专利名称：人卵母细胞序列玻璃化冷冻液和融解液的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物学中的细胞保存领域，具体地说是一种人卵母细胞序列玻 璃化冷冻液和融解液。
背景技术：
玻璃化冷冻技术是生物学领域中针对各种卵细胞及胚胎的保藏技术。人卵 母细胞的玻璃化冷冻保存是建立人类卵子库，为广大不孕患者解决生育力保存 的重要技术手段。现有技术中应用于人卵细胞的玻璃化冷冻液和融解液虽然有 许多种，但是还没有一种获得大家的公认，可以得到稳定的很好的复苏效果。如，在冷冻液中常用到1.2-丙二醇(PROH)和乙烯乙二醇(EG)为保护剂，而 其浓度高达15%。这类冷冻液主要存在以下不足 一、高浓度导致了较高的毒 性，对卵母细胞冷冻复苏后应用于人类生殖目的的安全性造成了威胁；二、卵 母细胞冷冻复苏后获得的胚胎的质量下降，不能获得令人满意的临床妊娠率。发明内容本发明的技术任务是针对上述现有技术的不足，提供一种毒性低、保藏效 果好的人卵母细胞序列玻璃化冷冻液和融解液。本发明的技术任务是按以下方式实现的人卵母细胞序列玻璃化冷冻液和 融解液，其特点是，基础液在含有HEPES的人输卵管液(mHTF)中添加10%人血蛋白； 冷冻液一基础液中添加10%Ficoll 70和6.5mol/L蔗糖； 冷冻液二基础液中添加10%Ficoll 70、 6.5mol/L蔗糖、10%乙二醇和 7.5mol/L二甲亚砜；融解液一基础液中添加1.0mol/L蔗糖； 融解液二基础液中添加0.6mol/L蔗糖； 融解液三基础液中添加0.3mol/L蔗糖；融解液四基础液中添加0.15mol/L蔗糖。本发明的人卵母细胞序列玻璃化冷冻液和融解液与现有技术相比具有以下突出的有益效果(1) 通过添加Ficoll 70，降低了乙二醇和二甲亚砜的浓度，也就是大 大减少了冷冻液的毒性；(2) 能够保证冷冻复苏效果，即获得良好的复苏成活率，获得具有良 好发育潜能的胚胎，更适用于建立人卵子库，并将复苏后卵母细 胞应用于患者妊娠之用；(3) 融解液采取低浓度、多次替换，可以逐渐将高浓度的冷冻保护剂 逐级替换出来，避免卵母细胞在较大浓度梯度的液体转换中，细 胞质水份的过度变化造成细胞的死亡，从而提高复苏后细胞的成 活率和发育潜能。
具体实施方式
参照以下具体实施例对本发明的人卵母细胞序列玻璃化冷冻液和融解液作 详细地说明，但不以任何形式限制本发明。 实施例(一)冷冻液和融解液的配制 基础液在100ml含有HEPES的人输卵管液中添加10 ml人血蛋白；冷冻液一在9 ml基础液中添加1 ml Ficoll 70和0.065mol蔗糖冷冻液二在8 ml基础液中添加1 ml Ficoll 70、0.065mol蔗糖、1 ml乙二醇和0.075mol 二甲亚砜；融解液一在10 ml基础液中添加0.01 mol蔗糖； 融解液二在10 ml基础液中添加0.006 mol蔗糖； 融解液三在10 ml基础液中添加0.003 mol蔗糖；融解液四在10 ml基础液中添加0.0015 mol蔗糖。 (二)冷冻液和融解液的使用方法冷冻时，将待冷冻保存的卵母细胞首先放入基础液中平衡5min，再入冷冻 液一3min;再入冷冻液二，马上用Cryoloop (市售的用于玻璃化冷冻的承载器 具，开放式)沾取体积不超过luL的冷冻液二，在Cryoloop的环上形成一个薄 膜，后将卵母细胞点在薄膜上，时间约20 30s，卵母细胞不超过3个，随后投 入液氮中保存。融解时，将Cryoloop拿出液氮后，直接将其放入融解液一，其上所带的卵 母细胞马上会沉入融解液中，再逐次转入融解液二、三、四，时间各30 60S。 最后转入普通卵母细胞培养液备用进行体外受精。融解过程完成。发明人利用上述冷冻液及融解液将197个人卵母细胞玻璃化冷冻保藏1 6 个月后融解，共存活169个(85.8%)，受精122个(72.2%)，卵裂72个(59.0 %)，获得优质胚胎41个(33.6%)，移植6例，其中4例为自身卵母细胞移植， 2例为卵巢早衰患者接受供卵移植。平均移植胚胎数2.5士0.6个，共获得临床妊 娠2例(33.3%)。各项指标均令人满意，证明本发明的冷冻液和融解液具有良 好的冷冻复苏效果。
权利要求
1、人卵母细胞序列玻璃化冷冻液和融解液，其特征在于，基础液在含有HEPES的人输卵管液中添加10％人血蛋白；冷冻液一基础液中添加10％Ficoll 70和6.5mol/L蔗糖；冷冻液二基础液中添加10％Ficoll 70、6.5mol/L蔗糖、10％乙二醇和7.5mol/L二甲亚砜；融解液一基础液中添加1.0mol/L蔗糖；融解液二基础液中添加0.6mol/L蔗糖；融解液三基础液中添加0.3mol/L蔗糖；融解液四基础液中添加0.15mol/L蔗糖。
全文摘要
本发明公开了一种人卵母细胞序列玻璃化冷冻液和融解液，属于生物学中的细胞保存领域。以含有HEPES及人血蛋白的人输卵管液为基础液，以低浓度的Ficoll 70、蔗糖、乙二醇和二甲亚砜为保护剂。与现有技术相比，本发明的人卵母细胞序列玻璃化冷冻液和融解液具有毒性低、保藏效果好等特点，可广泛应用于人类卵母细胞的玻璃化保藏之中。
文档编号C12N5/08GK101215548SQ20081001378
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月15日 优先权日2008年1月15日
发明者媛 李, 赵跃然, 陈子江 申请人:山东省立医院