专利名称：：天然酶与蛋白酶协同法制备硫酸软骨素的工艺的制作方法
技术领域：
：本发明属于生化制药领域，具体涉及一种硫酸软骨素的制备方法。
背景技术：
：硫酸软骨素是广泛存在于人和动物软骨组织中的一类黏多糖，它作为结缔组织的重要组成部分，具有多种药理作用与生理功能。在我国硫酸软骨素用于治疗神经痛、神经性偏头痛、关节炎、肩关节痛和腹腔手术后疼痛等，预防和治疗链霉素引起的听觉障碍及各种噪声引起的听觉困难、耳鸣症等，效果显著。在西方发达国家，硫酸软骨素作为保健品长期应用于防治冠心病、心绞痛、心肌梗塞、冠状动脉机能不全、心肌缺血等疾病，无明显的毒副作用，能显著降低冠心病患者的发病率和死亡率。长期的临床应用发现，在动脉和静脉壁上沉积的脂肪等脂质可以被有效去除或减少，能显著降低血浆胆固醇，从而防止动脉粥样硬化的形成。硫酸软骨素的提取方法主要有碱提-酶解法、碱提法、超声波辅助法和乙酸提取法，而碱提-酶解法又分为稀碱-酶提取工艺、浓碱-酶提取工艺和稀碱稀盐-酶提取工艺等。但是以上几种提取方法都存在或多或少的问题，如工序长，碱盐用量大、耗能高、收率低、产品纯度低等。
发明内容本发明的目的是针对现有的稀碱稀盐-酶提取工艺中产品收率低、纯度低的缺点，提供一种利用天然酶与蛋白酶的协同作用来提高产品质量的硫酸软骨素的制备方法。天然酶是利用冷冻的猪胰脏经机器绞碎后用30%左右的酒精均质，酒精能使细胞膜破碎直接剌激胰酶的分泌。此法比用纯胰酶成本低，酶的原始状态好酶活高，实际效果比纯胰酶更好。所用的蛋白酶是2709碱性蛋白酶，此酶是采用地衣型芽孢杆菌2709优良菌株经液态深层培养发酵提取的固态酶。本发明的目的可以通过以下措施达到一种天然酶与蛋白酶协同制备硫酸软骨素的工艺，包括如下步骤(A)用NaHC03溶液清洗软骨后蒸煮810小时；其中NaHC03溶液的质量含量为15%。；(B)待冷却至30°C以下后，加入NaOH和NaCl提取2次(2小时/次)；其中NaOH的用量为软骨质量的0.55%，NaCl的用量为软骨质量的5100/0;(C)向提取液中加入2709蛋白酶和猪胰脏，在4555。C、pH8.89.0下处理510小时，其中2709蛋白酶的加入量为软骨质量的0.31%，猪胰脏的加入量为软骨质量的510%;猪胰脏在加入前先经过冷冻搅碎，用体积百分比为2040%的酒精混合均匀(酒精的加入量为猪胰脏质量的0.52倍)；酶解的温度优选为4951°C，pH优选为8.88.9;(D)经过酶处理的提取液在温度6567。C、pH4.44.6下处理0.53小时，再调pH5.56.0至明显分层后，用747过滤布过滤，滤液减压浓缩到原体积的1/3左右；(E)向浓縮液中加入酒精至酒精的体积含量为6268%，处理26小时进行一次沉淀，过滤；(F)滤液加入酒精至体积含量为7074%，处理0.21小时进行二次沉淀，再过滤，合并二次沉淀过滤物和一次沉淀过滤物，脱水、干燥得粗品。粗品经过球磨后即得到白色粉末状成品。本发明中的酒精除特别说明的以外，一般指纯乙醇。通过反复实验可以确定本发明的一种优化的工艺条件，其中NaHCCb溶液的质量含量为3%。，NaOH的用量为软骨质量的13%，NaCl的用量为软骨质量的79%，2709蛋白酶的加入量为软骨质量的0.40.8%，猪胰脏的加入量为软骨质量的79%，一次沉淀时加入酒精至酒精的体积含量为6466°/。，一次沉淀处理时间35小时，二次沉淀时加入酒精至酒精的体积含量为7173%，二次沉淀处理时间0.40.6小时。本发明采用两种酶(2709蛋白酶和猪胰脏)按特定的比例混合使用，由于猪胰脏中胰酶的原始状态好酶活高，通过与2709蛋白酶的协同作用从而提高酶解效率，再通过其他步骤的相互配合，可以使牛鼻骨最终收率达到25%以上，其他易提取软骨的收率可达到40%。本发明的方法可以使最终产品中硫酸软骨素的纯度达到95°/。以上。猪胰脏直接搅碎使用省去了提取胰酶的步骤，縮短了处理时间，降低了生产成本。具体实施方式实施例1将冷冻的猪胰脏搅碎，用体积百分比为30%的酒精按1:1的比例混合均匀。将牛鼻骨用3%。的NaHC03溶液清洗后，蒸煮9小时；待冷却至3(TC以下后，加入NaOH和NaCl提取2次/次2小时；其中NaOH的用量为软骨质量的2%，NaCl的用量为软骨质量的8。/。。向提取液中加入2709蛋白酶和处理过的猪胰脏，在51°C、pH8.88.9下处理7小时，其中2709蛋白酶的加入量为软骨质量的0.5%，猪胰脏的加入量为软骨质量的9%。经过酶处理的提取液在温度67°C、pH4.44.6下处理1小时，再调pH5.56.0至明显分层后，过滤，滤液浓縮至原体积的1/3左右。向上述浓縮液中加入酒精至体积含量为64%,处理4小时进行一次沉淀，过滤；滤液再加入酒精至体积含量为73%，处理0.5小时进行二次沉淀，再过滤，合并二次沉淀过滤物和一次沉淀过滤物，脱水、干燥得粗品，再经过球磨后即为白色粉末成品。最终成品的收率为28%，经检测，硫酸软骨素的各项质量指标如表1所示表l实施例l所得产品的各项质量<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例2将猪胰脏搅碎，用体积百分比为30%的酒精按1:l的比例混合均匀。将牛鼻骨用3^的NaHC03溶液清洗后，蒸煮9小时；待冷却至3(TC以下后，加入NaOH和NaCl提取2次/次2小时；其中NaOH的用量为软骨质量的2%，NaCl的用量为软骨质量的8%。向提取液中加入2709蛋白酶和处理过的猪胰脏，在5CTC、pH8.88.9下处理8小时，其中2709蛋白酶的加入量为软骨质量的0.6%，猪胰脏的加入量为软骨质量的8%。经过酶处理的提取液在温度66°C、pH4.44.6下处理1小时，再调pH5.56.0至明显分层后，过滤，滤液浓縮至原体积的1/3左右。向上述浓縮液中加入酒精至体积含量为65%，处理4小时进行一次沉淀，过滤；滤液再加入酒精至体积含量为72%，处理0.5小时进行二次沉淀，再过滤，合并二次沉淀过滤物和一次沉淀过滤物，脱水、干燥得粗品，再经过球磨后即为白色粉末成品。最终成品的收率为27%，经检测，硫酸软骨素的纯度为97%。实施例3除将牛鼻骨替换为牛喉管外，其他同实施例1，最终白色粉末的收率为19%，纯度为96%。实施例4除将牛鼻骨替换为牛脊椎骨外，其他同实施例2，最终白色粉末的收率为8%，纯度为96%。实施例5除将牛鼻骨替换为鸭喉管外，其他同实施例1，最终白色粉末的收率为39%，纯度为95%。实施例6除将牛鼻骨替换为鸡喉管外，其他同实施例2，最终白色粉末的收率为43%,纯度为95%。权利要求1、一种天然酶与蛋白酶协同作用制备硫酸软骨素的工艺，其特征在于包括如下步骤(A)用NaHCO3溶液清洗软骨后蒸煮8～10小时；(B)加入NaOH和NaCl提取2次；(C)向提取液中加入2709蛋白酶和猪胰脏，在45～55℃、pH8.8～9.0处理5～10小时，其中2709蛋白酶的加入量为软骨质量的0.3～1％，猪胰脏的加入量为软骨质量的5～10％；(D)经过酶处理的提取液在温度65～67℃、pH4.4～4.6下处理0.5～3小时，再调pH5.5～6.0至明显分层后，滤液减压浓缩到原体积的1/3左右；(E)向浓缩液中加入酒精至酒精的体积含量为62～68％，，处理2～6小时进行一次沉淀，过滤；(F)滤液加入酒精至体积含量为70～74％，处理0.2～1小时进行二次沉淀，再过滤，合并二次沉淀过滤物和一次沉淀过滤物，脱水、干燥得粗品。2、根据权利要求1所述的天然酶与蛋白酶协同制备硫酸软骨素的工艺，其特征在于猪胰脏加入前先经过搅碎，用体积百分比为2040%的酒精混合均匀。3、根据权利要求2所述的天然酶与蛋白酶协同制备硫酸软骨素的工艺，其特征在于酒精的加入量为猪胰脏质量的0.52倍。4、根据权利要求1所述的天然酶与蛋白酶协同制备硫酸软骨素的工艺，其特征在于所述的NaHC03溶液的质量含量为15%。。5、根据权利要求1所述的天然酶与蛋白酶协同制备硫酸软骨素的工艺，其特征在于用NaOH和NaCl提取时，NaOH的用量为软骨质量的0.55%，NaCl的用量为软骨质量的510%。6、根据权利要求1所述的天然酶与蛋白酶协同制备硫酸软骨素的工艺，其特征在于步骤C中酶解的温度为4951°C，pH为8.88.9。全文摘要本发明公开了一种天然酶与合成酶协同作用制备硫酸软骨素的工艺，包括清洗蒸煮后加入NaOH和NaCl提取，再向提取液中加入合成酶(2709)和天然酶(猪胰脏)进行酶解处理，经过酶处理的提取液去蛋白后浓缩，最后通过一次沉淀和二次沉淀即得到硫酸软骨素粗品。本发明采用两种酶按特定的比例混合使用，通过它们之间的协同作用从而提高酶解效率，再通过其他步骤的相互配合，可以使牛鼻骨的最终收率达到25％以上，硫酸软骨素的纯度达到95％以上。猪胰脏直接搅碎使用省去了提取胰酶的步骤，缩短了处理时间，大大降低了生产成本。文档编号C12P19/00GK101348815SQ20081012479公开日2009年1月21日申请日期2008年9月3日优先权日2008年9月3日发明者于文涛,卡张,晗杨,岸谭,和黄申请人:南京工业大学