专利名称：转基因细胞覆盖的血管内支架及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种转基因细胞覆盖的血管内支架，特别是一种抑制经皮冠状动脉成形 术或支架植入术后再狭窄的转基因细胞覆盖的血管内支架及其制备方法。
背景技术：
血管内再狭窄主要是由于介入手术对血管壁造成的机械性损伤(主要是内皮层损伤) 引起内皮细胞剥脱和功能紊乱，导致损伤部位长期暴露在血液环境中，诱发自身免疫应 激和炎症反应，诱导血液中单核细胞和血管中膜平滑肌细胞向内膜迁移并增殖，最终形 成再狭窄。目前再狭窄问题已成为血管介入治疗面临的主要挑战和研究热点。血管内皮细胞是一类功能复杂的细胞，分泌多种调节血管功能的活性物质,活跃参 与血小板的功能调节、血浆促凝因子激活、活化凝血因子清除及纤溶过程，与心血管疾 病密切相关。VanderGiessen等首先进行了血管内支架内皮化研究。随后的部分研究表 明，金属支架表面内皮化可以防止急性血栓的形成，降低血栓的发生率，并通过早期修 复受损动脉的局部内皮，抑制平滑肌细胞的增生和迁移，预防再狭窄的发生，因而可能 是一种较为理想的方法。目前对于血管内支架再内皮化研究较多，并且分别研究了支架再内皮化的几个关键技术(1)种子细胞的来源；(2)细胞的种植技术；(3)筛选适用于细胞与血管内支架的粘附基质。体外研究用内皮细胞常取自牛主动脉，但在体内实验中，为了避免排斥反应的发生， 自体内皮细胞无疑是进行细胞种植的最佳选择。在早期实验研究中，血管内皮细胞主要 取自大血管。但从大血管收集血管内皮细胞有一定的危险性，临床应用有限，近来从表 浅静脉收集血管内皮细胞，取自自体的大隐静脉或颈外静脉，常采用胰蛋白酶或胶原酶 消化分离内皮细胞。临床上要求种植内皮细胞操作越简单，时间越短越好，因此仅靠从 体静脉中获取的原代血管内皮细胞，尚不能满足种植的要求。为了获得足够数量的内皮细 胞，1990年Zilla等建立了快速、大规模扩增血管内皮细胞培养技术，其方法是取自体 浅静脉内皮细胞进行原代培养后，以l : (30-40)的比例作单次传代培养，在3周左右， 细胞数量激增300余倍，足以满足种植的需要。随着对干细胞研究的深入，人们开始从骨 髓中分离和培养内皮细胞。Shattacharya等利用CD34+骨髓细胞可以分化成内皮细胞的特 点，先用免疫磁珠技术富集CD34+骨髓细胞，然后种植到移植物上，与未种植的相比，内 皮化的面积前者明显大于后者。由于胚胎干细胞具有分化成人体内任何细胞的潜能，干 细胞尤其是成体干细胞研究技术迅速发展和成熟，利用细胞克隆技术和胚胎干细胞定向 培养技术建立起基本上无免疫源性的内皮细胞株也许能解决内皮细胞来源问题且具有无 可比拟的优点，值得探讨。支架内皮化的效果取决于种植的内皮细胞数目、细胞的黏附率、贴壁细胞暴露于血 流后的保留率。其中如何提高内皮细胞的黏附率，是目前最需要解决的问题。细胞在材 料上的黏附包括两个过程贴附过程和黏附过程。贴附过程非常迅速，是细胞与材料之 间的一些物理、化学作用，如范德华力、离子力等所引起的，目前主要采取旋转培养的 方法使细胞与血管内支架表面充分接触、贴附。黏附过程是由材料与一些生物活性分子 如细胞外基质蛋白、细胞膜蛋白、细胞骨架蛋白等相互作用而引起，是十分关键的过程。 只有当细胞与材料发生适当的黏附，才能在材料上进行铺展生长，乃至分化、增殖。在 血管内支架表面涂覆促细胞粘附的基质，能够增加细胞在支架表面的粘附和生长。基因修饰的内皮细胞在血管内支架上接种是一种利用细胞作为传递药物平台的新技 术。所谓基因修饰就是向靶细胞内引入外源基因，以纠正其基因缺陷或加强某基因表达。 研究表明，体外培养种植的内皮细胞较体内生长内皮细胞在功能方面有所不足。基因工 程技术的迅速发展，使得研究者可以对内皮细胞进行基因修饰，加强其分泌细胞因子和 黏附生长能力以及抗血栓功能。与支架表面吸附或交联生长因子蛋白或抗血栓形成的药 物相比，转入的外源基因可持续表达目的蛋白，应当具有更好的效果。目前主要从两个 方面考虑目的基因的选择， 一类是能够促进内皮细胞增殖如VEGF, FGF此类生长因子；另 一类是具备抑制平滑肌细胞增殖功效的基因，如eN0S， wtP53等基因。因此，我们将能够促进内皮细胞增殖和能够抑制平滑肌细胞增殖基因分别转染或共 同转染内皮细胞或干细胞，再通过超声雾化喷涂技术制备血管内支架表面的粘附基质涂 层，然后进行血管内支架和转基因细胞的旋转培养制备细胞涂层，以提高支架植入术后 支架表面的再内皮化速度，最终达到抑制血管内再狭窄的目的。发明内容本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种通过加速内皮细胞修复防治经皮 冠状动脉成形术(PTCA)后或支架植入术后再狭窄，最终能达到消除血管内再狭窄的效 果的转基因细胞覆盖的血管内支架及其制备方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案一种转基因细胞覆盖的血管内支架，它具有金属裸支架，在所述的金属裸支架表面 有处理层，在处理层上有粘附基质涂层，在粘附基质涂层上有细胞涂层，细胞涂层是通过 目的基因稳定转染细胞获得。所述的金属裸支架为不锈钢支架、镍钛记忆合金支架、钴基合金支架以及可降解的 镁合金支架。所述的处理层为低温等离子体涂层，其表面粗糙度为5 15陶。 所述的粘附基质涂层为蛋白涂层、序列肽涂层中的一种。所述的蛋白为明胶、IV型胶原蛋白、多聚赖氨酸、纤维连接素等具有促进细胞粘附 功能的蛋白中的一种或多种。所述的序列肽为具有促进细胞粘附功能的序列肽，如RGD序列肽涂层。所述的细胞为内皮细胞或具有向内皮细胞分化潜能的干细胞。上述转基因细胞覆盖的血管内支架的制备方法，包括以下步骤-a) 、获取目的基因，采用提取基因组再PCR扩增出目的基因片段，或者是提取目的 基因的RNA再通过RT-PCR法扩增获取中的 一种；b) 、目的基因的真核细胞表达载体的构建与扩增；所述的目的基因的真核表达载 体为腺病毒、质粒中的一种；所述腺病毒为AdEasyTM腺病毒载体系统，所述质粒可以为 PcD2、 PcDNA3. l质粒。c) 、获取细胞，采用的细胞可以是内皮细胞，也可以是干细胞。内皮细胞可由消化 血管内皮层获得，干细胞可以来源于骨髓或者是外周血，具有向内皮分化的潜能。d) 、金属裸支架表面改性采用低温等离子体技术对所用的金属裸支架表面处理， 使表面形成5 15Mm粗糙度的处理层，更有利于粘附基质涂层和细胞的粘附；e) 、制备粘附基质涂层制备粘附基质涂层的方法为超声雾化喷涂法；将粘附基质涂层中的蛋白或肽段用溶剂，制备成相应浓度的溶液；支架转动速率保 持在每分钟30 — 60转，喷涂时间为0.5 — 2分钟，将涂层置于真空干燥箱里，干燥时间24 一48小时，干燥温度30—50度干燥后重复喷涂，重复次数2 — 3次，每次喷涂时间O. 5 — l分钟，控制涂层表面粗糙度在2 — 5纳米，厚度为5 15微米左右；f) 、旋转培养制备转基因细胞覆盖的血管内支架 制备细胞涂层的方法为旋转培养法；将血管内支架固定于旋转培养管内，与转基因细胞共旋转培养。转基因细胞接种密 度为lXl()5个/毫升，旋转速度为0.4转每分钟，旋转时间为6小时。旋转培养完成后，取 下支架，再静态培养24-48小时，成品可用于进一步的研究或检测。本发明旨在预先在血管内i架表面涂覆一层转基因细胞， 一方面通过对目的基因的 高水平表达来增强损伤的血管内'皮层的修复和抑制平滑肌细胞增殖，另一方面通过外源 细胞的增殖达到加速血管内支架表面内皮化的目的。动物实验结果可行、安全、有效， 能有效的抑制金属支架或球囊损伤的再狭窄。所述的金属支架涂层与金属支架之间涂覆 紧密，生物相容性良好，最终达到抑制血管内支架再狭窄的目的。
图1是本转基因内皮细胞覆盖血管内支架的剖面结构示意图； 图2是转基因内皮细胞覆盖血管内支架的光学显微镜图片(X400)。 图3是转基因内皮细胞覆盖血管内支架的扫描电镜图片(XIOO)。 图4是转基因内皮细胞覆盖血管内支架的免疫荧光染色图片(X200)。 图5是转基因内皮细胞覆盖血管内支架植入兔腹主动脉一周后扫描电镜观察支架表 面的再内皮化情况(X50)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例 范围之中参见图1:本转基因细胞覆盖的血管内支架是在传统的金属裸支架4的金属表面设 处理层1,在处理层1上设粘附基质涂层2，在粘附基质涂层上设细胞涂层3,细胞涂层3 是通过目的基因稳定转染细胞获得。其中，处理层1为低温等离子体涂层，其表面粗糙度为5 15Wn。粘附基质涂层2 为蛋白涂层、序列肽涂层中的一种。蛋白为明胶、IV型胶原蛋白、多聚赖氨酸、纤维连 接素等具有促进细胞粘附功能的蛋白中的一种或多种。序列肽为具有促进细胞粘附功能 的序列肽，如RGD序列肽涂层。细胞涂层的细胞为目的基因稳定转染的内皮细胞或具有 向内皮细胞分化潜能的干细胞。上述转基因细胞覆盖的血管内支架按以下步骤制备1. 获取目的基因VEGF^目的基因VEGF^采用逆转录法获得人白血病细胞(HL-60)，用TRIZOL常规提取总 RNA，经逆转录合成cDNA进行PCR反应。取cDNA反应液2ul，用VEGF^的上游引物为5' GGGGGATCCGCCTCCGAAACCATGAACTT 3',下游引物为5' CCCGAATTCTCCTGGTGAGAGATCTGGTT 3'，设计有BaraH I和EcoR I酶切位点，通过PCR进行扩增。PCR条件为95'C预变性5分钟， 94°C 45秒，55°C 40秒，72°C l分钟，36个循环后，72'C继续反应5分钟，PCR产物经琼 脂糖凝胶电泳分离,DNA胶回收纯化试剂盒回收纯化，获得VEGF^ (分子量为550bp)基因片 段。2. 以质粒为载体构建真核细胞表达载体以PcD2.0为载体，重组？002.0- VEGFm真核表达质粒；应用fcoWI 、历'"Z m双酶切 PcD2.0载体和纯化的目的基因VEGF^，用T4 DNA连接酶4。C连接过夜,连接产物分别转化 DH5a感受态细胞，冰浴30分钟，置42'C水浴90秒，再冰浴1分钟。然后加入LB培养液O. 8 ml，于37'C摇床上振摇1小时，离心后接种于氨卞青霉素选择培养板中，37'C下培养16小 时。挑取细菌克隆，接种于氨卞青霉素选择培养液中，置37t:振摇培养扩增。取5ml菌液， 培养后用质粒DNA小量抽提试剂盒抽提质粒，DNA序列测定及酶切鉴定后，得到分子量为 5. 6kb重组质粒PcD2. 0-VEGFm，重复用试剂盒抽提质粒后无菌保存于无核酶水中，经紫外 分光光度计检测，0D260/0D280值为L8，其纯度达到转染要求，置于-20'C,备用。3. 内皮细胞的培养、鉴定及稳定转染传代培养的HUVEC (人脐静脉内皮细胞系)经形态、表面抗原和功能的鉴定后进行 VEGFm的稳定转染实验。用阳离子脂质体2000进行转染，实验结果通过RT-PCR和免疫 细胞化学鉴定。4. 金属支架表面改性，在表面形成低温等离子处理层l;采用低温等离子体技术、电镀或者其他化学方法对本发明所用的金属支架表面处理， 以利于涂层的紧密涂覆。本发明采用低温等离子体技术进行金属支架的表面改性。支架的表面改性是这样进行的采用的装置是一个钟式的直流电源反应体系。等离子体发生器是由MDX-1K磁电管驱使电源提供。两块平行放置的不锈钢板(25.4 X 25.4 X 0.16 cm)构成两个阳极，磁电管安放于距两板15.5cm处。 一个铁环(外径17. 5 cm， 内径13.8 cm，厚O. 16 cm)和一块铁盘(直径5 cra，厚0. 16 cm)同轴放于2块阳极板 的外侧作为磁场分配器。八条永久磁铁等距的环形放置于铁板和铁环上，南极指向铁板 的中心。每块磁铁的磁场强度范围是700—800高斯。不锈钢和镍钛合金支架作为等离子 体反应系统的阴极放置于两块平行的阳极之间。把已消毒的金属支架放于等离子体反应器中作为其阴极。先用真空泵将反应室抽空 至低于1毫托。由于过程的类型不同，可以是一个单体或是气体混合物进入反应室，本 发明是以TMS (三甲基硅垸)和(U氧气)为反应气体。MKS流量仪用于记录和测量进入的 单体或混合气体的流速，用压力控制器来控制进入反应室的气体的压力。待系统压力稳 定于25毫托后，启动直流电源持续预先规定的时间(2-5分钟)后在金属支架上获得低 温等离子体涂层l，操作结束后，剩余的气体被排出，系统压力恢复。反应器的真空状态 消失，此时可将支架取出以用于进一步的实验。5. 制备粘附基质涂层2制备粘附基质涂层2的方法为超声雾化喷涂法。将明胶、多聚赖氨酸和水在室温25-35 °C，充分混合，制备明胶浓度为2—6毫克/毫升，多聚赖氨酸为10微克/毫升的溶液。支 架转动速率保持在每分钟30—60转，喷涂时间为0.5—2分钟，将涂层置于真空干燥箱里， 干燥时间24—48小时，干燥温度30—40度。6. 旋转培养制备血管内支架将血管内支架固定于旋转培养管内，与转基因内皮细胞共旋转培养。转基因内皮细 胞接种密度为"105个/毫升，旋转速度为0.4转每分钟，旋转时间为6小时。旋转培养完 成后，取下支架，再静态培养24-48小时，在光学显微镜下观察，细胞在支架表面粘附生 长(见图2)。并通过扫描电镜检测，旋转培养后血管内支架表面粘附的细胞数量多和铺 展均匀(见图3)，免疫荧光检测发现支架表面粘附的细胞能很好的表达代表内皮细胞特 性的vWF因子(见图4)。7. 动物实验采用标准球囊导管技术，将本发明支架和对照支架植入兔腹主动脉，转基因内皮细 胞覆盖的血管内支架组和裸支架、明胶蛋白涂层支架对照组样本容量均为10。 1周后处 死2只，剩下的分别于手术后4周后处死4只，12周后处死余下4只。将处死的动物体 内病变处支架连同血管取出，制作扫描电镜观察样本，观察血管内支架表面的再内皮化 程度；制作透射电镜观察样本，确定覆盖于支架表面内膜的细胞成分；制作病理切片， 观察支架的再狭窄程度和增生内膜的厚度。动物实验结果证明基因支架安全、有效。结果显示，与对照组相比，细胞支架表面内皮层在一周时就覆盖完全(见图5)，而裸支架表面内皮完全撕裂，平滑肌暴露，极少 部分发生再内皮化，支架表面有血栓形成，蛋白涂层支架表面内皮化不完整，有大量血 细胞和血小板聚集。说明转基因内皮细胞覆盖的血管内支架能显著提高血管内支架表面 内皮化速度，具有抗血栓和抗再狭窄的功效。
权利要求
1、一种转基因细胞覆盖的血管内支架，它以金属裸支架(4)为基体，在所述金属裸支架(4)的金属表面有处理层(1)，在处理层(1)上有粘附基质涂层(2)，在粘附基质涂层上有细胞涂层(3)，细胞涂层(3)是通过目的基因稳定转染细胞获得，其特征为所述的金属裸支架(4)为不锈钢支架、镍钛记忆合金支架、钴基合金支架或可降解的镁合金支架；所述的处理层(1)为低温等离子体涂层，其表面粗糙度为5～15μm；所述的粘附基质涂层(2)为蛋白涂层、序列肽涂层中的一种；所述的细胞涂层上的细胞为目的基因稳定转染的内皮细胞或具有向内皮细胞分化潜能的干细胞。
2、 根据权利要求1所述的转基因细胞覆盖的血管内支架，其特征为所述蛋白涂层中的 蛋白为具有促进细胞粘附功能的明胶、IV型胶原蛋白、多聚赖氨酸、纤维连接素中的一种。
3、 根据权利要求1所述的转基因细胞覆盖的血管内支架，其特征为所述序列肽涂层中 的肽段为具有促进细胞粘附功能的肽段。
4、 根据权利要求3所述的转基因细胞覆盖的血管内支架，其特征为所述序列肽涂层为 RGD肽或其他序列肽涂层。
5、 一种制备权利要求1所述的转基因细胞覆盖的血管内支架的方法，其特征在于， 该包括以下步骤1) 、获取目的基因；2) 、目的基因的真核细胞表达载体的构建与扩增；3) 、获取细胞采用的细胞为内皮细胞或干细胞；4) 、对金属裸支架(4)进行表面改性，获得处理层(1);5) 、在处理层(1)上制备粘附基质涂层(2);6) 、通过旋转培养在粘附基质涂层(2)制备转基因细胞涂层(3)，覆盖的血管内支架。
6、 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述目的基因采用提取基因组再PCR 扩增出目的基因片段，或者是提取目的基因的RNA再通过RT-PCR法扩增获取；目的基因的真 核表达载体为腺病毒、质粒中的一种。
7、 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述腺病毒为AdEasyTM腺病毒载 体系统，所述质粒为PcD2或PcDNA3. 1真核表达质粒载体。
8、 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述金属裸支架表面改性采用低温等离子体技术对所用的金属裸支架表面处理，使表面形成5 15陶粗糙度的处理层(1)。
9、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，采用超声雾化喷涂法制备所述的粘 附基质涂层(2):将粘附基质涂层中的蛋白或序列肽用溶剂制备成溶液；支架转动速率保持在每分钟30—60转，喷涂时间为0.5—2分钟，将粘附基质涂层置于 真空干燥箱里，干燥时间24—48小时，干燥温度30—40度；干燥后重复喷涂，重复次数2—3次，每次喷涂时间0.5—1分钟，控制粘附基质涂层表 面粗糙度在2 — 5纳米，厚度为5 15微米。
10、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，通过旋转培养法制备细胞涂层(3)， 将血管内支架固定于旋转培养管内，与转基因细胞共旋转培养；转基因细胞接种密度为IX 105个/毫升，旋转速度为0. 4转每分钟，旋转时间为6小时；旋转培养完成后，取下支架， 再静态培养24-48小时，得成品。
全文摘要
本发明请求保护一种转基因细胞覆盖的血管内支架，其在金属裸支架表面依次设低温等离子体处理层、粘附基质涂层和细胞涂层。粘附基质涂层为蛋白涂层、序列肽涂层中的一种，细胞涂层是通过目的基因稳定转染细胞获得。制备该血管内支架包括以下步骤获取目的基因；目的基因的真核细胞表达载体的构建与扩增；获取细胞；金属支架表面改性；制备粘附基质涂层；旋转培养制备转基因细胞覆盖的血管内支架。本发明一方面通过对目的基因的高水平表达来增强损伤的血管内皮层的修复和抑制平滑肌细胞增殖，另一方面通过外源细胞的增殖达到加速血管内支架表面内皮化的目的，涂层与支架之间涂覆紧密，生物相容性良好，能最终达到抑制血管内支架再狭窄的目的。
文档编号C12N15/79GK101269242SQ20081006925
公开日2008年9月24日 申请日期2008年1月16日 优先权日2008年1月16日
发明者雪 吴, 唐朝君, 怡 曹, 王贵学, 丽 肖, 翔 谢, 才 邢 申请人:重庆大学