利用整细胞生物转化再生氧化型辅酶i的方法

专利名称：：利用整细胞生物转化再生氧化型辅酶i的方法
技术领域：
：本发明涉及利用整细胞生物转化再生氧化型辅酶I的方法。
背景技术：
：在氧化还原酶中，大约80。/o的氧化还原酶需要尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+，NADH)作为辅酶，10。/o的氧化还原酶以尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+,NADPH)为辅酶，只有很少一部分以黄素(FMN，FAD)和辅酶Q(PQQ)为辅酶。使用氧化还原酶进行生物催化时，合成产物的同时会消耗一定量的辅酶。辅酶的高效供应是开发氧化还原酶催化反应的关键技术之一。辅酶价格昂贵，每摩尔氧化型辅酶I(NAD+)的价格约为1300欧元，PQQ的价格则超过了2700000欧元每摩尔，而且辅酶稳定性低，从技术经济角度考虑，投加大量的辅酶是不可行的。根据生物催化反应的过程经济性和工业可行性，氧化还原酶在应用中除了必须有合适的酶和反应工程技术以外，还必须提供高效、低成本的辅酶再生系统。利用辅酶再生系统，不仅能够降低成本，而且可以通过与合适的辅酶再生反应相耦合，使原本热力学上不易进行的反应变得容易发生。辅酶再生主要有化学法，电化学法，光化学法，酶耦联法和整细胞生物转化再生辅酶。酶耦联法是利用两个平行的氧化还原反应酶系统，一个酶催化底物转化，另一个酶则催化辅酶循环再生。为了达到最佳效果,两个酶的底物应相对独立，以避免两个底物竞争同一酶的活性中心。酶耦联法再生效率高，但由于需要外加酶和对应的底物，再生系统较复杂，过程控制难。辅酶再生系统中的酶可以是游离状态的，也可以是整细胞。用游离酶作为生物催化剂有如下的优点只使用一两种酶，能够避免副反应，从而使还原反应具有对映选择性，同时下游的工艺过程也可以被简化，和整细胞催化相比，可以忽略扩散的限制。但是，使用游离酶时需要添加辅酶，且游离状态的酶对高浓度的底物和有机溶剂敏感。整细胞催化具有如下的优点酶处在它们的自然环境当中，更稳定，在发酵过程当中细胞具有内部的辅酶再生系统，仅添加葡萄糖就足以推动反应的进行。酶法再生NAD+—般常用酶为谷氨酸盐脱氢酶、乳酸脱氢酶、酵母酒精脱氢酶或者NADH氧化酶。其中，NADH氧化酶由于只需要氧气参与，且产物为水，没有其他副产物的生成，因此是极具潜力的NAD+再生体系之一。在实际应用中，依赖NAD+的R型特异乙醇脱氢酶(R-specificADH)可以在R，S-l-苯基乙醇中让R型对映体完全氧化，从而生产纯的S对映体，NADH氧化酶与此反应过程耦合，为ADH提供再生NAD。目前采用该酶再生的转化数TTN(每摩尔辅酶用于转化生成目的产物的摩尔数)一般可以达到100到60之间。但是采用纯酶进行再生成本高，酶活性不稳定，特别是对于NADH氧化酶目前纯化成本还相当高，而且能用的酶的种类非常有限。相对而言，采用整细胞催化再生辅酶的操作简便，反应稳定，成本低。但是由于NADH为带电分子，且分子量较大(709.4Da)，通常很难进入细胞进行反应。
发明内容本发明的目的是提供一种利用整细胞生物转化再生氧化型辅酶I的方法。本发明所提供的再生氧化型辅酶I的方法，是在缓冲溶液中，以还原型辅酶I(NADH)为底物利用产气肠杆菌将还原型辅酶I转化为氧化型辅酶I(NAD+)。其中，所述缓冲溶液可以为各种缓冲溶液，如磷酸缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或三乙醇胺缓冲液等，只要能保证反应在适合的pH范围内进行的缓冲溶液均可。所述缓冲溶液的pH具体为4.0-9.0。所述缓冲溶液中所述还原型辅酶I的浓度为0.02函-10mM。所述方法中，反应温度为4-5(TC，在该温度范围内，产气肠杆菌NADH氧化酶都具有活性，所述温度优选为37°C。所述产气肠杆菌可以是死菌体，也可以是活菌体，只要产气肠杆菌中的NADH氧化酶存在并具有活性，就可将还原型辅酶I转化为氧化型辅酶I。产气肠杆菌^^ero力a"eraeiY^朋e^的NADH氧化酶位于细胞外膜，带电荷的大分子NADH不需要进入细胞进行反应，有利于酶与底物的接触，提高酶的转化效率。本发明利用产气肠杆菌整细胞生物转化再生氧化型辅酶I的方法可将NADH转化为NAD+，转化率达到72%。本发明利用产气肠杆菌整细胞生物转化再生氧化型辅酶I的方法与ADH酶耦联可将乙醇转化为乙醛，转化数为580;与展示手性ADH脱氢酶的大肠杆菌整细胞耦联可将苯乙醇转化为苯乙酮，与展示手性ADH脱氢酶的大肠杆菌单独将苯乙醇转化为苯乙酮相比，苯乙酮的产量从O.12mM提高到0.65mM。图1为￡ae/Y^e/es整细胞再生NAD+转化乙醇为乙醛时不同NADH添加量下乙醛生产随时间变化曲线。具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1、产气肠杆菌(^>7Z^_ratecz^raero《e/7e^将NADH转化为NAD+1)培养产气肠杆菌产气肠杆菌^^ero/^cter朋iY^e/2^;IAM1183接入培养基中(葡萄糖15g/L、蛋白胨5g/L、K2HP0414g/L、KH2P046g/L、(NH4)2S042g/L、MgS047H200.2g/L)，37°C，170rpm空气浴摇床培养。取60ml经过12小时好氧摇瓶培养的产气肠杆菌IAM1183，10，200Xg，4°(3离心5min，收集产气肠杆菌菌体。2)NADH转化为NAD+用pH6.80的50函三乙醇胺缓冲液(TEA)洗涤步骤1)的产气肠杆菌菌体三次，然后重悬于pH6.80的50mM三乙醇胺缓冲液(TEA)中，调整细胞浓度至ODe。。为0.8，加入NADH，使NADH的终浓度为210pM，37°C，170rpm培养，作为实验组。用pH6.80的50mM三乙醇胺缓冲液(TEA)洗涤步骤1)的产气肠杆菌菌体三次，然后重悬于pH6.80的50mM三乙醇胺缓冲液(TEA)中，调整细胞浓度至OD,为0.8，加入NAD+，使NAD+的终浓度为210|iM，37°C，170rpm培养，作为对照1。用pH6.80的50rnM三乙醇胺缓冲液(TEA)加入NADH，使NADH的终浓度为210|oM，37°C，170rpm培养，作为对照2。用pH6.80的50raM三乙醇胺缓冲液(TEA)加入NAD+，使NAD+的终浓度为210pM，37°C,170rpm培养，作为对照3。3)NADH转化为NAD+的效率培养8小时后，测定培养液中的NADH和NAD+的浓度。NADH和NAD+浓度的测定方法如下1)样品预处理分别取出5ral培养8小时的培养液，立即置于冰上。加入适量的HC1(6M)分钟，最后用KOH(IOM)中和pH至6.5-7，加入KOH时要不断震荡样品以避免局部pH过高，制得测定NAD+的预处理样品。分别取出5ml培养8小时的培养液，立即置于冰上。用适量KOH(IOM)调pH至12.5，然后在25°C下培养10分钟，制得测定NADH的预处理样品。2)检测由于在350nm附近紫外激发光激发下NADH产生强烈荧光，而NAD+不被激发，故可利用这一性质检测二者的浓度，通过酶偶联反应，检测NADH荧光量的变化来确定NADH和NAD+的浓度。NADH荧光量用荧光分光光度计(HitachiF-2500，J即an)进行检测，激发波长350nm，发射波长460nm，狭缝宽度10nm。分别配制各种不同浓度的标准NADH溶液和NAD+溶液。lml检测NAD+浓度的反应液(50mMpH8.8的磷酸盐缓冲液，2.5gL—'氨基脲，80mM纯乙醇，0.5U'mr'乙醇脱氢酶ADH)中分别加入不同浓度的标准NADH溶液测定并记录RFU值，绘制并拟合RFU随NADH溶液浓度变化标准曲线。lml检测NADH浓度的反应液(200raMpH7的乙醇胺缓冲液，5raM丙酮酸，20U/ml乳酸脱氢酶)中加入不同浓度的标准NAD+溶液测定并记录RFU值，绘制并拟合RFU随NAD+溶液浓度变化标准曲线。lml检测NAD+浓度的反应液(50mMpH8.8的磷酸盐缓冲液，2.5g1/氨基脲，80mM纯乙醇，0.5Uml—'乙醇脱氢酶ADH)中加入一定体积测定NAD+的预处理样品摇匀后迅速检测荧光量。根据标准曲线中RFU随NAD+浓度拟合方程计算出待测样品的NAD+浓度。lml检测NADH浓度的反应液(200mMpH7的乙醇胺缓冲液，5mM丙酮酸，20U/ml乳酸脱氢酶)中加入一定体积测定NADH的预处理样品摇匀后迅速检测荧光量。根据标准曲线中RFU随NAD+浓度拟合方程计算出待测样品的NAD+浓度。NADH和NAD+浓度的测定结果如表1所示，表明在好氧状态下，反应8小时后，产气肠杆菌将NADH氧化为NAD+，转化率达到72%;对照l中的产气肠杆菌未能将NAD+转化为NADH，对照2和3中均为发生NADH和NAD+间的相互转化。表1.培养液中NADH和NAD+的浓度(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例2、产气肠杆菌将NADH转化为NAD1)培养产气肠杆菌产气肠杆菌《/7Z^rote"eraaroge/7e^IAM1183接入培养基中(葡萄糖15g/L、蛋白胨5g/L、K2HP0414g/L、KH2P046g/L、(NH4)2S042g/L、MgS047H200,2g/L)，37°C，170rpm空气浴摇床培养。取60ml经过12小时好氧摇瓶培养的产气肠杆菌IAM1183，10，200Xg，4"离心5min，收集产气肠杆菌菌体。2)NADH转化为NAD+用pH9的50raM三乙醇胺缓冲液(TEA)洗涤步骤l)的产气肠杆菌菌体三次，然后重悬于pH9的50mM三乙醇胺缓冲液(TEA)中，调整细胞浓度至OD,为1.0，加入NADH，使NADH的终浓度为10mM，50°C，170rpm培养，作为实验组。用pH9的50mM三乙醇胺缓冲液(TEA)加入NADH，使NADH的终浓度为10mM，50°C，170rpm培养，作为对照。3)NADH转化为NAD+的效率培养8小时后，测定培养液中的NADH和NAD+的浓度。NADH和NAD+浓度的测定方法同实施例1。NADH和NAD+浓度的测定结果如表2所示。表2培养液中NADH和NAD+的浓度(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例3、产气肠杆菌将NADH转化为NAD+1)培养产气肠杆菌产气肠杆菌伍/7力ero力3cter3erc^e77e^IAM1183接入培养基中(葡萄糖15g/L、蛋白胨5g/L、K2HP0414g/L、KH2P046g/L、(NH4)2S042g/L、MgS047H200.2g/L)，37°C，170rpra空气浴摇床培养。取60ml经过12小时好氧摇瓶培养的产气肠杆菌IAM1183，10，200Xg，4。C离心5rain，收集产气肠杆菌菌体。2)NADH转化为NAD+用pH4的50mM三乙醇胺缓冲液(TEA)洗涤步骤l)的产气肠杆菌菌体三次，然后重悬于pH4的50mM三乙醇胺缓冲液(TEA)中，调整细胞浓度至OD,为0.8，加入NADH，使NADH的终浓度为20pM，4°C，170rpm培养，作为实验组。用pH4的50mM三乙醇胺缓冲液(TEA)加入NADH，使NADH的终浓度为20jiM，4°C，170rpm培养，作为对照。3)NADH转化为NAD+的效率培养8小时后，测定培养液中的NADH和NAD+的浓度。NADH和NAD+浓度的测定方法同实施例1。NADH和NAD+浓度的测定结果如表3所示表3.培养液中NADH和NAD+的浓度(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例4、产气肠杆菌整细胞与ADH耦联再生NAD+1)培养产气肠杆菌产气肠杆菌^feroZ^ckrse^^e/jedIAM1183接入50ml厌氧培养瓶(预先用氮气置换培养瓶顶部及培养基中的空气)，厌氧培养瓶装有40ml培养基中(葡萄糖15g/L、蛋白胨5g/L、K2HP0414g/L、,046g/L、(NH4)2S042g/L、MgS047H200.2g/L)，37°C，170rpm空气浴摇床培养。取50ml经过12小时厌氧摇瓶培养的产气肠杆菌IAM1183，10，200Xg，4。C离心5min，收集产气肠杆菌菌体。2)产气肠杆菌整细胞与ADH耦联再生NAD+用缓冲液A(50mM三乙醇胺缓冲液，pH6.80，5mM二硫苏糖醇)洗涤步骤l)的产气肠杆菌菌体三次，菌体重悬于缓冲液A中，调整细胞浓度至ODe。。为1.0，加入乙醇，使其终浓度为lOOraM，然后加入NADH(终浓度分别为0.02mM和0.2mM)，二硫苏糖醇(终浓度5mM)，ADH酶，在37'C，170rpm空气浴摇床中培养。以不加NADH作为对照。培养24小时后，测定培养液中的乙醛的浓度。乙醛浓度的测定方法如下用气相色谱(ShimadzuGC10A,Japan)检测，采用AT-5柱，FID检测器，以氮气为载气。升温程序为5(TC维持1分钟，然后以IOTVmin的速度升温至120°C。乙醛浓度的测定结果如图l所示，表明随着NADH浓度的增加，生成的乙醛也增加了。反应24小时以后，初始NADH为0.02mM，生成的乙醛为32.08raM，转化数TTN为580;初始NADH为0.2mM，生成的乙醛为34.27mM乙醛，转化数TTN为69。对照生成的乙醛为20.48mM。上述实验结果说明产气肠杆菌把NADH氧化为再生NAD+，为乙醇转化乙醛的反应提供辅酶。图1中，"□"代表对照；"〇"代表添加0.02mMNADH;"△"代表添加0.2mMNADH。实施例5、产气肠杆菌与展示手性ADH脱氢酶的大肠杆菌整细胞耦联再生NAD+转化苯乙醇为苯乙酮1)展示手性ADH脱氢酶的大肠杆菌的制备RE-ADH来源于红平红球菌y/oo^coccwse/TZ^ro/w7isDSM43297，能够专一性氧化R型醇为相对应的酮。RE-ADH可用来手性拆分带芳香基的醇类，手性醇是一种非常重要的医药中间体，近年来在生物催化领域得到了广泛的重视。RE-ADH展示在大肠杆菌表面，能够在胞外进行反应，解决了辅酶和RE-ADH接触的问题。展示手性ADH脱氢酶的大肠杆菌的制备方法如下以红平红球菌(朋oobcoccwsezrtArapo7iJDSM43297基因组DNA为模版，ReADH-F和ReADH-R为引物，扩增re-a必基因。ReADH-F和ReADH-R的核苷酸序列如下5'-CGCGGATCCATGAAGGCAATCCAGTACACG-3'和5'-CCCAAGC,TTCTACAGACCAGGGACCACAAC-3。PCR扩增条件为94°C，5min;94。C，45s，63.5°C，1rain,72°C，2min，30个循环；最后72。C延伸5min。PCR产物回收纯化后插入到质粒pHLA(JunyaNarita，KenjiOkano，ToshihiroTateno，TakanoriTanino，TomomitsuSewaki，Moon-HeeSung，HidekiFukuda，AkihikoKondo.DisplayofactiveenzymesonthecellsurfaceofEscherichiacoliusingPgsAanchorproteinandtheirapplicationtobioconversion.ApplMicrobiolBiotechnol(2006)70:564-572)(清华大学)的BamHI和HindIII位点之间，得到质粒pHLA-READH。将pHLA-READH转入f.co7丄DH5a获得展示手性ADH脱氢酶的大肠杆菌。展示手性ADH脱氢酶的大肠杆菌接入培养基(蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl10g/L)，温度37°C，170rpm空气浴摇床培养。取50ml经过24小时培养的￡coh'(pHLA-READH)，10,200Xg，4℃离心5min，收集E.coli(pHLA-READH)菌体。2)培养产气肠杆菌产气肠杆菌^)fero^"eraeroge/e5v1IAM1183接入50ml厌氧培养瓶(预先用氮气置换培养瓶顶部及培养基中的空气)，厌氧培养瓶装有40ml培养基中(葡萄糖15g/L、蛋白胨5g/L、K2HPO414g/L、野046g/L、(NH4)2S042g/L、MgS047H200.2g/L)，37°C，170rpm空气浴摇床培养。取50ml经过12小时厌氧摇瓶培养的产气肠杆菌IAM1183，10，200Xg，4"C离心5rain,收集产气肠杆菌菌体。3)产气肠杆菌与E.coli(pHLA-READH)整细胞偶联再生NAD＋用缓冲液A(50mM三乙醇胺缓冲液，pH6.80，5mM二硫苏糖醇)洗涤步骤2)的产气肠杆菌菌体三次，菌体重悬于缓冲液A中，调整细胞浓度至20D6Q。*mr;用缓冲液A(50mM三乙醇胺缓冲液，pH6.80，5mM二硫苏糖醇)洗涤步骤l)的￡(pHLA-READH)菌体三次，菌体重悬于缓冲液A中，调整细胞浓度至20D6。。ml—1;将产气肠杆菌重悬液与￡coh(pHLA-READH)重悬液按照体积比为1:l混合，加入苯乙醇(终浓度为10raM)，NADH(终浓度为4mM)，二硫苏糖醇(终浓度为5mM)，ADH酶，37°C，170rpm空气浴摇床中培养。分别以仅含有产气肠杆菌和Aco"'(pHLA-READH)为对照1和对照2。培养24小时后，测定培养液中的苯乙酮的浓度。苯乙酮浓度的测定方法如下用气相色谱(ShimadzuGC10A，Japan)检测，采用AT-5柱，FID检测器，以氮气为载气。升温程序为5(TC维持1分钟，然后以IO°C*min—'的速度升温至150。C。苯乙酮浓度的测定结果表明，，对照l没有苯乙酮产生，对照2苯乙酮产量为0.12mM，而在￡(pHLA-READH)中添加产气肠杆菌的苯乙酮的产量从0.12raM提高到0.65mM，表明产气肠杆菌能再生NAD+供给RE-ADH进行反应。E.aerogenes整细胞把NADH氧化为NAD+，所形成的NAD+供给E.coli胞外展示的RE-ADH，使得苯乙醇氧化为苯乙酮。权利要求1、一种再生氧化型辅酶I的方法，是在缓冲溶液中，以还原型辅酶I为底物利用产气肠杆菌将还原型辅酶I转化为氧化型辅酶I。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述缓冲溶液的pH为4.0-9.0。3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述缓冲溶液中所述还原型辅酶I的浓度为0.02mM-10mM。4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法中，反应温度为4-50°C。5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述产气肠杆菌为死菌体或活菌体。6、权利要求1至5中任一所述方法将乙醇转化为乙醛中的应用。7、权利要求1至5中任一所述方法将苯乙醇转化为苯乙酮中的应用。全文摘要本发明公开了一种利用整细胞生物转化再生氧化型辅酶I的方法。本发明的再生氧化型辅酶I的方法，是在缓冲溶液中，以还原型辅酶I为底物利用产气肠杆菌将还原型辅酶I转化为氧化型辅酶I。所述缓冲溶液的pH为4.0-9.0。所述缓冲溶液中所述还原型辅酶I的浓度为0.02mM-10mM。本发明的再生氧化型辅酶I的方法可将NADH转化为NAD⁺，转化率达到72％。文档编号C12P7/24GK101386878SQ20081022531公开日2009年3月18日申请日期2008年10月29日优先权日2008年10月29日发明者希吴,翀张,邢新会申请人:清华大学