专利名称：：一种甜瓜杂交种的鉴定方法
技术领域：
：本发明涉及植物品种的鉴定方法，具体涉及利用分子标记(SCAR-SequenceCharacterizedAmplifiedRegions)技术鉴定甜瓜(L)杂交种的纯度及真实性的方法。
背景技术：
：甜瓜(Cwcmm'swetoL.)是我国重要的经济作物之一。随着甜瓜产业的迅速发展，目前甜瓜杂交一代品种已广泛应用于生产，但是在人工杂交制种过程中，由于隔离不严或人工去雄不及时、不彻底等原因，常混有母本自交系种子或由其它不明来源甜瓜花粉所造成种子的生物性混杂；同时在种子流通过程中，也可能会出现外来种子混入或人为掺假造成的机械混杂，不仅给生产带来了重大损失，也制约了甜瓜杂交种的推广应用。此外，个别不法分子为牟取暴利，甚至盗用育种者的亲本材料繁种销售，大大侵害了育种单位和育种者的合法知识产权。因此，寻找一种快速有效地鉴定甜瓜杂交品种/组合真实性和纯度的方法十分必要。传统的大田形态鉴定法仍是目前最常用的方法。该法鉴定结果虽较为可靠，但周期长，花费大，占用土地，受季节限制，秋季鉴定往往要利用温室或到海南等气候适宜的地方进行，而且很多性状的表现易受栽培措施及环境因子的影响；鉴定者的观察经验也制约着鉴定的准确性；随着大量新品种的不断涌现，又增加了形态鉴定的难度。因此该法不能有效地起到"打假"的作用。九十年代，我国不少学者曾利用蛋白质、同工酶电泳技术对甜瓜杂交种迸行鉴定。该法可在室内进行，易于早期识别。但是同工酶和蛋白质都是基因表达的产物，都是对基因的间接反应，多态位点有限，且易受发育阶段和表达器官的影响，条件要求严格，不易控制。再者，它们的提取过程复杂，尤其是同工酶，需要低温操作，耗时长，成分数量不稳定，难以提取，不易对大量样本进行分析。随着分子生物学的飞速发展，各种DNA分子标记技术也相应问世。美国科学家Williams等建立的RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)技术是发展较早的分子标记技术之一，由于该技术具有操作简便，速度快，费用低等优点，特别是它可以对无任何分子生物学基础的物种展开研究，因此倍受青睐。闫鹏等从100条RAPD引物中筛选到在2个甜瓜杂种一代及其亲本间呈现多态性的特异引物，可用于其纯度鉴定(《甘肃农业大学学报》，2007,42(2)，43~46)。乐锦华等利用20个随机引物对厚皮甜瓜8个亲本与4个杂交种进行RAPD分析，发现10个引物的扩增谱带具有多态性，亲本具有各自的特异谱带，绝大部分Fi的谱带是双亲互补带，可用于亲缘关系及纯度的鉴定(《果树科学》，2000，17(4)，295299)。刘富中等(2002)从80个随机引物中选出5个可鉴定3个甜瓜杂交种的纯度，其中0PM17可同时用于3个甜瓜杂种的纯度鉴定(《中国蔬菜》，2002(5)，7~9)。由于RAPD技术稳定性、重复性较差，鉴定结果的准确度会大受影响。再者，利用分子标记技术鉴定甜瓜杂交种的真伪目前还处于空白阶段。
发明内容本发明使用了RAPD-SCAR分子标记及相关分子生物学技术，目的旨在建立一套快速、准确地鉴定甜瓜杂交种纯度及真伪的新方法。本发明公开了一种甜瓜(CWCWwhwe/oL.)杂交种的鉴定方法，包括利用特异双引物GGGATATCGGAAGGT和GGGATATCGGGAATA对样本的基因组DNA进行PCR扩增。上述甜瓜(Cwc^^we/oL.)杂交种为'东方蜜2号'。上述特异双引物为针对甜瓜(Cwc謹z》舰/oL.)杂交种'东方蜜2号，的特异RAPD标记序列设计的。较佳的，上述样本的基因组DNA为植物幼苗的基因组DNA。上述鉴定方法还包括根据PCR后439bp的DNA条带的有无对甜瓜(Cwwm》me/oL.)杂交种的纯度及真实性进行鉴定。本发明的鉴定方法中，特异性引物通过下列方法筛选获得采用200条RAPD引物对甜瓜(C"cww:me/oL.)杂交一代品种'东方蜜2号，及其亲本和7个同母异父的杂交组合进行一系列的分子生物学技术处理和实验分析，并筛选到'东方蜜2号'的特异RAPD标记，对RAPD标记迸行克隆和测序，根据测序结果设计并合成特异性PCR(PolymeraseChainReaction)引物，并对该引物的特异性进行验证。最后利用该SCAR标记对甜瓜(Cwcww&mWoL.)杂交种'东方蜜2号，进行真伪及纯度鉴定。筛选具体过程如下(1)材料DNA的提取以发芽3天的幼嫩子叶为材料，采用尿素提取法从甜瓜(a/c謂^鹏/oL.)杂交种'东方蜜2号，及其亲本和同母异父的7个不同组合材料中提取基因组DNA。4(2)RAPD多态性分析用200条10个碱基的寡核苷酸随机引物对各个材料的基因组DNA进行RAPD多态性分析，从中筛选出扩增条带清晰、差异明显的RAPD标记。将此标记回收纯化后在相同的反应条件下进行RAPD重扩增，从而得到增强的RAPD标记。(3)克隆、测序将得到的增强RAPD标记回收纯化后克隆到载体上，进行测序，确定多态性标记的DNA两端碱基组成。(4)SCAR特异引物的设计根据克隆片段两端的碱基序列设计出稳定性较强的特异性双引物(PCR引物)。弓l物长度在14-25个碱基之间，原则上尽可能多的保留原RAPD引物的碱基。(5)甜瓜(a^W/mJme/0L.)杂交种纯度及真伪的SCAR检验应用开发出的特异双弓I物对待鉴定对象进行纯度和真实性检验。本发明的甜瓜(Cwcww^we/oL.)杂交种的鉴定方法能快速准确地鉴定甜瓜(C"cww^me/oL.)杂交品种/组合的真实性和纯度，技术稳定性、重复性好，鉴定结果的准确度高。图1和图2:为利用SCAR标记对甜瓜(CMCwmfsme/oL.)杂交种'东方蜜2号，真伪鉴定的电泳结果l一50为50个不同的甜瓜(Cwcw脂;y微/oL.)品种/组合，其中11有明显的特异SCAR标记，为事先混入的'东方蜜2号，。图3为利用SCAR标记对'东方蜜2号'杂交种纯度鉴定的电泳结果(显示部分样品电泳结果)l是标准'东方蜜2号，种子，2—25是被检测的种子，其中13无SCAR标记带，即不是'东方蜜2号'种子。具体实施例方式以下列举具体实施例进一步阐述本发明，应理解，具体实例并非用于限制本发明的保护范围。实施例1甜瓜(Cwcwm^we/oL.)杂交种特异RAPD标记的筛选一、种子发芽处理分别将甜瓜(Cwc纖/s靴/0L.)杂交一代品种'东方蜜2号，及其父母本、与'东方蜜2号'同母异父的7个不同杂交组合的种子浸种24小时，置于28"C条件下催芽24小时后，播于湿润的蛭石中，2028'C条件下培养3天，取其幼嫩子叶为材料进行DNA提取。二、基因组DNA的提取称取子叶0.05克于1.5ml离心管中，加入200pl提取缓冲液(成分尿素7M，Tris-HCl0.2M(pH8.0)，EDTA0.05M，十二烷基肌氨酸钠2%),用小研棒迅速研磨成浆，再用400^提取缓冲液冲洗；加入600nl酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)剧烈震荡20秒，12000rpm离心5分钟，取上清(可重复抽提l次)；加入l/10体积3MNaAc(pH5.2)和等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，12000rpm离心5分钟；弃上清，沉淀溶于400pl灭菌ddH20中，加入40pl3MNaAc(pH5.2)禾n1ml无水乙醇轻轻混匀后，12000rpm离心5分钟；弃上清，70%乙醇洗涤，室温干燥后溶于50plTE中；加入5plRNaseA(10mg/ml)，37。C水浴40分钟，一2(TC保存备用。三、RAPD多态性分析选取200条由10个碱基组成的寡核苷酸随机引物(由上海赛百盛公司合成)，利用RAPD技术对甜瓜(C"c,h附e/oL.)杂交种'东方蜜2号，及其亲本、7个与'东方蜜2号，同母异父的杂交组合进行多态性分析。以提取的基因组DNA为模板，RAPD扩增反应条件为每25|il反应体系中包括lxbuffer，2mMMgCl2，25~50ng的基因组DNA，0.2mMdNTPs，1U的TaqDNA聚合酶，0.4引物，无菌水补齐。然后用PCR仪进行扩增，扩增反应程序为预变性94'C，3min，94'C变性15s，退火37。C，30s，72。C延伸90s，35个循环，72。C终延伸5min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳(5v/cm，50min)后，Goldview染液(100ml中含5|alGoldview染料)染色10min，于紫外检测仪下观察并拍照。从200条RAPD引物中筛选到2条引物能够在'东方蜜2号，及其亲本和7个同母异父组合之间扩增出多态性条带，其中引物SBS-F8(序列为5'GGGATATCGG3')扩增出的多态性条带(标记大小为439bp)表现出稳定的、较强的特异性差异，这种差异表现为条带的有或者无，条带清晰易于分辨。将RAPD引物SBS-F8扩增出的特异标记从琼脂糖凝胶中切下并转入灭菌的离心管中，用无菌水洗涤2次后，加2(V1灭菌水于60。C温浴20分钟，离心后取5^1上清液作为模板，以RAPD相同条件再次进行PCR扩增，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，利用DNA回收试剂盒(TIANGEN公司生产)回收纯化后得到增强的RAPD标记。四、克隆和测序将回收得到的增强的RAPD标记克隆到载体pMD18-TVector(TIANGEN公司出品)上，并送至上海桑尼公司测序，根据测序结果为，可确定多态性标记两端的DNA碱基组成。实施例2PCR双引物设计及SCAR标记根据测得的RAPD多态性标记两端的碱基序列，用引物设计软件PrimerPremier5.0进行引物设计，参照特异引物的一般设计原则。引物长度在14-25bp之间，原则上尽可能多的保留原RAPD引物的碱基。设计的PCR双引物序列见表一。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>用这对引物对'东方蜜2号，及其亲本和同母异父的7个组合进行PCR扩增，扩增反应体系为25^1:lxbuffer，2mMMgCl2，0.2mMdNTPs，lUTaqDNA聚合酶，正反向引物各0.2nM，约100ng基因组DNA模板，无菌三蒸水补齐。反应程序为94'C预变性3min，94。C变性30s,56。C退火30s，72。C延伸30s，35个循环，72。C终延伸5min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳50min(5v/cm)后，Goldview染液(100ml中含5^1Goldview染料)染色10min，于紫外检测仪下观察、拍照，根据特异标记条带的有无对甜瓜杂交种'东方蜜2号'的纯度及真实性进行鉴定。实施例3SCAR标记鉴定应用实施例1.利用开发出的SCAR标记对甜瓜(Cwcww^we/oL.)杂交种'东方蜜2号'的品种真伪进行鉴定。用引物SCAR-1对50个不同的甜瓜品种/组合(其中含有事先设计混入的'东方蜜2号')进行PCR扩增，结果显示在50个品种/组合中，只有品种ll能扩增出可识别的较亮的特异SCAR标记，其它品种/组合无条带或肉眼不易识别(图l、图2)。而品种ll恰好为混入的'东方蜜2号'，说明该SCAR标记具有很高的特异性，能够成功将<东方蜜2号'与其它49个甜瓜品种/组合区分开。2.利用该SCAR标记对甜瓜杂交种'东方蜜2号，的纯度进行鉴定。其纯度以大田种植鉴定结果为标准。首先从被检种子群体中随机抽取IOO粒种子，逐个提取其基因组DNA。选用设计的引物SCAR-1对被检测的100粒种子和标准的'东方蜜2号'种子进行PCR扩增。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳和Goldview染色后于紫外检测仪下拍照观察。看是否出现特异SCAR标记条带，若有即为真的'东方蜜2号'种子，若无此条带即不是'东方蜜2号'种子，鉴定结果见表二和图3。表二'东方蜜2号，杂交种纯度的SCAR标记鉴定和大田鉴定的结果比较鉴定方式所需时间检测群体样假杂种数纯度(％)符合率(％)_本数(粒)_(粒)SCAR标记鉴定l周100397大田鉴定2.5个月1785_^_8权利要求1.一种甜瓜(CucumismeloL.)杂交种的鉴定方法，包括利用特异双引物GGGATATCGGAAGGT和GGGATATCGGGAATA对样本的基因组DNA进行PCR扩增。2.如权利要求l所述甜瓜(Cwwm!'s附e/oL.)杂交种的鉴定方法，其特征在于，所述甜瓜杂交种为'东方蜜2号'。3.如权利要求l所述甜瓜(a/c讓/5靴/oL.)杂交种的鉴定方法，其特征在于，所述特异双引物为针对甜瓜杂交种'东方蜜2号，的特异RAPD标记序列设计的特异性引物。4.如权利要求l所述甜瓜(Q/c謹"膨/oL.)杂交种的鉴定方法，其特征在于，所述样本的基因组DNA为植物幼苗的基因组DNA。5.如权利要求1-4中任一权利要求所述甜瓜(Q/cwm、me/oL.)杂交种的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法还包括根据PCR后439bp的DNA条带的有无对甜瓜杂交种进行品种真伪或纯度鉴定。全文摘要本发明涉及植物品种的鉴定方法，具体公开了一种甜瓜(CucumismeloL.)杂交种的鉴定方法，包括利用特异双引物GGGATATCGGAAGGT和GGGATATCGGGAATA对样本的基因组DNA进行PCR扩增。该方法的优点是速度快、周期短、不受环境条件影响、结果稳定准确。文档编号C12Q1/68GK101671724SQ20081004293公开日2010年3月17日申请日期2008年9月12日优先权日2008年9月12日发明者李菊芬,马国斌申请人:上海市农业科学院