专利名称：一种利用蛋白质等电点提高硫酸软骨素质量的方法
技术领域：
本发明属于生化制药领域,具体涉及一种硫酸软骨素的制备方法。
背景技术：
硫酸软骨素是广泛存在于人和动物软骨组织中的一类黏多糖，它作为结 缔组织的重要组成部分，具有多种药理作用与生理功能。在我国硫酸软骨素 用于治疗神经痛、神经性偏头痛、关节炎、肩关节痛和腹腔手术后疼痛等， 预防和治疗链霉素引起的听觉障碍及各种噪声引起的听觉困难、耳鸣症等， 效果显著。在西方发达国家，硫酸软骨素作为保健品长期应用于防治冠心病、 心绞痛、心肌梗塞、冠状动脉机能不全、心肌缺血等疾病，无明显的毒副作 用，能显著降低冠心病患者的发病率和死亡率。长期的临床应用发现，在动 脉和静脉壁上沉积的脂肪等脂质可以被有效去除或减少，能显著降低血浆胆 固醇，从而防止动脉粥样硬化的形成。
硫酸软骨素的提取方法主要有碱提-酶解法、碱提法、超声波辅助法和乙 酸提取法，而碱提-酶解法又分为稀碱-酶提取工艺、浓碱-酶提取工艺和稀碱 稀盐-酶提取工艺等。以上几种提取方法都存在或多或少的问题，如碱盐用量 大、生产周期长、耗能高、收率低、产品纯度低等。
发明内容
本发明的目的是针对现有的稀碱稀盐-酶提取工艺中产品收率低、纯度低
的缺点，采用较浓的碱液(2%)有效释放硫酸软骨素，同时使部分蛋白质降 解及变性沉淀，提高纯度。再将酶解后的滤液浓縮，减少了酒精用量，使沉 淀更加完全，然后将一次沉淀物用水溶解，将夹杂在一次沉淀物中的蛋白质 根据所含蛋白的种类在不同等电点进行沉降，再经过H202的氧化去细菌和漂 白，最大限度的去除了产品中的杂蛋白，使产品质量大大提高达到97%以上。
本发明的目的可以通过以下措施达到 一种硫酸软骨素的制备方法，包括如下步骤
(A) 用NaHC03溶液清洗软骨后蒸煮8 10小时；其中NaHC03溶液 的质量含量为1 5%。；
(B) 待冷却至3(TC以下后，加入NaOH和NaCl提取2次，2小时/次； 其中NaOH的用量为软骨质量的0.5 5%， NaCl的用量为软骨质量的5
10%;
(C) 向提取液中加入破碎均质好的猪胰脏和2709碱性蛋白酶，在45 55°C、 pH8.8 9.0下处理5 10小时；其中猪胰脏的加入量为软骨质量的5 10%， 2709蛋白酶的加入量为软骨质量的0.3 1%。；酶解的温度优选为49 51°C， pH优选为8.8 8.9;
(D) 经过酶处理的提取液在温度65 67。C、 pH4.4 4.6下处理0.5 3 小时，再调pH5.5 6.0至明显分层后，用747过滤布过滤，滤液浓縮至1/3 体积；
(E) 向浓縮液中加入酒精至酒精的体积含量为62 68%，处理2 6小 时进行一次沉淀；
(F) 沉淀加水溶解，在60 65t:下，根据所含蛋白的种类，在不同等 电点沉降不同的蛋白质。先调pH5.0 5.5放置1小时，再调pH6.5 7.0下静 置0.5 3小时，然后调pH9.0 9.3，加入0.5 1.0%的H202处理0.5 5小 时，过滤去掉杂蛋白；
(G) 滤液加入酒精至体积含量为70 74%，处理0.2 1小时进行二次
沉淀，再过滤，得到的沉淀经脱水、干燥得粗品。
粗品经过球磨后即得到白色粉末状成品。本发明中的酒精除特别说明的 以外， 一般指纯乙醇。
通过反复实验可以确定本发明的一种优化的工艺条件，其中NaHC03溶 液的质量含量为3%。， NaOH的用量为软骨质量的1 3%， NaCl的用量为软 骨质量的7 9%， 一次沉淀时加入酒精至酒精的体积含量为64 66%， 一次
沉淀处理时间3 5小时；将一次沉淀物用水溶解后进行在不同等电点的pH 调节，以除去杂质蛋白，去除方法为在60 65。C下，先在pH5.0 5.5下静置 处理0.8 1.5小时，再在pH6.5 7.0下静置处理0.8 1.5小时，最后调 pH9.0 9.3，加入0.5 1.0°/0的&02处理1 3小时氧化漂白，过滤；滤液进 行二次沉淀，加入酒精至酒精的体积含量为71 73%， 二次沉淀处理时间 0.4 0.6小时。
本发明一方面利用天然酶与蛋白酶的协同作用来提高产品质量，天然酶 是利用冷冻的猪胰脏经机器绞碎后用30%左右的酒精均质，酒精能使细胞膜 破碎直接剌激胰酶的分泌。此法比用纯胰酶成本低，酶的原始状态好酶活高， 实际效果比纯胰酶更好。所用的蛋白酶是2709碱性蛋白酶，此酶是采用地衣 型芽孢杆菌2709优良菌株经液态深层培养发酵提取的固态酶。另一方面利 用蛋白质等电点来提高硫酸软骨素质量，根据所含蛋白的种类，在不同等 电点沉降不同的蛋白质，从而提高硫酸软骨素的纯度。
本发明采用两种酶(2709蛋白酶和猪胰脏)按特定的比例混合使用，由 于猪胰脏中胰酶的原始状态好酶活高，通过与2709蛋白酶的协同作用从而提 高酶解效率，可以使牛鼻骨最终收率达到25%，其他易提取软骨的收率可达 到40%。同时本发明将一次沉淀物中所夹杂的蛋白质通过精确的pH值调节， 在不同的等电点时进一步除去混在硫酸软骨素中不易除去的杂蛋白，再通过 其他步骤的相互配合，从而使最终得到的硫酸软骨素的纯度达到97%以上。
具体实施例方式
将牛鼻骨用3%。的NaHC03溶液清洗后，蒸煮9小时；待冷却至3(TC以 下后，加入NaOH和NaCl提取两次；其中NaOH的用量为软骨质量的2%, NaCl的用量为软骨质量的8%。
向提取液中加入破碎均质好的猪胰脏和2709蛋白酶，在51。C、 pH8.8 8.9下处理7小时，其中猪胰脏的加入量为软骨质量的8%， 2709酶的加入量 为软骨质量的0.6%。经过酶处理的提取液在温度67'C、 pH4.4 4.6下处理1
小时，再调pH5.5 6.0至明显分层后，用747过滤布过滤，滤液浓縮至原体 积的1/3。
向上述浓縮液中加入酒精至体积含量为64%，处理4小时进行一次沉淀， 过滤，滤渣加水溶解后在63'C下，先在pH5.0 5.5下静置处理1小时，再在 pH6.5 7.0下静置处理1小时，最后调pH9.0 9.3，加入0.8%的恥2处理 2小时氧化漂白，过滤；滤液再加入酒精至体积含量为73%，处理0.5小时 进行二次沉淀，再过滤，滤渣脱水、干燥得粗品，再经过球磨后即为白色粉 末成品。最终成品的收率为25%，经检测，硫酸软骨素的纯度为98.6%。 实施例2
将牛鼻骨用30%。的NaHC03溶液清洗后，蒸煮9小时；待冷却至30°C以 下后，加入NaOH和NaCl提取两次；其中NaOH的用量为软骨质量的2%， NaCl的用量为软骨质量的8%。
向提取液中加入均质好的猪胰脏和2709蛋白酶，在50°C、 pH8.8 8.9 下处理8小时，其中猪胰脏的加入量为软骨质量的6%， 2709酶的加入量为 软骨质量的1%。。
经过酶处理的提取液在温度66°C、 pH4.4 4.6下处理1小时，再调 pH5.5 6.0至明显分层后，过滤，滤液浓縮。
向上述浓縮液中加入酒精至体积含量为65%，处理4小时进行一次沉淀， 过滤，滤渣加水溶解后在64"C下，先在pH5.0 5.5下静置处理l小时，再在 pH6.5 7.0下静置处理1小时，最后调pH9.0 9.3，加入0.7%的11202处理 2小时氧化漂白，过滤；滤液加入酒精至体积含量为72%，处理0.5小时进 行二次沉淀，过滤，滤渣脱水、干燥得粗品，经过球磨后即为白色粉末成品。 最终成品的收率为24%，经检测，硫酸软骨素的纯度为98.5%。 实施例3
除将牛鼻骨替换为牛喉管外，其他同实施例1，最终白色粉末的收率为 15%，纯度为97.4%。 实施例4
除将牛鼻骨替换为牛脊椎骨外，其他同实施例2，最终白色粉末的收率 为6%，纯度为9挑。 实施例5
除将牛鼻骨替换为鸭喉管外，其他同实施例1，最终白色粉末的收率为 36%，纯度为97. 3%。 实施例6
除将牛鼻骨替换为鸡喉管外，其他同实施例2,最终白色粉末的收率为 40%，纯度为97. 1%。
权利要求
1、一种利用蛋白质等电点提高硫酸软骨素质量的方法，其特征在于包括如下步骤(A)用NaHCO3溶液清洗软骨后蒸煮8～10小时；(B)加入NaOH和NaCl提取两次；(C)向提取液中加入破碎均质好的猪胰脏和2709碱性蛋白酶，在45～55℃、pH8.8～9.0下处理5～10小时；(D)经过酶处理的提取液在温度65～67℃、pH4.4～4.6下处理0.5～3小时，再调pH5.5～6.0至明显分层后，过滤，滤液浓缩至1/3体积；(E)向浓缩液中加入酒精至酒精的体积含量为62～68％，处理2～6小时进行一次沉淀；(F)沉淀加水溶解，在60～65℃下，先调pH5.0～5.5放置1小时，再调pH6.5～7.0下静置0.5～3小时，然后调pH9.0～9.3，加入0.5～1.0％的H2O2处理0.5～5小时，过滤；(G)滤液加入酒精至体积含量为70～74％，处理0.2～1小时进行二次沉淀，过滤，将沉淀脱水、干燥得粗品，再经过球磨得成品。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于均质猪胰脏的加入量为软骨质量 的5 10%， 2709碱性蛋白酶的加入量为软骨质量的0.3 1%。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的NaHC03溶液的质量含 量为1 5%0。
4、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于用NaOH和NaCl提取时，NaOH 的用量为软骨质量的0.5 5%， NaCl的用量为软骨质量的5 10%。
5、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤C中酶解的温度为49 51°C ， pH为8.8 8.9。
全文摘要
本发明公开了一种双酶法制备硫酸软骨素的工艺，包括清洗蒸煮后加入NaOH和NaCl提取，再向提取液中加入胰酶进行酶解处理，经过酶处理的提取液去蛋白后浓缩，最后通过一次沉淀以及调节pH值去除杂蛋白和二次沉淀即得到硫酸软骨素粗品。本发明在一次沉淀后通过精确的pH值调节，可以进一步除去混在硫酸软骨素中不易除去的杂蛋白，再通过其他步骤的相互配合，从而使最终得到的硫酸软骨素的纯度达到97％以上。
文档编号C12P19/00GK101348814SQ200810124789
公开日2009年1月21日 申请日期2008年9月3日 优先权日2008年9月3日
发明者于文涛, 波 易, 岸 谭, 和 黄, 龙园园 申请人:南京工业大学