专利名称：一种循环利用重组酿酒酵母生产低聚半乳糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用重组酿酒酵母生产低聚半乳糖的方法，尤其涉及一种表面展示e-半乳 糖苷酶的重组酿酒酵母及其制备方法以及循环利用该重组酿酒酵母发酵乳糖生产低聚半乳糖的 方法。
背景技术：
低聚半乳糖(Galacto-oligosaccharides, G0S)是一种具有天然属性的非消化类寡糖，是 人类母乳中的主要成分，具有促进双歧杆菌增殖；降低龋齿发病率；保护肝脏，改善钙铁锌等矿 物质的吸收；改善脂类代谢，降低血脂和胆固醇等功能。该类寡糖可通过微生物产生的P-半乳 糖苷酶以乳糖为底物转糖基合成，制备方式有两种， 一种是采用游离酶，另一种是采用固定化酶。 游离酶在反应过程中不稳定，并且难以重复利用，不适合工业化生产，而固定化酶能有效提高酶 的稳定性，可重复利用，适合于工业化生产。但固定化酶反应过程中存在副产物(葡萄糖)的抑 制和酶的不断流失等问题，降低了其使用效率。因而迫切需要寻找简便高效的适合于固定化酶法 生产低聚半乳糖的方法，提高固定化酶的使用效率，大大降低工业化生产成本。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种表面展示e -半乳糖苷酶的重组酿酒酵母和循环利用 该重组酿酒酵母发酵乳糖生产低聚半乳糖的方法。
一种表面展示e -半乳糖苷酶的重组酿酒酵母细胞，该重组酿酒酵母细胞含有插入了 e -半乳 糖苷酶基因序列的质粒载体。
优选的，所述的P-半乳糖苷酶基因选自扩张青霉(尸e/ /cj7L^历e耶朋s咖)CGMCCNo. 2352 中的0-半乳糖苷酶基因。
一种表面展示e-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母细胞的制备方法，其特征在于，步骤如下
1) 将3-半乳糖苷酶基因插入酵母表面展示质粒pYDl，得重组质粒pYDl;
2) 将步骤l)构建的重组质粒pYDl转化大肠杆菌DH5a，然后从阳性重组大肠杆菌中提取 含有e -半乳糖苷酶基因的重组质粒pYDl,再用该重组质粒pYDl转化酿酒酵母EBY-100，获得 含有重组质粒pYDl的重组酿酒酵母；
3) 将步骤2)获得的含有重组质粒pYDl的重组酿酒酵母接种于YNB-CAA-葡萄糖培养液，30 'C培养，当菌液0Ds。。为2.0 5. 0时，3000转/分离心3 5分钟，收集重组酿酒酵母细胞；
4) 将步骤3)收集的重组酿酒酵母细胞用诱导产酶培养液重悬菌细胞，并调0D^为0.5 L0， 2(TC 25。C诱导38 42小时，3000转/分离心3 5分钟，收集已表面展示P -半乳糖苷酶 的重组酿酒酵母细胞。
所述YNB-CAA-葡萄糖培养液成分无氨基酸酵母氮源(YNB,购自Difco公司，产品号0919-15) 6.7g/L，酪蛋白水解物(CAA，购自Sigma公司，产品号A2427) 5 g/L，葡萄糖20 g/L， pH自然， 115。C灭菌30分钟。
所述诱导产酶培养液成分无氨基酸酵母氮源(YNB) 6.7g/L，酪蛋白水解物(CAA) 5 g/L， pH自然，115'C灭菌30分钟；使用之前加入过滤除菌的半乳糖溶液至终浓度20 g/L。
3优选的，所述步骤l)中的P-半乳糖苷酶基因来源于扩张青霉(尸ey7/ci7/^/ff e;^a/7sw/77) CGMCC No.2352。
优选的，所述步骤4)中的诱导产酶温度为20'C。 优选的，所述步骤4)中的诱导产酶时间为40小时。
一种表面展示P -半乳糖苷酶的重组酿酒酵母细胞在生产低聚半乳糖的应用，其特征在于， 先将表面展示0 -半乳糖苷酶的重组酿酒酵母细胞悬于YNB-CAA-乳糖培养液，调0"。。为8. 0 10.0, 25'C培养4 6天；然后3000转/分离心3 5分钟，对离心后所得的上清液通过高效液相色 谱分析其低聚半乳糖含量；将离心后所得的重组酵母细胞，重悬于新的YNB-CAA-乳糖培养液，按 上述方法循环利用该重组酿酒酵母细胞发酵乳糖生产低聚半乳糖，并分析每个循环所得上清液的 低聚半乳糖含量。
所述YNB-CAA-乳糖培养液成分为无氨基酸酵母氮源(YNB) 6. 7 g/L，酪蛋白水解物(CAA) 5 g/L，乳糖IOO g/L， pH自然，115。C灭菌30分钟。
本发明中所涉及的实验步骤及实验试剂，除有特别说明，均为本领域常规操作和普通市售产品。
本发明提供了一种简便高效的固定化酶生产低聚半乳糖的方法，即利用表面展示e-半乳糖 苷酶的重组酿酒酵母发酵乳糖生产低聚半乳糖。该方法应用分子生物学技术将e -半乳糖苷酶直 接锚定在酿酒酵母细胞表面，以乳糖为底物催化合成低聚半乳糖，节省了固定化酶所需要的载体 材料，解决了固定化酶反应过程中酶的不断流失、酶稳定性差、使用效率低等问题，该方法还利 用酿酒酵母代谢葡萄糖的特点，解决了e-半乳糖苷酶反应过程中葡萄糖副产物的抑制问题。重 组酵母细胞在发酵过程中利用葡萄糖进行生长繁殖，有利于低聚半乳糖的生产；同时重组酵母细 胞能被反应过程中新生成的半乳糖诱导产酶，即在其细胞表面展示e-半乳糖苷酶，可及时补充 反应过程中酶的损耗。此外， 一个批次反应结束后离心收集的重组酵母细胞仍然保持较高的e-半乳糖苷酶活性，可作为酶源直接用于下一个批次的低聚半乳糖合成，简化了生产流程。本发明 所述的低聚半乳糖生产方法具有产量高、成本低、步骤简单合理、可重复利用等优点，具有广阔 的工业化前景。
图l是循环利用重组酿酒酵母发酵乳糖生产的低聚半乳糖的含量分析其中纵坐标表示低聚半乳糖含量；横坐标表示发酵时间；图上方"1-7"数字表示循环数， 每个循环的曲线图均表示低聚半乳糖含量随发酵时间的变化趋势。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，e-半乳糖苷酶基因来源于菌株扩张青霉CGMCC
No. 2352，但不限于此。
实施例i: e -半乳糖苷酶的酿酒酵母表面展示载体构建及其在酵母表面表达 根据扩张青霉CGMCC No. 2352P-半乳糖苷酶基因序列(GenBank Accession No, EU543998) 设计引物F和R,分别引入能插入质粒pYDl (购自Invitrogen公司，该质粒载体具有a -凝集素受 体基因部分序列，可将重组蛋白锚定在酵母细胞表面)的fcoWI、 Abtl限制内切酶位点(下划 线所示)，序列如下
F: 5' -CATGAATTCGGAGTTGCTTCAAAAATATGTGACTTGGG-3' R: 5' -GCATGCGGCCGCGTACGCCCCCTTTCGAGAC-3，
4以提取的扩张青霉总RNA为模板，采用上述R引物进行反转录合成cDNA第一条链。以cDNA 第一链为模板，用F禾B R引物进行PCR扩增，回收PCR产物，加限制性内切酶fbo^ I、 I 于37'C保温5小时，凝胶回收目的片段，采用同样酶切方法处理表达载体pYDl。将制备好的基 因片段与酶切处理后的酵母表面展示质粒pYDl混合，于16。C连接24小时。采用CaCl2转化法 转化宿主菌大肠杆菌DH5 a ，转化菌液涂布氨苄青霉素LB平板，37'C过夜培养，选取阳性质粒， 采用电转化法转化酿酒酵母EBY-100,转化液涂布YNB-CAA-葡萄糖筛选平板，3(TC培养2 3 天，挑选生长良好的酵母菌落，采用菌落PCR法验证阳性转化子。
将上述重组质粒阳性转化子及pYDl空质粒对照转化子的单菌落接种于YNB-CAA-葡萄糖培 养液中，3(TC培养至OD,达到2. 0 5. 0， 3000转/分离心5分钟收集细胞，弃去上清，用YNB-CAA-半乳糖培养液重悬细胞，并调0D6。。为0.5 L0， 2(TC半乳糖诱导40小时。测定细胞表面的P-半乳糖苷酶活性，将完全符合要求的重组酵母作为菌种保存。
上述LB平板成分蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L， NaC17g/L，琼脂粉15 g/L, pH 7. 0~ 7.5， 121。C灭菌20分钟；
上述YNB-CAA-葡萄糖平板成分无氨基酸酵母氮源(YNB) 6. 7 g/L，酪蛋白水解物(CAA) 5 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉15 g/L， pH自然，115。C灭菌30分钟。
上述细胞表面e-半乳糖苷酶活性的测定方法取lmL培养液，离心收集菌体，加2mmol/L 的邻硝基苯-e -D-半乳糖苷溶液45CmL， 50'C反应10分钟，加lmLO. 5mol/L的％20)3溶液终止 反应，12, 000转/分离心1分钟，上清液测0D4。。。酶的活力单位规定以1分钟水解邻硝基苯-P -D-半乳糖苷释放l陶ol邻硝基苯酚的酶量为一个酶活力单位(U)。
实施例2:循环利用细胞表面重组酵母发酵乳糖生产低聚半乳糖
将实施例1保存的重组酵母接种于YNB-CAA-葡萄糖培养液，3(TC培养至0D,达到2. 0 5. 0， 3000转/分离心5分钟收集细胞，弃去上清，用YNB-CAA-半乳糖培养液重悬细胞，并调00600为 0.5 1.0， 2CTC半乳糖诱导40小时，然后3000转/分离心5分钟，收集表面展示P-半乳糖苷 酶的重组酿酒酵母EBY-100，重悬于YNB-CAA-乳糖培养液，调OD,为8. 0 10. 0， 25。C培养4 6天，3000转/分离心5分钟，所得上清液进行高效液相色谱分析低聚半乳糖含量，所得酵母细 胞重悬于新的YNB-CAA-乳糖培养液，按照上述方法重复进行下一循环培养。
其中所述第一个循环的上清液的高效液相色谱分析结果表明糖组分含量为低聚半乳糖 43.6%，半乳糖1.41%，葡萄糖0、乳糖54.99%。
按上述方法连续进行7个循环，高效液相色谱分析结果表明，每个循环所得的低聚半乳糖含 量均高于40% (图1)。
上述高效液相色谱分析所用设备及条件如下
岛津(SHIMADZU)高效液相色谱仪；岛津RID-10A示差检测器；BIO-RAD Aminex HPX-42C柱 (300咖X7.8mm);流动相为超纯水，流速为0.4mL/min ，柱温70°C ;结果分析软件为 Class-VP6.0。含低聚半乳糖的上清液用超纯水稀释成重量体积百分比为1%的溶液，煮沸离心后， 上清液用0. 22 u m的滤膜过滤，进样分析。SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> —种循环利用重组酿酒酵母生产低聚半乳糖的方法 〈腿2
<170〉 Patentln version 3. 5
<210〉 1
<211> 38
<212〉 DNA 〈213>人工合成
〈400〉 1
catgaattcg gagttgcttc犯aaatatgt gacttggg 38
<210> 2
〈211〉 31 <212>腿 〈213>人工合成
〈400〉 2
gcatgcggcc gcgtacgccc cctttcg卿c 31
权利要求
1、一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母细胞，其特征在于，含有插入了β-半乳糖苷酶基因序列的质粒载体。
2、 如权利要求1所述的重组酿酒酵母细胞，其特征在于，所述的半乳糖苷酶基因选自扩张 青霉CGMCC No. 2352中的0 -半乳糖苷酶基因。
3、 一种如权利要求l所述的表面展示e-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母细胞的制备方法，其特征在 于，步骤如下1) 将e-半乳糖苷酶基因插入酵母表面展示质粒pYDl，得重组质粒pYDl;2) 将步骤l)构建的重组质粒pYDl转化大肠杆菌DH5a ，然后从阳性重组大肠杆菌中提取 含有0 -半乳糖苷酶基因的重组质粒pYDl，再用该重组质粒pYDl转化酿酒酵母EBY-100，获得 含有重组质粒pYDl的重组酿酒酵母；3) 将步骤2)获得的含有重组质粒pYDl的重组酿酒酵母接种于YNB-CAA-葡萄糖培养液，30 'C培养，当菌液0D,为2.0 5.0时，3000转/分离心3 5分钟，收集重组酿酒酵母细胞；4) 将步骤3)收集的重组酿酒酵母细胞用诱导产酶培养液重悬菌细胞，并调0Ds。。为0.5 1. 0， 2(TC 25'C诱导38 42小时，3000转/分离心3 5分钟，收集已表面展示0 -半乳糖苷酶 的重组酵母细胞；所述YNB-CAA-葡萄糖培养液成分无氨基酸酵母氮源6. 7 g/L，酪蛋白水解物5g/L,葡萄糖 20 g/L， pH自然，115。C灭菌30分钟j所述诱导产酶培养液成分无氨基酸酵母氮源6.7 g/L，酪蛋白水解物5 g/L， pH自然， 115'C灭菌30分钟；使用之前加入过滤除菌的半乳糖溶液至终浓度20 g/L。
4、 如权利要求3所述的重组酿酒酵母细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤i)中的e-半乳糖苷酶基因来源于扩张青霉CGMCC No. 2352。
5、 如权利要求3所述的重组酿酒酵母细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中的诱导产酶 温度为20。C。
6、 如权利要求3所述的重组酿酒酵母细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中的诱导产酶 时间为40小时。
7、 一种利用如权利要求i所述的表面展示e -半乳糖苷酶的重组酿酒酵母细胞生产低聚半乳糖的应用，其特征在于，先将表面展示P-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母悬于YNB-CM-乳糖培养液，调 0D恥。为8.0 10.0， 25。C培养4 6天；然后3000转/分离心3 5分钟，对离心后所得的上清液通过 高效液相色谱分析其低聚半乳糖含量；将离心后所得的重组酵母细胞，重悬于新的YNB-CAA-乳糖 培养液，按上述方法循环发酵乳糖生产低聚半乳糖，并分析每个循环所得上清液的低聚半乳糖含 量；所述YNB-CAA-乳糖培养液成分为无氨基酸酵母氮源6. 7 g/L，酪蛋白水解物5g/L，乳糖IOO g/L， pH自然，115 。C灭菌30分钟。
全文摘要
本发明涉及一种利用重组酿酒酵母生产低聚半乳糖的方法，尤其涉及一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母及其制备方法以及循环利用该重组酿酒酵母发酵乳糖生产低聚半乳糖的方法。首先构建β-半乳糖苷酶酵母表面展示载体，将β-半乳糖苷酶展示在酿酒酵母细胞表面，然后循环利用该重组酵母发酵乳糖生产低聚半乳糖。本发明所述的表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母可被循环利用生产低聚半乳糖，且产量高，生产成本低，工艺简单，具有广阔的工业化应用前景。
文档编号C12N1/19GK101475914SQ200810157830
公开日2009年7月8日 申请日期2008年10月15日 优先权日2008年10月15日
发明者卢丽丽, 李玉梅, 敏 肖 申请人:山东大学