草鱼肠道组织腺苷酸基琥珀酸裂解酶基因序列的制作方法

专利名称：草鱼肠道组织腺苷酸基琥珀酸裂解酶基因序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学中基因克隆领域，尤其涉及草鱼肠道组织腺苷酸基琥珀酸裂解酶 基因的核苷酸及氨基酸序列。
背景技术：
苹果酸脱氢酶(MDH)广泛分布于生物体内，是一种活性非常强的酶，它催化草酰乙酸 盐和苹果酸盐的相互转化反应，与二核苷酸辅酶的氧化还原相关。草酰乙酸盐在许多代谢途 径中都有重要作用，包括三羧酸循环、乙醛酸旁路、氨基酸合成、糖原异生等，并维持氧化 还原平衡，还能促进胞质和亚细胞器代谢物的交换。依生物体的功能不同、组织差异、细胞 内定位的不同其表达种类不同，MDH具有多种同工酶形式。胞质苹果酸脱氢酶(cMDH)存 在于细胞胞质内，担负着将NADH转入线粒体的重任，并且还对调控三羧酸循环有作用，同 时cMDH还是核酸通路(NACh)复合体的一个组成部分。但目前对cMDH的研究相对较少， 且主要的研究集中在植物上。硬骨鱼类通常会表达两种平行基因形式的胞质苹果酸脱氢酶
(cMDH-S和cMDH-L)，这与鸟类和哺乳动物类这些四足动物只表达一种是不同的，而 cMDH-L与线粒体苹果酸脱氢酶(mMDH)很相似。目前NCBI上只能查到较少种类鱼类的 cMDH的全长cDNA，而在淡水经济鲤科鱼类中克隆到苹果酸脱氢酶(MDH)尚属首次。
目前胞质苹果酸脱氢酶在草鱼基因研究上还属空白。本基因的获得可以进一步研究该基 因在草鱼细胞中的组成及基因结构，并为研究该基因在草鱼生长中的作用提供更高层次的科 学服务，为研究草鱼功能饲料提供理论依据和新思路。

发明内容
本发明的目的是根，ADSL基因的部分序列设计引物，应用RT-PCR技术和RACE技术，克隆 到ADSL基因的全部表达序列。
上述目的是通过以下技术方案来实现的
解剖草鱼取出肠道组织，提取总RNA,使之与反转录接头引物(oligo-dT接头引物)混合， 进行反转录，合成cDNA的第一链。
将通过EST测序得到的ADSL基因部分序列在GeneBank上进行比对，比对结果显示该序 列为腺苷琥珀酸裂解酶的同源序列，根据该序列设计基因特异性引物，利用cDNA末端快速扩 增技术(R邻id Amplification of cDNA Ends, RACE)对目的基因的5端和3端进行PCR扩
6增。
在3'端的快速扩增中，基因特异性引物和接头引物进行PCR反应，扩增片段大小约为 1513bp。所述基因特异性引物和接头引物序列为-
基因特异性引物5' - GTTGCCCGAGTCCTTCCTCACAGC-3' 接头引物5' -CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3'
3'端的快速扩增后，进行5'端扩增。在cDNA第一链的合成中，由于M-MLV反转录酶在 到达RNA模板末端时，会表现出末端转移酶的活性，在cDNA的第一链的3端加入3-5个C碱 基。以此cDNA为模板，禾U用末端转基因特异性引物和接头引物进行RACE反应，扩增片段大 小约为579bp。所述的基因特异性引物和接头引物
基因特异性引物5' - CAGACACGCACGCTTCCCGACAGT-3'
接头引物5， -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3'
经末端快速扩增技术时行PCR所得到的PCR产物在1%的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测 后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD18-T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳 性克隆，用M13引物对质DNA进行测序，测序所得序列再与已知序列利用Vector NTI Advance 9. 0软件进行拼接得到目的基因。
草鱼肠道组织腺苷酸基琥珀酸裂解酶基因的分离，对于研究草鱼体内腺苷酸基琥珀酸裂 解酶的基因结构组成，探讨其行使催化能力的功能区域位置及其它动物的区别，从而对于研 究其重组蛋白在生产中的应用提供重要的理论依据。
具体实施例方式
下面通过具体实施方式
对本发明作进一步阐述，但本发明的内容完全不限于此。
1. 总RNA的提取
取成熟雌性草鱼，解剖鱼体取出肠道组织，立即放入液氮中，按照TR工Z0L Reagent (Invitrogen， USA)^明书上的方法提取总RNA。
2. cDNA第一链的合成
取草鱼总隨u 1与反转录引物(oligo-dT接头引物)2. 5 u 1 (10pmol/L)混合，加入2 u 1 5 X Reverse Transcriptase Buffer ,lnl dNTP (4X 2. 5腸1/U混合液，0. 25yl Ribonuclease Inhibitor, lyl M-MLV反转录酶，2. 25 u 1DEPC处理水，反应体系为10yl。 反应过程为室温放置10min，转入42'C恒温槽中，42。C保温60min，之后冰水冷却2min，放入-8(TC保存备用。 3.引物设计
将通过EST测序得到的ADSL基因部分序列在GeneBank上进行BLAST比对，比对结果如下
Total E score value
Accession Description
r「is/ioqc; Danio rerio adenylosuccinate lyase, mRNA (cDNA clone Qnf( n n MGC:174389 IMAGE:8785806)， complete cds
,1,nw^户Danio rerio clone RK126A4F05 adenylosuccinate lyase (ADSL)卄「 AY398306.1 、" ， ， 795 0.0 -mRNA， complete cds
RrYi71q4q Danio rerio adenylosuccinate lyase, mRNA (cDNA clone 7Qc; n n MGC:86656 IMAGE:6894111)， complete cds
Danio rerio adenylosuccinate lyase (adsl), NM 199899.1 mRNA >gb|BC045891.11 Danio rerio adenylosuccinate lyase, 795 0.0 mRNA (cDNA clone MGC:56061 IMAGE:3820563), complete cds
根据Ironl995年的报道，只要两个序列间用BLAST软件比对后E-Value值小于0. 005, 两个序列之间具有绝对的同源性，即证明序列为同一种基因序列。从比对结果看草鱼的基因 序列BLAST比对后，与其它物种的ADSL基因的E值绝对小于0. 005，所以证明该序列是ADSL 基因的同源序列，根据该序列设计基因特异性引物。 4.草鱼肠道组织腺苷酸基琥珀酸裂解酶基因cDNA全序列的克隆
根据己得到的cDNA片段序列设计基因特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)对目的基因的5端和3端进行PCR扩增。
在3'RACE中，基因特异性引物和接头引物进行PCR反应，扩增片段大小约为500bp。所 述基因特异性引物和接头引物序列为
基因特异性弓I物5' - GTTGCCCGAGTCCTTCCTCACAGC-3'
接头引物5' -CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3'
反应体系10XPCR buffer 5yl， lul dNTP(4X2. 5ramol/L)混合液，25mmol/LMgcl2 5ul, 10uraol/L基因锫异性引物和接头引物各2y 1， Tag酶lnl，用PCR水将反应体系补 充至50ul。反应条件为1个循环，94。C变性5min; 30个循环94。C变性30s， 54。C退火 30s, 72'C延伸lmin; 1个循环，72。C延伸10min; 4。C保温。
3' RACE后，进行5' RACE。在cDNA第一链的合成中，由于M-MLV反转录酶在到达RNA 模板末端时，会表现出末端转移酶的活性，在cDNA的第一链的3端加入3-5个C碱基。以 此cDNA为模板，禾I」用末端转基因特异性引物和接头引物进行RACE反应，扩增片段大小约 为579bp。
8接头引物5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3' 反应体系10 X PCR buffer 5 u 1, 1 u 1 dNTP(4X2. 5mraol/L)混合液，25咖ol/L Mgcl2 5ul， 10limol/L基因特异性引物和接头引物各2y 1， Tag酶lul，用PCR水将反应 体系补充至50ul。反应条件为l个循环，94'C变性5min; 30个循环94'C变性30s， 68°C 退火30s, 72'C延伸lmin; 1个循环，72'C延伸10min; 4'C保温。所扩增的PCR产物用1%的 琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶回收纯化目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD18-T 载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA，用M13引物进行 测序。
5.草鱼ADSL基因的测定
将测序所得序列与已知的序列用Vector NTI Advance 9.0软件进行拼接，得到草鱼肠 道组织腺苷酸基琥珀酸裂解酶基因的全长表达序列。用BLAST软件进行同源性测定，来确定 该基因为腺苷酸基琥珀酸裂解酶基因。比对结果如为
Total L
Accession Description
score value
- Danio rerio adenylosuccinate lyase, mRNA (cDNA clone BG154:2%, 1 1999 0.0
^ MGC:174389 IMAGE:8785806)， complete cds '
Danio rerio clone RK126A4F05 adenylosuccinate lyase (ADSL) AY398306. 1 1988 0.0
mRNA， complete cds
Danio rerio adenylosuccinate lyase, mRNA (cDNA clone BC071343. 1 1971 0.0
MGC:86656 IMAGE:6894111)， complete cds
Danio rerio adenylosuccinate lyase (adsl)， 醒19,9.1 mRNA >gb | BC045891. 11 Danio rerio adenylosuccinate lyase, 1965 0.0 mRNA (cDNA clone MGC:56061 IMAGE:3820563)， complete cds
根据Iron 1995年的报道，只要两个序列间用BLAST软件比对后E-Value值小于0. 005， 两个序列之间具有绝对的同源性，即证明序列为同一种基因序列。从比对结果看草鱼的基因 序列BLAST比对后，与其它物种的ADSL基因的E值绝对小于0. 005，所以证明该序列是ADSL 基因的同源序列。序列表
〈110〉通威股份有限公司
〈120〉草鱼肠道组织腺苷酸基琥珀酸裂解酶基因序列 〈160〉 2 <210〉 1 〈211〉 1689 <212> RNA
<213>草鱼(Ctenopharyngodon idellus) <220>
〈221〉 5，證 〈222〉 (l)... (62) 〈220> 〈221> CDS
〈222〉 (64)…(1512) 〈220>
〈221> 3，證
<222> (1513)…(1689)
〈220〉
〈221> PolyA一signal 〈222〉 (1657亍...(1662) 〈220>
〈221〉 PolyA—site <222> (1576)... (1689) <400> 1
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Asp Val Lys lie Glu 479
47权利要求
1. 草鱼肠道组织腺苷酸基琥珀酸裂解酶基因，其特征在于以下的RNA核苷酸及相应的氨基酸序列aacagaaaac cgcgtgcagt cttgttttcg cggcactgag cgcttcgctg aactgctatt 60aac atg gag gga tcc ggg gac gag ttc atg aaa tac 96Met Glu Gly Ser Gly Asp Glu Phe Met Lys Tyr 1 5 10cgc tca ccg ctg gtg tcc cgg tac gcc agc aaa gag132Arg Ser Pro Leu Val Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Glu15 20atg gcc tat aac ttc agc gac agg aaa aaa ttc aca168Met Ala Tyr Asn Phe Ser Asp Arg Lys Lys Phe Thr25 30 35act tgg aga aaa ctg tgg att tat ctc gct aag gcc204Thr Trp Arg Lys Leu Trp Ile Tyr Leu Ala Lys Ala40 45gag aag gca ttg ggt ctc ccc ata acc gat gcc cag240Glu Lys Ala Leu Gly Leu Pro Ile Thr Asp Ala Gln50 55gtg agc gag atg gag tct cac gcg gag gac att gat276Val Ser Glu Met Glu Ser His AIa Glu Asp Ile Asp60 65 70ttc gtc atg gct gca gag gaa gag agg aag ttg agg312Phe Val Met Ala Ala Glu Glu Glu Arg Lys Leu Arg75 80cat gat gtc atg gct cat gtg cac acg ttc gct cat348His Asp Val Met Ala His Val His Thr Phe Ala His85 90 95tgc tgt ccc act gct gct ccc atc atc cac ttg ggt384Cys Cys Pro Thr Ala Ala Pro Ile Ile His Leu Gly100 105gcc acg tcc tgt tat gtg gga gac aac acg gat ctg420Ala Thr Ser Cys Tyr Val Gly Asp Asn Thr Asp Leu110 115atc atg cta cgt gat gga ttt gat att ctg cta ccc456Ile Met Leu Arg Asp Gly Phe Asp Ile Leu Leu Pro120 125 130aag ttg gct cgt gtc ata gac agg cag gct aac ttt 492Lys Leu Ala Arg Val Ile Asp Arg Gln Ala Asn Phe135 140gca gag aaa tat gct gac cag ccg act tta ggc ttc 522Ala Glu Lys Tyr Ala Asp Gln Pro Thr Leu Gly Phe145 150 155acc cac tat caa cca gct cag ctg act act gtc ggg 564Thr His Tyr Gln Pro Ala Gln Leu Thr Thr Val Gly160 165aag cgt gcg tgt ctg tgg ctg cag gat ctg gtc atg 600Lys Arg Ala Cys Leu Trp Leu Gln Asp Leu Val Met170 175gac atg cgc aat ctt cag cgt gca aga gag gac ctg 636Asp Met Arg Asn Leu Gln Arg Ala Arg Glu Asp Leu180 185 190cgc ttc agg ggg gtc aaa gga acc aca ggc act cag 672Arg Phe Arg Gly Val Lys Gly Thr Thr Gly Thr Gln195 200gcc agc tct ctg cag ctc ttc cag ggg gat cat gag 708Ala Ser Ser Leu Gln Leu Phe Gln Gly Asp His Glu205 210 215aag gtg gag gag ttg gat agg atg gtc act gag atg 744Lys Val Glu Glu Leu Asp Arg Met Val Thr Glu Met220 225gct gga ttt aaa aaa tca tac ttg gtg acg ggt cag 780Ala Gly Phe Lys Lys Ser Tyr Leu Val Thr Gly Gln230 235acg tac agt cgt aag gtg gat gtc gac tca ctc tgt 816Thr Tyr Ser Arg Lys Val Asp Val Asp Ser Leu cys240 245 250gtg ctg gcc agc ctc gga gcc aca gta cac aag att 852Val Leu Ala Ser Leu Gly Ala Thr Val His Lys Ile255 260tgc act gat att cgt ctg tta gct aat ctg aaa gag 888Cys Thr Asp Ile Arg Leu Leu Ala Asn Leu Lys Glu265 270 275atc gag gag cct ttt gag aaa gag cag att ggt tcc924Ile Glu Glu Pro Phe Glu Lys Glu Gln Ile Gly Ser280 285agt gcc atg ccg tac aag aga aac ccc atg cgt gca960Ser Ala Met Pro Tyr Lys Arg Asn Pro Met Arg Ala290 295gag cgc tgc tgt agt ctt gct cgc cac ctg atg gcg996Glu Arg cys Cys Ser Leu Ala Arg His Leu Met Ala300 305 310ctg gtg tca gac cct ctg cag act gca tca gtg cag 1032Leu Val Ser Asp Pro Leu Gln Thr Ala Ser Val Gln315 320tgg ctg gaa aga acc cta gac gac agc gct aac agg 1068Trp Leu Glu Arg Thr Leu Asp Asp Ser Ala Asn Arg325 330 335agg atc tcg ttg ccc gag tcc ttc ctc aca gct gac 1104Arg Ile Ser Leu Pro Glu Ser Phe Leu Thr Ala Asp340 345atc atc ctc agc act ctg cag aac atc act gaa ggg 1140Ile Ile Leu Ser Thr Leu Gln Asn Ile Glu Gly350 355ctg gtg gtg tat cct aag gtg atc gag agg cat atc 1176Leu Val Val Tyr Pro Lys Val Ile Glu Arg His Ile360 365 370cgt cat gag ctg ccc ttc atg gct act gaa aac atc 1212Arg His Glu Leu Pro Phe Met Ala Thr Glu Asn Ile375 380atc atg gcc atg gtg aag gct gga gga aac aga cag 1248Ile Met Ala Met Val Lys Ala Gly Gly Asn Arg Gln385 390 395gac tgc cac gag aag atc cgt gtg ctg tcc cag caa 1284Asp cys His Glu Lys Ile Arg Val Leu Ser Gln Gln400 405gct gca gct gtg gtc aaa cag gaa ggg gga gat aat 1320Ala Ala Ala Val Val Lys Gln Glu Gly Gly Asp Asn410 415gac cta ctg gct cgg gtt cag gct gat cca tat ttc 1356Asp Leu Leu Ala Arg Val Gln Ala Asp Pro Tyr Phe420 425 430act ccc ata ctt gga cag ctg gac gcc tta ctg gat 1392Thr Pro Ile Leu Gly Gln Leu Asp Ala Leu Leu Asp435 440ccc aaa acc ttc atc ggc cga gcc cca caa cag gtt 1428Pro Lys Thr Phe Ile Gly Arg Ala Pro Gln Gln Val445 450 455aca agg ttt ttg tct gag gag gtc agg cct gtt cta 1464Thr Arg Phe Leu Ser Glu Glu Val Arg Pro Val Leu460 465gac cca tac aaa agt aaa atg gat gtg aag att gaa 1500Asp Pro Tyr Lys Ser Lys Met Asp Val Lys Ile Glu470 475cta gag ctt tgagacgtgc gactctgtga ctgatgcatc aaaacggtat 1549Leu Glu Leu480aacaatgaat aaatgtctag ctgtttaaaa aaaaaaaaaa 1689
全文摘要
本发明公开了草鱼肠道组织腺苷酸基琥珀酸裂解酶基因。通过大规模的EST测序，得到草鱼肠道组织腺苷酸基琥珀酸裂解酶基因的部分序列，以此序列设计引物，应用RT-PCR技术和RACE技术克隆到草鱼肠道组织腺苷酸基琥珀酸裂解酶基因的全表达序列。对于研究草鱼体内的腺苷酸基琥珀酸裂解酶的基因结构组成，探讨其行使催化能力的功能区域位置及与其它动物的区别，从而对于研究其重组蛋白在生产中的应用提供重要的理论依据。
文档编号C12N15/60GK101475953SQ200810044928
公开日2009年7月8日 申请日期2008年3月10日 优先权日2008年3月10日
发明者江 吴, 刚 屈, 恒 徐, 朱文漓, 辜文博, 顾继锐 申请人:通威股份有限公司;四川大学