4是由SEQIDNO:3编码的、突变型成熟产气荚膜梭菌a毒素的氨基酸序列。SEQIDNO:5是改良型15kDa玉米醇溶蛋白内质网耙向肽(targetingpeptide)的植物优化DNA序列。SEQIDNO:6提供了改良型15kDa玉米醇溶蛋白内质网靶向肽的蛋白质序列。SI':QIDNO:7提供了编码成熟突变型产气荚膜梭菌a毒素蛋白质(Mcpa)与15kl)A玉米醇溶蛋白内质网靶向肽、和KDELER存留肽(retentionpeptide)的才直物优化DNA序列。S1':QIDNO:8提供了成熟突变型产气荚膜梭菌a毒素蛋白质(Mcpa)与15kDA玉米醇溶蛋白内质网靶向肽、和KDELER存留肽的融合蛋白。SEQIDNO:9提供了编码有his标签、凝血酶识别位点、S标签和肠激酶识别位点的，在荧光假单胞菌中表达的Mcpa的DNA序列。SEQIDNO:10提供了有his标签、凝血酶识别位点、S标签和肠激酶识别位点的，在焚光假单胞菌中表达的Mcpa的蛋白质序列。SEQIDNO:ll提供了编码没有his标签、凝血酶识别位点、S标签和肠激酶识别位点的，在焚光假单胞菌中表达的Mcpa的DNA序列。SEQIDNO:12提供了没有his标签、凝血酶识别位点、S标签和肠激酶识别位点的，在焚光假单胞菌中表达的Mcpa的蛋白质序列。发明详述本发明部分地关于针对坏死性肠炎(NE)的家禽用疫苗的开发。本发明牵涉在导入适宜突变以消除其毒性后利用毒力因子(诸如外毒素)作为疫苗。本发明为NE提供了家禽疫苗。该疫苗利用突变的全长产气荚膜梭菌(X-毒素(cpa)。此疫苗的效用通过例如NE挑战试验中NE损害严重程度的降低得到了证明。如果a-毒素抗原对于家禽NE的保护是有效的，那么要求坏死性损害在肠道中发作之前成功投递以实现a-毒素的致敏和后续中和。它还必须是无毒的。选择全长a-毒素蛋白质依照本发明进行评估，试图保证正确折叠和有效抗原呈递。然而，用作疫苗要求无毒型式。这可以通过在cpa中工程化改造多种突变以消除毒性和将在异源表达系统中回复的可能性降至最低来实现。依照本发明生成的a-毒素疫苗设计成具有3处位点特异性突变(D56L、H148G和E152G)以消除毒性。正如根据GenBank提交序列所确定的，公众可获得的cpa序列在牛和哺乳类隔离群中是高度保守的。已经公开了来自天鹅的全长a毒素序列，但是高度分歧(Justin等，2002)。得到了来自两个自鸡肠衍生的Cp隔离群的基因组DNA(BenchmarkBiolabs,Inc.,Lincoln,NE)，而且a-毒素基因进行了完全测序。在这两个鸡隔离群之间没有检测到差异。将所得氨基酸序列与发表的数据比对，而且确定与牛肠隔离群CER89L43是高度同源的(见图l)。图l显示了来自产气荚膜梭菌隔离群BBLl和BBL2的受试a毒素序列(BBL鸡a毒素)与Sheedy等(2004)的I-V型序列和天鹅、人、牛、和受试突变型cpa序列的比对。如图2所示，BBL基因表现为新的VI型的例子，与m型最密切相关。图2是树形图，图示了鸡Cp隔离群的相关性。此新类毒素和基因是本发明的一个方面。选择cpa的三个氨基酸位置进行突变以生成无毒型式的cpa，同时潜在地保留免疫原性。第56位(天冬氨酸)是cpa的催化位点。两个位置是因为可能干扰锌结合而选择的第148位组氨酸和第152位谷氨酸。因此，在鸡衍生的cpa序列中进行以下替代，以用作全长突变型NE抗原D56L;H148G;E152G(见图l)。本文中还披露了用于以巨大数量生产此疫苗的新方法。所例示的方法涉及细菌表达系统，优选利用菱光假单胞菌系统的细菌表达系统，例如美国专利No.4，861，595中所记载的。8至今的研究指明了可以在荧光假单胞菌中以巨大数量表达突变型(X-毒素蛋白质。已经在体外测试了过表达的、纯化的蛋白质，而且发现它不具有溶血或卵磷脂酶活性。在体内，已经证明了作为疫苗的功效。这些结果例证了焚光假单胞菌作为非常合适的系统用于表达疫苗候选蛋白质的用途。此系统不仅提供动物健康疫苗的高水平表达，而且大部分所生成的蛋白质是可溶性形式的。取决于蛋白质的类型，摇瓶中的产量范围为10-100mg/l;在受控发酵罐条件下，这些产量可以提高数倍，使得疫苗生产是成本效果合算和经济的。此项工作的目标之一是生成所表达抗原以保护驯养的家禽免于坏死性肠炎(NE)。如此，本发明涉及设计用于抗击NE疾病的策略。本发明的一种策略和一个实施方案牵涉在细菌培养物中生成突变型式的关键毒力因子，Cpa—毒素，供用作疫苗。另外，纯化的重组蛋白质可用于以下应用，包括生成抗血清(家兔或小鼠)、筛选用于酶联免疫吸附测定法(ELISA)开发/优化的单克隆、和提供Westem印迹开发/优化的阳性对照。作为疫苗候选物测试了全长突变型a毒素(Mcpa)。为了验证其作为疫苗候选物，需要足够量的纯蛋白质来进行临床研究以检验Mcpa是否针对NE提供保护。为了能够进行临床研究和为了开发用于评估异源系统中NE抗原表达的试剂，在细菌细胞中表达并自细菌细胞纯化该蛋白质。在大肠杆菌中以谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合物的形式表达Mcpa至很高的水平；然而，使用肠激酶(EK)切割位点自GST标签纯化Mcpa的努力由于Mcpa对EK的敏感性是复杂的。因此，在荧光假单胞菌(:Pf)中与较小标签一起生成Mcpa，纯化，测试毒性的缺失，并获得足够数量供临床试验和抗体生成用。Pf生成的蛋白质在鸡中引发免疫应答，而且在作为皮下疫苗施用时降低Cp诱发的NE损害的严重性。另外，生成无标签Mcpa抗原以更完全地表征该蛋白质的抗原性能力。如此，修饰该基因以排除所有分子标签。在荧光假单胞菌中表达无标签Mcpa,随后纯化，并测试毒性的缺失。无标签Mcpa也在作为皮下疫苗施用时降低NI':损害的抑制性并在鸡中引发免疫应答。另外，启动了一项研究计划来探索为家禽产业中控制NE的商业用途在植物细胞悬浮培养物中生成NE疫苗(a毒素)的可能性。在一项确定植物生成的蛋白质能否生成针对突变型毒素的免疫应答的努力中生成植物二元构建体来表达无活性形式的(X-毒素(经3处单一氨基酸替代突变锌结合磷脂酶位点)。还重新设计核苷酸序列以使用用于在优选的稻和/或烟草植物细胞中实现优化表达的密码子。在这些植物系统中获得了成功的表达。虽然植物生成的抗原的临床测试最初没有产生功效指标，但是可以优化特定投递配制剂等等来解决这些问题。"转基因"植物、植物细胞、等等定义为完整植物、植物细胞、植物细胞培养物、植物细胞系、植物组织培养物、低等植物、单子叶植物细胞培养物、双子叶植物细胞培养物、或其自包含外来DNA的转化植物细胞或原生质体衍生的后代，该外来DNA是通过实验室技术引入的，最初不存在于相同物种的天然非转基因植物细胞中。术语"转基因植物"和"转化植物"有时在本领域中是经过稳定转化以包含外来DNA的(该外来DNA在植物的基因组DNA内发挥功能和整合入植物的基因组DNA中)，或者是经过基于病毒的载体转化并瞬时表达外来DNA的转基因植物。对于本发明的实施，优选转化能培养和迅速扩大规模的植物细胞系。植物细胞培养物的使用避免了露地生产和大大降低了基因逃逸和食物污染的机会。烟草悬浮细胞培养物诸如NT-l和BY-2(Kato等,1972,Proc.IVIFS:l'，e匿nt.Technol.Today689-695;An，G.,1985,PlantPhysiol.79,568-570;Nagata等，1992,InternationalReviewofCytology132,l-30)是一些优选的实施方案，因为这些系对培养中的操作特别易感，易于转化，产生稳定整合事件，和易于冷冻保存。如此，烟草悬浮细胞系NT-1适合于本发明的实施。NT-l细胞最初是自烟草栽培变种亮黄2(NicotianatabacumL,cv.brightyellow2)衍生的。NT-l细月包系被广泛使用且易于获得；尽管可以使用几乎任何悬浮细胞系(烟草或其它)来实施本发明。此外，该细胞系是可变的且会应答培养条件而变化。适于使用的NT-1细胞可以自美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)以编号ATCCNo.74840获得。还可参见美国专利No.6,140,075。用于生成本发明疫苗的植物细胞培养物可包含自低等植物、双子叶植物、或单子叶植物衍生的转化植物细胞系。可衍生转化细胞系的双子叶植物的非限制性例子有番茄、马铃薯、甘薯、木薯、豆类(包括苜蓿和大豆)、胡萝卜、草莓、莴苣、橡/枥(oak)、枫/槭(maple)、核桃/胡桃(walnut)、玫瑰/蔷薇、薄荷、向日葵、红花、棉花、烟草、南瓜、雏菊(daisy)、芸苔(canola)或仙人球/仙人掌(cactus)。一些优选的系包括烟草细胞系，诸如NT-l或BY-2。若转化植物细胞系是自单子叶植物衍生的，则可使用诸如小麦、草地、草地草、谷类、玉蜀黍或玉米或谷类、稻、燕麦、小麦、大麦、高粱、兰花(orchid)、^尾(iris)、百合(lily)、洋葱、香蕉、甘蔗、高粱、或棕榈的植物来建立植物细胞系。另外，可以自低等植物诸如蕨类(ferns)、棵子植物(gymnosperms)、松柏类(conifers)、木贼(horsetails)、石松类(clubmosses)、莒类(liverwarts)、角苔(hornworts)、藓类(mosses)、红藻、褐藻、酉己子体、蕨类(pteridophytes)的孢子体、或绿藻建立细胞系。可以自玉米、稻或烟草植物衍生一些优选的植物细胞培养物。用众所周知的方法容易地实现，诸如Sambrook等，(1989)和Ausubel等，(1987)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,NewYork,NY中披露的那些。在制备稳定转化的植物细胞系后，可以通过验证基因插入物(遗传事件)琼脂板和悬浮培养的培养基可以基于普通的植物培养培养基(MurashigeandSkoog;MS)。如此，本发明包括植物细胞培养物及培养和保存植物细胞以用于生产家禽在本文中定义为任何驯养的、为了蛋或肉而饲养的鸟类，尤其是鸡、火鸡、和鴕鸟。"分离的"和"纯化的"暗示"人为"(handofman)且可应用于多核苷酸和蛋白质。例如，克隆的多核苷酸就是分离的多核苷酸。疫苗指用于给动物接种的组合物，其包含至少一种诱导对宿主免疫系统的刺激和预防或削弱后续的、不想要的病理的蛋白质性质药剂，该病理与宿主对后续病原体暴露的反应有关。致病生物体指在受感染的动物或宿主中引起疾病或诱导的/受控的生理状况的细菌、病毒、真菌、或原生动物。11佐剂指增强、提高、緩和或增强对免疫原或抗原的免疫应答的物质。佐剂通常增强体液和细胞二者免疫应答，但是任一应答提高而另一应答缺失也可用于定义佐剂。此外，佐剂及其用途是免疫学家众所周知的，而且通常用于在免疫原的剂量受限制时、在免疫原的免疫原性不佳时、或在施用路径是亚最佳时增强免疫应答。如此，术语"佐剂量，，指能够增强对给定免疫原或抗原的免疫应答的佐剂数量。等于"佐剂量"的质量会有变化，而且依赖于多种因素，包括但不限于免疫原的特征、所施用的免疫原的数量、宿主物种、施用路径、和施用免疫原的方案。"佐剂量，，可容易地通过特定情况集下常规实验来量化。这完全在普通技术人员的范围内，而且通常采用常规剂量应答测定，施用不同量的免疫原和佐剂。使用酶联免疫吸附测定法、放射免疫测定法、血细胞凝集测定法等等通过测定针对免疫原的细胞介导的应答或血清抗体滴度来测定应答。"有效剂量，，指在动物中诱导免疫应答所必需的量，其足以使动物有效抵抗由致病剂引起的攻击。对此类动物施用的剂量由内科医师、兽医、或受过训练的科学家根据相关情况(包括具体的免疫保护性颗粒或颗粒组合、动物的状况和大小、和所选择的施用路径)来确定。下文实施例显示了一些有效剂量。可以修饰本发明的多核苷酸以具有为在各种异源系统中的表达而优化的密码子使用率。此类技术是本领域众所周知的。参见例如美国专利6,013,523和6,015，891。本文中所公开的Mcpa基因是为了在烟草或稻植物细胞培养物中的表达经过密码子优化的。出乎意料的是，相关的核苷酸序列在大肠杆菌和荧光假单胞菌中导致高产量。荧光假单胞菌是用于回收可溶性Mcpa抗原的优选表达系统。本发明还包括与编码免疫保护性抗原的公开序列具有实质性(substantial)序列同源性的DNA序列。作用于本申请时，术语"实质性序列同源性"用于指明核苷酸序列(就DNA或RNA而言)或氨基酸序列(就蛋白质或多肽而言)展现出与另一核苷酸或氨基酸序列实质性等同的功能或结构。具有实质性序列同源性、同一性、或相似性的序列间的任何功能或结构差异会是最低限度的；也就是说，它们不会影响该序列如本申请所述发挥功能的能力。与本文本发明的实施方案可包括与例示序列具有90，91,92，93,和94%同一性，更优选95,96,97,98,和99%同一性且作为实质性等同物发挥功能的变体。这些变化(包括保守的和/或有些情况中非保守的变化)位于这些序列中对于功能性而言不是至关重要的部分。用于修饰寡核苦酸序列的例示性技术包括使用多核苦酸介导的、定点的诱变，记载于例如Zoller等(1984);Higuchi等(1988);Ho等(1989);Horton等(1989);及PCRTechnology:PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification,(编)Erlich(1989)。遗传工程技术的使用是本领域众所周知的。适当重建基因并适当放置在宿主质粒载体中在启动子(可能是强调节启动子)和转录/翻译终止子之间可实现Mcpa在特定外来宿主中的表达。任何此类宿主的合适性也可通过本领域普通技术人员知道的手段来测试。一旦转化微生物细胞(优选荧光假单胞菌)表达Mcpa至期望的(一般是高的)水平，就可收获细胞，溶解、纯化，并与佐剂一起配制。在本发明的这个方面，制备包含纯化的重组蛋白的组合物，而且可以以足以诱导期望生物学效应的量施用。本发明提供了活性Mcpa组合物，包括其中Mcpa是在微生物系统中生成的那些。本发明的细胞可通过口、鼻、眼或胃肠外注射手段来投递。此类接种方法也可用于治疗非鸟类的动物。本发明的方法也可用于减少、减轻或缩短NH。可通过免疫系统的佐剂和/或促进剂经由以足以诱导期望生物学效应的量施用纯化的重组蛋白和佐剂来增强此类疫苗。适用于本发明的微生物细胞包括原核生物(革兰氏阳性和革兰氏阴性两类生物体)和低等真核生物(诸如真菌)。适用于本发明的细菌细胞的物种包括以下属的那些1)肠杆菌科(Enterobacteriaceae),包括埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、志贺氏菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)、和变形菌属(Proteus)的种；2)芽孢杆菌科(Bacillaceae);3)根瘤菌科(Rhizobiaceae)，诸如根瘤菌属(Rhizobium);4)螺菌科(Spirillaceae)，诸如发光菌属(Photobacterium)、酵单胞菌属(Zymomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、气单月包菌属(Aeromonas)、弧菌属(Vibrio)、月充辟"弧菌属(Desulfovibrio)、螺菌属(Spirillum);6)乳杆菌科(Lactobacillaceae);7)假单胞菌科(Pseudomonadaceae),诸如假单胞菌属(Pseudomonas)和醋酸杆菌属(Acetobacter);8)固氮菌牙牛(Azotobacteraceae)禾口确M匕斥干菌牙+(Nitrobacteraceae)。其它合适的生物体包括低等真核生物、真菌(诸如藻状菌纲(Phycomycetes)和子嚢菌纲(Ascomycetes))、酵母(诸如糖酵母属(Saccharomyces)和裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces))、担子菌纲(Basidiomycetes)酵母(诸如红酵母属(Rhodotomla)、金担子菌属(Aureobasidium)、掷孢酵母属(Sporobolomyces))、等等。可以在任何方便的营养培养基中培养包含一种或多种异源基因的细胞宿主，其中倘若使用选择性培养基，DNA构建体提供选择优势(例如在含有抗生素的选择性培养基中生长)，使得所有或基本上所有细胞保留异源基因。然后可以依照常规方式收获这些细胞。可以使用各种构建体，包括来自质粒、病毒、或与自主复制区段(ars)组合以实现稳定维持的着丝粒的复制系统。若只希望整合，则可使用可提供复制的构建体，或是转座子或具有转座子样插入活性，或是提供与宿主基因组的同源性。通常，釆用这样的DNA序列，其在与宿主基因组中序列同源的序列之间具有异源基因，其或是染色体或是质粒。异源基因可以以多个拷贝存在。参见例如美国专利No.4,399,216。如此，可采用接合、转导、转染和转在采用染色体外元件的实施方案中，会希望DNA构建体包含容许对包含该构建体的那些宿主细胞进行选择的标志物。标志物通常是提供针对杀生物剂的抗性(例如抗生素抗性或重金属抗性)、给营养缺陷型宿主提供原养型的互补、等等的。复制系统可提供特殊特性，诸如失控复制(runawayreplication),可牵涉cos细胞，或者其它特殊特征。与异源基因一起，可采用具有受到宿主细胞识別的转录和翻译起始和终止调节信号的异源基因。可以操作DNA序列，使得提供与天然转录起始调节序列不同的转录起始调节序列。极其多种宿主存在极其多种转录起始序列。该序列可支持Mcpa基因的组成性表达或受调节的表达，其中所述调节可以是通过化学药品(例如代谢物)、通过温度、或通过可调节阻抑物可诱导的。参见例如美国专利No.4，374，927。启动子的具体选择会依赖于许多因素，即启动子的强度、启动子对细胞生存力的干扰、细胞内源的调节机制对启动子的影响、等等。可以自多种来源(包括商业来源)获得许多启动子。适合于Mc.pa表达的载体是本领域技术人员已知的。同样的，编码天然cpa的异源基因是本领域技术人员已知的。可以自多种来源(包括各种专利数据库和其它公众可利用的数据库，诸如在国家医学图书馆(NationalLibraryofMedicine)或欧洲分子生物学实验室(EuropeanMolecularBiologyLaboratory)处找到的核酸和蛋白质数据库)获得多肽序列和编码序列。在本发明的有些方面，操作微生物细胞以表达cpa的各种组合。本发明提供了在个体中诱导和/或加速免疫应答的方法，包括给家禽动物施用包含纯化的Mcpa和一种或多种佐剂分子的组合物的步骤，所施用的量在所述动物中有效产生免疫应答。本发明提供了用于刺激和/或调控家禽动物的免疫系统的方法，其中所述方法包括施用包含依照本发明的教导表达的Mcpa蛋白质的组合物。在其它实施方案中，本发明包括包含(至少一种)本发明的新Mcpa的组合物，其调控期望的生物学效应。以足以刺激、调控、影响、或产生期望生物学效应(例如细菌抗性)的量施用此类组合物。期望的生物学效应可选自例如下组1)对个体中巨噬细胞的激活或刺激；2)对个体的免疫系统的刺激或调控；和3)提高个体中的细菌抗性。如此，本发明提供了许多非限制性实施方案和方面，包括疫苗，其包含自一种或多种编码针对产气荚膜梭菌a-毒素(Mcpa)的改良保护性抗原的异源基因衍生的蛋白质；所述疫苗，其中所述异源基因包含在单一载体中；所述疫苗，其中所述异源基因包含在多个载体中；所述疫苗，其中所述微生物细胞是革兰氏阳性生物体、革兰氏阴性生物体、或低等真核生物(诸如真菌)；所述疫苗，其中所述微生物表达系统是荧光假单胞菌。本发明还包括在家禽动物个体(包括家禽动物群体中的个体)中诱导和/或加速针对抗原或免疫原的免疫应答的方法，包括给所述个体施用以下各项的步骤疫苗，其包含一种或多种编码Mcpa的异源基因；和任选的例如脂多糖(LPS),其量足以产生免疫应答。本发明的其它实施方案可用于在家禽动物(诸如鸡)中预防NE，包括保护新生的、幼年的、和成年的鸡免于所述疾病或疾病症状的发作。本发明的组合物可以经口地、胃肠外地、作为喷雾(包括吸入喷雾)、15表面地、经直肠地、经鼻的、经颊地、经阴道地、或经植入药库地施用。术语胃肠外在用于本文时包括皮下、皮内、静脉内、紋状体内(intrastriatial)、月几肉内、腹膜内、鞘内、室内、胸骨内、或颅内注射和其它输注技术。可以在任何合适的载体中配制组合物，包括例如E.W.Martin的《Remington'sPharmaceuticalScience》，MackPublishingCompany,Easton,PA中记载的载体。本文中提及的或引用的所有专利、专利申请、临时申请、和出版物，以其整体并入本文作为参考，包括所有附图和附表，其程度为它们与本说明书的明显教导不矛盾。下文是例示用于实施本发明的M^程的实施例。这些实施例不应解释为限制。所有百分比是以重量计的，而所有溶剂混合物比例是以体积计的，除非另有说明。所使用的缩写SDS-PAGE,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；dl，去离子的；DTT，二硫苏糖醇；TRIS，盐酸三(羟曱基)氨基甲烷；MWCO,分子量截留(cutoff);bp,碱基对；TAE，Tris乙酸盐EDTA;MSG,谷氨酸一钠；CV，柱容；PBS，磷酸盐緩冲盐水。实施例实施例l:来自衍生自鸡的产气荚膜梭菌隔离群的全长ot毒素(cpa)基因的克隆和测序此实施例描述了如下DNA片段的分离和碱基序列测定，该DNA片段包含来自两个产气荚膜梭菌菌抹的、编码a毒素蛋白质(cpa)的基因的交叠部分。这些菌抹(BBL1和BBL2)是在BenchmarkBioLabs(Lincoln,Nebraska)自i貪断有天然发生坏死性肠炎的鸡的肠道分离的。这两个隔离群来自相同禽群的不同鸟，而且在实验室中培养时具有不同特征(例如它们在培养物滤出液中分泌的cpa的量不同)。自BBL1和BBL2的细胞制备基因组DNA,并用作聚合酶链式反应(PCR)的模板以扩增cpa基因的交叠片段。根据来自产气荚膜梭菌人隔离群的高度保守cpa基因的DNA序歹'J(GenBank登录号CLOPLC、CLOPLC05和NC—003366)设计引物序列。选择引物对来扩增交叠片段，它们一起包含完整cpa蛋白质编码区的DNA序列和少量5'和3'侧翼序列。引物对1由正向引物PLC5'FS(5'-GGTATAATTTCAGTGCAAGTGTTAATCGTTATC-3')和反向引物PLCINTR1(5'-CCATCCTTTGTTTTGATTCCAAAATAC-3')组成，而且生成1019碱基对的扩增产物。引物对2由正向引物PLCINTF1(5'-GAAAATTTTCAGCATTAGCTAGATATGAATGG-3')和反向引物PLC3'R(5'-AGCTTTTATTTTGTAAATACCACCAAAACC-3')组成，而且生成869碱基对的扩增产物。这两个扩增产物交叠558个》咸基对。PCR反应含有(终体积25|iL)214ng(BBLl)或275ng(BBL2)DNA模板，50pmol每种适宜的正向和反向引物，IXFailSafeTM缓沖液D(Epicentre,Madison,Wisconsin),和1.25单位FailSafeTM酶混合物。扩增进行20个循环96。，30sec;45。，30sec;72。，30sec;继以72。延伸10分钟。如供应商的说明书所指导的(Invitrogen,Carlsbad,California),将PCR产物克隆入TOPOTA2.1载体中，并通过标准方法转化入大肠杆菌ToplO细胞(Invitrogen)中。通过限制酶消化对自菌落个体制备的重组质粒分析插入物大小，并自具有适宜大小的插入物的克隆制备质粒，供DNA序列分析用。通过染料终止循环测序快速启动大师级混合物(DyeTerminatorCycleSequencingQuickStartMasterMix)依照供应商的4,荐(BeckmanCoulter,Inc.,Fullerton,California)对来自每个菌抹的每种扩增产物的克隆的插入物测定DNA序列。将来自每个菌株的交叠序列装配成单一DNA序列，其包含编码a毒素(cpa)蛋白质的不间断可读框(ORF)。来自BBLl和BBL2的cpaORF的DNA序列比较显示了它们是同样的(SEQIDNO:l)，而且如此编码同样的蛋白质(SEQIDNO:2)。来自这些BBL菌抹的398个氨基酸的a原毒素蛋白质构成鸡a毒素的一个新类(VI型)，如表l所总结的。表l显示了在a毒素蛋白质的各个位置处存在的氨基酸(AA)残基；所有其它氨基酸与其它产气荚膜梭菌隔离群的a毒素蛋白质的研究结果一致，预测SEQIDN():2的前28个氨基酸残基构成在细菌细胞分泌原毒素的过程中被切除的分泌信号肽，而且成熟a毒素包含SEQIDNO:2的氨基酸29-398(370个氨基酸)。实施例2:用于在植物细胞中表达的突变型全长a毒素(Mcpa)基因的设计和合成用于在植物中表达的序列的优化。为了获得异源基因在植物中的高表达，再次工程化改造所述基因使得它们在植物细胞中更加有效地表达可能是优选的。稻和烟草是两种这样的植物，其中在转化前再次设计异源基因以提高转基因植物细胞中的表达水平(即生成更多的蛋白质)可能是优选的。因此，用于植物表达的、编码细菌(X毒素的基因的设计中的一个步骤(即在提供植物基因启动子元件、内含子、3'非翻译区、等之外)是再次工程化改造异源基因蛋白质编码区以实现最佳表达。再次工程化改造用于在植物细胞中表达的细菌a毒素编码序列的一项动力是由于天然基因的非最佳G+C含量。例如，许多天然细菌基因的很低的G+C含量(及由此所致朝向高A+T含量的倾向)导致如下序列的生成，该序列模拟或复制已知高度富含A+T的植物基因控制序列。导入植物中的基因的蛋白质编码序列内一些富含A+T序列的存在(例如常见于植物基因启动子中的TATA盒区)可导致基因的异常转录。另一方面，所转录mRNA中存在的其它调节序列的存在(例如多腺苷酸化信号序列(AAUAAA)或与牵涉前mRNA剪接的小核RNA互补的序列)可导致RNA不稳定。对本文中SEQIDNO.1所公开的天然产气荚膜梭菌a毒素编码区的1197碱基对(bp)DNA序列的广泛分析揭示了认为对于最佳植物表达有害的数个序列基序以及非最佳密码子组成的存在。如此，编码细菌a毒素的植物优化基因的设计的一个目标是生成在本质上更"像植物的"且其中序列修饰不阻碍翻译或不产生mRNA不稳定性的DNA序列。存在多个公众可获得的DNA序列数据库，其中可以找到关于植物基因组的G十C含量或各种植物基因的蛋白质编码区的G+C含量的信息。一个这样的数据库在WorldWideWeb上位于URLhttp:〃www.kazusa.or.jp/codon/。在此站点，可以找到烟草(yV/co""wato6ac'wm)蛋白质编；马序歹'j的平均G+C含量为43.3%(对包含453,797个密码子的1268个序列的分析)。还可以找到稻((9ry加m〃vojaponicacultivar)蛋白质编码序列的平均G+C含量为55%(对包含12，783，238个密码子的32,630个序列的分析)。比较而言，SEQIDNO:l中/〉开的产气荚膜梭菌a毒素蛋白质编码序列的的G+C含量为33.3。/。。如此，在设计用于在稻或烟草细胞中表达的a毒素基因时将蛋白质编码区的G+C含量提高至40-55%的范围可能是有利的。因此，用于植物表达的编码细菌毒素的基因(更优选地称为植物优化基因)的设计中的一个目标是生成具有如下G+C含量的DNA序列，所述G+C含量优选接近编码代谢酶类的天然宿主植物基因18的G+C含量。由于遗传密码的冗余性/简并性所提供的可塑性(即有些氨基酸由超过一种密码子来规定)，不同生物体或生物体类别中基因组的进化导致了同义密码子的差异使用率。蛋白质编码区的碱基组成均值反映了这种"密码子偏爱"。例如，基因组具有较低G+C含量的生物体更多地利用密码子第三位为A或T的同义密码子，而那些具有较高G+C含量的更多地利用第三位为G或C的密码子。例如，发现，在烟草编码区中G或C作为39.84。/。的密码子的第三个碱基，而在稻编码区中G或C作为61.29。/o的密码子的第三个字母。另外，认为，mRNA内"次要"(minor)密码子的存在可降低该mRNA的绝对翻译速率，尤其在与次要密码子对应的负载tRNA的相对丰度低时。这种推理延伸得出，次要密码子个体对翻译速率的降低作用对于多个次要密码子至少会是叠加的。因此，次要密码子相对含量高的mRNA会具有相应地低的翻译速率。此速率会表现为相应地低水平的所编码蛋白质。在工程化改造用于在稻或烟草(或其它植物，诸如玉米、棉花或大豆)中表达的编码细菌a毒素的基因时，如果预定宿主植物的密码子偏爱已经测定，这是有帮助的。密码子偏爱是植物使用密码子来编码其蛋白质的氨基酸的统计分布，而且稻和烟草的优选密码子使用率显示于表2。可以以使用单一密码子相对于所有氨基酸的密码子的频率来计算密码子偏爱。或者，可以以使用单一密码子编码特定氨基酸相对于该氨基酸的所有其它密码子(同义密码子)的频率来计算密码子偏爱。若存在多种选择，在为细菌a毒素的植物表达设计编码区，应当测定植物优选的主要(primary)("第一选择")密码子，以及优选密码子的第二、第三、第四等选择。然后可以设计一种新的DNA序列，其编码细菌a毒素的氨基酸序列，但是该新的DNA序列不同于天然细菌DNA序列(编码毒素的)，这是由于植物(第一优选的、第二优选的、第三优选的、或第四优选的、等)密码子的替代，以规定毒素氨基酸序列内每个位置的氨基酸。然后对该新序列分析通过修饰可能已经导入的限制酶位点。通过用第一、第二、第三、或第四选择优选密码子替换来进一步修饰所鉴定位点。该序列中能影响感兴趣基因转录或翻译的其它位点是外显子:内含子连接处(5'或3')、polyA添加信号、或RNA聚合酶终止信号。进一步分析和修饰该序列以降低TA或GC双联体的频率。在双联体之外，具有超过大约六个相同残基的G或C序列嵌段能影响该序列的转录或翻译。因此，通过将第一或第二选择等的密码子用次之优选的密码子选择替换来有利地修饰这些嵌段。上文所述方法使得本领域技术人员能够修饰对特定植物而言外来的基因，使得该基因在该植物中最佳地表达。该方法进一步例示于PCT申请WO97/13402。如此，可以用在功能上与本发明的毒素/基因等效的合成基因转化宿主，包括植物。关于合成基因生成的别的指导可见于例如美国专利No.5,380,831。为了工程化改造编码细菌a毒素的植物优化基因，利用自密码子偏爱表确定的冗余遗传密码将DNA序列设计成编码蛋白质毒素的氨基酸序列，密码子偏爱表是自特定宿主植物(稻和烟草)的蛋白质编码序列汇编的。在表2中，C、D、I、和J栏代表每种氨基酸的同义密码子的分布(以每种密码子对该氨基酸的使用率％的形式)，如在稻(Oryzasativa)和烟草(Nicotianalabacum)基因的编码区中找到的。每种植物类型最优选的密码子以粗体指示，而且若存在多种选择，则可以鉴定第二、第三、或第四选择密码子。显然，有些氨基酸的有些同义密码子在植物基因中只是罕见的(例如稻中的TTA和烟草中的GCG)。还有，稻和烟草植物在密码子使用率方面有差异(例如丙氨酸密码子GCC在稻基因中比在烟草基因中更频繁，而精氨酸密码子AGA在烟草基因中比在稻基因中更常使用)。如此，显然，设计成反映一种植物物种的基因的最佳密码子组成的蛋白质编码区对于在另一种植物物种中的表达而言可能具有亚最佳的密码子组成。因此，在创建接近稻和烟草二者基因的平均密码子分布的蛋白质编码DNA序列的设计过程中，排除任何在任一类型的植物中相对于该氨基酸的其它同义密码子使用不频繁的密码子(在表2的F和L栏中以DNU指示)。通常，若某种密码子在任一植物类型的基因中编码相关氨基酸的次数为大约10%或更少，则认为它是很少使用的(在表2的E和K栏中以NA指示)。为了平衡氨基酸的剩余密码子选择的分布，使用下式计算每种密码子的力。权平均表现(WeightedAveragerepresentation):C1的加权平均％二1/(%C1+%C2+%C3+etc.)x%C1x100，其中Cl是所讨论的密码子，而%C2、％C3、等代表稻和烟草剩余同义密码子的平均％数值(相关密码子的平均％数值取自表2的E和K栏)。表2F和L栏给出了每种密码子的加权平均％数值。为了在稻和烟草二者细胞中的最佳表达，使用在稻和烟草基因中找到的频繁使用密码子的平衡密码子分布，设计了一种新的基本上编码SEQIDNO:2的产气荚膜梭菌a毒素蛋白质的氨基酸序列的DNA序列。如上所述，SEQIDNO:2中公开的原毒素序列的头28个氨基酸包含分泌信号肽。因而，设计植物优化DNA序列(SEQIDNO:3)来仅仅编码SEQIDNO:2的成熟蛋白质部分(氨基酸29-398)，但是已经修饰以包含三处氨基酸变化以消除磷脂酶C酶活性，如上文所讨论的和SEQIDNO:4中所公开的。下文总结了这些变化原毒素的天冬氨酸84(成熟蛋白质的残基56)突变成亮氨酸原毒素的组氨酸176(成熟蛋白质的残基148)突变成甘氨酸谷氨酸180(成熟蛋白质的残基152)突变成甘氨酸新DNA序列与编码ot毒素蛋白质的天然细菌DNA序列的区别在于植物(第一优选、第二优选、第三优选、或第四优选)密码子的替代以规定蛋白质氨基酸序列内每个位置处的适宜氨基酸。植物优化的DNA序列的设计是由使用自表2F和L栏构建的平衡稻-烟草密码子偏爱表对SEQIDNO:4的蛋白质序列进行的逆翻译开始的。然后通过补偿密码子变化(同时保持整体加权平均密码子表现)来修饰初始序列，以消除或添加限制酶识别位点、消除高度稳定的链内二级结构、和消除其它对克隆操作或工程化基因在植物中的表达可能有害的序列。然后对DNA序列再次分析通过所述修饰可能已经创建的限制酶识别位点。通过用第一、第二、第三、或第四选择优选密码子替换相关密码子来进一步修饰所鉴定的位点。序列中可影响感兴趣基因转录或翻译的其它位点包括外显子内含子连接处(5，或3，)、polyA添加信号、或RNA聚合酶终止信号。进一步分析和进一步修饰经过修饰的序列以降低TA和CG双联体的频率，和提高TG或CT双联体的频率。在这些双联体之外，具有超过大约六个连续[G+C]或[A+T]残基的序列嵌段也能影响该序列的转录或翻译。因此，通过用其它优选密码子选择替换第一或第二选择等的密码子也修饰这些序列嵌段。基因设计中包括罕用密码子未到实质性程度，只在为了适应密码子组成本身以外的不同设计准则(例如添加或删除限制酶识别位点)必要时所得DNA序列具有更高程度的密码子多样性、期望的碱基组成，包含策略性放置的限制酶识别位点，和不含可能干扰基因转录或产物mRNA翻译的21序列。表3呈现了在天然基因中找到的成熟a毒素蛋白质编码区和植物优化型式的密码子组成比较，并将二者与根据表2的F和L栏为植物优化序列计算得出的密码子组成推荐进行比较。对编码成熟产气荚膜梭菌a毒素的植物优化序列进行了其它修饰。一处这样的修饰是添加编码自玉蜀黍(Zeamays)15kDaa玉米醇溶蛋白基因(Genbank编号M72708)衍生的内质网(ER)耙向肽的DNA序列。此DNA序列包含63个碱基，而且通过密码子替代(如上所述)和通过在紧挨ATG(曱硫氨酸)起始密码子之后添加丙氨酸的GCT密码子对初始玉蜀黍序列进行了修饰使其组成与稻和烟草细胞中的表达更加相容。此GCT密码子的添加将ATG翻译起始密码子置于有利于植物中翻译起始的序列环境中。15kDa玉米醇溶蛋白ER耙向肽的稻-烟草优化DNA序列公开于SEQIDNO:5，所编码肽公开于SEQIDNO:6。在将SEQIDNO:5的DNA序列置于SEQIDNO:3的DNA序列的开始处时，创建了1239个碱基的全长读码框，其编码包含与肽产气荚膜梭菌a毒素成熟蛋白连接的15kDa玉米醇溶蛋白ER靶向的融合蛋白。在将此读码框作为功能性基因导入植物细胞时，自mRNA翻译的蛋白质会被导向内质网的内腔中。本领域已知，在进入ER后，异源蛋白常常一皮细胞分泌。还知道，某些小肽序列在添加至导向ER的蛋白质的羧基末端后能抑制细胞对经如此修饰的蛋白质的分泌。由于本发明的一个目标是在稻和烟草细胞中积累高水平的突变型产气荚膜梭菌a毒素蛋白质，对SEQIDNO:3中公开的DNA的进一步修饰是将编码KDEL(赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸)肽(已知促进蛋白质在ER内的保持)的密码子添加至该序列的3'端。在实践中，由于SEQII)NO:4中公开的突变型产气荚膜梭菌a毒素以赖氨酸终止，只将规定DEL的密码子(即GATGAGCTT)添加至SEQIDNO:3。编码此融合蛋白的全长才直物优化DNA序列公开于SEQIDN():7，而所编码的融合蛋白公开于SEQIDN():8。一旦在纸上或在计算机中设计了植物优化DNA序列，可在实验室中合成实际的DNA分子以在序列方面精确地符合设计序列。可克隆和以其它方式操作此类合成DNA分子，完全就像它们是自自然或天然来源衍生的那些。由商业供应商(PicoScript,Houston.TXUSA)实施包含SEQIDNO:7的DNA片段的合成。然后将合成的DNA克隆入表达载体中并导入细胞培养物中，正如实施例3和4中所述。实施例3:用于临床研究和抗原验证的带6X-HIS标签的Mcpa的表达和纯化用于C端带6X-his标签的Mcpa的大肠杆菌表达载体的构建。质粒DAS28P7B2得自PicoScript(Houston,TX),其在NcoI和SacI限制性位点之间包含合成的植物优化Mcpa基因。将NcoI/SacI片段克隆入pET-41a(+)(Novagen,Cat#:70556-3)中并用于在大肠杆菌中表达。此载体生成截短的蛋白质。DNA序列的Closer检验指示了该Mcpa序列与pET-41a(+)N端GST、S、和His标签不属同一读码框。为了校正读码框及以N端GST和C端His标签融合物的形式表达Mcpa，4吏用如下策略。设计并在PicoScript定制合成一种DNA片段以产生DASPIC019。DASPIC019包含自pET-41a(+)的Spel位点至NcoI位点的序列，不包括C端6X-his标签(N端GST标签和多克隆位点之间的区域)。这后面是小肽区加自DAS28P7B2的EcoRV位点至Sacl位点的DNA序列。使用此合成片段来开发用于Mcpa的表达载体，pDAB2448。图3图解了牵涉McpaC端6Xhis标签大肠杆菌表达载体pDAB2448的构建的克隆步骤。将来自DAS28P7B2的1.1kbEcoRV/NcoI片段克隆入DASP1C019中以形成pDAB2447。将来自pDAB2447的Spel/Sacl片段克隆入pET-41a(+)中以创建pDAB2448。C端带his标签的Mcpa的表达。将pDAB2448导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中并将表达Mcpa蛋白质的大肠杆菌转化体培养过夜以获得种子。将种子培养物接种入250ml烧瓶中50ml含50ug/ml卡那霉素的Luria肉汤(LB)中。将培养物培养至OD600为0.5-1.0，然后用lmM异丙基-(3-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)并于37。C温育。在温育后4小时和约24小时取出2ml培养物样品供蛋白质分析用。然后将细胞在20(V1样品缓冲液中溶解，并在SDS-PAGE凝胶上分析5iul每种样品。结果显示了所有Mcpa蛋白质都在沉淀物中；这通过Westem印迹杂交得到了证实。通过改良诱导条件(即IPTG浓度、温度和温育时间)来获得可溶性表达的尝试对可溶性蛋白质的表达没有任何影响。用于N端带6X-his标签的Mcpa的大肠杆菌表达载体的构建。测试了N端His标签对Mcpa的可溶性表达的影响。通过将pDAB2448的BglII/EcoRV片段克隆入先前所述读码框不符的构建体生成了一种新的表达载体。此新的表达载体命名为pDAB2449(图4)。N端带h's标签的M卬a的表达。将pDAB2449转化入大肠杆菌中并使用如先前所述的标准条件诱导Mcpa表达。结果再次显示了不溶性蛋白质形式的Mcpa。通过改变温度和IPTG浓度来优化诱导条件以获得可溶性表达(所测试的变量20。C和37。C;20、100、250、和IOOO50pMIPTG;4小时和过夜诱导)。对于20。C培养并用250pMIPTG诱导过夜或于37。C培养并用50(iMIPTG诱导4小时的培养物观察到显著量的可溶性蛋白质。在这两种条件下将培养物扩大规模并通过谷胱甘肽Sepharose层析纯化蛋白质。将来自1L培养物的细胞沉淀物在含0.6mg/ml溶菌酶的PBS中于RT溶解30分钟，接着在Branson超声波仪中超声处理4x30秒。将澄清的细胞提取物用于纯化Mcpa，使用10ml谷胱甘肽Sepharose4B树脂(Amersham)。将纯化的蛋白质在含25mMTris-HCLpH8和4mMCaCl2(NewEnglandBiolabs)及不同量的肠激酶(EK)的緩沖液中温育不同时间以切割GST标签和释放Mcpa蛋白质。将反应于室温摇动温育，并通过SDS-PAGE分析样品。切割GST标签和保留全长Mcpa的尝试由于McpaN端部分对非特异性EK切割的敏感性而不成功。优化切割条件的数次尝试导致截短的u毒素。因此，在荧光假单胞菌中以不带GST标签、带6X-his标签的蛋白质的形式表达该蛋白质。用于带6X-his标签的Mcpa的焚光假单胞菌表达质粒的构建。使用正向和反向PCR引物(IntegratedDNATechnologies,Skokie,1L)自包含作为DNA模板的全长Mcpa基因的大肠杆菌表达载体pDAB2449PCR扩增Mcpa基因(SEQIDNO:9)。正向引4勿5'agagaactagtaaaaaggagaaatccatgcateaccateaccateactccgegg3'反向引物:5'agagactcgagetatcatttgatattgtaggttgaattgc3'使用正向引物将Spel限制性位点导入优化核糖体结合位点的5'端，并使用反向引物将Xhol位点导入翻译终止密码子的下游。这使得能够将Mcpa基因克隆入Pf表达载体中，产生构建体pDAB2454(图5)。依照Sambrool(等(1989)来实现将合成的McpaN端带6X-his标签基因连接入SpeI和XhoI位点中。用BeckmanCoulterCEQ2000XLDNA分析系统进行克隆基因的验证并用Sequencher软件分析。N端带His标签的Mcpa在荧光假单胞菌中的表达。制备荧光假单胞菌感受态细胞，即用得自DowAgroSciences(DAS)培养物保藏中心的荧光假单胞菌MB324菌^^朱的冷冻甘油原种接种5mlLB，并于30。C以300rpm摇动培养过夜。次日，将750(il过夜培养物接种入250ml烧瓶中的50mlLB中。将细胞培养至0.2-0.4OD600。一旦达到适当的密度，将培养物样品在水上冷却5-10分钟，转移至50ml锥形管，并在SorvallRC5C落地式离心机中使用GSA转子以7Krpm旋转5分钟。将沉淀的细胞用冰冷的无菌去离子水清洗和重悬3次，最后将细胞悬浮在400jLil无菌水中。将连接的DNA用乙醇沉淀至1(V1体积。将连接的DNA的10|11等分试样添加至0.2cm电击杯中的100|11清洗后的细胞悬浮液中，并用BioRadGenePulser于200ohm、25)iF和2.25kV以时间常数4.6-4.8电穿孔。容许转化体于30。C、300rpm恢复2小时，然后涂布到含30iig/ml四环素的LB琼脂板上。将板于30。C温育36-48小时。筛选转化体，并通过限制酶分析和使用Beckman测序仪和Sequencher软件的SpeI和XhoI连接处的测序来验证包含全长N端带6X-his标签的Mcpa的Pf表达构建体pDAB2454。制备表达McpaN端带6Xhis标签的Pf的甘油原种并保存于-80。C。表达带6X-his标签的Mcpa的荧光假单胞菌的培养和诱导。将甘油原种的20(Vl等分试样接种入250ml烧瓶中的50ml补充有终浓度3(Vg/ml的四环素的LB培养基中。将培养物在NewBrunswickInnova摇床中于30。C以300rpm温育约16小时。然后使用过夜种子培养物接种等份到5个1升烧瓶中的l升培养培养基(见实施例3和4的附件)(2Q/。接种物和30iig/ml四环素)。将烧瓶在摇床中以300rpm于30。C温育24小时，之后将它们用终浓度0.3mM的IPTG诱导。将培养物再温育48小时，之后收获。带6X-his标签的Mcpa的纯化。诱导和表达1升含有带6X-his标签的Mcpa蛋白质(Si':QIDNO:10)的重组Pf培养物细胞后，通过将培养物以7.5Krpm离心20分钟来沉淀细胞，并转移至装有200ml0.1mm玻璃珠(BioSpec)的400ml珠搅拌容器。给容器注满磷酸盐緩冲液(50mM嶙酸钠緩冲液pH7.5,0.3MNaCl)，然后为带His标签的蛋白质添加2mlSigma蛋白酶抑制剂混合液。通过珠搅拌8次，每次1分钟，间隔冰上l分钟，将细胞沉淀物裂解。最后一次珠搅拌循环后，在冰上容许珠沉降5分钟，之后将裂解的细胞倾倒入50mlFalcon管中。然后将裂解的细胞以12Krpm离心15分钟以将裂解物与沉淀物分开。使用装有20mlTALON固定化金属亲和层析树脂(BDBiosciences)的重力柱自裂解物纯化带His标签的Mcpa蛋白质。将树脂用20个柱体积的含0.3MNaCl的50mM磷酸盐緩冲液pH7.5平衡，并小心地让上清液过柱3次。收集流出液样品并放置在冰上。然后再次将柱用20个柱体积的平衡緩冲液，接着是5个柱体积的含10mM咪唑的平衡緩沖液清洗。分开保留流出液。最后，使用5个柱体积的含200mM咪唑的平衡緩冲液(洗脱緩沖液)自树脂洗脱带6X-his标签的Mcpa蛋白质。使用10ul每种流出液实施SDS-PAGE(10%Bis-Tris凝胶，InvitrogenCorporation)和Western印迹分析无咪峻清洗液，10mM咪哇清洗液，和200mM咪唑洗脱液，以验证Mcpa在纯化的级分中的存在。通过Bradford分析来量化纯化的蛋白质。蛋白质的冻干。将蛋白质透析入含3mMTris-HClpH7.5的緩沖液中。然后使用PIERCE基于Bradford的蛋白质测定法来量化蛋白质并计算总蛋白质。为此，添加0.5%海藻糖并将样品冻干。测量冻千蛋白质粉末的重量，并在减去Tris-HCl緩沖液、海藻糖和残余水的重量后估算百分比纯度。最终纯化的蛋白质的产量为〉80mg。实施例4:用于临床研究和抗原验证的无标签Mcpa的表达和纯化用于无标签Mcpa的荧光假单胞菌表达质粒的构建。利用VectorNTI8软件设计的引物通过PCRX应自构建体pDAB2454(实施例3)扩增出Mcpa基因，排除His标签、S标签和凝血酶位点。正向引4勿5，agagaactagtaaaaaggagaaatccatgagttgggatggaaagattgatggcactgg3，反向引4勿5'agagactcgagetatcatttgatattgtaggttgaattgc3'为了克隆和表达目的，引物包含核糖体结合位点加SpeI和XhoI克隆位点。使用EP1CENTRE的FailSafePCR方案和FailSafePCR系统(cat.#FS99060)用FailSafePCR2x预混合液实施(A,cat.#FSP995A)PCR反应，30个循环的PCR(94。C，2分钟；94°C,l分钟；52°C，l分钟；72°C，l分钟；4。C保持；MJResearchDNAEngineDYADPeltier热循环仪)。通过1%琼脂糖凝胶继以QIAEXII琼脂糖凝胶提取(cat.#20051)纯化反应产物，并用SpeI和XhoI消化。用BeckmanCoulterCEQ2000XLDNA分析系统进行PCR产物的验证并用Sequencher软件分析。使用InvitrogenTOPOTA克隆试剂盒(cat.#K4500-Ol)将PCR产物连接入TOPO⑧TA(pCR2.1)载体中，然后化学转化入大肠杆菌感受态细胞(T()PIOF，，cat.#K4550-40)中。将转化体涂布到LB-氨千青霉素(100)ig/ml)X-26半乳糖苷酶琼脂板上并于37。C温育24小时(NewBrunswickScientificInnova4230冷藏摇动培养箱)。筛选转化体，并通过独特限制酶分析(BamHI和NotI)来验证新载体pDAB3909。另外，通过SpeI和XhoI连接处的测序进一步验证阳性克隆，测序遵循Beckman测序方案(catJ608120),有45个循环(96°C，2分钟;96。C，20秒;50。C,20秒;60。C，4分钟;4。C，不限时；GeneAmpPCR系统9700)并用Sequencher4.1.4(GeneCodesCorp.)分析。DNA凝月交电泳揭示了阳性克隆包含大约1.2kb的Mcpa基因。制备pDAB3909的甘油原种并保存于-80。C。通过将来自pDAB3909的无标签Mcpa基因(SEQIDNO:ll)克隆入用于获得pDAB2454的Pf表达质粒来完成用于荧光假单胞菌的无标签Mcpa表达载体的构建。自pDAB3909提取基因并利用SpeI和XhoI位点连接入Pf表达质粒中。连接反应在16。C浸泡(PerkinElmerCetusDNA热循环仪)中进行过夜。使用以下方案进行连接产物的转化。为了制备荧光假单胞菌感受态细胞，用荧光假单胞菌MB324菌抹的冷冻甘油原种接种5mlLB，并于30。C以300rpm摇动培养过夜(NewBrunswickScientificInnova4230冷藏摇动培养箱)。次日，将750)il过夜培养物接种入250ml烧瓶中的50mlLB中。将细胞培养至0.2-0.4OD600。一旦达到适当的密度，将培养物样品在水上冷却5-10分钟，转移至50ml锥形管，并在SorvallRC5C落地式离心机中使用GSA转子以7Krpm旋转5分钟。将沉淀的细胞用冰冷的无菌去离子水清洗和重悬3次，最后将细胞悬浮在400ji1无菌水中。将连接的DNA用乙醇沉淀至10iil体积。将连接的DNA的10(il等分试样添加至0.2cm电击杯中的100(il清洗后的细胞悬浮液中，并用BioRadGenePulser于200ohm、25nF和2.25kV以时间常数4.6-4.8电穿孔。容许转化体于30。C、300rpm恢复2小时，然后涂布到含30)ig/ml四环素的LB琼脂板上。将板于30。C温育36-48小时。然后筛选转化体，并通过限制酶分析来验证最终的构建体pDAB3910。制备pDAB3910(图6)的甘油原种并保存于-80。C。表达无标签Mcpa的焚光假单胞菌的培养和诱导。使用包含质粒pDAB3910的荧光假单胞菌的冷冻甘油原种来进行无标签Mcpa蛋白质的表达(SEQIDNO:12)。将甘油原种的200(il等分试样接种入250ml烧瓶中的50ml补充有终浓度30(ig/ml的四环素的LB培养基中。将培养物在NewBrunswicklnnova摇床中于30。C以300rpm温育约16小时。然后使用过夜种子培养物接种等份到5个1升烧瓶中的1升培养培养基(见实施例3和4的附件)(2%接种物27和30吗/ml四环素)。将烧瓶在NewBrunswickInnova摇床中以300rpm于30。C温育24小时，之后将它们用终浓度0.3mM的IPTG诱导。将培养物再温育48小时，之后收获。48小时后，将培养物倾倒入无菌500ml离心瓶中并在SorvallRC5C离心机中以8165xg离心15分钟。弃去上清液并将沉淀物保存于-80。C。随后筛选每种培养物，并通过限制酶分析和SpeI和XhoI连接处的测序来验证最终的构建体pDAB3910，其中测序利用Beckman测序方案，有45个循环(96。C,2分钟；96。C，20秒;50。C，20秒;60。C，4分钟;4。C保持；GeneAmpPCR系统9700)并用Sequencher4丄4(GeneCodesCorp.)分析。遵循上文所述规程进行经无标签Mcpa基因转化的Pf细胞的2升扩大规模和收获。无标签Mcpa蛋白质的纯化。将细胞浆的24g等分试样重悬在200ml裂解緩冲液(50mMTrispH8.0，5%(v/v)甘油，20mMEDTA，0.5%(v/v)TritonX-IOO，lmMDTT)和lX蛋白酶抑制剂混合液(Sigmacat.邦P8465)中，并通过在450ml破裂槽(BioSpec)中用O.lmm玻璃珠进行的珠搅拌来裂解。将细月包处理7次，每次1分钟，间隔冰上的l分钟休息期以防止过热。另外，用冰冷却该槽。将裂解物(lysate)放置在250ml离心瓶中并在SLC-1500转子中以14,000xg旋转20分钟。将上清液过滤3次(0.85(im，0.45fim,和0.22(im)。弃去沉淀物。将澄清后的样品通过阴离子交换层析纯化，即以5ml/min加载到用BufferA(50mMTrispH8.0，5%(v/v)甘油，20mMEDTA，0.5%(v/v)TritonX-100,ImMDTT)平衡的QSepharoseXK26/11柱上。用10个柱体积(CV)的50。/。緩冲液B(緩冲液八+1MNaCl)线性梯度洗脱Mcpa蛋白质100分钟，然后是100%緩冲液B。收集10ml级分并获得洗脱图谱(图7)。洗脱级分的SDS-PAGE分析指示了大约42kDa的Mcpa蛋白质的存在。制作了与所采集级分SDS-PAGE分析照片重叠的层析图的特写。标注了无标签Mcpa蛋白质在SDS-PAGE中的位置。在含20。/。曱醇的Tris-甘氨酸緩冲液中以100伏60分钟将SDS-PAGE分级的蛋白质转移至硝酸纤维素膜供Western印迹分析用。将印迹在PBS-Tween(Pierce,Rockford，1L)中简短温育，然后在溶于PBS的50/。v/v乳和0.5%Tween20封闭缓冲液中于室温封闭60分钟。使用家兔抗CPA(DowAgroSciences,Lot#DAS1041-156-2)作为一抗。将抗体在封闭緩沖液的新鲜等分试样中稀释至lpg/ml，并与印迹一起于室温温育60分钟。将印迹用PBS于室温清洗2次15分钟。使用偶联有碱性磷酸酶的山羊抗家兔IgG(KPLCatNo.075-1506)抗体来检测一抗。将抗体在封闭緩冲液的新鲜等分试样中1/1000稀释，并与印迹一起于室温温育60分钟。将印迹用PBS于室温清洗3次10分钟。将印迹用NBT/BCIP(Pierce,Rockford,ILcat.#34042)显影，并用蒸馏水清洗和风干。自合并的级分56-70制备SDS-PAGE和Western印迹，与纯化的带标签的Mcpa(实施例3)和阴性对照(来自用空载体转化的细胞的裂解物)比较。凝胶指示约90Q/。的无标签Mcpa样品纯度。在Western印迹中，观察到Mcpa条大的聚集和降解的一些存在。另外，在阴性对照中注意到交叉反应性。还使用无标签Mcpa的基质辅助激光解吸附/电离-飞行时间(MALDI-TOF)质谱和N端测序来验证纯化后的蛋白质的身份。样品的N端序列(SWDGKIDGTG)与预期的McpaN端残基2-ll序列匹配。样品的胰蛋白酶消化后，使用将通过MALDI-TOF检测到的肽与PAWS软件(GenomicSolutions,Inc.)得到的Mcpa预期肽质量指紋(PMF)进行比较。鉴定出总共18种来自无标签Mcpa的肽，得到56。/。的PMF覆盖率。此分析强烈指示样品的PMF与无标签Mcpa的理i仑序列匹配。合并最干净的级分(级分56-70)并用MilliporeIOK-MWCO旋转浓缩器(依照制造商的指示使用)浓缩至大约35ml。将浓缩液注射入蛇皮(SnakeSkin)Slide-A-Lyzer透析盒(3.5-kMWCO,cat.#GD96524)中并针对2升IXPBSpH8.0于4。C透析过夜。将透析后的样品分配成2份约25ml等分试样，在预先称重的50ml锥形Falcon管中shell冷冻并冻干2天(VirtisFreezemobile25m.)。冻千产生了1.13g粉末，保存于4。C。测定总蛋白质浓度(Bradford测定法)并计算纯度为2.2%(以重量计)，产生大约25mg无标签Mcpa。总之，经阴离子交换层析自400mlPf培养物纯化得到25mg无标签Mcpa的样品。可以进一步优化纯化方案。另外，为了蛋白质的长期稳定性，推荐针对含0.5。/。海藻糖的3mMTrispH8.0透析，而非IXPBS缓冲液。使用所生成的无标签Mcpa作为测试抗原。实施例3和4的附件焚光假单胞菌种子烧瓶培养基LB培养基(Miller或Lennox都行)等分50或100ml培养基入250ml烧瓶中。用泡沫塞和盖子关闭。于121。C高压灭菌20分钟。实施例5:纯化的重组Cpa蛋白质的毒性测试开发了两项体外测定法，各用于一企测天然Cpa毒素的一项特征性活性，即红血球(RBC)溶血或卵磷脂酶。在溶血测定法中，将红血球(RBC)与假定无毒cpa—起温育并观察溶血效应，与阳性和阴性对照比较。该测定法可用于基于含有已知量PLC单位的标准品来测定实验样品中磷脂酶C(PLC)的大致活性或浓度。卵磷脂(L-a磷脂酰胆碱)是最丰富的磷酸甘油酯，即充当细胞膜主要结构成分的一种磷脂。若自Cp分泌a毒素，则它天然结合宿主细胞膜，切割卵磷脂，和触发导致细菌感染部位氧降低和Cp增殖的事件级联。开发了第二种测定法，用于测量实验样品的卵磷脂酶活性，如此通过与标准品比较来测定PLC的大致活性或浓度(Logan,1991)。在体外通过将cpa重组蛋白与卵磷脂酶溶液一起温育来检测和量化卵磷脂酶活性。通过分光光度法测量得出浊度升高指示切割活性。这两种测定法有助于在动物石开究启动之前i正明抗原在消除或降低溶血和卵磷脂酶有毒活性方面的有效设计。用于检测产气荚膜梭菌a-毒素活性的RBC裂解测定法PLC标准品的制备。在清洁的生物安全橱中打开冻干的PLC标准品(SigmaP-4039,500单位，Lotno.014K86152)。将PLC管中的内含物用无菌DPBS(CellgroCatNo.21-031-CV)再水化至终浓度106PLC单位/mL，用作原液。将原液以5(VL等分试样在冷冻管中保存于-80。C直至使用。硼酸4丐緩冲液。4吏用硼酸4丐緩冲液来稀^奪所有测试样品。使用如下身见程制备该緩沖液将200mM硼酸(Sigma)和1.3mM氯化钙(Sigma))容角罕于500mLRO/DI水中，用lOOmM四硼酸钠(Borax)(19g/500mLRO/DI水)将pH调至7.6，将体积调至1L。将该緩冲液保存于室温，保质期1年。1%(v/v)红血球溶液。如下使用用于清洗和稀释的DPBS制备1。/。(v/v)鸡RBC(cRBC)(ColoradoSerumCompany:CatalogNo.CS1151)溶液3.自沉淀物的顶部吸出上清液和白血i^。4.将沉淀物重悬在10mL盐水中。5.以250xg沉淀细胞10分钟。6.将步骤3-5再重复2次，或直至上清液变得清澈。(如果上清液在盐水中第3次清洗后仍然是红色的，那么cRBC原液太陈旧了，应当销毁。注意，Alsevers溶液中的cRBC在2-7。C稳定大约2周。)7.在盐水中最后一次清洗后，吸出上清液并保留压紧的cRBC沉淀物。8.将cRBC在DPBS緩沖液中稀释至1。/。(v/v)。注意，每个测试板需要大约5mLP/。cRBC溶液。9.在540nm测定lo/。溶液中裂解后的血细胞的吸光度。可接收的范围是0.4-0.5A540。1.将400(iL1%(v/v)cRBC溶液转移至小管并添力口1.6mLRO/DI水。ii.以最高设定旋涡震荡20秒以裂解细胞。iii.在540nm用1.6ml水中的40(^LDPBS测定分光光度计的空白值。iv.将裂解后的cRBC溶液转移至比色杯并在540nm读取吸光度。v.若540nm吸光度为0.4-0.5，则1%溶液可用于测定法。若540nm吸光度<0.4或>0.5，则必须调节1%溶液，即添加DPBS緩沖液以降低吸光度至范围内或添加额外的来自细胞沉淀物的cRBC以提高吸光度。若由于540nm吸光度在限度外而调节1%溶液，则必须裂解调节后的cRBC溶液并测定新的A540。或者，若初始1%溶液在范围外，则可制备和再次测定新的]%cRBC溶液。测定规程。给96孔U底板(Falcon产品目录No.35-3918)的孔加载50jiL硼酸钓緩冲液。然后给一行或一列孔的第一个添加样品或PLC原液(50iaL)。将样品或对照混合，并通过转移50jiL来连续稀释至后续孔直至达到期望的最终稀释度。自最后一个稀释孔取出剩余的5(VL并弃去，使得每个孔装有50pL样品或对照。然后向所有孔添加50pL1。/。RBC溶液，并将板在摇板仪上混合30秒。将板于37。C土2。C温育1小时。使用读板仪来测定每个孔在620nm的吸光度。还使用SyngeneGeneGeniusBio成像系统成像仪捕捉板的图像。值和孔内混浊且板底没有收集到细胞指示RBC完全裂解。部分裂解产生混浊的孔及板底比对照孔小的RBC小"纽扣"。在孔底收集到所有RBC的完全集31合及RBC上方清澈的緩冲液指示没有裂解。RBC裂解是样品和/或对照的生物学活性的体外指标。与包含已知浓度PLC的标准品一起测试样品，容许通过与标准曲线比较来测定样品中的PLC浓度。阴性对照包括緩沖液但无样品或标准品，和1%RBC但无緩冲液。测定法的有效性取决于阴性对照指示在任何稀释度没有裂解活性。测试来自细菌来源的纯化的Mcpa重组蛋白。在荧光假单胞菌(Pf)中表达和纯化突变型cpa(Mcpa)，用作参比抗原(实施例3和4)。在RBC裂解测定法中评估带6X-his标签型式的Mcpa(SEQIDNO:IO.Lotno.DASF1041-188-2，实施例3),而且在最大测试浓度(50(Vg/mL,表4)没有检测到溶血活性。还在Pf中生成了无标签型式(NHTMcpa,SEQIDNO:12,实施例4)并纯化(LotNo.E2036-70-1072295)。然而，发现此蛋白质在低达7.81(ig/mL的浓度裂解RBC。由于不存在用于纯化的His标签，使用了一种备选的方法，其在纯化緩沖液中包含TritonX-100去污剂(0.5%v/v)。推测制备物中的残余TritonX-100可能是溶血的原因。生成了另一批NHTMcpa(LotNo.E2036-88-96)，更用心地清除去污剂，并在RBC裂解测定法中测试。结果指示TritonX-100得到更完全地清楚，没有检测到RBC裂解活性(图8)。不存在残余X-100的l-:2036-88-96批次的NHTMcpa直到500fig/mL的浓度仍不裂解鸡RBC。表4总结了所有三个Mcpa批次的PLC活性终点。用于检测产气荚膜梭菌a-毒素活性的卵磷脂酶测定法。蛋黄乳液。使用蛋黄乳液(OxoidSR0047C)作为体外测定法中的卵磷脂来源。将溶液以10，000xg离心20分钟。收集上清液并用0.9%硼酸钙缓冲液(0.002MCaCl，0,2MH3B03，pH7.6)l:8稀释。测定规程。将测试样品和磷脂酶C(PLC)阳性对照(先前所述，SigmaP-4039)的50(iL等分试样添加至96孔板的孔。将每种样品在硼酸钙緩冲液中连续稀释，维持总体积50pL每孔。然后每孔添加50pL卵黄乳液。将板在摇床上放置30秒并在620nm读数作为基线读数。将板于37。C温育l小时并在620nm进行最终的读板。计算l小时时相对于基线的A620值增量。PLC活性解读为孔浊度的50%或更大增量。使用如下方程式实施计算%浊度增量二[100X(l小时读数/0小时读数)]-100测试来自细菌来源的纯化的Mcpa重组蛋白。对来自实施例3和4的、在荧光假单胞菌中表达并自荧光假单胞菌纯化的带His标签的和无标签的Mcpa(NHTMcpa)评估卵磷脂酶活性。在高至1000)ig/mL的浓度测试时，带His标签的Mcpa蛋白质在卵磷脂酶测定法中没有展示出PLC活性。直至最大测试浓度500ng/mL,NHTMcpa抗原也不展示卵磷脂酶活性(图9)。Mcpa纯化抗原的卵磷脂酶和溶血评估证明了这些a毒素活性通过全长蛋白质的新的点突变被大大降低或消除。实施例6:用于针对坏死性肠炎保护鸡的重组突变型a毒素的皮下疫苗接种疫苗制备。如实施例3和4中所述的纯化的Mcpa和NHTMcpa的冻干样品(批号DASF1197-08-03,Mcpa(Pf)和DASE2036-88-96,无标签Mcpa(Pf))在使用前保存于-20。C。为了疫苗配制，将抗原用无菌水再水化并添加lmMt:DTA。将Mcpa和NHTMcpa与卵磷脂丙烯酸类聚合物加QuilA胆固醇(LAP/QAC)—起配制，其中QuilA:胆固醇比例为l:l或4:l(以重量计)，如研究设计(表5)所示。研究规程。自McMurrayHatchery,WebsterCity,IA收到孵化当天(第0天)的CornishRock杂交童子鸡，并在插钉板育雏器中在刨花上饲养，连续照明。以大约750g每天每处理组的量提供补充有锌400ppm的低蛋白质-鱼粉起始饲料(LP-FM起始饲料，批号092505)(见实施例6的附件)；小鸡可自由饮水。如研究设计所示，在第5和15天给鸟接种。在注射当天配制疫苗并皮下施用于颈背。在第8天，对于研究持续期间给小鸡换成补充有锌40(^111的高蛋白质-鱼粉生长饲料(HP-FM生长饲料，批号100405)(见实施例6的附件)。在第24天取出如]料大约20小时。继以攻击，每天两次，共4天，使用含Cp菌抹JGS4143的詞料(100g饲料每125mL培养物)。混合物的Cp成分如下制备将保存于-80。C的Cp培养物接种入1OOmL体积的液体巯基乙酸培养基(FTG)中并于37土2。C温育18小时。将5。/。接种物转移入100mL体积的庖肉培养基(CMM)中，继以37。C士2。C温育18小时。最后，将接种有5%CMM培养物的1L体积FTG于37。C士2。C温育18小时，之后与饲料混合。对鸟观察NE的征候(抑郁、食欲不振、不适、腹泻、羽毛起皱紋)，并将那些展现出严重征候的鸟施以安乐死，供尸检和损害评分。在第29天将幸存的鸟尸检并记录损害得分。用于尸检的评分系统0:无总体损害l+:小肠扩张和薄壁或脆弱；含有黄色/褐色、水样、恶臭气味的内含物；增厚的粘膜层与肌粘膜分离；绒毛尖端糜烂或脱落(sloughing)、坏死碎屑、纤维蛋白、和细菌积累2+:水肿和充血；小肠局灶性坏死或溃痴；绒毛尖端中等糜烂3+:大片坏死和溃疡；出血；粘膜脱落4+:整个肠衬里坏死，包括离散区域的完全脱落；常常存在假膜；绒毛糜烂；现场实例的典型(typicaloffieldcases)数据分析。首先作为没有结构的处理简表一起分析所有处理的损害得分。接着，作为具有两个水平的阶层进一步分析处理T4-T7的子集。第一水平比较带标签的与无标签的Mcpa,而第二水平比较LAP/QAC比例1:1与4:1。作为有序分类测量来分析损害得分数据，而且该分析是偶然性分析。若此分析是显著的，则使用每一种可能的处理对的简单偶然性分析来比较各处理。所有分析都使用JMP统计包来实施。损害得分。表6总结了每个处理组的损害得分频率。分析显示了处理间的显著差异(p=0.001)。马赛克(mosaic)图(图10)图示了每个组的损害得分的频率，自数据集中清除了不可评分的鸟。分析揭示了所有攻击处理与无攻击对照有显著差异，而且处理T4(Mcpa(Pf)[LAP/QAC4:1])和T6(无标签Mcpa(Pf)[LAP/QAC4:1])与未接种、攻击对照有显著差异(分别为p4.0239和pi.0116，表7)。这些数据强烈指示Pf衍生的重组突变型a毒素(或是带标签的或是无标签的)与LAP/QAC4:1佐剂一起在作为皮下疫苗施用后有效降低小鸡中的坏死性肠炎损害的严重程度。实施例6的附件飼料组成低蛋白质-鱼粉起始伺料(LP-FM起始饲料)成分%组成小麦(Feedmill)85.00大豆粉(Bulk)3.00鱼粉6.0034<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>补充锌至大约400ppm高蛋白质-鱼粉生长饲料(HP-FM生长饲料)<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>求Sheedy等(2004)表2:32,630种稻(Oyzasa"va)基因(C和I栏)和1268种烟草(Mco"a朋totocwm)基因(D和J栏)的编码区中的同义密码子表现。F和L栏是用于植物优化合成基因设计的平衡偏爱密码子表现集的数值。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>TGT34.857.446146.1SER(S)AGC20.312.516.41S.5ENDTAA24.742.633.7AGT11.617.314.516.3TAG31.819.625.7TCA15.522.619.021.5TGA43,537.840.6TCC20.514117,319.6GLIV(Q)CAA41.05&950.050.0TCG15.87.2NA醒JCAG59.041.150.050.0TCT16.426.2".324.1CLU(E)GAA36.955.746.346.3THR(T)ACA23.732.728.2337gag63.144.353.753.7acc30.519.124.829.6GCA21.434.628.028.0ACG23.68.8DNUDNU(;gc37.016.226.626.6act22.339.430.836.8CGG22.315.418.918.9TRP(W)TGGl()O.O100.01()()■()100.0GGT19.333.726.526.5TYR(Y)TAC58.841.450.15—0.1CAC54.538.346.446.4TAT41.258.649.949.9CAT45.561.753.653.6GTA10.718.3NADNUIl丄("ATA20.825.823.323.3GTC29.8I7.G23.427.4ATC45.224.634.934,9GTG36.124.330.235.3ATI34.049.641.841,8GTT23.440.431"37.3**NA=不适用***DNU=不使用表3:成熟a毒素蛋白质(370个氨基酸)编码区的密码子组成。将天然产气荚膜梭菌(x毒素编码区与包含3处突变的植物优化型式比较。氨基酸密码子天然基因#天然基因%植物优化基因#植物优化基因％植物优化重组体氨基酸密码子天然基因#天然基因%植物优化基因#審^s楚$3植物优化重组体ALA(A)GCA1244.4725.930.4LEUWCTA425.000.0DNUGCC00.0933.330.2CTC00.0423.525.6CCG00.000.0DNUCTG6.3423.521.4(;CT1555.6n40.739.4CTT212.5423.527.0ARC(R)A(;A888.93">，JJ.J32.8TTA956.300,0DNU37<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>PBS=磷酸盐緩冲盐水LAP/QAC=卵磷脂丙烯酸类聚合物加QuilA胆固醇SQ=皮下施用LAP/QAC(1:1)=卵磷脂丙烯酸类聚合物和QuilA胆固醇(QuilA:胆固醇=1:1比例，以重量计)LAP/QAC(4:1)=卯磷脂丙烯酸类聚合物和QuilA胆固醇(QuilA:胆固醇=4:1比例，以重量计)<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>组号损害得分01+2+3+4+不可评分*115225623166244225172164622*研究完成前死亡；肠自溶妨碍评分表7:损害得分的偶然性分析的结果处理组比较P值PBS+攻击对PBS+无攻击<.0001Mcpa+攻击LAP/QAC1:1对PBS+无攻击<.0001Mcpa十攻击LAP/QAC4:1对PBS+无攻击<細1无标签Mcpa+攻击LAP/QAC1:1对PBS十无攻击无标签Mcpa+攻击LAP/QAC4:1对PBS十无攻击<里1<.0001Mcpa十攻击LAP/QAC1:1对PBS+攻击0.1374Mcpa+攻击LAP/QAC4:1对PBS+攻击0.0239无标签Mcpa十攻击LAP/QAC1:1对PBS+攻击0.0743无标签^/^^&+攻击LAP/QAC4:1对PBS+攻击0.0116Mc:pa十攻击LAP/QAC1:1对Mcpa+攻击LAP/QAC4:10.4034Mcpa+攻击LAP/QAC1:1对无标签Mcpa十攻击LAP/QAC1:10.8125Mcpa+攻击LAP/QAC1:1对无标签Mcpa十攻击LAP/QAC4:10.2630Mcpa+攻击LAP/QAC4:1对无标签Mcpa十攻击LAP/QAC1:10.5914Mcpa+攻击LAP/QAC4:1对无标签Mcpa十攻击LAP/QAC4:10.9799无标签Mcpa+攻击LAP/QAC1:17十无标签Mcpa+攻击LAP/QAC4:10.538140权利要求1.一种用于针对坏死性肠炎免疫鸟类的保护性抗原，所述抗原包含SEQIDNO4。2.—种多核苷酸，其编码权利要求l的抗原。3.权利要求2的多核苷酸，其包含选自下组的序列SEQIDNO:3、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、和SEQIDNO:ll。4.权利要求1的抗原，其中所述抗原包含选自下组的序列SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、和SEQIDNO:12。5.—种用于生产权利要求1的保护性抗原的方法，所述方法包括构建包含编码所述抗原的核酸序列的植物表达载体，用所述植物表达载体转化植物细述经过转化的植物细胞富集所述抗原。6.—种用于生产权利要求1的保护性抗原的方法，所述方法包括构建包含编码所述抗原的多核苷酸的原核表达载体，用所述原核表达载体转化原核细7.权利要求6的方法，其中所述原核细胞是荧光假单胞菌细胞。8.—种分离的多核苷酸，其编码包含SEQIDNO:2残基29-398的蛋白质。9.一种蛋白质，其包含SEQIDNO:2残基29-398。10.权利要求8的多核苷酸，其编码SEQIDNO:2。11.权利要求9的蛋白质，其编码SEQIDNO:2。全文摘要本发明部分地关于针对坏死性肠炎(NE)的家禽用疫苗的开发。该疫苗利用突变的、全长的、无毒的产气荚膜梭菌α-毒素蛋白质的保护性抗原(Mcpa)。此疫苗的效用通过例如NE挑战试验中损害严重程度的降低得到了证明。本文中还披露了用于以巨大数量生产此疫苗的新方法。一种例示性的方法牵涉在细菌表达系统中生产NE疫苗(突变的α毒素)，优选利用荧光假单胞菌系统，用于在家禽产业中控制NE的商业用途。本疫苗可以优选地以数种不同方式施用于鸡。还披露了一种新型的来自Cp鸡隔离群的VI型α毒素。文档编号C12N5/10GK101578109SQ200780045511公开日2009年11月11日申请日期2007年10月26日优先权日2006年10月27日发明者克里什纳·马达里,凯利·A·史密斯,史蒂文·R·韦布,唐纳德·J·默洛,威廉·M·安利,沈柳寅,詹纳·阿姆斯特朗,马克·A·汤普森申请人:陶氏益农公司