专利名称：中药粉萆薢主要混淆基原叉蕊薯蓣鉴定ISSR-SCARs标记的制作方法
技术领域：
本发明属于分子标记技术及生药鉴定学领域，是一组鉴别中药粉萆蘚基原及主要混淆基 原植物的分子鉴别方法。
背景技术：
按照《中华人民共和国药典》(2005版)，中药粉萆蘚(RhizomaDioscoreaeHypoglaucae) 的基原主要是薯蓣科(Dioscoreaceae)薯蓣属(D/oycowa)根状茎组(Sect. S&朋—ora)粉背薯蓣(D. co〃e加7 /^; og/awca Pei et C. T. Ting.)，粉背薯蓣原变种叉森薯蓣(￡>. co〃e衍/ Hook, f.)在某 些地方作粉萆蘚的地方习用品使用，由于是变种关系，所以这2个种基原植物及药材无论是外 部形态、组织结构还是淀粉粒形态都很相似，采用常规的方法，不易对其进行鉴别，它们的 fmL-F、 rc6L和ma汰序列比对差异也很小。
序列特异性扩增区域(Sequence characterized amplified regions, SCARs)是从RAPD衍生 而来的一种分子标记，是由Paran和Michelmore发展出的，这些标记是对感兴趣的PAPD片段进 行克隆测序，通过序列分析，设计出一对互补到原来RAPD片段两端的20bp左右引物，用这 对引物对原来的模板进行了PCR扩增，这样单一位点的特征扩增区域被特异性扩增。这些 SCARs或维持原来RAPD片段的共显性分离的行为，或转换成共显性标记。SCARs克服了 RAPD重复性差的缺点，使用专一性的引物和严格的PCR条件；另外，SCARs是限定的基因组 区域的可重复扩增，更适用于有关种之间的同源性的研究，目前，又发展出了直接根据测序 结果设计进行的序列特异性扩增及基于ISSR标记的SCARs技术，已广泛应用于植物、药材等 的特异性鉴定。
目前，国内外尚无有关ISSR-SCARs标记鉴别中药粉萆蘇基原植物粉背薯蓣和叉蕊薯蓣的 报道，本发明填补了该领域的空白。
发明内容
本发明的目的是提供鉴别叉蕊薯蕷的一组引物和一段DNA片段。 本发明的另外一个目的是提供鉴别叉蕊薯蓣的方法
技术领域：
本发明运用ISSR方法在叉蕊薯蓣基因组中扩增出一条特异性条带，通过克隆和测序获得 一段长度为1170bp的DNA序列(SEQ-1)，并根据此序列设计了一组鉴别叉蕊薯蕷的引物。本 发明提供了一对引物，其序列如SEQ-2 (上游引物)和SEQ-3 (下游引物)所示，它们分别对
应于SEQ-l序列的51-71nt及990-1010nt位点，扩增出的片段长度为960bp。
本发明提供一种鉴别叉蕊薯蓣的方法，其特征在于根据样品的PCR反应产物琼脂糖凝胶 电泳结果鉴定样品的来源。该方法中PCR引物根据SEQ-1所示的序列设计合成。该方法中PCR 产物的电泳结果中出现一段960bp条带的样品为叉蕊薯蓣，而相同部位没有出现条带的样品为 粉背薯蓣。
反应体系为20nl，其组分及终浓度为10 X Buffer 2.0^1， MgCl2 2.0^1， dNTP(10mm)0.6|il， 引物各0.6pl(10mm)，模板DNA25ng/pl 2pl， Tag聚合酶lp，最后用水补齐20pl， PCR程序为95'C 变性2.5min， 95'C 40s， 58°C 30s， 72。Clmin， 35个循环，最后72。C延伸5min。 0.8%琼脂糖凝 胶电泳检测PCR结果。
应用购自上海生物工程技术有限公司的64个ISSR引物，选取了其中扩增条带丰富、信号 强的16个引物进行实验。其中引物18311-37(序列为5'- (AT)8CA-3')、 ISSR-59(序列为5'. (TG)8GC -3、)、 ISSR-63(序列为5、-(AG)sTG-3')、 13311-810(序列为5'- (GA)8T-3、)在叉蕊薯蓣和 粉背薯蓣中各扩增出了一条多态性条带，其中ISSR-63共扩增出了7个位点，在叉蕊薯蓣中扩 增出的多态性条带大小约1.2kb，与其它带的距离较远，对此带进行切胶回收并构建载体进行 序列测定，部分ISSR引物对叉蕊薯蓣和粉背薯蓣的扩增结果见图1。
将ISSR-63在叉蕊薯蓣中扩增出的多态性条带进行克隆、测序，序列如SEQ-1所示，片段 长度为1170bp，将该序列在Genbank上进行序列比对，未发现与之同源的序列。
根据该序列设计出一对SCAR引物SEQ-2: 5'-ACTTGGAGGAGAGGGCATCAG-3'， SEQ-3: 5'- TTCGGGATGTTACAGTTCTGG -3'，分别对应于SEQ-l序列的51-71nt及990-1010nt 位点。
通过对4个叉蕊薯蓣居群和4个粉背薯蓣居群检验这对引物的有效性，结果表明，除叉蕊 薯蓣中出现预期的长度为960bp的SCAR条带外，粉背薯蓣中没有出现SCAR条带(图2)。 4个 叉蕊薯蓣中3个居群均扩增出一条长1099bp的条带，云南蒙自样品呈现极淡的带谱。
综上所述，本发明提供了一段长度为1170bp的叉蕊薯蓣特异性的DNA序列，并根据该序 列设计引物，可以用于叉蕊薯蓣的鉴别，检验结果证明了引物和PCR方法可以准确鉴别叉蔬 薯蓣和粉背薯蕷。
图l叉蕊薯蓣和粉背薯蓣部分ISSR引物扩增图谱
粉背薯蓣1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21; 叉蕊薯蓣2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22;
从左至右引物顺序ISSR-4、 ISSR-8、 ISSR-9、 ISSR-12、 ISSR-17、 ISSR-24、 ISSR陽43、
ISSR-48、 ISSR-59、 ISSR-63 、 ISSR-74。 图2叉蕊薯蓣和粉背薯蓣验证结果，叉蕊薯蓣l云南蒙自，3四川峨嵋，5广西田林，7云南 景洪；粉背薯蓣2浙江临安，4湖南永顺，6重庆南川，8湖南衡山。M: DNA分子量标记物
具体实施例方式
1 .DNA提取和ISSR-SCARs标记的获得
实验选取生长状况良好植株中部的健康嫩叶，去掉主脉，70%的酒精擦去叶片表面的灰 尘，参照Paterson等的CTAB法提取总DNA。选择广西田林的叉蕊薯蓣和湖南衡山的粉背薯 蓣作为ISSR-SCARs实验样品，其他3个居群(云南景洪、云南蒙自、四川峨嵋)的叉蕊薯蓣 和3个居群(浙江临安、湖南永顺、重庆南川)的粉背薯蓣样品仅作验证。
ISSR引物的筛选的在PE-9700PCR仪上进行，反应体系为20pl。 20pl的反应体系包括 lxTagDNA酶缓冲液(10mmTris-HCl， 50mmKCl， 0.1%Trionx-100， PH8.4), 2.5mMMgCl2 ， lpTag酶，50ng模板，0.4(iM引物，各0.4mM的dATP， dGTP， dCTP禾口dTTP。 PCR程序为95°C 预变性3min; 95t变性30s， 58。C退火40s， 72。C延伸lmin， 35个循环，最后72。C保温7min， 4°C 保存。PCR产物在0.8。/。的琼脂糖胶中电泳1小时左右，溴化乙锭(EB)染色，凝胶成像系统 进行拍照，记录实验结果。
经过筛选64条ISSR引物找到叉蕊薯蓣的特异性条带。利用上海生物工程技术有限公司生 产的离心式凝胶回收试剂盒对该特异性条带进行回收，纯化。连接反应参照PGEM-TEasy vector Systems I说明书。连接反应的体系(10nl):包括以下组分DNA3(al， vectorial, buffer 5^1， T41igase 16摄氏度连接2小时(连接的DNA就是割胶纯化的产物,载体就是TA载体， 购自promega公司)。
对连接产物进行纯化，取纯化好的连接产物2nl，把已经制好的大肠杆菌DH5ot感受态拿出 来，把2pl的连接产物加入感受态细胞中，轻轻搅动，使感受态细胞都融化，转入电转杯中， 1500V电压电击，取出电转杯，加入500ml液体LB，于37'C， 200rpm的摇床中培养l小时，涂 平板，放在培养相中过夜培养。挑选菌落，做PCR检测。最后将PCR产物再次纯化，测序。
本发明中该特异序列为SEQ-1。根据该特异序列设计出一对长度皆为21个碱基的特异性 弓I物用于SCAR反应，本发明中这对引物为SEQ-2和SEQ-3。 2.ISSR-SCARs标记的验证实验
以SEQ-2和SEQ-3这对引物为扩增引物，用4个居群的叉蕊薯蓣和4个居群的粉背薯蓣DNA
模板进行PCR扩增。反应体系为20(al，其组分及终浓度为10xBuffer2.0(al， MgCl2 2.0^1，
dNTP(10mm)0.6nl，引物各0.6(il(10mm)，模板DNA25ngVl 2^1， Tag聚合酶lp，最后用水补齐
20pl， PCR程序为95。C变性2.5min， 95°C 40s， 58°C 30s， 72。Clmin， 35个循环，最后72。C延 伸5min。 0.8n/。琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。
序列表
<110>江苏省中国科学院植物研究所
〈120中药粉萆蘚主要混淆基原叉蕊薯蓣鉴定ISSR-SCARs标记 <160〉3
<210>1
<211〉1170
<212>DNA
<213〉来源于叉森薯蓣(Z). co/tort/Hook.f.) <400>1
agagaagaga gagagctaga gaaggagcct catcatcatc ttcttctcca acttggagga 60
gagggcatca gcggggttcc tcatctcaag gctcttgaeig gca卿卿a agggcgaaga 120
agcgaaggat ccatctatct tcatcaatag ggatttttta cttgagtttc atgttttaaa 180
ctttcttcat tattatggat tgttgccctc cattgatgga gggctaattt cttgatgctt 240
gggtgtagat gaacctttgg atgctatttt aattaaatta gtatttctat gttaattgct 300
tgcatgattt cattagttta ttggatgatt tgtattgagc tatcatctct ctacttgcag 360
aagcccggag agactattgt tgtccatgtg ggggaagact caagtctccc cacgaaaaac 420
tgtctttaat aagaggatta gtggaaatta tattatcttt ggggggagaa gccatgtttt 480
cactaattat tttattaaat ccaaagggga ttggaccccc aagcatccct ttcttgattg 540
肌tttctcca agttttaatc gattgtgtct tttcaatttc cactttctag gtttagaatt 600
agttgttaat caccc犯ctt ccgatcgact agataataga taeiataiggta gtactagtat 660
ttcccttctc cctgaggatc gataacccaa cttcaagtcc actttattac ttgattcgac 720
ccgtacactt gcggttagaa cgcatcaagt ttttggcgcc gttgccgggg agattttagg 780
attattagga aatctaggag tttattaatt tagtcatatt atctttttgc actttaattt 840
ttatttgatt cgtgattatt gatttctctc aatttttcat tgc肌ggtgt tgatgtatga 900
cccgaaagaa ctctaaggac cttgttgaag ccgatagtga aattgaacga acttttcgtc %0
gaaggttgag araggtggag g肌tcaaatc cagaactgta acatcccgaa attttctaaa 1020
tatatttcag tatttttcaa aatttttaaa agagattaat tagcataaaa aactgatttc 1080
attagtttaa actaatcact agtgcggccg cctgcaggtc gaccatatgg gagagctccc 1140 caaccgccgt tggatgccat agccttgagt 1170
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工引物
<400〉2
acttggagga gagggcatca g 21
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工引物
<400>3
ttcgggatgt tacagttctg g 2权利要求
1.叉蕊薯蓣DNA分子鉴别的特异性片段，其序列为SEQ-1所示。
2. 叉蕊薯蓣DNA分子鉴别的一组引物，该组引物根据SEQ-1所示序列设计合成，其序列为 SEQ-2和SEQ-3所示。
3. 叉蕊薯蓣DNA分子鉴别方法，其特征在于该方法是利用序列为SEQ-2和SEQ-3所示的引物 对待鉴定样品进行PCR反应，然后通过PCR反应产物的琼脂糖凝胶电泳结果鉴定样品，PCR 产物电泳结果中出现一条960bp条带的样品为叉蕊薯蓣，而相同部位没有出现条带的样品则 为粉背薯蓣。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于该反应体系为20pl，其组分及终浓度为10*Buffer 2.0^1， MgCl22.0jal， dNTP(10mm)0.6|al，引物各0.6pl(10mm)，模板DNA25ng/pl 2^1， Tag 聚合酶lp，最后用水补齐20ial， PCR程序为95。C变性2.5min， 95°C 40s, 58°C 30s， 72°Clmin， 35个循环，最后72。C延伸5min。 0.8。/。琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。该方法中PCR产物电 泳结果中出现一条960bp条带的样品为叉蕊薯蓣，而相同部位无此条带的样品为粉背薯蓣。
全文摘要
本发明涉及中药粉萆薢主要混淆基原叉蕊薯蓣的分子鉴别方法，该方法在对叉蕊薯蓣和中药粉萆薢正宗基原粉背薯蓣在进行总DNA提取、PCR扩增、引物筛选、ISSR-SCARs扩增与检测、分析等过程的基础上，找到了鉴定叉蕊薯蓣的ISSR-SCARs标记及鉴别方法。使用本发明公开的引物进行PCR反应可以从叉蕊薯蓣中获得长度为960bp扩增片段，而在粉背薯蓣中无此片段。根据这个ISSR-PCR扩增片段的差异，设计出可鉴别中药粉萆薢不同基原植物的高特异性鉴别引物，并能成功进行叉蕊薯蓣的高特异性PCR鉴别。
文档编号C12N15/11GK101358234SQ20081002144
公开日2009年2月4日 申请日期2008年8月2日 优先权日2008年8月2日
发明者吴宝成, 周义锋, 杭悦宇, 郑玉红, 顾子霞, 兴 高 申请人:江苏省中国科学院植物研究所