有毒有害物急性毒性响应的敏感藻确定方法

专利名称：：有毒有害物急性毒性响应的敏感藻确定方法
技术领域：
：本发明涉及对特殊藻类筛选的方法，具体涉及一种对有毒有害物急性毒性响应的用于藻红外测试技术的敏感藻确定方法。属于环境保护和食品安全监测等
技术领域：
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背景技术：
：自然水体中的藻类具有各种生理特性及采样、分离、培养和保存容易等特点，因而藻类资源在有关行业中被不断开发。根据不同藻类的特点，其用途各有不同。目前，普遍使用的通过分析发光细菌发光强度变化测试有毒有害物急性毒性的发光细菌检测技术，存在操作烦琐、用时较长、仪器昂贵和仪器笨重，不便携带以及某些微生物取材困难而成本过高等不足。有关运用操作简便、测试迅速、仪器价廉携带方便、藻类取材容易成本低的藻类红外辐射测试急性毒性尚未见国内外报道。经研究发现，不同藻种对不同有毒有害物急性毒性的藻红外响应不同，其中，只有对急性毒性具有特殊的藻红外辐射响应的敏感藻可作为藻红外测试技术中的测试藻。敏感藻是指对有毒有害毒物急性毒性的藻红外辐射响应具有显著性、灵敏性和专一性的藻类，显著性指对急性毒性的响应温差大、响应时间快，灵敏性指对有毒有害物的响应剂量小，专一性指对某类有毒有害毒物急性毒性的良好响应。自然水体中是否存在敏感藻，怎样从成千上万种藻类中确定敏感藻，成为建立藻红外测试技术的技术关键。如何确定有毒有害物急性毒性响应的敏感藻是所述领域还未涉及的研究内容。目前，国内外尚无对有毒有害物急性毒性与藻红外辐射响应的研究报道，也无用红外测温仪测试微生物红外辐射的报道。经检索也未发现与本方法研究有关的最接近的对比文献。
发明内容针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种有毒有害物急性毒性响应的敏感藻确定方法。本发明的目的是这样实现的有毒有害物急性毒性响应的敏感藻确定方法，包括如下步骤(1)选择对水环境污染敏感的藻类进行筛选确定供试藻；以叶绿素a含量》4.0呢吃-1作为测试藻量标准；(2)以红外测温仪为测试仪器，分辨率《o.rc;(3)设计有毒有害物供试药品，配制成10g，L-l稀释液备用；有机毒物C6H6、C6H5CH3、C6H5(CH3)2、C6H5C1、CHC13、C6H50H、CH20、H0CH2CH20H、NH2C6H4S02NH2和[CH2CHC0NH2]n;重金属HgS04、Pb(N03)2、CuS04'5H20、K2Cr207、FeC13'6H20、馳04、ZnC12、A1C136H20、BaC12'2H20和CrC13'6H20;农药除草剂类——百草枯(C12H14隨2)、盖草能(C15H11C1F3N04)、草甘膦(C3H8N05P);杀菌剂类——多菌灵(C14H18N403)、三唑酮(C14H16C1N302)、井闪霉素(C20H35013N)、克菌康(C19H3408N8)、春雷霉素(C14H25N309);杀虫剂类——杀虫单(C5H12N06S2Na'H20)和灭扫利(C22H23N03);(4)毒性响应测试在自然光照，室温1828'C条件下，以绝热塑料容器作为测试容器；测试过程试验组3重复，对照组3重复；在两组的每一容器中分别加入5ml藻液，待藻液温度稳定时用红外测温仪对藻液面中部测温记录，然后分别加入配制的供试药品0.05ml稀释液，对照组加入0.05ml蒸馏水，立即测温记录，每1.5min测一次，直到温度变化停时止；如果藻液未响应则依次增加0.05ml稀释液进行测试直到产生响应；当确定第一次响应浓度后，再将该浓度样品液按X2、X4、X6、X8进行稀释测试，测试顺序从高向低稀释倍数逐一进行；数据分析每种药品测试的平均温差值=(试验组温度之和一对照组温度之和)+3，其绝对值》0.2'C的最大平均温差值来确定供试藻对毒物毒性的显著响应；敏感藻确定根据毒性响应测试中供试藻对毒物毒性响应的最大平均温差值、对应的响应时间，以及对毒物种类、种数响应的情况确定敏感藻如下有机毒物的敏感藻为羊角月牙藻(5We/astri/fflc邻ri'corm/tw/)，平均响应温差0.27°C,平均响应时间4.4min，较好响应种类70%;重金属的敏感藻为短线脆杆藻(,ragi7ar&fo"eWWi^a&)，平均响应温差0.2rc，平均响应时间5.7min，较好响应种类达80%;农药的敏感藻为水华鱼腥藻G4朋6ae/7aawae)，平均响应温差0.20。C,平均响应时间3.6min，较好响应种类达80%。采用本发明方法具有如下优点可以确定对有毒有害物急性毒性响应的敏感藻，其取材广泛，分离、培养、保存容易，所需成本低；敏感藻对有毒有害物具有显著性、灵敏性、专一性；有毒有害物急性毒性响应的敏感藻用于藻红外测试技术可保证该技术测试效果的准确性、灵敏性、稳定性。图1是有毒有害物急性毒性响应敏感藻确定方法的流程图。具体实施方式参见图l，为了实现有毒有害物急性毒性响应的敏感藻确定方法，本发明的步骤如下(1)供试藻筛选I.制定筛选标准选择对水环境污染敏感、容易分离培养的藻类作为供试藻。II.分析资料根据《中国淡水藻类分类》及国内外相关藻类研究资料分析各种藻类对水环境污染的敏感性和分离培养特性筛选供试藻。III.确定供试藻根据试验要求中国科学院水生生物研究所在查阅资料、研究分析后提出对水环境污染敏感的、易分离培养的8种供试藻莱茵衣藻GWa77yt/a77o;a51re/"Aanyz^'i、羊角月牙藻5k/e/as^rifflca;ricoi7wt"/s、纤细裸藻f〃^7e朋^rac_z7i5"、双尖菱板藻7Kz'^c力ia力a/7^c力/a柳jP力/oy7s(Her.)Grun、7jC华鱼腥藻/^a力3e/a/7os1—3(〃ae、斜生栅藻Sce/7eoksm^o/W/<w/s(Turp.)Kutz、蛋白核小球藻GW。reWajD/re/7azVo幼Chick、短线脆杆藻尸r柳7ar/a力reKi5^,/ata。(2)选定测试仪器便携式红外测温仪，型号ST60，分辨率O.rC，重量320g，美国雷泰公司生产。(3)有毒有害物设计根据产量多、使用广、对环境危害大的常见化学品来设计试验用有毒有害物的类型。有机毒物(IO种):C6H6、C6H5CH3、C6H5(CH3)2、C6H5C1、CHC13、C6H50H、CH20、H0CH2CH20H、NH2C6H4S02NH2、[CH2CHC0NH2];重金属(10种)HgS04、Pb(N03)2、CuS04*5H20、K2Cr.A、FeCl3'6H20、KMn04、ZnCl2、A1C13'6H20、BaCl2'2H20、CrCl3*6H20;农药(10种)除草剂类——百草枯(Cl2Hl4N2Cl2)、盖草能(dsH"ClF3肌)、草甘膦(C3H8N05P);杀菌剂类——多菌灵(C"HwN403)、三唑酮(C"HwClNA)、井闪霉素((:2。仏50^)、克菌康(d9H3ANs)、春雷霉素(C,晶5NA);杀虫剂类——杀虫单(C晶2N06S2Na'H20)、灭扫利(。萬)0浓度确定供试药品配制成10g，L—'稀释液。用量确定测试时滴加10g*L—'稀释液0.05ml。(4)试验条件确定测试环境自然光照，室温1828'C测试容器透明绝热塑料容器，规格为平底，直径4cm，高3cm，厚0.2cm。测定指标选择测试组与对照组温度之差的平均温差值来分析测试藻液对毒性的响应温度变化。测试时间加药前测一次，加药即测，每1.5min—次，直到藻液温度变化停时止。(5)确定藻量指标供试藻培养培养基制作、培养方法、培养设备参照中国科学院水生生物研究所提供的资料。测试藻量标准藻种间个体大小、形态不同，为了在相同条件测试比较，经研究确定采用叶绿素a作为测试藻液藻量标准，叶绿素a含量》4.0mgT1。供试藻液用量用于毒性测试的藻液量为5ml、10ml。(6)毒性响应测试测试过程先将每种药品配制成10g吃—'稀释液备用；试验组3重复，对照组3重复；两组每一容器加5ml或10ml藻液，待藻液温度稳定时用红外测温仪对藻液面中部测温记录，然后加入0.05tnl稀释液，对照组加入等量蒸馏水，立即测温记录，每1.5min测一次，直到温度变化停时止。如果藻液未响应则依次增加0.5ml稀释液进行测试直到产生响应。测试结果见表13。数据分析每一次测试平均温差值的计算方法是平均温差值=(试验组温度之和一对照组温度之和)+3，其绝对值》0.2'C的最大平均温差值来确定供试藻对毒物毒性的显著响应；用所有测试时间中的最大平均温差值来确定供试藻对毒物毒性的响应和对毒物种类、种数的响应。(7)敏感藻确定根据毒性响应测试中供试藻对毒物毒性响应的最大平均温差值、对应的响应时间以及对毒物种类、种数响应的情况等，所确定的敏感藻如下-有机毒物的敏感藻为羊角月牙藻(^e7e/a"i7y/zcapricoi77"^人平均响应温差0.27°C,平均响应时间4.4min，较好响应种类70%;重金属的敏感藻为短线脆杆藻(T^^77ar^6rei^s^7'ataJ,平均响应温差0.2rC，平均响应时间5.7min，较好响应种类达80%;农药的敏感藻为水华鱼腥藻"朋力ae/a/7os-邵i/aey)，平均响应温差0.2(TC,平均响应时间3.6min，较好响应种类达80%。(8)敏感藻灵敏度试验根据发光细菌测试毒物浓度和不同藻类对毒物毒性的响应不同，试验中供试药品浓度设计4个浓度级别10g.L-l、1g'L-l、0.1g'L-l、0.01g'L-l。测试顺序从稀释液低浓度向高浓度进行，用首次出现温度响应的毒物剂量确定敏感藻灵敏度，测试结果见表4、5。各敏感藻灵敏度如下羊角月牙藻对有机毒物的灵敏度在0.19.0mg*L-l之间；短线脆杆藻对重金属的灵敏度在0.067.0mg'L-l之间；水华鱼腥藻对农药的灵敏度在0.0033.0mg*L—'之间。(9)敏感藻评价自然水体中存在用于藻红外测试的敏感藻，并可通过上述方法找到。根据敏感藻的平均响应时间为4.6min，平均响应温差为0.23°C;发光细菌对有毒有害物急性毒性响应的灵敏度为0.0150呢*1/'之间，平均响应时间为5.0min;重金属的敏感藻为短线脆杆藻，农药的敏感藻为水华鱼腥藻，有机毒物的敏感藻为羊角月牙藻；采用上述方法确定的敏感藻对有毒有害物急性毒性响应具有显著性、灵敏性、专一性。测试所用5ml、10ml藻液量对供试药品均有响应，为了节省藻液用5ml藻液即可。采用本发明筛选方法具有如下优点可以确定对有毒有害物急性毒性响应的敏感藻，敏感藻取材广泛，分离、培养、保存容易，所需成本低；敏感藻对有毒有害物具有专一性，因此用于藻红外测试技术可保证该技术测试效果的稳定性。表1藻类对重金属的响应水华鱼腥藻莱茵衣藻羊角月芽藻纤细裸藻双尖菱板藻蛋白核小球藻短线脆杆藻斜生栅藻平均绝对值<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表6羊角月牙藻对有机药品的灵敏度<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>验证实施例1、重金属急性毒性大小测试l)供试药品:HgS04、Pb(N03)2、CuS(V5H20、K2Cr207、FeCl3*6H20、麵04、ZnCl2、A1C13'6H20、BaCl2*2H20、CrCl3'6H20;稀释浓度10g,L—1、1g'L—1、0.1g'L—|、0.01g'L-'。滴加稀释液0.05ml。2)敏感藻短线脆杆藻敏感藻浓度藻叶绿素a为4.0mg吃-1。敏感藻用量5ml。3)测试环境室内，自然光照，气温1828'C4)测试容器直径4.5cm、高3cm、厚0.2cm的平底透明绝热塑料容器。5)测试仪器便携式红外测温仪，型号ST60、分辨率O.1°C、重量320g、美国雷泰公司生产。6)测试过程先将每种药品配制成10g*L—l、1g《1、0.1g,L—1、0.01g'l/稀释液;试验组3重复，对照组2重复；在两组的每一容器中加入5ml藻液，待藻液温度稳定时用红外测温仪对准藻液面中心测试并记录所测温度一次，然后用移液管取出药品稀释液0.05ml加入每一试验组藻液中，每一对照组藻液加入等量蒸馏水，立即用前面的测试方法对两组藻液进行测温记录，以后每1.5min—次，直到温度变化停时止。测试顺序从毒物的低浓度向高浓度逐一进行。7)数据分析每一次测试平均温差值的计算方法是平均温差值=(试验组温度之和一对照组温度之和)+3，其绝对值》0.2匸的最大平均温差值来确定供试藻对毒物毒性的显著响应；用各不同样品稀释浓度测试时最先出现温度响应的样品稀释浓度及加入量来确定敏感藻对样品的响应剂量，用各不同样品稀释浓度测试时最先出现温度响应的样品稀释浓度确定敏感藻对样品的最低响应浓度。分析结果见表7。表7短线脆杆藻对重金属响应的最低剂量<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>8)试验结果根据表7中数据所测试10种重金属的最低响应剂量，它们的毒性大小顺序为重铬酸钾>氯化铝高〉锰酸钾>三氯化铬>三氯化铁>氯化锌〉氯化钡〉硫酸铜>硫酸汞。2、农药急性毒性大小测试1)供试药品Paraquat(Ci2H14N2Cl2)、Haloxyfop(C^HuCIFgNC^)、Glyphosate(C3H8N05P)、Carbendazim(C14Hi8N403)、Triadimefon(Ci4Hi6ClN302)、JingangmycinA(C20H35O13N)、Zhongshengmycin(C19H34O8N8)、Kasugamycin(C14H25N309)、Monosultap(C5H12N06S2Na'H20)、Fe叩ropathrin(C22H23N03)。稀释浓度10g'L"、lg'L"、O.lg'L"、O.Olg'L"。滴加稀释液0.05ml。2)敏感藻水华鱼腥藻敏感藻浓度藻叶绿素a为4.0mg'L'1。敏感藻用量5ml。3)测试环境室内，自然光照，气温1828t:4)测试容器直径4.5cm、高3cm、厚0.2cm的平底透明绝热塑料容器。5)测试仪器便携式红外测温仪，型号ST60、分辨率O.rC、重量320g、美国雷泰公司生产。6)测试过程先将每种药品配制成10g'L—1、lgT1、O.lg'L"、O.OlgT稀释液；试验组3重复，对照组2重复；在两组的每一容器中加入5ml藻液，待藻液温度稳定时用红外测温仪对准藻液面中心测试并记录所测温度一次，然后用移液管取出药品稀释液0.05ml加入每一试验组藻液中，对照组加入等量蒸馏水，立即用前面的测试方法对两组藻液进行测温并记录，以后每1.5min—次，直到温度变化停时止。测试顺序从毒物的低浓度向高浓度逐一迸行。7)数据分析每一次测试平均温差值的计算方法是平均温差值=(试验组温度之和一对照组温度之和)+3用所有测试时间中的最大平均温差值来确定水华鱼腥藻对重金属响应的最低剂量。分析结果见表8。表8水华鱼腥藻对农药响应的最低剂量<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>8)试验结果根据表8中数据所测试IO种农药的最低响应剂量，它们的毒性大小顺序为盖草能〉杀虫单>草甘膦〉多菌灵〉春雷霉素〉井冈霉素〉三唑酮〉百草枯>灭扫利>克菌康。注多菌灵的平均响应时间为1.5min，春雷霉素的平均响应时间为3.0min。3、有机毒物急性毒性大小测试1)供试药品C6H6、C6H5CH3、C6H5(CH3)2、C6H5C1、CHC13、CH、CH20、HOCH2CH2OH、NH2C6H4S02NH2、[CH2CHCONH2]n。稀释浓度10g'L"、lgT1、O.lg'L'1、0.01g'L—滴加稀释液0.05ml。2)敏感藻羊角月牙藻敏感藻浓度藻叶绿素a为4.2mg'L"。敏感藻用量5ml。3)测试环境室内，自然光照，气温1828'C4)测试容器直径4.5cm、高3cm、厚0.2cm的平底透明绝热塑料容器。5)测试仪器便携式红外测温仪，型号ST60、分辨率O.rC、重量320g、美国雷泰公司生产。6)测试过程先将每种药品配制成10g'I/1、lg'L'1、0.1g'I/1、o.oig'i;稀释液；试验组3重复，对照组2重复；在两组的每一容器中加入5ml藻液，待藻液温度稳定时用红外测温仪对准藻液面中心测试并记录所测温度一次，然后用移液管取出药品稀释液0.05ml加入每一试验组藻液中，对照组加入等量蒸馏水，立即用前面的测试方法对两组藻液进行测温并记录，以后每1.5min—次，直到温度变化停时止。测试顺序从毒物的低浓度向高浓度逐一进行。7)数据分析每一次测试平均温差值的计算方法是平均温差值=(试验组温度之和一对照组温度之和)+3用所有测试时间中的最大平均温差值来确定羊角月牙藻对重金属响应的最低剂量。分析结果见表9。表9羊角月牙藻对农药响应的最低剂量<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>对敏感藻的评价(1)根据目前了解情况发光细菌对有毒有害物急性毒性响应的灵敏度在敏感度为0.0150mgL—'之间，平均响应时间为5.0min，因此敏感藻达到发光细菌的灵敏度和平均响应时间。(2)测试所用5ml、10ml藻液量对供试药品均有响应，为节省藻液用5ml藻液即可。(3)敏感藻对毒物响应具有针对性，而发光细菌对毒物响应没有针对性。有毒有害物急性毒性响应的敏感藻确定是建立藻红外测试技术的技术关键。本发明原理是藻类具有光合磷酸化和氧化磷酸化两套代谢系统，受毒物影响时其红外辐射变化容易被红外测温仪测试；但是不同的藻类对有毒有害物急性毒性的响应温差和响应时间不同，对有毒有害物剂量、种类、数量的响应不同，因此只有同时具备对毒物响应温差大、响应时间快、响应剂量低、响应种类多的敏感藻才能用于急性毒性的藻红外测试技术。权利要求1、有毒有害物急性毒性响应的敏感藻确定方法，包括如下步骤(1)选择对水环境污染敏感的藻类进行筛选确定供试藻；以叶绿素a含量≥4.0mg·L-1作为测试藻量标准；(2)以红外测温仪为测试仪器，分辨率≤0.1℃；(3)设计有毒有害物供试药品，配制成10g·L-1稀释液备用；有机毒物C6H6、C6H5CH3、C6H5(CH3)2、C6H5Cl、CHCl3、C6H5OH、CH2O、HOCH2CH2OH、NH2C6H4SO2NH2和[CH2CHCONH2]n；重金属HgSO4、Pb(NO3)2、CuSO4·5H2O、K2Cr2O7、FeCl3·6H2O、KMnO4、ZnCl2、AlCl3·6H2O、BaCl2·2H2O和CrCl3·6H2O；农药除草剂类——百草枯(C12H14N2Cl2)、盖草能(C15H11ClF3NO4)、草甘膦(C3H8NO5P)；杀菌剂类——多菌灵(C14H18N4O3)、三唑酮(C14H16ClN3O2)、井冈霉素(C20H35O13N)、克菌康(C19H34O8N8)、春雷霉素(C14H25N3O9)；杀虫剂类——杀虫单(C5H12NO6S2Na·H2O)和灭扫利(C22H23NO3)；(4)毒性响应测试在自然光照，室温18～28℃条件下，以绝热塑料容器作为测试容器；测试过程试验组3重复，对照组3重复；在两组的每一容器中分别加入5ml藻液，待藻液温度稳定时用红外测温仪对藻液面中部测温记录，然后分别加入配制的供试药品0.05ml稀释液，对照组加入0.05ml蒸馏水，立即测温记录，每1.5min测一次，直到温度变化停时止；如果藻液未响应则依次增加0.05ml稀释液进行测试直到产生响应；当确定第一次响应浓度后，再将该浓度样品液按×2、×4、×6、×8进行稀释测试，测试顺序从高向低稀释倍数逐一进行；数据分析每种药品测试的平均温差值＝(试验组温度之和-对照组温度之和)÷3，其绝对值≥0.2℃的最大平均温差值来确定供试藻对毒物毒性的显著响应；敏感藻确定根据毒性响应测试中供试藻对毒物毒性响应的最大平均温差值、对应的响应时间，以及对毒物种类、种数响应的情况确定敏感藻如下有机毒物的敏感藻为羊角月牙藻(Selenastrumcapricornutum)，平均响应温差0.27℃，平均响应时间4.4min，较好响应种类70％；重金属的敏感藻为短线脆杆藻(Fragilariabrevistriata)，平均响应温差0.21℃，平均响应时间5.7min，较好响应种类达80％；农药的敏感藻为水华鱼腥藻(Anabaenaflos-aquae)，平均响应温差0.20℃，平均响应时间3.6min，较好响应种类达80％。2、根据权利要求1所述有毒有害物急性毒性响应的敏感藻确定方法，其特征在于确定敏感藻灵敏度，根据发光细菌测试毒物浓度和不同藻类对毒物毒性的响应不同，试验中供试药品浓度设计4个浓度级别10g'l/1、1g.L—'、0.1g'l/1、0.01g*L—'。3、根据权利要求2所述有毒有害物急性毒性响应的敏感藻确定方法，其特征在于测试顺序从稀释液低浓度向高浓度进行，用首次出现温度响应的毒物剂量确定敏感藻灵敏度，各敏感藻灵敏度如下羊角月牙藻对有机毒物的灵敏度在0.19.0mg*L—'之间；短线脆杆藻对重金属的灵敏度在0.067.0mg，l/之间；水华鱼腥藻对农药的灵敏度在0.0033.0mg*L—'之间。全文摘要本发明提供一种有毒有害物急性毒性响应迅速敏感藻的确定方法，包括选择对水环境污染敏感、容易分离培养的藻类作为筛选对象；采用叶绿素a含量≥4.0mg·L^-1藻类；以便携式红外测温仪为测试仪器；设计有毒有害物供试药品，配制成10g·L^-1稀释液备用；经过毒性响应测试，用所有测试时间中的最大平均温差值来确定供试藻对毒物毒性的响应和对毒物种类、种数的响应；根据毒性响应测试中供试藻对毒物毒性响应的最大平均温差值、对应的响应时间以及对毒物种类、种数响应的情况等因素确定的敏感藻。可以确定对有毒有害物急性毒性具有敏感性的敏感藻，加之敏感藻的取材广泛，分离、培养、保存容易，所需成本低；同时，所选的敏感藻对有毒有害物具有针对性，因此用于藻红外测试技术，并保证该技术测试效果的稳定性。文档编号C12Q1/06GK101220389SQ200810069289公开日2008年7月16日申请日期2008年1月23日优先权日2008年1月23日发明者姜文超,智张,曾晓岚,艳林,郭蔚华,春阳申请人:重庆大学