专利名称：一种植物生长素调控的启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及到分子生物学与基因工程领域中一种从番茄中分离出来的、受生长素调控的 启动子及其应用。
背景技术：
植物是一个多细胞组成的复杂有机体，要维持正常协调的生长发育状态、适应外界环境， 各细胞、组织和器官之间必须及时进行有效的信息交流。担负这种信息交流任务的化学信使 之一就是植物激素。因此，植物激素及其作用机制是植物学研究的核心领域之一。生长素是第一个被发现的植物激素，在植物发育过程中起着关键的调节作用。在茎切段 实验和胚芽鞘实验中表现出刺激细胞生长伸长的作用，它的主要生理作用还包括诱导不定根 发生、促进微管束分化、控制向性生长和顶端优势，以及调节植物开花坐果等生理过程。近 20年来的研究已经清楚地证明，生长素还在分子水平对基因表达起着特殊的快速调控作用。 生长素调控基因表达的方式一直是植物分子生物学的重要研究热点。特别是那些在几分钟内 便可被生长素特异诱导表达的基因，称为早期基因或原初响应基因研究较为深入。目前，多个生长素应答基因的启动子(如大豆Gi73、 &4C/i "J和豌豆尸S-2A^/5)己通 过不同方法(如缺失分析、接头扫描、定点突变和增益分析)详细分析。对启动子的研究发 现，^^//^s和其他生长素响应基因的启动子中都含有转录因子结合区域，即生长素响应元 件(AuxRE)。最常见的生长素响应原件是一个六碱基保守序列TGTCTC，它是J x//X^与 生长素反应因子(ARF)特异性结合的位点。天然AuxREs启动子-报告基因构建可用于研究生长素应答基因在组织和器官的表达模 式。这些构建体是跟踪基因在与生长素梯度或灵敏度变化有关的生长反应，(如向地性和向光 性等)中的表达事件的有力工具，也是研究植物信号传导途径的手段。AuxRE-报告基因复合 体在许多种类的器官、组织和细胞中都表现出对生长素的响应。通过差异显示PCR法从番茄果实中分离出果实发育相关基因(development regulation DR)。通过同源序列分析得出￡>i /、 3、么《属于^Mx/Z4^s基因家族，Z)i 72属于ARF基因 家族。到目前为止，研究得比较清楚的是DR12和DR4。研究结果表明在果实中，2)及/、 ■ 、 (S的表达受到乙烯的调控，而在叶片中则没有这种情况，表明这些基因在特定组织(果实) 中的表达受到乙烯的调控，它们可能与果实发育相关。经表达分析发现，在果实发育过程中稳定表达，但在果实成熟过程中(转色期)其表达水平迅速下降；该基因的表达水平受到乙烯的负调控和生长素的正调控，绿熟期果实经50 pM乙烯处理后表达水平迅速降低，果实经10pM2， 4-D处理后，表达增强。DiW作为一 个生长素诱导表达的基因，但却强烈地受到乙烯和果实成熟的调节，预示着该基因不仅对果 实成熟过程具有重要的调控作用，并且可能和生长素与乙烯的相互作用密切相关。目前，已被成功转入番茄中，但对该基因的功能的了解，目前还只是来源于对转基 因植物的表型分析的一些初步推测，因此研究该基因启动子的调控特征是十分有必要的。目 前的研究证实，在Z)及《基因的启动子中含有一个类似乙烯响应元件的序列，却未发现与已知 生长素响应元件类似的序列。启动子片断荧光表达载体在原生质融合体中表达研究证实，该 启动子确实受到生长素诱导。因此，该启动子有可能含有新的生长素响应元件，研究该基因 在组织和器官的表达模式，将为进一步揭示生长素对番茄生长以育的调控奠定基础。构建Z)i S启动子-报告基因，是研究该基因在与生长素有关的生长反应(如向地性和向光 性等)中的表达调控方式的重要方法。另外，已有充足的证据表明，生长素调控基因的表达 也受其它信号转导途径影响。因此，构建启动子-报告基因，转化模式植物，研究其表 达的组织特异性和对生长素及其它刺激条件(如乙烯、伤害等)的响应特性，可以为进一步 揭示生长素调控的分子机理奠定基础，也可探讨生长素信号转导途径与其它信号的相互影响。发明内容本发明的目的是提供一种植物生长素调控的启动子及其应用本发明所提供的从番茄中分离的受植物生长素调控的启动子DiW，它的核苷酸序列是序 列表中序列1所述核苷酸，长度为1031bp。含有上述启动子的表达盒和重组表达载体也属于本发明的保护范围。上述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显 微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织或器官，得到转 基因植物细胞或组织或器官及由此分化、再生的完整植株及其无性系或其后代。本发明还提供了一种上述生长素调控的启动子的获得方法。是以番茄的基因组DNA为 模板，用巢式PCR法进行扩增得到启动子，所用前引物AP1和AP2分别是序列表中SEQID NO: 1和SEQ ID NO: 2所述核苷酸，后引物DR8-P1和DR8-P2分别是序列表中SEQ ID NO: 3禾口SEQIDNO: 4所述核苷酸。启动子5'端截短构建实验证明，本发明中生长素调控的启动子D朋可以启动pGreen-GFP 表达载体在烟草原生质中表达。通过构建将3个含DiW启动子缺失片段的pGreen-GFP表达 载体，分别转化烟草原生质体，并用2，4-D处理，用荧光分光光度计检测其荧光强度，以未处理为对照，进一步分析该启动子的缺失片段对外界生长素刺激的表达情况，确定了该启动 子在起始位点前-250bp区域内存在1个生长素的正调控位点。本发明提供了一种利用启动子构建植物表达载体pBI121及其转化番茄的方法，用 Z)i S启动子替换表达载体pBI121上的35S启动子，使其驱动报告基因的表达，将构建正确的 此类载体命名为pBIDR8，并进一步将构建好的pBIDR8重组质粒通过农杆菌介导的方法转化 番茄外植体可以获得转基因番茄。本发明从番茄中获得了一种受生长素调控的启动子，并对其进行了序列与功能分析，通 过序列缺失分析，发现该启动子在起始位点前-250bp区域内存在1个生长素的正调控位点。 本发明还提供了利用该启动子构建植物表达载体与获得转基因植物的方法。这将有助于深入 阐明该基因的表达调控机制及其对乙烯、生长素的反应机制，同时为该启动子的利用及果实 成熟的激素调控研究奠定基础。
图1为2， 4-D处理对3个ZW6"启动子截短片段GFP荧光表达强度的影响图。图2为"/ 6*启动子驱动GUS基因(pBI121: GUS)植物表达载体pBIDR8的构建图。图3为pBIDR8质粒转化农杆菌PCR检测鉴定电泳图，其中1: Marker2000; 2:阴性对照；3:阳性对照；4、 5:菌落PCR。图4为转pBIDR8番茄的基因组PCR鉴定电泳图。其中1~12: pBIDR8转基因番茄单株；13、 14:野生型番茄；15: pBI121质粒为模板的阳性对照；16:阴性对照。
具体实施方式
本发明中所述的启动子核苷酸序列可以是其中一个或多个核苷酸发生取代、缺失、插入 或倒位的核苷酸序列，即所分离的核苷酸序列的人工突变体或"天然"突变体，它保留其启 动子功能；还可以是所述的核苷酸序列与其它启动子序列或启动子区保守调控序列("motif " 或"box")的融合序列。本发明中所述的表达载体是指现有技术中己知的、能够在植物中进行表达的任何一种植 物载体，例如pBin19 、pB1121 (美国ClonTech公司产品)和pCAMBIA系列(澳大利亚CAMBIA 中心产品)等。本发明中所述的转化是指现有技术中已知的、能够将外源基因导入植物细胞或植物组织 的任何一种植物转化方法，如农杆菌介导法和基因枪等。本发明中所述的宿主细胞或宿主组织或宿主器官及其后代细胞是指所有植物细胞或植物组织或植物器官或由这些细胞、组织或器官通过组织分化或无性胚再生并且发育成熟的整体 植株(包括种子)。术语"核酸序列"或"核苷酸序列"指含有天然存在的核苷酸或核苷单体的序列。该序 列也包括具有相似功能的非天然存在的单体或其部分的修饰的或取代的序列。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为基因工程或分子生物学实验的常规方法。实施例l:番茄中i)i S基因启动子的克隆与分离1. 番茄总DNA的提取适当调整的CTAB法提取植物基因组DNA步骤为1) 取0.5克番茄叶片，用微量匀浆器磨碎，加入65'C预热的CTAB500nl后转移至2mL 离心管中，剧烈震荡；2) 65。C温浴15 min，期间震荡4 5次；3) 加入等体积氯仿异戊醇(24: 1)，轻轻混匀后，10000 rpm离心5 min;4) 重复步骤(3)—次；5) 加入2倍体积无水乙醇，轻轻混匀；6) 10000 rpm离心5 min，弃上清后再用75%乙醇洗涤沉淀一次；7) 晾干乙醇，加30 plddH20溶解DNA沉淀，待用。2. PCR扩增采用染色体步移方法克隆启动子，将番茄基因组DNA用内切酶DmI，五coi V ，PvmII， 进行消化，构建DNA步移文库。PCR扩增的前引物AP1、 AP2由启动子扩增试剂盒(Universal genome walker kit, Clontech, USA)提供API: 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3，；AP2: 5，-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3，。两个后引物DR8-P1、 DR8-P2根据己经获得的基因序列设计DR8-P1: 5'-ATCACCTATTCTTATGCACC-3，；DR8-P2: 5'-CGTTTTGCTGTTAGAATTGGAC-3，。采用巢式PCR法进行启动子扩增，首先选择接头引物API和DR8-P2进行第一次扩增， PCR扩增条件为94。C25s， 72。C3min， 7个循环；94°C 25 s， 67°C 3 min， 32个循环；67°C 7 min， 1个循环，模板分别为四个已构建的DNA文库。采用引物API和DR8-P1进行第一 次PCR扩增，然后用引物AP2和DR8-P2分别对第一次PCR产物的100倍稀释液进行第二 次PCR扩增，扩增条件为94。C25s， 72。C3min, 5个循环；94°C 25 s, 67°C 3 min， 32个循环；67'C7min, 1个循环。 3.扩增片段的回收扩增片段用琼脂糖凝胶回收试剂盒(BioFlux公司)回收。1) 切胶电泳后的凝胶在紫外灯照射下，快速切取目标带，放入离心管中；2) 溶胶每100毫克凝胶加入100 ^Extraction Buffer, 50。C水浴至胶融化；3) 上柱将混合液转移至Spin column, 6000卬m离心1 min，弃去废液；4) 加入500Extraction Buffer, 12000 rpm离心1 min， 弃去废液；5) 漂洗加入750 pi Wash Buffer, 12000 rpm离心1 min，弃去废液后再离心lmin，在 室温下静置5 10min，彻底晾干乙醇；6) 洗脱把Spin column转移到干净离心管中，加50^il6(TC预热的Elution Buffer,静 置1 min后12000 rpm离心2 min;收集的溶液重新加入柱子中，再洗脱一次。7) 回收的DNA于一2(TC保存。实施例2:启动子缺失片段的荧光定量表达分析设计前引物P2 (见序列表SEQIDNO: 6)、 P5 (见序列表SEQ ID NO: 7)、 P7 (见序 列表SEQIDNO: 8)和后引物P3 (见序列表SEQ ID NO: 9)，在前引物中引入历"dll，后 引物中引入BflwH I限制性内切酶位点。前引物-P2: 5 ，-CCCAAGCTTTTTGGTGCATAAG-3'; P5: 5，-CCCAAGCTTGGTACAACGAATGAGAT-3，; P7: 5 ，-GCGAAGCTTATTAACGTGTAGAAATC-3'。 后引物P3: 5 ， -CCTGGATCCTTGAAATTAAGGCCGGAA-3 ，。从已获得的D及S启动子片段中分离出以3'端为固定点的3个不同大小的缺失片段。缺失 片段与载体pGreen-GFP同时经i^m/ffl和5flmHI酶切，凝胶回收纯化获得目标片段，经T4 DNA连接酶连接，分别克隆到pGreen-GFP载体中。连接产物转化大肠杆菌JM109， PCR反 应筛选阳性克隆子，并测序验证，所得序列见序列表中序列1。用大小分别为l kb (由引物P2、 P3扩增得到)，0.5kb (由引物P5、 P3扩增得到)，0.25 kb (由引物P7、 P3扩增得到)的截短的Z)i^启动子片段取代35S启动子构建了3个Z)i S启动子的 GFP瞬时表达载体，并将其转入烟草原生质体中，以50 ^M的2,4-D处理转化的烟草原生质体 24h后，检测其荧光表达强度，结果见图l。由图l可以看出，D及《启动子250bp、 500bp、 1000bp的缺失片段未经生长素处理的对照荧光表达强度基本一致，无显著差异；而同一表达载体 在经生长素处理后荧光强度显著增强，但不同缺失片段间无显著差异，这说明在-250 bp至 -lOOObp区域内不存在生长素响应位点，但在-250bp序列内存在着生长素响应位点。实施例3: ZW《启动子驱动GUS基因(pBI121: GUS)植物表达载体pBIDR8的构建 "/ 《启动子驱动GUS基因(pBI121: GUS)植物表达载体pBIDR8的载体图谱如图2所示， 具体方法如下所述将pGreen-GFP-DR8经限制性内切酶///wdn和B"mH I双酶切后，得到ZW《启动子片段 约1000bp，用DNA片段回收试剂盒(Easy-NA Gel Extraction Kit，德国Omeg-Bio / TEK产 品)回收并纯化ZW《启动子片段，与经过//z'"dll和Bfl/wH I双酶切的植物表达载体pBI121 的大片段相连，得到重组质粒。将所得到重组质粒用"热激法"转化到大肠杆菌菌株JM109。转化的JM109在含卡那霉 素50mg/L的LB固体培养基上于37 'C过夜培养，挑取平板上生长的单菌落，接入含卡那霉 素50 mg/L的LB液体培养基中于37 'C振荡过夜培养。当菌液浓度达到006。。值0. 5-0. 6时， 离心收集菌体，按小量碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶州'm/ffl和Bc^HI双酶切后，在 1.2%琼脂糖凝胶电泳，验证切下的小片段为1000 bp左右。将含有ZW《启动子片段和pBI121 酶切得到的大片段的重组表达载体命名为pBIDR8。 pBIDR8中GUS基因需要ZWS启动子驱动表 达。实施例4:转pBIDR8基因番茄的获得与鉴定 1.农杆菌的转化与转化子的鉴定用CaCl2法制备根癌农杆菌菌株GV3101的感受态细胞。利用冻融法将重组的植物表达载体pBIDR8转入制备的GV3101的感受态细胞。将转化的GV3101细胞接种到含有卡那霉素(Kan) 50 mg/L和利福平(Rif) 50 rag/L的YEB固体培养基，置于28 'C在暗处培养48-72 h，挑取平板上的单菌落，接入含有利福平50 mg/L和卡那霉素50 mg / L的YEB液体培养基，在28 °C振荡过夜培养。当培养物的浓度达到0De。。值0.4-0.5时，取少量菌液进行PCR扩增，体系为10xPCRbuffer 2.5 nl; 25mMMgS04 1.5 lOmMdNTP0.5 10uMP2 0.5^1;10uM P3 0.5 nl; Ta《0.5 pi; Temp 0.5 ^d; ddH20加至25 pl。反应条件为95 。C预变性5 min;95t)变性45s ， 56。C退火45s , 72"C延伸45 s， 35个循环；72。C保温10 min充分延伸；4°C保存。所得产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测目标带约1000 bp。另取1 mL菌液于1.5 mL离心管中，10000 rpm离心l分钟后，弃上清，用GUS染液重悬菌体，将离心管置于37'C， 18小时后观察，GUS染液呈蓝色，说明启动子驱动GUS基因正确表达。至此，得到含有pBIDR8 的阳性克隆农杆菌，将其命名为pBIDR8/GV3101。2. 浸染农杆菌的准备1) 挑取携带植物表达载体PBIDR8的农杆菌GV3101单菌落，接种到20 ml附加抗生素(50 mg/L Kan.和50 mg/L Rif.)的YEB液体培养基中，28°C 、225卬m摇菌约18 h至ODM。=0. 6~0. 8;2) 取500 pl菌液，接种到50 ml新鲜YEB液体培养基中(无抗生素)，摇菌8 h左右至 OD600=0. 2~0. 5;3) 将菌液导入无菌离心管中，16°C、 4000 rpm离心10 min，弃上清，用20 ml MS液 体培养基(加入100nM的乙酰丁香酮(AS))重悬菌体。3. 番茄转化与转化植株的再生1) 将干燥的番茄种子用纱布包好，用清水浸泡lh,轻轻搓去种子表面粘膜；2) 用75%酒精浸泡种子30秒后立即用无菌水漂洗3次；3) 再用10%次氯酸钠浸泡15min，中途用无菌的镊子翻动4 5次，然后用无菌水漂洗 5~7次；4) 将种子接入1/2MS固体培养基中，28'C避光培养，3 d后大部分种子可以整齐地萌发；5) 将开始萌发的种子转移到24'C培养箱中，光照16h，黑暗8h交替培养一周左右； 取萌发的小苗，切下子叶和下胚轴，作为遗传转化的外植体。去掉子叶柄和叶尖，将子叶和 下胚轴接入分化培养基(MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L仏八+0.7%琼脂+3%蔗糖)中预培养1~2 d 即可用于转化。6) 将制备的番茄外植体浸泡于制备的菌液中，10~15 min后，用滤纸吸干外植体表面菌 液。再将外植体接到分化培养基上(MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA.+ 0.7%琼脂+3°/。蔗糖)， 28t:暗培养2~3d。7) 共培养后的外植体用无菌水漂洗5 6遍后，再用无菌滤纸吸干多余水分，转移到加抗 生素(50mg/LKan.、 300 mg/LCb.)的番茄分化培养基中，光照16 h，黑暗8h交替，24'C 筛选培养；8) 选择培养15 d后，外植体切口处逐渐分化出抗性愈伤组织，将它们转入相同的新鲜 选择培养基中(MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L ZT+0.1 mg/L IAA+50 mg/L Kan.+300mg/L Cb.十 0.7%琼脂+3%蔗糖)，继续培养直至分化出芽；9) 抗性幼苗长至3 cm以上时，切下不定芽，转入番茄生根培养基(MS+0.5 mg/LIAA+100mg/L Kan.+300 mg/L Cb.+ 0.7%琼脂+3%蔗糖)，光照16 h培养，黑暗8 h交替，24 。C培养，约10d后长出不定根。继续培养约一个月后，可进行炼苗和移栽。转基因植株可通过以上三步的筛选，长出健壮的小苗。当小苗长至3 4片叶时，可将封口膜揭开，在温室中炼苗3 4 d，移栽到盛有珍珠岩的营养钵中成活。4.转基因番茄的鉴定采用前述改良的CTAB法提取选择性培养获得的植株的基因组DNA，通过PCR检测 pBI121质粒上的7V尸rn(Kan)序列鉴定转基因植株。pBI121质粒中含有卡那霉素抗性基因(TV/Til),而野生型植株本身不含该序列，因此以 MTn序列的特异性引物，以待检测植株基因组DNA作为模板，PCR扩增该序列，通过琼脂 糖凝胶电泳检测扩增产物，从而鉴定转基因植株。上下游引物的Tm值为54.9'C，目标序列长度为758 bp，因此调整PCR扩增体系为体 系为10xPCR buffer 2.5 pi; 25mM MgS04 1.5 10mM dNTP 0.5 pi; 10u MMTIIPrimer R 0.5 nl; 10u MiVPriI Primer F 0.5 r呵0.5 pi; Temp 0.5 pi; ddH20加至25 pl。反应条件为 94。C预变性5min; 94。C变性45s ， 52。C退火45s ， 72。C延伸45 s， 35个循环；72。C保温 10min充分延伸；4'C保存。设立两个阴性对照组，模板分别采用野生型植株的基因组DNA和ddH20;阳性对照组的 模板为pBI121质粒，结果见图4。序列表<110〉重庆大学〈120〉-一种植物生长素调控的启动子及其应用〈170〉 DNAMAN Version 5. 2. 2<160〉 9<210〉 1 〈211〉 1031 〈212〉 DNA〈213〉番茄属Alisa cring番茹(Z^coper5"ic"/z7 esci/Jeflt"/")<400〉 1ttattcccgtt taataaatacatgattmat50atatttta.ttttacta己gttttaatg犯tt薩atataattattttgtttacttteiacggaga150aat at 11 caatacatggaattttt犯ELgtCcataittct￡i￡ic.200aaagataacgatcttaga.at250gcgtatataitat￡iatatttcgatgc犯agcattaaacttaaagttttttc:则gctagcat.atgcaatatggattttaga.gactatcaatttttctacttaacaagcac.gtgceit已ttta.tgl:eitgggc卿c棚gtgtC￡Ltg￡lCttatgtttaatacgtatctaattctctat1...lo()gagtgtt,ttattctacattactatteitta.gacctataaaa.ggtgtcaaatttctgatgtgcaacacttttcagcctaccacaattc.cccag3gtt3g￡Ua￡ltgacactcca.ctcttttggctgtteitctga600atggta,c犯cg犯tgeigattgttcctctteitaatcaagagt:cttgatt tt650ga.actctgaatataaataat1111 aataaaa a. a t & 11 a a cttttttatgg700a.ttttacctagcgtgaatttg犯at犯tta.taa^tttcgagsgtgcggaa.750aaa&ac t c catctctttgcatcattcactcccttattaac800gtgtagaaat ctgtaccgt.t catctgcaga cacgcgtcac ga.U卿atg 850gctaacat.ga aagcctxcgt ccacctaccc gagaccatat atagt:ggccl; 9()0aaccgcattt tttcaaagca ccaaaagata tttcatttca ccaaactatc 950taaaaagggg gaaaatgtca tcggagacag ccaaatcagc gaacggtttg 画Oacggaaacaa ataattccgg ccttaatttc a〈210〉 2 〈211〉 22 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈220> 〈223〉〈400〉 2gtaatacgac tcactatagg gc 22〈210〉 3<211〉 19〈212〉 DNA 〈213〉人工序列<220〉 〈223〉<400> 3a,ctatagggc acgcgtggt 19〈210〉 4 〈211〉 20 <212> DNA〈213〉人工序列<220〉 〈223〉〈400〉 4atcacctatt cttatgcacc 2()<210〉 5 〈211〉 22 <212> DNA 〈213〉人工序列<220〉 〈223〉<400〉 5cgttttgctg ttagaattgg ac 22〈210〉 6〈211〉 22<212> DNA <213>人工序列〈220〉 <223〉<400〉 6cccaagcttt ttggtgcata ag 22〈210〉 7〈211〉 26<212〉 DNA <213>人工序列〈220〉 〈223〉<400> 7cccaagcttg gtacaacgaa tgagat 26〈210〉 8<211〉 26<212> DNA <213〉人工序列〈220〉 <223〉〈400〉 8gcgaagctta ttaacgtgta gaaatc 2(—〈210〉 9 <211> 27 〈212〉廳 〈213〉人工序列<220> <223><400> 9cctggatcct tgaaattaag gccggaa 2权利要求
1. 一种从番茄中分离的受植物生长素调控的启动子DR8，它的核苷酸序列是SEQ IDNO1所示的核苷酸序列，其全部序列和部分序列均在权利要求之内。
2. 含有权利要求1所述的启动子的表达盒，其特征在于所述启动子的下游连接结构 基因，或调节基因，或结构基因或调节基因的反义基因，或者能够干扰内源基因表达的小RNA。
3. 含有权利要求1所述启动子、或权利要求2所述的表达盒的重组表达载体，其特征 在于所述重组表达载体是由权利要求2所述的表达盒与质粒、病毒或运载体表达载体所构 建的重组载体。
4. 根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为重组植物表 达载体，所述重组植物表达载体含有权利要求2所述的表达盒并且能够将所述的表达盒转送 进入植物宿主细胞、组织或器官及其后代并且能够或者至少方便所述的表达盒整合到宿主的 基因组中。
5. 由权利要求3、 4任一所述的重组表达载体转化植物细胞或植物组织或植物器官得到 的转基因植物细胞或组织或器官。
6. —种权利要求1所述的ZW《启动子的应用，包括利用该启动子替换pBI121: GUS表 达载体中的35S启动子，将所构建的重组载体利用农杆菌介导的方法进行转化获得转基因番 茄，以此达到利用该启动子对植物进行调控或其它相关应用的目的。
7. 根据权利要求6所述启动子的应用，除了构建与GUS融合基因的应用，还包括利用该 启动子构建其它融合基因的应用。
全文摘要
本发明公开了一种植物生长素调控的启动子及其应用。该启动子分离自番茄基因组DNA，与果实生长发育相关并且受生长素的正调控，其核苷酸是SEQ ID NO1所示的核苷酸，长度为1031bp。本发明提供了一种分析鉴定该启动子受生长素调控的有效方法。启动子5’端截短构建实验表明该启动子在-250bp至-1000bp区域内不存在生长素响应位点，但在-250bp序列内可能存在着生长素响应位点。利用该启动子可以构建各种重组表达载体，并能驱动报告基因表达，如GUS基因。利用该启动子所构建的载体可以转化宿主细胞并获得相关转基因植物，为进一步揭示生长素调控启动子的分子机理奠定基础。
文档编号C12N15/29GK101260405SQ20081006922
公开日2008年9月10日 申请日期2008年1月10日 优先权日2008年1月10日
发明者孟德尔·布泽依, 宋红丽, 李正国, 杨迎伍, 王心宇, 伟 邓 申请人:重庆大学