专利名称：：一种检测人类乳头瘤病毒基因型的方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测人类乳头瘤病毒基因型的方法。
背景技术：
：HPV是一种小型无包膜DNA病毒，具有双链闭环的DNA基因组，7.2-8kb，相对分子量5xl06，HPV基因组可分为3个区域非编码的上游调节区，早期开放读码框，包括E6、E7、El、E2、E4、E5，晚期开放读码区Ll(主要衣壳蛋白)和L2(小衣壳蛋白)。根据编码衣壳蛋白Ll的开放读码框(ORF)基因序列不同进行分型，Ll区ORF的差异小于60。/。分为不同的属，在60-70%之间分为不同的种，差异位于71-89%则分为不同的型别，目前已鉴定的HPV约有130多型，根据病毒致病力大小，分为高危型，如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73等，可致宫颈上皮内瘤病变(cervicalintraepithelial,CN),多见于高龄妇女，不易自然缓解,与宫颈癌的发生关系密切，低危型HPV有HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44等，多见于年轻妇女,自然緩解率高。通过对HPV基因分型^r测，可以将不同HPV型别感染与宫颈病变的关系研究得更深入，有很高的学术研究价值。目前HPV检测多是采用通过美国食品和药物管理局认证的第二代杂交捕获法(HC2)，此种方法检测13种高危型HPV,但不能分型、不能检测多重感染。现有的基于HPV核酸杂交技术的检测产品，准确率有限，通量低，成本高，且多数的探针为RNA，可能会影响反应的稳定性。
发明内容本发明实施例所要解决的技术问题在于提供一种检测人类乳头瘤病毒基因型的方法，旨在解决现有检测方法不能分型、不能检测多重感染、准确率有限，以及通量低，成本高，且因为探针为RNA，可能会影响反应的稳定性的问题。本发明实施例是这样实现的，一种检测人类乳头瘤病毒基因型的方法，待检测人类乳头瘤病毒基因为HPV6、HPVll、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68和HPV73中的一种或几种，包括如下步骤(1)根据所选择的待检测HPV基因型别通用引物序列的变异位点，修改GP5十/GP6+通用引物，设计出针对每型的扩增引物，在每一特异型别的扩增引物3，位置有12个碱基的完全匹配，且该扩增引物均带了10个碱基acgttggatg的标签序列；设计延伸引物，该延伸引物的长度为17-28碱基，在延伸引物的3，端末位包括延伸碱基在内的4个碱基中，包涵一个型特异多态位点标记；延伸引物选择的位置是GP5十/GP6+序列中相对保守的区域；(2)通过PCR扩增，获得含有所述突变位点的輩巴序列扩增产物；(3)通过SAP酶处理，除去所述扩增产物中含有的dNTPs;(4)通过延伸反应，在延伸引物的3，端连接一个碱基，得到的延伸产物与所述延伸引物之间分子量差异不小于9D，且各个型别的延伸产物间的分子量差异不小于9D;(5)釆用树脂纯化延伸反应产物；(6)将纯化后的产物采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统进行质谱检测，确定所选择的待检测HPV基因型别。与现有技术相比，上述技术方案采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质i普(MALDI-TOF-MS)系统进行检测，在质谱技术中使用的试剂耗材相对简单且相对稳定，不需要荧光染料、特殊的酶等价格昂贵的试剂，反应可以在微量体系中进行，减少样品和各种消耗品的使用。由于质i普技术直接检测DNA的分子量(质荷比)，直接确定碱基的类型，不需要经过任何形式的信号转换，理论上只要有一个拷贝的SNP片断被扩增即可识别，杜绝了假阳性发生的可能。此外质谱技术还有自动化、高通量检测特点，质i普技术与多引物延伸技术相结合，可以在一个反应体系中同时检测多型HPV,PCR反应可以在微量体系中进行，结合DNA自动提取设备、多重PCR引物设计软件及数据分析软件，大大减轻了工作量，提高了检测通量。另外，质谱分型系统从引物设计的角度适合进行HPV检测。质谱系统要求前PCR的产物在100-180bp的范围内为最佳，HPV在L1区通用引物GP5+ZGP6+大约扩增140bp的片段产物，且扩增有效性已经得到证实。此方法中修改后的引物GP5+/GP6+扩增的产物长度满足质谱对前PCR产物片段长度的要求。质谱系统延伸反应中要求延伸引物与延伸产物之间,各个型别的延伸产物间的谱系统中能彼此区分，也能满足质谱系统的要求，因此，可以同时检测出上述17型HPV基因。图1表示HPV6、HPVll、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68和HPV73型别的HPV延伸弓1物峰图2表示HPV6分析结果图3表示HPV11分析结果图4表示HPV16分析结果图5表示HPV18分析结果图6表示HPV31分析结果图7表示HPV33分析结果图8表示HPV35分析结果图9表示HPV39分析结果图10表示HPV45分析结果图；图11表示HPV51分析结果图；图12表示HPV52分析结果图；图13表示HPV56分析结果图；图14表示HPV58分析结果图；图15表示HPV59分析结果图；图16表示HPV66分析结果图；图17表示HPV68分析结果图；图18表示HPV73分析结果图；图19表示HBB分析结果图。具体实施例方式为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明实施例提供的检测人类乳头瘤病毒基因型的方法，待检测人类乳头瘤病毒基因为HPV6、HPVll、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68和HPV73中的一种或几种，包括如下步骤(1)根据所选择的待检测HPV基因型别通用引物序列的变^;位点，修改GP5+ZGP6+通用引物，设计出针对每型的扩增引物，在每一特异型别的扩增引物3，位置有12个碱基的完全匹配，且该扩增引物均带了10个碱基acgttggatg的标签序列；设计延伸引物，延伸引物的长度为17-28碱基，在延伸引物的3'端末位包括延伸碱基在内的4个碱基中，包涵一个型特异多态位点标记；延伸引物选择的位置是GP5十/GP6+序列中相对保守的区域；所述延伸引物与延伸产物之间，各个型别的延伸产物间的分子量差异不小于9D。各型HPV扩增引物序列见表l。对应HPV延伸引物序列^;量见表2。扩增引物为PAGE纯化，延伸引物为HPLC纯化。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(2)通过PCR扩增，获得含有所述突变位点的靶序列扩增产物'PCR扩增反应试剂的配置见表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>反应条件为94。C，15min;94。C变性20s，56。C退火30s,72。C延伸1min,共扩增45循环；最终72。C延伸3min。(3)通过SAP消化酶(虾碱性磷酸酶)处理，除去所述扩增产物中含有的dNTPs。SAP消化酶反应体系见表4。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>反应条件为37。C孵育40分钟，去除反应中剩余的dNTP;85°C5分钟使SAP酶失活。(4)通过延伸反应，在延伸引物的3'端连接一个碱基，得到的延伸产物与所述延伸引物之间分子量差异不小于9D，且各个型别的延伸产物间的分子量差异不小于9D。延伸反应体系见表5。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*其中延伸反应mix按照各型引物的分子量大小进行线性关系调整。反应条件为94。C，30s;94。C变性5s,52。C退火5s,80。C延伸5s，共扩增40循环，在每个循环中退火和延伸进行5个小循环；最终72°C延伸3min。(5)采用树脂纯化延伸反应产物。(6)将纯化后的产物采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统进行质谱检测，确定待检测HPV基因型别。图1-19中，图中横坐标表示各型延伸引物和产物的分子量大小，其中左边的虚线表示延伸引物分子量所在位置(由于完全消耗，所以无峰型)，右边虚线表示延伸产物分子量所在位置(由于有延伸，所有有峰型)；纵坐标表示引物的信号强度。用TYPE4.0软件阅读峰图及导出数据。在没有感染的情况下，每一型HPV和内参HBB都有在质谱不同的质量处都有延伸引物的峰图；在有HPV感染的情况下，相对的HPV有延伸产物的峰图。在一个样本中可检测多重感染。峰图报告结果分为4种A:结果可靠；B:中度可靠；C:一般可靠；D:低度可靠。前三种视为该延伸反应有效，有相应HPV感染，第四种由于质i普峰图基线不平而致，视为无HPV感染。具体的样本中要根据样本信息和质谱峰图具体分析。本实施例中还包括HPV质粒标准品的制备。使用Ll区特异引物将包含HPV6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73型的L1区基因片段的扩增产物纯化后，分别连接到PMD-T载体(TakaraPMD-T连接试剂盒)，再转化至大肠杆菌DH5a，LB固体培养基平板涂布培养1214小时，通过蓝白斑筛选挑选单克隆二次扩大培养，使用质粒提取试剂盒(AXYGEN)提取并纯化质粒，通过DNA测序鉴定为阳性的质粒。将制备好的HPV6,11,16，18，31,33,35，39,45,51,52，56,58,59,68,66,73质粒分别测定OD值，再根据OD值将质粒稀释500pg,5pg,O.Spg三种浓度的存储液。然后根据摩尔公式lng质粒的拷贝数-[lng*l(T9/2*330*(载体分子量+插入片断分子量)]*6.02*1023计算出lng的拷贝数，根据这个值将质粒梯度稀释为105,104,5000，103,102,10、opies/ul6个浓度梯度进行灵敏度验证。HPV标准品灵敏度检测。HPV标准品稀释为105，104,5000，103，102，10copies/d6个浓度梯度进行灵敏度验证。HPV11,33,35，45,51,52,58，66，68灵敏度为50copies/ul;HPV16,18,31灵敏度为50copies/ul;HPV6,39,56,59,73灵敏度为100copies/ul。本实施例中还包括HPV对照品选择和制备。HPV18重组质粒(250c叩ies/ul)为阳性对照，并掺入10ng/ul的经检测无HPV感染人基因组DNA背景。HPV阴性对照为无菌双蒸水和鼠肝。在反应中加入设计的阳性对照和阴性对照。质控标准参见表6。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>所有的检测中三个质控项目均为正常时，视结果有效，否则本实施例中HPV基因型检测内参以(3-球蛋白基因(HBB)作为内部参照基因，监测DNA模板的质量和PCR扩增反应的质量。通用引物序列为SEQIDNO.l1acgttggatgACACAACTGTGTTCACTAGSEQIDN0.24acgttggatgCAACTTCACCCACGTTCACC,延伸引物序列为SEQIDNO.42GGTAGGGCAGATTTCC。本发明基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱，具有高灵敏度，高特异性和高通量的特点，且相对于其它的检测方法成本低。本发明适应于HPV感染基因型与肿瘤相关性的研究，HPV感染的大规4莫的流行病学调查以及宫颈疾病发生和发展的监测。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。权利要求1、一种检测人类乳头瘤病毒基因型的方法，待检测人类乳头瘤病毒基因型为HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68和HPV73中的一种或几种，包括如下步骤(1)根据所选择的待检测HPV基因型别通用引物序列的变异位点，修改GP5+/GP6+通用引物，设计出针对每型的扩增引物，在每一特异型别的扩增引物3’位置有12个碱基的完全匹配，且该扩增引物均带了10个碱基acgttggatg的标签序列；设计延伸引物，延伸引物的长度为17-28碱基，在延伸引物的3’端末位包括延伸碱基在内的4个碱基中，包涵一个型特异多态位点标记；延伸引物选择的位置是GP5+/GP6+序列中相对保守的区域；(2)通过PCR扩增，获得含有所述突变位点的靶序列扩增产物；(3)通过SAP酶处理，除去所述扩增产物中含有的dNTPS；(4)通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，得到的延伸产物与所述延伸引物之间分子量差异不小于9D，且各个型别的延伸产物间的分子量差异不小于9D；(5)采用树脂纯化延伸反应产物；(6)将纯化后的产物采用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统进行质谱检测，确定待检测HPV基因型别。2、如权利要求1所述检测人类乳头瘤病毒基因型的方法，其特征在于，所述步骤(1)中待检测HPV基因型别的相应扩增引物的序列为SEQIDNO.lHPV18/66正向引物SEQIDNO.2HPV16正向引物SEQIDNO.3HPV31/33/52正向引物SEQIDNO.4HPV35/68正向引物SEQIDNO.5HPV39/45正向引物SEQIDNO.6HPVll/6正向引物SEQIDN0.7HPV59/73正向引物SEQIDNO.8HPV51正向引物SEQIDNO.9HPV58正向引物SEQIDNO.10HPV56正向引物SEQIDNO.12HPV16/18/45/68反向引物SEQIDNO.13HPV39/6反向引物SEQIDNO.14HPV52反向引物SEQIDNO.15HPV35反向引物SEQIDNO.16HPV31反向引物SEQIDNO.17HPV73/11反向引物SEQIDNO.18HPV33反向引物SEQIDNO.19HPV51反向引物SEQIDNO.20HPV59反向引物SEQIDN0.21HPV58反向引物SEQIDNO.22HPV66反向引物SEQIDNO.23HPV56反向引物延伸引物序列为SEQIDN0.25HPV16SEQIDNO.26HPV18SEQIDNO.27HPV31SEQIDNO.28HPV33SEQIDNO.29HPV35SEQIDNO.30HPV39SEQIDNO.31HPV45SEQIDNO.32HPV51SEQIDNO.33HPV52SEQIDNO.34SEQIDNO.35SEQIDN0.36SEQIDN0.37SEQIDN0.38SEQIDN0.39SEQIDNO.40HPV6HPV59HPV58HPV66HPV68HPV56HPV73SEQIDN0.41HPV113、如权利要求2所述检测人类乳头瘤病毒基因型的方法，其特征在于，所述步骤(l)中以p-球蛋白基因作为内部参照基因，采用的扩增引物序列为SEQIDNO.l1和SEQIDNO.24,延伸引物序列为SEQIDN0.42。4、如权利要求2或3所述检测人类乳头瘤病毒基因型的方法，其特征在于，所述扩增引物为PAGE纯化，所述延伸引物为HPLC纯化。5、如权利要求1所述检测人类乳头瘤病毒基因型的方法，其特征在于，还包括在反应中加入阳性对照和阴性对照，所述阳性对照HPV18重组质粒，并掺入经检测无HPV感染人基因组DNA背景，所述阴性对照为无菌双蒸水和鼠肝DNA。6、如权利要求1所述检测人类乳头瘤病毒基因型的方法，其特征在于，还包括HPV质粒标准品的制备步骤，以及采用该标准品对引物特异性和灵敏度进行测试的步骤，所述HPV质粒标准品为插入人类乳头瘤病毒MY09/MY11序列的PMD质粒。全文摘要本发明提供了一种检测人类乳头瘤病毒基因型的方法，待检测基因为17型HPV中的一种或几种，包括如下步骤(1)根据所选择的待检测HPV基因型别通用引物序列的变异位点，设计出针对每型的扩增引物；设计每型特异的延伸引物；(2)PCR扩增；(3)SAP酶处理；(4)延伸反应，延伸产物与所述延伸引物之间，各个型别的延伸产物间的分子量差异不小于9D；(5)采用树脂纯化延伸反应产物；(6)质谱检测，确定待检测HPV基因型别。采用本发明提供的方法，解决了现有某些检测方法不能分型、不能检测多重感染、准确率有限，以及通量低，成本高，且因为探针为RNA，可能会影响反应的稳定性的问题。文档编号C12Q1/70GK101435002SQ20081021833公开日2009年5月20日申请日期2008年12月12日优先权日2008年12月12日发明者平吴,爽喻,张俊青,李晶晶,玲杨,威王,扬高申请人:深圳华大基因科技有限公司