专利名称：：一种从红树莓果实中提取超氧化物歧化酶的方法一种从红树莓果实中提取超氧化物歧化酶的方法
技术领域：
'本发明属于生物
技术领域：
，特别涉及利用生物技术从红树莓果实中提取超氧化物歧化酶(SOD)的方法。
背景技术：
：超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD,EC)是一种金属酶，分子量为31000-33000,由两个亚基组成。SOD酶广泛存在于生物体中，催化氧自由基的歧化反应，从而清除对生物体有强烈毒性的超氧化物自由基，对生物体起保护作用。因此SOD具有抗炎症、抗衰老、抗辐射损伤及抗肿瘤作用，并已应用于医药、化妆品和食品等领域。由于具有巨大的药用价值和广阔的应用前景，多年来对SOD的研究与应用一直受到科学界和企业界的极大关注。目前，国内的SOD生化制品主要是从动物血液和动物肝脏的红细胞中提取的。从高等植物中提取SOD于20世纪90年代开始研究，如中国轻工业出版社出版的《功能性食品》第一卷所介绍的从小白菜叶中提取SOD。目前从植物中提取SOD的工艺流程植物组织或器官—离心收集上清液—硫酸铵分级沉淀-收集沉淀"水或缓冲液溶解-丙酮沉淀—PH7.8磷酸盐缓冲液溶解—离心除去不溶杂蛋白—透析—BiogelP-60柱层析—收集活力组分-硫酸铵沉淀—PH7.8磷酸盐缓冲液溶解—透析—DE-32柱层析—收集活力组分—浓缩得到S0D成品。相关资料表明，国内外有关S0D分离提取工艺中均釆用乙醇、丙酮有机溶剂。若大规模生产SOD，需回收乙醇、丙酮有机溶剂，不仅浪费人力物力，而且有机溶剂易燃易爆，用于工业生产将有重大的安全隐患。
发明内容本发明的目的是提供一种从红树果实中提取超氧化物歧化酶(SOD)的方法。为实现上述目的，本发明釆用的技术方案为从红树莓果实中提取超氧化物歧化酶的方法按下述步骤1)抽提将磷酸盐缓冲液分两次加入到100g速冻红树莓中，抽提1-2小时，保留上清液待用；其中红树莓与磷酸盐缓冲液按l.0:1.0-1.5(G:V)混合；2)盐析将上述上清叙内先后加入100-150ml的50%饱和度的硫酸铵和100-150ml的90%饱和度的硫酸按，每次加入后均放置在4。C冷藏静置1-2h再冷冻离心，取两次所得沉淀用磷酸盐缓冲液溶解；溶解后在4'C下透析30-50小时;而后经聚乙二醇浓缩，浓缩液以12000-15000r/min下-l(TC冷3冻离心10-20min收集上清液；3)柱层析将上述上清液用磷酸盐缓冲液洗进行柱层析，将各洗脱液经紫外检测收集230-500nm的活性峰，而后经聚乙二醇浓缩，浓缩液以12000-15000r/min下-l(TC冷冻离心10-20min收集上清液,待用；4)金属螯合亲和层析将上述上清液上金属螯合亲和层析柱，用PH5.0柠檬酸缓冲液洗脱，将各洗脱液经紫外检测收集230-500nm的活性峰，经透析除去无机盐，即得超氧化物歧化酶。所述步骤1中分两次加入到红树莓中的磷酸盐缓冲液用量相同；先加入的磷酸盐缓冲液中加入1-2g石英砂，而后连同红树莓在冰盐洛下充分研磨；在12000-15000r/min离心条件下高速冷冻离心30-40min,使悬浮物完全沉淀，取沉淀再加入另一部分磷酸盐缓冲液冰盐洛充分研磨，低温冰盐洛配方为碎冰用量100克，洛温-4X:,釆用的盐类是CaCh6H20用量为20g。高速冷冻离心，弃去沉淀合并两次上清液，待用。所述步骤1和2中磷酸盐缓冲液为pH7.8，浓度50醒ol/L,其具体配方为磷酸氢二钠10.3736g/L;磷酸二氢钠1.55835g/L。所述步骤2中上清液加入100-150ml的50%饱和度的硫酸铵后冷冻离心为12000-15000r/min下冷冻离心10-20min;加入100-150ml的90%饱和度的硫酸铵后冷冻离心为12000-15000r/min下冷冻离心20-30min。所述步骤3中层析柱为SephadexG-100，流速为0.3-0.5mL/min，每管收集3-5mL;所述洗脱液为pH7.8,2.5-3.Ommol/L磷酸盐缓冲，其具体配方为磷酸氢二钠5.1868-6.22416g/L;磷酸二氢钠0.779175-0.93501g/L。所述步骤4)金属螯合亲和层析柱，釆用用0.1-0.2mol/L的CuS04作为离子载体，用pH5.0,0.1-0.2mol/L柠檬酸缓冲液洗脱，流速为0.3-0.5mL/min，每管收集3-5本发明所具有的优点-.本发明以速冻红树莓果实为原料，经抽提、盐析、柱层析和金属螯合亲和层析，提取SOD粗制品，提高粗制品的得率，制备出稳定的高活性的S0D。本发明所述红树莓果实中SOD的提取工艺，具有工艺简单、成本低、提取率高、对SOD产品活性损伤程度小、无环境污染且适合工厂化生产等特点。应用该方法提取的SOD具有活性高和稳定性好等特点，在医药、保健品及化妆品工业中具有巨大的应用潜力。同时可以解决现有方法中釆用有机溶剂提取导致生产成本高，需回收乙醇、丙酮等有机溶剂，浪费人力物力，及有机溶剂易燃易爆，用于工业生产将有重大安全隐患等一系列问题。图1为本发明Sephade.xG-100柱层析洗脱曲线。具体实施例方式实施例11)抽提取100g冷冻树莓，按1.0:1.O(G:V)比例加入pH7.8,50mmol/L的磷酸盐缓冲液100mL，先加人50mL磷酸盐缓冲液和lg石英砂，在冰盐浴的条件下充分研磨；在12000r/min离心条件下-l(TC高速冷冻离心40min，使悬浮物完全沉淀，取沉淀再加入50mL的磷酸盐缓冲液冰盐洛充分研磨，并以上述离心条件高速冷冻离心；弃去沉淀合并两次上清液，在抽提l小时，保留上清液待用；2)盐析向上清液中加100ml的50%饱和度的硫酸铵，4'C冷藏静置lh，而后以12000r/min下冷冻离心10min;取上清液再加100ml的90%饱和度的硫酸按，冷藏静置lh，12000r/min下-l(TC冷冻离心10min;沉淀用pH7.8,3Ommol/L的磷酸盐缓冲液溶解，溶解后在4'C下透析30小时；而后经聚乙二醇浓缩，浓缩液以12000r/min下-10'C冷冻离心10min收集上清液；3)SephadexG-100柱层析将上述上清液上SephadexG-100层析柱(柱体为1.6x60cm)，用pH7.8,2.5國ol/L嫌酸盐缓冲液洗脱，流速为0.3mL/min,每管收集3mL;将各洗脱液经紫外检测收集230nm的活性峰同时检测其酶活性，合并230nm的活性峰，而后经聚乙二醇浓缩，浓缩液以12000r/min下-l(TC冷冻离心10min,收集上清液待用；4)金属螯合亲和层析将得到的SOD浓缩液上MetalsChelatingAffinityChromatogram(金属螯合亲和层析柱，柱体为1.0cmx40cm),用0.1mol/LCuS(U,为离子载体，同时釆用pH5.0，0.1mol/L柠檬酸缓冲液洗脱，流速为0.3mL/min，每管收集3mL;将各洗脱液经紫外检测收集230腿的活性峰同时检测其酶活性，合并230nm的活性峰，经透析除去无机盐，即得超氧化物歧化酶。而后将其浓缩、冷冻、干燥后得到超氧化物歧化酶成品。实施例2与实施例l不同之处在于l)抽提取100g冷冻树莓，按1.5:1(G:V)比例加入pH7.8，50隱ol/L的磷酸盐缓冲液150mL，分两次加入到红树莓中的嫌酸盐缓冲液用量相同；首次加入时磷酸盐缓冲液中加入2g石英砂，在12000r/min离心条件下-l(TC高速冷冻离心40min，弃去沉淀合并两次上清液；在抽提2小时，保留上清液待用；2)盐析向上清液中加入150ml的50。/。饱和度的硫酸铵，4'C冷藏静置2h,而后以12000r/min下冷冻离心20min;取上清液再加150ml的90%饱和度的硫酸按，冷藏静置lh,15000r/min下冷冻离心20niin;沉淀用pH7.8,50咖ol/L的磷酸盐缓冲液溶解，溶解后在4'C下透析50小时；而后经聚乙二醇浓缩，浓缩液以15000r/min下-l(TC冷冻离心20min收集上清液；3)SephadexG-100柱层析用pH7.8,3.Ommol/L磷酸盐缓冲液洗脱,流速为0.5mL/min,每管收集5mL;将各洗脱液经紫外检测收集400nm的5活性峰，合并400nm的活性峰，而后经聚乙二醇浓缩，浓缩液以15000r/min下-1(TC冷冻离心20min，收集上清液；4)金属螯合亲和层析用0.2mol/LCuS04作为离子载体，同时采用pH5.0,0.2mo1/L柠檬酸缓冲液洗脱，流速为0.5mL/min，每管收集5mL;将各洗脱液经紫外检测收集400nm的活性峰同时检测其酶活性，合并400nm的活性峰，经透析除去无机盐，即得超氧化物歧化酶。实施例3与实施例l不同之处在于l)抽提取100g冷冻树莓，按l.0:1.2(G:V)比例加人pH7.8,50mmol/L的磷酸盐缓冲液120mL，分两次加入到红树莓中的磷酸盐缓冲液用量相同；首次加入时磷酸盐缓冲液中加入1.5石英砂，均在15000r/min下高速冷冻离心15min，弃去沉淀合并两次上清液；在抽提1.5小时，保留上清液待用；2)盐析向上清液中加120ml的50%饱和度的硫酸铵，冷藏静置1.5h，12000r/min下冷冻离心15min;取上清液加120ml的90%饱和度的硫酸按，冷藏静置1.5h，15000r/min下冷冻离心25min;沉淀用pH7.8，40隱ol/L的磷酸盐缓冲液溶解；并在4。C下对该缓冲液透析40小时；聚乙二醇浓缩；15000r/min下冷冻离心15min收集上清液;3)SephadexG-IOO柱层析用pH7.8,2.8隱ol/L磷酸盐缓冲液洗脱，流速为0.3mL/min,每管收集3mL;将各洗脱液经紫外检测收集280mn的活性峰，合并280nm的活性峰，收集上清液，待用；4)金属螯合亲和层析用0.15mol/LCuS04作为离子载体，同时釆用pH5.0,0.15mol/L柠檬酸缓冲液洗脱，流速为0.5mL/min,每管收集5mL;将各洗脱液经紫外检测收集280nni的活性峰同时检测其酶活性，合并280nm的活性峰，经透析除去无机盐，即得超氧化物歧化酶。实施例4红树莓果实中SOD提取结果l)酶活力测定釆用NBT光还原法，酶活性单位釆用抑制NBT光化学还原5W为一个酶活性单位表示。2)蛋白质含量测定釆用Lowery法，以牛血清白蛋白作标准。(参见下表)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求1.一种从红树莓果实中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于按下述步骤1)抽提将磷酸盐缓冲液分两次加入到速冻红树莓中而后抽提，保留上清液待用；其中红树莓与磷酸盐缓冲液按1.0∶1.0-1.5(G∶V)混合；2)盐析将上述上清液内先加入50％饱和度的硫酸铵再加入的90％饱和度的硫酸按，每次加入后均冷冻离心，取两次所得沉淀用磷酸盐缓冲液溶解；溶解后经聚乙二醇浓缩，浓缩液冷冻离心收集上清液；3)柱层析将上述上清液用磷酸盐缓冲液洗进行柱层析，将各洗脱液经紫外检测收集230-500nm的活性峰，而后经聚乙二醇浓缩，浓缩液冷冻离心收集上清液，待用；4)金属螯合亲和层析将上述上清液上金属螯合亲和层析柱，用pH5.0柠檬酸缓冲液洗脱，将各洗脱液经紫外检测收集230-500nm的活性峰，经透析除去无机盐，即得超氧化物歧化酶。2.按权利要求1所述的从红树莓果实中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于所述步骤1中分两次加入到红树莓中的磷酸盐缓冲液用量相同；先加入的磷酸盐缓冲液中加入1-2g石英砂，而后连同红树莓在冰盐洛下充分研磨；在12000-15000r/min离心条件下高速冷冻离心30-40min，使悬浮物完全沉淀，取沉淀再加入另一部分磷酸盐缓冲液冰盐浴充分研磨，低温冰盐浴配方为碎冰用量100克，洛温-4°C，釆用的盐类是CaCL'6H20用量为20g。高速冷冻离心，弃去沉淀合并两次上清液，待用。3.按权利要求1所述的从红树莓果实中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于所述步骤2中上清液加入100-15Gml的50%饱和度的硫酸铵后冷冻离心为12000-15000r/min下冷冻离心10-20min;加入100-150ml的90%饱和度的硫酸铵后冷冻离心为12000-15000r/min下冷冻离心20-30min;所述溶解液后在4'C下透析30-50小时；冷冻离心条件为以12000-15000r/min下-l(TC.离心10-20min。4.按权利要求1或2所述的从红树莓果实中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于所述步骤1和2中嫌酸盐缓冲液为pH7.8，浓度50mmol/L，其具体配方为磷酸氢二钠10.3736g/L;磷酸二氢钠1.55835g/L。5.按权利要求1所述的从红树莓果实中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于所述步骤3中层析柱为S印hadexG-100,流速为0.3-O.5mL/min，每管收集3-5mL;所述洗脱液为pH7.8，2.5-3.O隱ol/L磷酸盐缓冲，其具体配方为磷酸氢二钠5.1868-6.22416g/L;磷酸二氢钠0.779175-0.93501g/L。6.按权利要求1所述的从红树莓果实中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于所述步骤4)金属螯合亲和层析柱，釆用用0.1-0.2mol/L的CuS04作为离子载体，用pH5.0,0.1-0.2mol/L柠檬酸缓冲液洗脱，流速为0.3-0.5mL/min，每管收集3-5mL。全文摘要本发明属于生物
技术领域：
，特别涉及利用生物技术从红树莓果实中提取超氧化物歧化酶(SOD)的方法。具体为以红树莓果实为原料，经抽提、盐析、柱层析和金属螯合亲和层析，制备出稳定的高活性的SOD。本发明所述红树莓果实中SOD的提取工艺，具有工艺简单、成本低、提取率高、对SOD产品活性损伤程度小、无环境污染且适合工厂化生产等特点。应用该方法提取的SOD具有活性高和稳定性好等特点，在医药、保健品及化妆品工业中具有巨大的应用潜力。文档编号C12N9/08GK101633918SQ200810012460公开日2010年1月27日申请日期2008年7月23日优先权日2008年7月23日发明者吕英杰,张惠文,张成刚,旭李申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所