专利名称：：精子的冷冻和解冻方法及精子的冷冻和解冻装置的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医学中的辅助生育领域，涉及少量睾丸精子、附睾精子的冷冻和解冻方法以及用于上述方法中的装置。
背景技术：
：现代辅助生育技术能对少精症或无精症患者(通过睾丸、附睾活检获得少量精子)进行卵细胞浆内单精子注射(Intracytoplasmicsperminjection,ICSI)治疗而获得子代。由于每个ICSI治疗周期的妊娠率在35%-40%,为了获得妊娠，部分患者需要重复数次ICSI治疗。如果没有对其精子冻存，每个周期都要排精或进行睾丸、附睾活检。少精症者精子不稳定，可能得不到精子以致本周期失败，而睾丸、附睾活检是创伤性手术，多次反复操作不但给患者带来额外的心理压力和经济负担，而且还可能造成睾丸、附睾组织纤维化，导致不可逆的睾丸萎縮、生精功能退化，甚至内分泌功能丧失而需要外源性睾酮替代治疗。但如果能将排出的少量精子或睾丸、附睾活检得到的精子冷冻，在平常或诊断性睾丸、附睾活检时即可进行精子的制备和冻存，可以大大提高这类患者辅助生育治疗的灵活性。中国专利申请200510061871.5号提供一种睾丸精子的冻存与复苏方法，该发明提供睾丸精子的冻存与复苏方法，以胞浆抽空的透明带为载体，将活检的睾丸精子装入封闭的透明带内，进行精子冷冻保护剂的添加和洗脱，冻存复苏过程中精子封闭保存于透明带内，该方法中透明带精子复苏不必经过繁锁的不连续密度梯度分离及洗涤离心过程，可直接在显微操作仪下吸出精子，直接用于ICSI。但是在上述方法中，以冷冻麦管，空透明带、冷冻环等装载精子，不少精子在操作过程中丢失，造成得到的精子数量少，活动力低，常规冻存复苏后，往往难以找到活精子进行ICSI。因此，在临床操作中冻存精子回收失败甚至放弃冷冻是辅助生育临床的常见问题。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简便、容易寻找精子、精子存活率高、精子回收率高的精子的冷冻和解冻方法，同时，也提供了一套用于上述方法中的装置。本方法所述的步骤如下所述。一种精子的冷冻和解冻方法，其包含以下步骤(1)少量精子的冷冻制备含有甘油的冷冻液，恒湿条件下在冷冻片的片部上做一个微滴，显微操作用针将少量精子放入微滴中，套上冷冻套，缓慢进入液氮蒸气中，暴露5分钟后，直接投入液氮，进行长期冷冻保存；(2)少量精子的解冻将冷冻片从液氮中取出，置入37摄氏度矿物油中复温，镜下寻找精子，用注射针将精子转移至mHTF(人输卵管液)微滴中备用。其中，实现步骤(1)中所述的恒湿条件需准备一个湿盒，该湿盒的上方设有一端开口的尾状袖套，注射针杆可从该开口进入该湿盒内部，所述湿盒的底部由透明的材料制成。所述湿盒内加水以保持湿度。所述尾状袖套由透明的、柔软的或有弹性的薄膜制成。所述湿盒的底部由玻璃或者聚苯乙烯制成。其中，步骤(1)中的冷冻片包含一杆部以及一片部，所述片部为长片状或者槽状，所述的冷冻片以透明且较硬的材料制成。所述冷冻片由玻璃或者聚苯乙烯制成。当冷冻片为槽状时，可在所述微滴上盖油保湿。其中，在步骤(1)中，冷冻套内还设有用于维持恒湿条件的湿润棉花。其中，在步骤(2)中，在冷冻片置入矿物油后，在冷冻片上放置一可压住冷冻片的小重物。精子的冷冻和解冻装置，其中，该装置是一种可承载精子的冷冻片，所述冷冻片包含杆部和片部，所述片部为长片状或者槽状，所述的冷冻片以透明且较硬的材料制成。其中，为了达到更佳的效果，所述的精子的冷冻和解冻装置还包括一种可以制造恒湿条件的湿盒，该湿盒的上方设有一端开口的尾状袖套，注射针杆可从该开口进入该湿盒内部，所述湿盒的底部由透明的材料制成；其中，所述尾状袖套由透明的、柔软的或有弹性的薄膜制成。所述湿盒的底部由玻璃或者聚苯乙烯制成。其中，所述冷冻片由玻璃或者聚苯乙烯制成。本发明的主要优点是(1)精子置于微滴中，在油中解冻，精子不会丢失，精子回收率接近100%;(2)冷冻液中含有甘油，精子存活动率可达90%;(3)操作相比现有技术简便易行。本发明很好地解决了目前精子冻存技术中出现的严重少弱精子、睾丸、附睾精子冻存后精子回收容易失败的难题，使无精子症患者接受辅助生育治疗的灵活性极大提高。图l为湿盒的结构示意图2为注射针杆伸入湿盒,内的示意图3为片部为长片状的冷冻片的结构示意图4为片部为槽状的冷冻片的结构示意图5为冷冻套的结构示意图。主要符号含义:1湿盒2底部3尾状袖套4注射针杆6冷冻片片部8片部9冷冻套10湿润棉花具体实施例方式现依据附图并结合实施例，对本发明做进一步的描述。首先请参见图l及图2所示，图中为湿盒l，盒内加水以保持湿度，所述湿盒1的上方设有一端开口的尾状袖套3，注射针杆4可从该开口进入所述湿盒1内部，所述湿盒1的底部2由聚苯乙烯制成。所述尾状袖套3由透明塑料制成。请参见图3及图4所示，图中为冷冻片6，所述冷冻片6包含杆部和片部，其中图3中的冷冻片的片部7为长片状，图4中的冷冻片的片部8为槽状。请参见图5所示，图中为冷冻套9，所述冷冻套9内空部分的底部设有湿润棉花10。实施例1取少量正常排出的精子置入少量的改良人输卵管液(mHTF)中，将放置精子的皿放入湿盒1内，在冷冻片6的片部7上做一个冷冻液微滴，显微操作用针吸取20个精子放入微滴中，此时，检视冻前存活率，然后在冷冻片6上套上预先湿润的冷冻套9，将冷冻套9缓慢放入液氮蒸气，暴露5分钟后，直接投入液氮，进行长期冷冻保存。复苏时，在液氮中取下冷冻套9，将冷冻片6置入37摄氏度矿物油中，缓慢移动，剪刀剪下冷冻片6的片部7，将小重物(未图示)靠近冷冻液微滴压住冷冻片6。倒置显微镜下用注射针吸走精子放入mHTF微滴中备用，此时检视冻后的存活率。实施例2将活检取出的曲细精管置入少量的改良人输卵管液(mHTF)中，曲细精管经弯头镊子碾碎，将该放置曲细精管的皿放入中的湿盒1内，在冷冻片6的片部8内做一个冷冻液微滴，加矿物油覆盖保湿，用注射针吸取10个精子放入微滴中，此时，检视冻前存活率，然后在冷冻片6上套上预先湿润的冷冻套9，将冷冻套9缓慢放入液氮蒸气，暴露5分钟后，直接投入液氮，进行长期冷冻保存。复苏时，在液氮中取下冷冻套9，将冷冻片6置入37摄氏度矿物油中，缓慢移动以复温，剪刀剪下冷冻片6的片部8，将小重物(未图示)靠近冷冻液微滴压住冷冻片6。倒置显微镜下用注射针吸走精子放入mHTF微滴中备用，此时检视冻后的存活率。实施例3将活检取出的曲细精管置入少量的改良人输卵管液(mHTF)中，曲细精管经弯头镊子碾碎，将该放置曲细精管的皿放入中的湿盒1内，在冷冻片6的片部8内做二个冷冻液微滴，加矿物油覆盖保湿，用注射针吸取20个精子放入微滴中，此时，检视冻前存活率，然后在冷冻片6上套上预先湿润的冷冻套9，将冷冻套9缓慢放入液氮蒸气，暴露5分钟后，直接投入液氮，进行长期冷冻保存。复苏时，在液氮中取下冷冻套9，将冷冻片6置入37摄氏度矿物油中，缓慢移动以复温，剪刀剪下冷冻片6的片部8，将小重物(未图示)靠近冷冻液微滴压住冷冻片6。倒置显微镜下用注射针吸走精子放入mHTF微滴中备用，此时检视冻后的存活率。实验结果请见下表所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>在上述实施例中，在湿盒上方设置尾状袖套是因为在具体操作时较柔软的尾状袖套可以锁住注射针杆，以使湿盒内保持相对封闭的状态，同时湿盒可随载物台做小范围移动。所述湿盒的底部采用透明的材料制成是为了不影响观察。所述的冷冻片也要求用透明的材料制成是由于冷冻片作为精子的载体若不透明很难在操作中找寻精子。具体操作中用到的小重物是为了压住冷冻片防止其移动之用。无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。权利要求1、一种精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，其包含以下步骤(1)少量精子的冷冻制备含有甘油的冷冻液，恒湿条件下在冷冻片的片部上做一个微滴，显微操作用针将少量精子放入微滴中，套上冷冻套，缓慢进入液氮蒸气中，暴露5分钟后，直接投入液氮，进行长期冷冻保存；(2)少量精子的解冻将冷冻片从液氮中取出，置入37摄氏度矿物油中复温，镜下寻找精子，用注射针将精子转移至人输卵管液微滴中备用。2、如权利要求1所述的精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，步骤(1)中的冷冻片包含一杆部以及一片部，所述片部为长片状或者槽状。3、如权利要求2所述的精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，当冷冻片为槽状时，可在所述微滴上盖油保湿。4、如权利要求2所述的精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，所述的冷冻片以透明且较硬的材料制成。5、如权利要求4所述的精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，所述冷冻片由玻璃或者聚苯乙烯制成。6、如权利要求1-3任意一项所述的精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，实现步骤(1)中所述的恒湿条件需准备一个湿盒，该湿盒的上方设有一端开口的尾状袖套，注射针杆可从该开口进入该湿盒内部，所述湿盒的底部由透明的材料制成。7、如权利要求6所述的精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，所述湿盒内加水以保持湿度。8、如权利要求6所述的精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，所述尾状袖套由透明的、柔软的或有弹性的薄膜制成。9、如权利要求6所述的精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，所述湿盒的底部由玻璃或者聚苯乙烯制成。10、如权利要求1所述的精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，其中，在步骤(1)中，冷冻套内还设有用于维持恒湿条件的湿润棉花。11、如权利要求1所述的精子的冷冻和解冻方法，其特征在于，在步骤(2)中，在冷冻片置入矿物油后，在冷冻片上放置一可压住冷冻片的小重物。12、一种用于权利要求1所述方法的精子的冷冻和解冻装置，其特征在于，该装置为一种可承载精子的冷冻片，所述冷冻片包含杆部和片部，所述片部为长片状或者槽状，所述的冷冻片以透明且较硬的材料制成。13、如权利要求12所述的精子的冷冻和解冻装置，其特征在于，所述的精子的冷冻和解冻装置还包括一种可以制造恒湿条件的湿盒，该湿盒的上方设有一端开口的尾状袖套，注射针杆可从该开口进入该湿盒内部，所述湿盒的底部由透明的材料制成。14、如权利要求13所述的精子的冷冻和解冻装置，其特征在于，所述尾状袖套由透明的、柔软的或有弹性的薄膜制成。15、如权利要求13所述的精子的冷冻和解冻装置，其特征在于，所述湿盒的底部由玻璃或者聚苯乙烯制成。16、如权利要求12所述的精子的冷冻和解冻装置，其特征在于，所述冷冻片由玻璃或者聚苯乙烯制成。全文摘要本发明提供一种操作简便、容易寻找精子、精子存活率高、精子回收率高的精子的冷冻和解冻方法，同时，也提供了一套用于上述方法中的装置。本发明的主要优点是(1)精子置于微滴中，在油中解冻，精子不会丢失，精子回收率接近100％；(2)冷冻液中含有甘油，精子存活动率可达90％；(3)操作相比现有技术简便易行。本发明很好地解决了目前精子冻存技术中出现的严重少弱精子、睾丸、附睾精子冻存后精子回收容易失败的难题，使无精子症患者接受辅助生育治疗的灵活性极大提高。文档编号C12M3/00GK101671651SQ20081004269公开日2010年3月17日申请日期2008年9月9日优先权日2008年9月9日发明者匡延平,彭秋平申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院