专利名称：从盐藻渣中制备水解低聚糖和短肽的方法
技术领域：
本发明属于盐藻利用技术领域，特别涉及从脱除;5—胡萝卜素的盐藻渣中制备盐藻糖和 短肽的方法。
二背景技术：
盐藻又称盐藻，是绿色单细胞藻，形态微小，具有糖蛋白形成的包被。主要分布在近海
水域，对盐度的适应范围为0.2 3.5%，具有繁殖快、生存力强、适于养殖等特点。我国海 岸线长，加之有大量适合盐藻生存的内陆盐湖，因此盐藻分布广，资源丰富。盐藻含有丰富 的油脂、yS—胡萝卜素、蛋白质、多糖类化合物和Ca、 P、 Zn等微量矿物质，包括人类必需 的8种氨基酸等系列可利用的物质。目前内蒙古吉兰泰公司已经实现从盐藻中提取甘油和yS 一胡萝卜素已形成产业化，有大量的盐藻渣资源。在提取^一胡萝卜素的盐藻渣中，还有超 过10%的多糖类、超过30%的蛋白质及矿质等营养成分。
近年来的研究发现，糖类在人体免疫系统中起十分关键的作用，在人体对抗病毒及细菌 侵袭的防御过程中尤其如此。例如，盐藻中的硫酸化多糖可抑制败血症病毒(VHSV)和非洲猪 热病毒(AFSV)的复制。现已发现盐藻多糖复合物具有较强的药物生物活性，能有效调节机体 免疫功能，增强巨噬细胞的吞噬功能，明显抑制60%以上实体瘤S180的生长。
短肽是由二到卜几个氨基酸组成的具有生物活性的肽类，又称功能性短肽。功能性短肽 属于生物活性肽，具有多种生物学功能，如激素作用、抗血栓、抗高血压、抗氧化、免疫调 节、降胆固醇、抑制细菌、促进生长、调节食品风味及硬度等。现代营养学家研究发现，蛋 白质经消化道中酶的作用后分解成游离氨基酸和短钛，机体吸收蛋白质营养一部分以游离氨 基酸的形式吸收，另一部分则以短肽形式吸收，且机体对短肽的吸收速度大于游离氨基酸。 此外，短肽无异味，渗透压低，因此，其生物效价和营养价值更高，用短肽开发保健食品和 保健用品的前景更好。所以，功能性短肽的制备已成为近年来的研究热点。
现有制备盐藻糖和短肽的方法，如《中国海洋大学学报》2005年11月第35巻第六期的 "盐藻多糖提取工艺的研究"一文，公开的方法是，以提取过胡萝卜素的盐藻渣粉为原料，先 按固液比为1:16，用NaOH调节pH为9的弱碱水，在温度为IOO'C的条件下，提取10小时，' 醇沉分离，制得多糖粗品(及蛋白多糖)，后用酶解法，即先加多种水解酶(中性蛋白酶和木瓜 蛋白酶及胰蛋白酶)，后灭酶，.然后醇沉分离，制得糖含量为29.01%的混合多糖。该方法提 取时间高达10小时，会导致多糖及蛋白质大量水解，虽然将盐藻多糖和盐藻蛋白质用醇沉淀 的方式从提取液中提出并用多种酶水解，但是，并未对蛋白质的酶水解物进行有效深加工及 利用，即同时制备出短肽，资源利用率低。此外，也未对脱y8—胡萝卜素的盐藻渣中存在的 大量矿质营养进行利用。又如公开号为CN101129324A的"一种盐藻二次提取液产品及其在皮 肤保健用日用化工产品中的应用"专利，公开的方法是，以除去脂溶性物质的盐藻粉为原料， 先用60 70%的乙醇为提取液，在75 100'C下，提取3 4个小时，后进行减压蒸馏回收乙醇，再调整浓縮液的pH值为5 10，然后用蒸馏水稀释至画体含量为3 10%，加入防腐剂 制得成品。该方法只是提取出盐藻渣中的小分子营养物质，例如矿质、氨基酸等，未对盐藻 多糖及蛋白质进行利用，资源利用率极低。
发明内容
本发明的目的是针对现有制备盐藻糖和短肽方法的不足之处，提供一种从盐藻渣中制备 水解低聚糖和短肽的方法。具有从脱y^—胡萝卜素的盐藻渣中同时制备水解低聚糖、水解盐 藻多糖、短肽及皮肤能量激活液等多种产品，资源综合利用率高的特点，制备工艺无"三废" 污染，属于绿色生产；其产品既可用于闩化行业，也可用于保健、食品及饲料等行业。
本发明的机理脱y6—胡萝卜素盐藻残渣中约含10%盐藻多糖，盐藻多糖是以半乳糖、 阿拉伯糖、木糖、葡萄糖等单糖聚合成的高分子，单糖之间主要是以/ 一l， 2、 ^一1， 3、 一l， 4糖苷键连接，溶解于热碱性水溶液，不溶于冷水或高浓度的低温醇溶液。因此，采用 弱碱性水溶液，先从盐藻渣屮提取出盐藻多糖，经过超滤分离矿质离子及小分子有机物，再 用葡聚糖酶(水解P—1， 3—糖苷键)、纤维素酶(水解-一l， 4糖苷键)等水解，获得分子量小 于3000Da的水解盐藻低聚糖液，再经过超滤截留、寘空浓縮、冷冻干燥，获得水解盐藻低 聚糖冻干粉。盐藻多糖为含蛋白的复合物，分子量最高达数十万Da，用蛋白酶水解其肽键， 制备出小分子短肽。将水解超滤截留液调节pH值，用中性蛋A酶和风味蛋白酶水解，获得 平均分子量为600Da的短肽溶液，水解经过超滤、浓縮和冻干，获得盐藻短肽冻干粉。此外， 脱P —胡萝卜素的盐藻残渣含蛋白超过30%，盐藻蛋白质是氨基酸以肽键聚合而成的高分子， 溶解于碱性溶液。分子量高的蛋白质水溶性、稳定性均差，大量的羧基，氨基及侧链基团被 压缩或掩蔽，抗氧化、抗衰老活性低，因此必须进行水解，降低其分子量，使大量侧链功能 基团暴露，方可提升其功能性质。蛋白酶是专门水解肽键的生物催化剂，不同种类的蛋白酶 可水解不同氨基酸组成的肽键。因此用数种酶联合水解盐藻蛋白质，可获得不同分子量的水 解盐藻肽。将水解盐藻肽进行纳滤分级分离，再进行浓縮和冻干，即获得平均分子量为5KDa 的水解盐藻肽和平均分子量为600Da的水解盐藻短肽。
本发明的目的是这样实现的 一种从盐藻渣中制备水解低聚糖和短肽的方法，以脱除y — 胡萝卜素的盐藻渣为原料，先经多次分离及酶水解，后经浓缩、千燥，制得多种产品，具体 的方法歩骤如下
(l)对盐藻渣进行分离
以提取/9一胡萝卜素的盐藻渣粉为原料，按盐藻渣粉的重量(克)去离子水的体积(升) 比为1:5 10的比例，先在容器中加入去离子水，再放入盐藻渣粉，搅拌至盐藻渣粉分散均 匀后，接着用超卢波处理30 60分钟，然后用10000 13000转/分的速度，离心5 20 分钟，分别收集下层沉淀和上层清液。收集的下层沉淀用于制备水解盐藻肽，收集的上层清 液用截留分子量为5KDa的超滤器进行超滤分离，再分别收集超滤滤过液和截留浓缩液，滤 过液中含有小分子量无机盐、氨基酸、三磷酸腺苷(ATP)、维生素等，截留浓缩液中含有大分 子量的多糖类化合物、蛋白质等。(2) 制备皮肤能量激活液
第(l)步完成后，将第(l)歩收集的超滤滤过液置于真空浓縮器中，先用氢氧化钾(KOH)溶 液调节其pH值为5.5 6.0，后在温度为80 90°C、真空度为0.06 0.08Mpa的条件下，进 行真空浓縮至可溶性固形物浓度为10 12%，就制备出K离子浓度为40 60mg/mL、氨基 酸浓度为18 25mg/mL及磷酸盐浓度为13 16mg/mL的皮肤能量激活液，其收得率为脱— 胡萝卜素盐藻渣粉质量百分数的8 12%。
(3) 对截留浓缩液进行分离
第P)歩完成以后，对第(l)歩收集的截留浓縮液，按截留浓缩液蒸馏水的体积比为1:5 IO的比例，先在截留浓縮液中加入蒸馏水并搅拌均匀后，再转移至提取罐中，用稀氢氧化钠 (NaOH)溶液调节其pH值为9 10，加热升温至80 90°C，在搅拌下保温提取5 10小时。 提取完成后，用换热器降温至40 5(TC，再泵入管式离心机，以10000 14000转/分的速 度，进行离心分离，分别收集下层沉淀和上层清液。将收集的下层沉淀称重，然后加入其5 IO倍重量的、pH值为9 10的蒸馏水，进行洗涤。再以10000 14000转/分的速度进行离心 分离，再分别收集下层沉淀和上层清液。如此重复洗涤和分离1 2次。最后，分别将各次收 集的下层沉淀和上层清液合并。
(4) 制备水解盐藻低聚糖和多糖冻干粉
① 制备水解盐藻多糖溶液
第P)歩完成以后，对第(3)歩最后合并的各次上层清液，先用稀盐酸溶液调节其pH值为 5 6，再加入脱除^一胡萝卜素盐藻质量百分数为2 4%的葡萄聚糖酶和1 3%的纤维素 酶，在温度为50 6(TC条件下，搅拌酶水解3 6小时，就制备出水解盐藻多糖溶液。
② 超滤分离
第(4)-①步完成以后，对第(4)-①步制备出的水解盐藻多糖溶液，用截留分子量为3KDa 的超滤器，在压力为0.1 0.25Mpa下，进行超滤分离，将水解盐藻多糖溶液分离为分子量小 于3KDa的水解盐藻低聚糖溶液(即过滤液)和分子量大于3KDa的水解盐藻多糖溶液(即截留 液)。分别收集超滤滤过液和超滤截留液。
③ 制备水解盐藻低聚糖冻干粉
第(4)-②歩完成后，先将(4)-②歩收集的分子量小于3KDa水解盐藻低聚糖过滤液，置于抽 滤机中，用截留分子量为300Da的纳滤膜，进行浓縮，浓縮至截留液中可溶性固形物的质量 浓度为10 15%为止，就制备出水解盐藻低聚糖浓縮液。然后，将水解盐藻低聚糖浓縮液 置于冷冻干燥机中，在真空度为20 60Pa、温度为一50 一6(TC下，进行真空干燥36 40 小时，就制备出分子量小于3KDa的水解盐藻低聚糖冻干粉，其收得率为脱除一胡萝卜素盐 藻渣粉质量百分数的5 7%。
④ 制备水解盐藻多糖冻干粉
第(4)-②歩完成后，先将第(4)-②步收集的分子量大于3KDa水解盐藻多糖截留液置于低 温冰箱中，预冻1 3小时，然后在真空度为20 60Pa、温度为一50^^ — 6CTC条件下，进行冷冻干燥24 30小时，就制备出平均分子量为12KDa的水解盐藻多糖冻干粉，其收得率为脱-一胡萝卜素盐藻渣粉质量百分数的1.5 2.5%。 (5)制备水解盐藻短肽冻干粉
① 制备水解盐藻蛋内液
第(4)歩完成后，将第(3)歩最后合并的下层沉淀，置于水解釜中，先按沉淀质量:纯净水 体积比为1:5 S的比例，向水解釜中加入纯净水，再搅拌至沉淀均匀分散于纯净水中。接着 用稀氢氧化钠溶液调节其pH值为8 9，再加热升温至50 6(TC后，加入沉淀质量百分数为 2% 5%的碱性蛋0酶或胰蛋白酶，保温搅拌酶水解40 60分钟后，再次加入沉淀质量百分 数1 2%的肽酶(如风味蛋白酶或木瓜蛋白酶等)，在搅拌下继续酶水解1.5 3.5小时。最后 加热升温至80 90°C ，并恒温保持15 20分钟，就制备出酶水解盐藻蛋白液。
② 离心分离
第(5) —①歩完成后，将第(5) —①步制备出的水解盐藻蛋白液泵入管式离心机屮，以 12000 14000转/分的速度，进行离心分离10 20分钟，分别收集沉淀和上层清液。对收集 的沉淀，保留备用，作制备微生物肥料的发酵基料。将收集的清液称重并置于脱色装置中， 升温至80 9(TC后，加入其重量3 5%的木质活性炭，搅拌脱色10 20分钟。脱色完成后， 弃活性炭，收集脱色液。将收集的脱色液放入真空过滤器中进行真空抽滤，收集过滤液。然 后将收集的过滤液泵入截留分子量为800Da的纳滤器中，在压力为0.1 0.3Mpa下，进行纳 滤浓縮，直至纳滤截留液中的可溶性固形物的质量浓度为10 15%为止，就制备出平均分子 量为5KDa的水解盐藻肽截留浓缩液；收集纳滤滤过液，并在压力为0.3 0.6Mpa下，进行 反渗透浓縮，.直至反渗透浓縮液中的口I溶性固形物的质量浓度为10 15%为止，就制备出平 均分子量为600Da的水解盐藻短肽浓缩液。'
③ 制备水解盐藻短肽冻干粉
第(5)—②歩完成以后，将第(5)—②歩制备出的平均分子量为600Da的水解盐藻短肽浓縮液置 于低温冰箱中，预冻1~3小时，然后置于冷冻干燥机中，在压力为25 50Pa、温度为一50 一6(TC条件下，进行冷冻干燥24 30小时，就制备出总氮含量为12.5 15%、平均分子量 为600Da的水解盐藻短肽冻干粉，总收得率为脱yS—胡萝卜素盐藻渣粉质量百分数的16 18 %。
④ 制备水解盐藻肽冻干粉
第(5)—③歩完成后，将(5)—②步制备出的平均分子量为5KDa的水解盐藻肽截留浓縮液 置于低温冰箱中，预冻1 3小时，再置于冷冻干燥机中，在压力为25 50Pa、温度为一50 一6(TC下，进行冷冻干燥20~24小时，就制备出总氮量为12.0~14.5%的平均分子量为5KDa 的水解盐藻肽冻干粉，总收得率为脱/S —胡萝卜素盐藻渣粉质量百分数的8 12%。
本发明采用上述技术方案后，主要有以下效果
(l)综合利用盐藻渣制备出多种产品。本发明方法能综合利用脱p—胡萝卜素盐藻渣，同 时制备出皮肤能量激活液、水解盐藻低聚糖和多糖和短肽等日化、医药及保健多种产品，生
11产过程中产生的水解盐藻蛋白沉淀残渣，都保留不弃，留作制备微生物肥料的发酵基料。充 分利用盐藻资源，降低各产品的能耗及生产成本。
(2)生产T艺简单。生产过稃无"三废"排放。本发明方法多次采用膜分离、真^浓缩、冷 冻干燥新技术，这不但原料利用率高，且生产过程中无"三废"排放，是节能、绿色环保的制 备方法，有利于推广应用。
采用本发明方法制备出的产品，可广泛应用于闩化护肤、保湿、营养、抗氧化、抗衰老 等产品中；也可用于保健品，提高人体免疫机能，抗肿瘤的产品中；还可作为单细胞蛋白食 品，补充氮素营养、抗辐射的产品中；其残渣还可用于制备微生物发酵肥料。具体实施例方式
结合具体实施方式
，进一歩说明本发明。
实施例1
一种从盐藻中制备水解低聚糖和短肽方法的具体歩骤如下
(l)对盐藻渣进行分离
以提取;3—胡萝卜素的盐藻渣粉为原料，按盐藻渣粉的重量(克)去离子水的体积(升) 比为1:5的比例，先在容器中加入去离子水，再放入盐藻渣粉，搅拌至盐藻渣粉分散均匀后， 接着用超声波处理30分钟，然用后10000转/分的速度，离心5分钟，分别收集下层沉淀和 上层清液。收集的下层沉淀用于制备水解盐藻肽，收集的上层清液用截留分子量为5KDa的 超滤器进行超滤分离，再分别收集超滤滤过液和截留浓缩液，滤过液中含有小分子量无机盐、 氨基酸、三磷酸腺苷(ATP)、维生素等，截留浓縮液中含有大分子量的多糖类化合物、蛋白质 等。
②制备皮肤能量激活液
第(D歩完成后，将第(l)步收集的超滤滤过液置于真空浓縮器中，先用氢氧化钾(KOH) 溶液调节其pH值为5.5，后在温度为8(TC、真空度为0.06Mpa的条件下，进行真空浓縮至可 溶性固形物沐度为10%，就制备出K离子浓度为40mg/mL，氨基酸浓度为18mg/mL及磷酸 盐浓度为13mg/mL的皮肤能量激活液，其收得率为脱;S —胡萝卜素盐藻渣粉质量百分数的8%。
(3) 对截留浓缩液进行分离
第(2)歩完成以后，对第(l)步收集的截留浓縮液，按截留浓縮液蒸馏水的体积比为1:5 的比例，先在截留浓縮液中加入蒸馏水并搅拌均匀后，再转移至提取罐中，ffl稀氢氧化钠 (NaOH)溶液调节其pH值为9，加热升温至80°C，在搅拌下保温提取5小时。提取完成后， 用换热器降温至4(TC，再泵入管式离心机，以10000转/分的速度，进行离心分离，分别收集 下层沉淀和上层清液。将收集的下层沉淀称重，然后加入其5倍重量的、pH值为9的蒸馏水， 进行洗涤。再以10000转/分的速度进行离心分离，再分别收集下层沉淀和上层清液。如此重 复洗涤和分离2次。最后，分别将各次收集的下层沉淀和上层清液合并。
(4) 制备水解盐藻低聚糖和多糖冻干粉
12① 制备水解盐藻多糖溶液
第(3)歩完成以后，对第(3)歩最后合并的各次上层清液，先用稀盐酸溶液调节其pH值为 5，再加入脱除^一胡萝卜素盐藻质量百分数为2%的葡萄聚糖酶和1%的纤维素酶，在温度 为5(TC条件下，搅拌酶水解3小时，就制备出水解盐藻多糖溶液。
② 超滤分离
第(4)-①歩完成以后，对第(4)-①歩制备出的水解盐藻多糖溶液，用截留分子量为3KDa 的超滤器，在压力为O.lMpa下，进行超滤分离，将水解盐藻多糖溶液分离为分子量小于3KDa 的水解盐藻低聚糖溶液(即过滤液)和分子暈大于3KDa的水解盐藻多糖溶液(即截留液)。分别 收集超滤滤过液和超滤截留液。
③ 制备水解盐藻低聚糖冻干粉 ， 第(4)-②步完成后，先将(4)-②步收集的分子量小于3KDa水解盐藻低聚糖过滤液，置于
抽滤机中，用截留分子量为300Da的纳滤膜，进行浓縮，浓缩至截留液中可溶性固形物的质 量浓度为10%为止，就制备出水解盐藻低聚糖浓缩液。然后，将水解盐藻低聚糖浓縮液置于 冷冻干燥机中，在真空度为20Pa，温度为一50'C下，进行真空干燥36小时，就制备出分子 量小T 3KDa的水解盐藻低聚糖冻干粉，其收得率为脱除一胡萝卜素盐藻渣粉质量百分数的5 %。
④ 制备水解盐藻多糖冻干粉
第(4)-②歩完成后，先将第(4)-②歩收集的分子量大于3KDa水解盐藻多糖截留液置于低 温冰箱中，预冻1小时，然后在真空度为20Pa，温度为一5(TC条件下，进行冷冻干燥24小 时，就制备出平均分子量为12KDa的水解盐藻多糖冻干粉，其收得率为脱^一胡萝卜素盐藻 渣粉质量百分数的1.5%。
(5)制备水解盐藻短肽冻干粉
① 制备水解盐藻蛋白液
第(4)步完成后，将第(3)歩最后合并的下层沉淀，置于水解釜中，先按沉淀质量纯净水 体积比为1:5的比例，向水解釜中加入纯净水，再搅拌至沉淀均匀分散于纯净水中。接着用 稀氢氧化钠溶液调节其pH值为8，冉加热升温至50'C后，加入沉淀质量百分数为2%的碱性 蛋白酶，保温搅拌酶水解40分钟后，再次加入沉淀质量百分数1%的肽酶(如风味蛋白酶;)， 在搅拌下继续酶水解1.5小时。最后加热升温至80"C，并恒温保持15分钟，就制备出酶水解 盐藻蛋白液。
② 离心分离
第(5)—①步完成后，将第(5;i —①步制备出的水解盐藻蛋白液泵入管式离心机中，以12000 转/分的速度，进行离心分离10分钟，分别收集沉淀和上层清液。对收集的沉淀，保留备用，
作制备微生物肥料的发酵基料。将收集的清液称重并置于脱色装置中，升温至8crc后，加入
其重量3%的木质活性炭，搅拌脱色10分钟。脱色完成后，弃活性炭，收集脱色液。将收集 的脱色液放入真空过滤器中进行真空抽滤，收集过滤液，然后将收集的过滤液泵入截留分子量为800Da的纳滤器中，在压力为0.1Mpa下，进行纳滤浓縮，直至纳滤截留液中的可溶性固 形物的质量浓度为10%为止，就制备出平均分子量为5KDa的水解盐藻肽截留浓缩液；收集 纳滤滤过液，并在爪力为0.3Mpa卞，进行反渗透浓缩，直罕反渗透浓縮液中的可溶件固形物 的质量浓度为10%为止，就制备出平均分子量为600Da的水解盐藻短肽浓縮液。
③ 制备水解盐藻短肽冻干粉
第(5)—②歩完成以后，将第(5)—②歩制备出的平均分子量为600Da的水解盐藻短肽浓縮液置 于低温冰箱中，预冻1小时，然后置于冷冻干燥机中，在压力为25Pa，温度为一5(TC条件下， 进行冷冻干燥24小时，就制备出总氮含量为12.5%、平均分于量为600Da的水解盐藻短肽 冻干粉，总收得率为脱/ 一胡萝卜素盐藻渣粉质量百分数的16%。
④ 制备水解盐藻肽冻干粉
第(5)—③歩完成后，将(5)—②歩制各.出的平均分子量为5KDa的水解盐藻肽截留浓縮液 置于低温冰箱中，预冻1小时，再置于冷冻干燥机中，在压力为25Pa、温度为一5(TC下，进 行冷冻十燥20小时，就制备出总氮量为12.0%的平均分子量为5KDa的水解盐藻肽冻干粉， 总收得率为脱;3 —胡萝卜素盐藻渣粉质量百分数的8%。
实施例2 '
一种从盐藻中制备水解低聚糖和短肽方法的具体步骤如下
(1) 对盐藻渣进行分离
同实施例l。其特征为盐藻渣粉的重量(克)去离子水的体积(升)比为1:8，超声波 处理45分钟，离心速度为12000转/分，离心时间为10分钟。
(2) 制备皮肤能量激活液
同实施例]。其特征为用氢氧化钾(KOH)溶液调节pH值为5.8，在温度为85'C、真空 度为0.07Mpa的条件下，进行真空浓縮至可溶性固形物浓度为11%，制备出K离子浓度为 50mg/mL、氨基酸浓度为22mg/mL及磷酸盐浓度为15mg/mL的皮肤能量^[活液，其收得率 为脱/6 —胡萝卜素盐藻渣粉质量百分数的10% 。
C3)对截留浓缩液进行分离 同实施例l。其特征为截留浓縮液:蒸馏水的体积比为1:8，用稀氢氧化钠(NaOH) 溶液调节其pH值为9.5，加热升温至85'C，保温提取8小时。提取完成后，降温至45°C， 离心速度为12000转/分，加入收集的下层沉淀8倍重量的、pH值为9.5的蒸馏水进行洗涤， 再以12000转/分的速度进行离心分离，如此重复洗涤和分离1次。
(4)制备水解盐藻低聚糖和多糖冻干粉 '
① 制备水解盐藻多糖溶液
同实施例l。其特征为用稀盐酸溶液调节pH值为5.5，加入脱除yS—胡萝卜素盐藻质 量百分数为3%的葡萄聚糖酶和2%的纤维素酶，在温度为55"C条件下，搅拌酶水解3.5小时。
② 超滤分离
同实施例l。其特征为在压力为0.2Mpa下进行超滤分离。同实施例l。其特征为浓缩至截留液中可溶性固形物的质量浓度为12%为止，将水解
盐藻低聚糖浓缩液在真空度为40Pa、温度为一55。C下进行真空干燥38小时，制备出的水解 盐藻低聚糖冻干粉的收得率为脱除一胡萝卜素盐藻渣粉质量百分数的6%。
制各水解盐藻多糖冻干粉
同实施例l。其特征为预冻2小时，在真空度为40Pa、温度为一55'C条件下进行冷冻 干燥26小时，制备出的水解盐藻多糖冻干粉的收得率为脱^ 一胡萝卜素盐藻渣粉质量百分数 的2.0%。
(5)制备水解盐藻短肽冻下粉
① 制备水解盐藻蛋白液
同实施例1。其特征为沉淀质量:纯净水体积比为1:6.5，用稀氢氧化钠(NaOH)溶液 调节pH值为8.5，升温至55'C后，加入沉淀质量百分数3.5%的碱性蛋白酶，保温搅拌酶水 解50分钟，再加入沉淀质量百分数1.5%的肽酶(如风味蛋白酶)，酶水解2.5小时，升温至 85"C并恒温保持18分钟。
② 离心分离
同实施例l。其特征为离心速度为13000转/分，离心分离15分钟，将收集的清液升温 至85'C后，加入其重量4X的木质活性炭，搅拌脱色15分钟，将收集的过滤液在压力为0.2Mpa 下进行纳滤浓缩，直至纳滤截留液中的可溶性固形物的质量浓度为13%为止，将收集的纳滤 滤过液在压力为0.5Mpa下进行反渗透浓縮，直至反渗透浓缩液中的可溶性固形物的质量浓度 为12.5 %为止。
③ 制备水解盐藻短肽冻干粉
同实施例l。其特征为预冻2小时，在压力为35Pa、温度为一55"C条件下冷冻千燥26 小时，制备出总氮含量为14%的水解盐藻短肽冻干粉，总收得率为脱y5—胡萝卜素盐藻渣粉 质量百分数的17%。
④ 制备水解盐藻肽冻干粉
同实施例1。其特征为预冻2小时，在压力为35Pa、温度为一55'C下冷冻十燥26小时， 制备出总氮量为13%的水解盐藻肽冻干粉，总收得率为脱^一胡萝卜素盐藻渣粉质量百分数 的10%。
实施例3
一种从盐藻中制备水解低聚糖和短肽方法的具体步骤如下-
(1) 对盐藻渣进行分离
同实施例l。其特征为盐藻渣粉的重量(克)去离子水的体积(升)比为1:10，超 声波处理60分钟，离心速度为13000转/分，离心时间为20分钟。
(2) 制备皮肤能量激活液
问实施例l。其特征为用氢氧化钾(KOH)溶液调节pH值为6.0，在温度为90'C、真空
15度为0.08Mpa的条件下，进行真空浓縮至可溶性固形物浓度为12%，制备出K离子浓度为 60mg/mL、氨基酸浓度为25mg/mL及磷酸盐浓度为16mg/mL的皮肤能量激活液，其收得率 为脱y6 —胡萝卜素盐藻渣粉质量百分数的12%。 C3)对截留浓缩液进行分离 同实施例l。其特征为截留浓缩液:蒸馏水的体积比为1:10，用稀氢氧化钠(NaOH) 溶液调节其pH值为10，加热升温至90。C，保温提取10小时，提取完成后降温至50。C，离 心速度为14000转/分，加入收集的下层沉淀10倍重量的、pH值为10的蒸馏水进行洗錄， 再以14000转/分的速度进行离心分离，如此重复洗涤和分离2次。
(4) 制备水解盐藻低聚糖和多糖冻干粉
① 制备水解盐藻多糖溶液
同实施例1。其特征为用稀盐酸溶液调节pH值为6，加入脱除;8—胡萝卜素盐藻质 量百分数为4%的葡萄聚糖酶和3%的纤维素酶，在温度为6(TC条件下，搅拌酶水解6小时。
② 超滤分离
同实施例l。其特征为在压力为0.25Mpa下进行超滤分离。
③ 制备水解盐藻低聚糖冻干粉
同实施例l。其特征为浓缩至截留液中可溶性固形物的质量浓度为15%为止，将水解 盐藻低聚糖浓縮液在真空度为60Pa、温度为一60'C下进行真空干燥40小时，制备出的水解 盐藻低聚糖冻干粉的收得率为脱除一胡萝卜素盐藻渣粉质量百分数的7%。
④ 制备水解盐藻多糖冻干粉
同实施例l。其特征为预冻3小时，在真空度为60Pa、温度为一6(TC条件下进行冷冻 干燥30小时，制备出的水解盐藻多糖冻千粉的收得率为脱/ 一胡萝卜素盐藻渣粉质量百分数 的2.5%。
(5) 制备水解盐藻短肽冻干粉
① 制备水解盐藻蛋白液
同实施例1。其特征为沉淀质量:纯净水体积比为1:8，用稀氢氧化钠(NaOH)溶液 调节pH值为'9，升溫节6(TC，加入沉淀质量百分数5%的胰蛋白酶，保温搅拌酶水解60分 钟，加入沉淀质量百分数2%的肽酶(如木瓜蛋白酶)，酶水解3.5小时，升温至90。C并恒温保 持20分钟。
② 离心分离
同实施例l。其特征为离心速度为14000转/分，离心分离20分钟，将收集的清液升温 至9CTC后，加入其重量5%的木质活性炭，搅拌脱色20分钟，将收集的过滤液在压力为0.3Mpa 下进行纳滤浓縮，直至纳滤截留液中的可溶性固形物的质量浓度为15%为止，将收集的纳滤 滤过液在压力为0.6Mpa下进行反渗透浓縮，直至反渗透浓縮液中的可溶性固形物的质量浓度 为15%为止。
③ 制备水解盐藻短肽冻干粉同实施例l。其特征为预冻3小时，在压力为50Pa、温度为一6(TC条件下冷冻干燥30 小时，制备出总氮含量为15%的水解盐藻短肽冻干粉，总收得率为脱j8—胡萝卜素盐藻渣粉 质量百分数的18%。
④制备水解盐藻肽冻干粉
同实施例l。其特征为将水解盐藻肽截留浓缩液预冻3小时，在压力为50Pa、温度为 一60'C下冷冻干燥24小时，制备出总氮量为14.5%的水解盐藻肽冻干粉，总收得率为脱^一 胡萝卜素盐藻渣粉质量百分数的12%。
权利要求
1. 一种从盐藻渣中制备水解低聚糖和短肽的方法，其特征在于具体的方法步骤如下(1)对盐藻渣进行分离以提取β—胡萝卜素的盐藻渣粉为原料，按盐藻渣粉的重量去离子水的体积比为1∶5～10的比例，先在容器中加入去离子水，再放入盐藻渣粉，搅拌至盐藻渣粉分散均匀后，接着用超声波处理30～60分钟，然后用10000～13000转/分的速度，离心5～20分钟，分别收集下层沉淀和上层清液，收集的上层清液用截留分子量为5KDa的超滤器进行超滤分离，再分别收集超滤滤过液和截留浓缩液；(2)制备皮肽能量激活液第(1)步完成后，将第(1)步收集的超滤滤过液置于真空浓缩器中，先用氢氧化钾溶液调节其pH值为5.5～6.0，后在温度为80～90℃、真空度为0.06～0.08Mpa的条件下，进行真空浓缩至可溶性固形物浓度为10～12％，就制备出K离子浓度为40～60mg/mL、氨基酸浓度为18～25mg/mL及磷酸盐浓度为13～16mg/mL的皮肤能量激活液；(3)对截留浓缩液进行分离第(2)步完成以后，对第(1)步收集的截留浓缩液，按截留浓缩液蒸馏水的体积比为1∶5～10的比例，先在截留浓缩液中加入蒸馏水并搅拌均匀后，再转移至提取罐中，用稀氢氧化钠溶液调节其pH值为9～10，加热升温至80～90℃，在搅拌下保温提取5～10小时，提取完成后，用换热器降温至40～50℃，再泵入管式离心机，以10000～14000转/分的速度，进行离心分离，分别收集下层沉淀和上层清液，将收集的下层沉淀称重，然后加入其5～10倍重量的、pH值为9～10的蒸馏水，进行洗涤，再以10000～14000转/分的速度进行离心分离，再分别收集下层沉淀和上层清液，如此重复洗涤和分离1～2次，最后，分别将各次收集的下层沉淀和上层清液合并；(4)制备水解盐藻低聚糖和多糖冻干粉①制备水解盐藻多糖溶液第(3)步完成以后，对第(3)步最后合并的各次上层清液，先用稀盐酸溶液调节其pH值为5～6，再加入脱除β—胡萝卜素盐藻质量百分数为2～4％的葡萄聚糖酶和1～3％的纤维素酶，在温度为50～60℃条件下，搅拌酶水解3～6小时；②超滤分离第(4)-①步完成以后，对第(4)-①步制备出的水解盐藻多糖溶液，用截留分子量为3KDa的超滤器，在压力为0.1～0.25Mpa下，进行超滤分离，分别收集超滤滤过液和超滤截留液；③制备水解盐藻低聚糖冻干粉第(4)-②步完成后，先将(4)-②步收集的分子量小于3KDa水解盐藻低聚糖过滤液，置于抽滤机中，用截留分了量为300Da的纳滤膜，进行浓缩，浓缩至截留液中可溶性固形物的质量浓度为10～15％为止，就制备出水解盐藻低聚糖浓缩液，然后，将水解盐藻低聚糖浓缩液置于冷冻干燥机中，在真空度为20～60Pa、温度为—50～—60℃下，进行真空干燥36～40小时，就制备出分子量小于3KDa的水解盐藻低聚糖冻干粉；④制备水解盐藻多糖冻干粉第(4)-②步完成后，先将第(4)-②步收集的分子量大于3KDa水解盐藻多糖截留液置于低温冰箱中，预冻1～3小时，然后在真空度为20～60Pa、温度为—50～—60℃条件下，进行冷冻干燥24～30小时，就制备出平均分子量为12KDa的水解盐藻多糖冻干粉；(5)制备水解盐藻短肽冻干粉①制备水解盐藻蛋白液第(4)步完成后，将第(3)步最后合并的下层沉淀，置于水解釜中，先按沉淀质量纯净水体积比为1∶5～8的比例，向水解釜中加入纯净水，再搅拌至沉淀均匀分散于纯净水中，接着用稀氢氧化钠溶液调节其pH值为8～9，再加热升温至50～60℃后，加入沉淀质量百分数为2％～5％的碱性蛋白酶或胰蛋白酶，保温搅拌酶水解40～60分钟后，再次加入沉淀质量百分数1～2％的肽酶，即风味蛋白酶或木瓜蛋白酶，在搅拌下继续酶水解1.5～3.5小时，最后加热升温至80～90℃，并恒温保持15～20分钟；②离心分离第(5)—①步完成后，将第(5)—①步制备出的水解盐藻蛋白液泵入管式离心机中，以12000～14000转/分的速度，进行离心分离10～20分钟，分别收集沉淀和上层清液，将收集的清液称重并置于脱色装置中，升温至80～90℃后，加入其重量3～5％的木质活性炭，搅拌脱色10～20分钟，脱色完成后，弃活性炭，收集脱色液，将收集的脱色液放入真空过滤器中进行真空抽滤，收集过滤液，然后将收集的过滤液泵入截留分子量为800Da的纳滤器中，在压力为0.1～0.3Mpa下，进行纳滤浓缩，直至纳滤截留液中的可溶性固形物的质量浓度为10～15％为止，就制备出平均分子量为5KDa的水解盐藻肽截留浓缩液；收集纳滤滤过液，并在压力为0.3～0.6Mpa下，进行反渗透浓缩，直至反渗透浓缩液中的可溶性固形物的质量浓度为10～15％为止，就制备出平均分子量为600Da的水解盐藻短肽浓缩液；③制备水解盐藻短肽冻干粉第(5)—②步完成以后，将第(5)—②步制备出的平均分子量为600Da的水解盐藻短肽浓缩液置于低温冰箱中，预冻1～3小时，然后置于冷冻干燥机中，在压力为25～50Pa、温度为—50～—60℃条件下，进行冷冻干燥24～30小时，就制备出总氮含量为12.5～15％、平均分子量为600Da的水解盐藻短肽冻干粉；④制备水解盐藻肽冻干粉第(5)—③步完成后，将(5)—②步制备出的平均分子量为5KDa的水解盐藻肽截留浓缩液置于低温冰箱中，预冻1～3小时，再置于冷冻干燥机中，在压力为25～50Pa、温度为—50～—60℃下，进行冷冻干燥20～24小时，就制备出总氮量为12.0～14.5％的平均分子量为5KDa的水解盐藻肽冻干粉。
2.按权利要求1所述的从盐藻渣中制备水解低聚糖和短肽的方法，其特征在于具体的方法步骤如下Cl)对盐藻渣进行分离同权利要求l，其特征为盐藻渣粉的重量去离子水的体积比为1:5，超声波处理30分 钟，离心速度为10000转/分，离心吋间为5分钟；(2) 制备皮肤能量激活液同权利要求l，其特征为用氢氧化钾溶液调节pH值为5.5，在温度为8(TC、真空度 为0.06Mpa的条件下，进行真空浓缩至可溶性固形物浓度为10%，制备出K离子浓度为 40mg/mL、氨基酸浓度为18mg/mL及磷酸盐浓度为13mg/mL的皮肤能量激活液；(3) 对截留浓縮液进行分离同权利要求l，其特征为截留浓縮液蒸馏水的体积比为1:5，用稀氢氧化钠溶液调节 其pH值为9，加热升温至8(TC，保温提取5小时，提取完成后，降温至4(TC，离心速度为 10000转/分，加入收集的下层沉淀5倍重量的、pH值为9的蒸馏水进行洗涤，再以10000转 /分的速度进行离心分离，如此重复洗涤和分离2次；(4) 制备水解盐藻低聚糖和多糖冻十粉① 制备水解盐藻多糖溶液 .同权利要求1，其特征为用稀盐酸溶液调节pH值为5，加入脱除P—胡萝卜素盐藻 质量百分数为2%的葡萄聚糖酶和1%的纤维素酶，在温度为50'C条件下，搅拌酶水解3小 时；② 超滤分离同权利要求l，其特征为在压力为0.1Mpa下进行超滤分离；③ 制备水解盐藻低聚糖冻干粉同权利耍求l，其特征为浓缩至截留液中可溶性固形物的质量浓度为10%为止，将水解盐藻低聚糖浓缩液在真空度为20Pa、温度为一5(TC下进行真空干燥36小时；④ 制备水解盐藻多糖冻干粉同权利要求l，其特征为预冻1小时，在真空度为20Pa、温度为一5(TC条件下进行冷 冻千燥24小时； '(5) 制备水解盐藻短肽冻干粉① 制备水解盐藻蛋白液同权利要求1，其特征为沉淀质量纯净水体积比为1:5，用稀氢氧化钠溶液调节pH 值为8，升温至50"C后，加入沉淀质量百分数2%的碱性蛋白酶，保温搅拌酶水解40分钟， 再加入沉淀质量百分数1%的肽酶，即风味蛋白酶，酶水解2.5小时，升温至80。C并恒温保 持15分钟；② 离心分离同权利要求l，其特征为离心速度为12000转/分，离心分离10分钟，将收集的清液升 温至8(TC后，加入其重量3%的木质活性炭，搅拌脱色IO分钟，将收集的过滤液在压力为、0.1Mpa下进行纳滤浓縮，直至纳滤截留液屮的可溶性固形物的质量浓度为10%为止，将收集 的纳滤滤过液在压力为0.3Mpa下进行反渗透浓縮，直至反渗透浓縮液中的可溶性固形物的质 量浓度为10%为止；③ 制备水解盐藻短肽冻干粉同权利要求l，其特征为预冻1小时，在压力为25Pa、温度为一50'C条件下冷冻干燥 24小时，制备出总氮含量为12.5%的水解盐藻短肽冻干粉；④ 制备水解盐藻肽冻干粉同权利要求1，其特征为预冻1小时，在压力为25Pa、温度为一5(TC卜'冷冻十燥20 小时，制备出总氮量为12.0%的水解盐藻肽冻干粉。
3.按权利要求1所述的从盐藻渣中制备水解低聚糖和短肽的方法，其特征在于具体的方 法歩骤如下(1)对盐藻渣进行分离同权利要求l，其特征为盐藻渣粉的重量去离子水的体积比为1:8，超声波处理45分 钟，离心速度为12000转/分，离心时间为10分钟； P)制备皮肤能量激活液同权利要求l，其特征为用氢氧化钟溶液调节pH值为5.8，在温度为85'C、真空度为 0.07Mpa的条件下，进行真空浓缩至可溶性固形物浓度为11%，制备出K离子浓度为 50mg/mL、氨基酸浓度为22mg/mL及磷酸盐浓度为15mg/mL的皮肤能量激活液；(3) 对截留浓缩液进行分离同权利要求1，其特征为截留浓缩液:蒸馏水的体积比为1:8，用稀氢氧化钠溶液调节 其pH值为9.5，加热升温至85'C，保温提取8小时，提取完成后，降温至45'C，离心速度 为12000转/分，加入收集的下层沉淀8倍重量的、pH值为9.5的蒸馏水进行洗涤，再以12000 转/分的速度进行离心分离，如此重复洗涤和分离1次；(4) 制备水解盐藻低聚糖和多糖冻干粉① 制备水解盐藻多糖溶液同权利要求l，其特征为用稀盐酸溶液调节pH值为5.5，加入脱除戶一胡萝卜素盐藻 质量百分数为3%的葡萄聚糖酶和2%的纤维素酶，在温度为55'C条件下，搅拌酶水解3.5小 时；② 超滤分离同权利要求l，其特征为在压力为0.2Mpa下进行超滤分离；③ 制备水解盐藻低聚糖冻干粉同权利要求l，其特征为浓縮至截留液中可溶性固形物的质量浓度为12%为止，将水 解盐藻低聚糖浓縮液在真空度为40Pa、温度为一55'C下进行真空干燥38小时； 制备水解盐藻多糖冻干粉同权利要求l，其特征为预冻2小时，在真空度为40Pa、温度为一55'C条件下进行冷 冻干燥26小时；(5)制备水解盐藻短肽冻干粉① 制备水解盐藻蛋白液同权利要求l，其特征为沉淀质量纯净水体积比为1:6.5，用稀氢氧化钠溶液调节pH 值为8.5，升温至55'C后，加入沉淀质量百分数3.5%的碱性蛋白酶，保温搅拌酶水解50分 钟，再加入沉淀质量百分数1.5%的肽酶，即风味蛋白酶，酶水解2.5小时，升温至85"C并恒 温保持18分钟；② 离心分离同权利要求l，其特征为离心速度为13000转/分，离心分离15分钟，将收集的清液升 温至85'C后，加入其重量4%的木质活性炭，搅拌脱色15分钟，将收集的过滤液在压力为 0.2Mpa下进行纳滤浓縮，直至纳滤截留液中的可溶性固形物的质量浓度为13%为止，将收集 的纳滤滤过液在压力为0.5Mpa下进行反渗透浓縮，直至反渗透浓縮液中的可溶性固形物的质 量浓度为12.5 %为止；③ 制备水解盐藻短肽冻丁粉同权利要求l，其特征为预冻2小时，在压力为35Pa、温度为一55'C条件下冷冻干燥 26小时，制备出总氮含量为14%的水解盐藻短肽冻干粉；④ 制备水解盐藻肽冻干粉同权利要求1，其特征为预冻2小时，在压力为35Pa、温度为一55t:下冷冻千燥26 小时，制备出总氮量为13%的水解盐藻肽冻干粉。
4.按权利要求1所述的从盐藻渣中制备水解低聚糖和短肽的方法，其特征在于具体的方 法歩骤如下(1) 对盐藻渣进行分离同权利要求l，其特征为盐藻渣粉的重量去离子水的体积比为1:10，超声波处理60 分钟，离心速度为13000转/分，离心时间为20分钟；(2) 制备皮肤能量激活液 ' 同权利要求l，其特征为用氢氧化钾溶液调节pH值为6.0，在温度为90"C、真空度为0.08Mpa的条件下，进行真空浓縮至可溶性固形物浓度为12%，制各出K离子浓度为 60mg/mL、氨基酸浓度为25mg/mL及磷酸盐浓度为16mg/mL的皮肤能量激活液；(3) 对截留浓縮液进行分离同权利要求l，其特征为截留浓缩液:蒸馏水的体积比为1:10，用稀氢氧化钠溶液调 节其pH值为10，加热升温至9(TC，保温提取10小吋，提取完成后降温至5(TC，离心速度 为14000转/分，加入收集的下层沉淀10倍重量的、pH值为10的蒸馏水进行洗涤，再以14000 转/分的速度进行离心分离，如此重复洗涤和分离2次；(4) 制备水解盐藻低聚糖和多糖冻干粉① 制备水解盐藻多糖溶液同权利要求1，其特征为用稀盐酸溶液调节pH值为6，加入脱除;8—胡萝卜素盐藻 质量百分数为4%的葡萄聚糖酶和3%的纤维素酶，在温度为6(TC条件下，搅拌酶水解6小 时；② 超滤分离同权利要求l，其特征为在压力为0.25Mpa下进行超滤分离；③ 制备水解盐藻低聚糖冻干粉同权利要求l，其特征为浓缩至截留液中可溶性固形物的质量浓度为15%为1匕将水解盐藻低聚糖浓縮液在真空度为60Pa、温度为一6(TC下进行真空干燥40小时； 制备水解盐藻多糖冻干粉同权利要求l，其特征为预冻3小时，在真空度为60Pa、温度为一60'C条件下进行冷 冻干燥30小时；(5) 制备水解盐藻短肽冻干粉① 制备水解盐藻蛋白液同权利要求1，其特征为沉淀质量纯净水体积比为1:8，用稀氢氧化钠溶液调节pH 值为9，升温至6(TC，加入沉淀质量百分数5%的胰蛋白酶，保温搅拌酶水解60分钟，加入 沉淀质量百分数2%的肽酶，即木瓜蛋白酶，酶水解3.5小时，升温至90"C并恒温保持20分 钟；② 离心分离同权利要求l，其特征为离心速度为14000转/分，离心分离20分钟，将收集的清液升 温至90'C后，加入其重量5%的木质活性炭，搅拌脱色20分钟，将收集的过滤液在压力为 0.3Mpa下进行纳滤浓缩，直至纳滤截留液中的可溶性固形物的质量浓度为15%为止，将收集 的纳滤滤过液在压力为0.6Mpa下进行反渗透浓縮，直至反渗透浓縮液中的可溶性固形物的质 量浓度为15%为止；③ 制备水解盐藻短肽冻十粉同权利要求l，其特征为预冻3小时，在压力为50Pa、温度为一6(TC条件下冷冻干燥 30小时，制备出总氮含量为15%的水解盐藻短肽冻干粉；④ 制备水解盐藻肽冻干粉同权利要求l，其特征为将水解盐藻肽截留浓縮液预冻3小时，在压力为50Pa、温度 为一60'C下冷冻干燥24小时，制备出总氮量为14.5%的水解盐藻肽冻干粉。
全文摘要
一种从盐藻渣中制备水解低聚糖和短肽的方法，属于盐藻利用技术领域。本发明以脱除β-胡萝卜素的盐藻渣为原料，先经多次分离及酶水解，后经浓缩、干燥，制得多种产品。本发明综合利用盐藻渣制得皮肤能量激活液、水解盐藻低聚糖和多糖及短肽等日化、医药、保健多种产品，且生产过程中产生的水解盐藻蛋白质沉淀残渣，都保留不弃，用作制备微生物肥料的发酵基料；且有生产工艺简单、能耗低、成本低，生产过程中无“三废”排放等特点。采用本发明方法制备出的产品，可广泛用于护肤、保湿、营养、抗氧化、抗衰老产品中，也可用于保健品、抗肿瘤的产品中，还可作为单细胞蛋白质食品补充氮素营养、抗辐射产品中。
文档编号C12P19/14GK101445819SQ20081023719
公开日2009年6月3日 申请日期2008年12月22日 优先权日2008年12月22日 公开号200810237196.0
发明者周小华, 廖妙飞, 苏霞利, 赵成霞, 挺 金, 林 陈, 魏顺安 申请人:重庆大学