促进细胞生长的制作方法

专利名称：促进细胞生长的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞培养技术领域。它涉及促进细胞生长的方法以及生产 型宿主细胞系的产生方法。本发明还涉及用所述方法所产生的细胞来制备 蛋白质的方法。
扭旦 《'7、
用于给人治疗的生物药的市场持续高速发展，有270种新的生物药正 在4妻受临床评估，估计销售额在2003会达到三百亿(Wemer 2004)。目前， 越来越多的生物药从哺乳动物细胞制备，因为这类细胞能正确加工并修饰 人的蛋白。因此，从哺乳动物细胞成功并高产量生产生物药成为关键，而 其取决于所用的重组单克隆细胞系的特性。
生物药制备方法中，产量取决于两项因素宿主细胞的比生产率(Pspec)
和在产生所需蛋白的时间段内活细胞的总数(IVC)。此关系用Y=Pspec*IVC 公式来表示。因此，提高产物产量的标准方法是提高宿主细胞的生产能力 或生物反应器中的活细胞密度。 一种获得较高IVC的方法是改进细胞的生 长特性，即产生生长较快且最大细胞密度较高的细胞。
促进细胞生长将深入影响生物药制备方法的多个方面
-细胞生产时间较短，使细胞系生长(cell line development)的时间较长；
-单细胞克隆后效率较高，之后生长较慢；
-按比例扩大规模所花时间较短，特别是接种大型生物反应器时； -单位发酵时间的产量较高，因为IVC与产量成比例。相反，IVC低
使产量较低和/或发酵时间较长。
二氢叶酸还原酶(DHFR)是核苷酸合成的关键酶之一 。它催化二氢叶酸
还原为四氢叶酸，后者是嘌呤结构单元合成及其他代谢途径中Cl单位的常
用传递物。
5在生物药产业及学术研究中，广泛用DHFR作为选4奪及扩增标记物， 来选择性培养稳定的转染细胞系。这样，DHFR的表达就与目的基因(GOI) (如产物基因的表达盒)的表达在功能上相连。因此，间接由于DHFR赋予的 抗性，可在选择条件下富集表达GOI的细胞。此功能性偶联通常通过使两 种基因呈双顺反子表达或至少使它们位于同一质粒上来介导/组成。
由于DHFR为非显性标记物，该系统主要用于缺乏内源性DHFR活性 的细胞。因此，当二十世纪八十年代得到dhfr阴性中国仓鼠卵巢(CHO)细胞 CHO-DG44和CHO-DUKX (B 11 )后，它们迅速成为宿主细胞系统的选择之 一，现如今它们已是全球生物药产业中最常用的哺乳动物生产平台。
DHFR酶是。票呤生物合成途径的关键酶之一。因此，缺乏DHFR的细 胞无活力，除非向培养基中加入核苷酸前体次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷 (HT),来补偿DHFR缺乏。
本发明意外发现，即使在补充了 HT的培养基中，dhfr缺乏型CHO细 胞也比亲代CHO野生型细胞的生长慢得多、密度也小很多(

图1)。
这种由本发明在dhfr阴性细胞(如CHO-DG44细胞)或dhfr内源水平很 低的细胞中发现的降低的生长能力，对生物药生产的多方面有不利影响
-细胞生产时间延长，使细胞系生长时间延长；
-单细胞克隆后效率较低，之后生长较慢；
-按比例扩大规模所花时间较长，特别是接种大型生产用发酵罐时； -每轮发酵的产量较低。
这些缺陷与用于生产的细胞(如CHO-DG44或DUKX(B11》的生长特性 直接有关。它们出现在，例如，当这些细胞与下列选择和扩增系统联用时 谷氨酰胺合成酶(GS)系统、新霉素、嘌呤霉素、博来霉素(bleomycin)等。
为补偿细胞特别是产生生物药的细胞系的生长缺陷，大多数努力都是 通过加入生长添加剂如碳水化合物、核芬、微量元素、蛋白水解物、植物 提取物等等来改良培养基。例如，通过向培养基加入蛋白质水解物可以稍 微提高dhfr阴性细胞的生长，但仍不能达到野生型细胞的生长水平。
由此，现在很需要提高生产型宿主细胞，特别是那些DHFR内源性表 达低或无的细胞如CHO-DG44的生长特性。另外，在需要高生物量的场合， 在发酵期间促进细胞生长并因此获得较高IVC是有好处的，例如，这样能 在短期发酵中获得高产，可以收获大量细胞用于分离、纯化或鉴定胞内成
6分或与细胞结合的成分，或者可以缩短用于产生细胞系、克隆单细胞及按 比例扩大培养所花的时间。
发明概述
本发明的总目的是，在生物药生产过程中促进细胞生长，从而提高细 胞密度及产量。
这一目的在本发明中通过将DHFR表达盒引入生产所用细胞来实现。 本发明因此意外发现，异源表达二氢叶酸还原酶(DHFR)可提高细胞生长。
本发明中，DHFR基因并不象往常一样用作另一个基因-目的基因 (GOI)的选择标记物，而是独立地起促进细胞生长的作用。此模式中，DHFR 基因不与一个或多个其它表达盒在功能上连锁/偶联。因此，它可与GOI在 同一质粒中或它可从另一个载体表达。如果两种基因位于不同的载体构建 物中，这些质粒可以共转染细胞或分先后引入细胞。
本发明首次意外发现，缺乏dhfr会降低细胞生长。还发现，再引入DHFR 可解决这个问题。
再引入DHFR转基因不仅使倍增时间缩短，而且会使IVC增加到野生 型水平或更高(图1)。不仅在两种不同的DG44细胞系中，而且在用功能性 DHFR基因转染的CHODUKXB11细胞中，都观察到了促进生长的效果。 然而，用含噤呤霉素或新霉素抗性盒的表达构建体转染，不会使细胞生长 特性发生改变。这表明，生长促进作用不归因于选择和/或培养稳定转染体， 而是因功能性DHFR表达在dhfr阴性CHO细胞中重建所致。
此外，DHFR的异源表达显示出基因剂量效应，这意味着稳定细胞亚 克隆的生长特性相对于活性DHFR蛋白的表达呈比例增力口(图2a，b)。
值得注意的是，此效应似乎不适于通过MTX处理而扩增了 DHFR基因 的那些细胞系(Gu W a/, 1992， Pendse " a/， 1992)。这可能是因为活性DHFR 水平达到阈值后不再有促进生长的作用，或者是因为抑制物MTX的补偿效 应，当MTX的浓度超过DHFR酶的分子浓度时，这种补偿效应将超过d/z/r 基因扩增的影响，导致DHFR活性下降，并因此使细胞生长下降。
本发明涉及促进细胞系，特别是内源性DHFR表达低或无的生产用细 胞系的生长的普遍问题。在这些细胞中，通过DHFR的异源表达能显著改 进生长特性。DHFR在缺乏dhfr的宿主细胞中异源表达还有其它好处，使发酵过程 中的扩增时间及接种时间缩短，使IVC如生产过程中的IVC提高，以及使
产量提高。
本发明的宿主细胞和方法还可用于产生生物药，特别是当使用基于 CHO-DG44或CHO-DUKX-B11的宿主细胞系统时。另外，它们可用于任何 希望高产重组蛋白以便例如纯化/在科研中分析结构的场合，或用于需要大 量细胞以便例如分离/研究细胞组分如核酸或蛋白质的场合。
在本发明优选实施方案中，本发明的宿主细胞和方法可与谷氨酰胺合 酶(GS-)系统、腺苦脱氨酶(ADA)、胞苷脱氨酶(CDA)、嘌呤霉素、新霉素、 博来霉素等等选择系统组合。这可使发酵过程中的生长速度更快并使细胞 密度更高。
本发明相对于现有技术不是显而易见的。
为了研究体细胞遗传，在1957年建立了 CHO细胞(PUCK, 1957)。通 过诱变原始的Kl细胞系，Urlaub und Chasin开发了缺乏DHFR的"CHO DG44，，细胞(Urlaub and Chasin， 1980),研究表明，该细胞染色体上的一斤基 因座发生纯合缺失(Urlaub et al., 1983)。这几位研究者没有研究这种新建立 的细胞系的生长性质。
CHO DG44细胞很快成为转染的选择方法之一，其利用携带功能性 基因及目的基因(GOI)表达盒的表达载体。DHFR为非显性选择标记 物，因此^艮适于缺乏DHFR的细胞。然而，它也适于有内源性DHFR活性 的宿主细胞，如通过用第二种显性标记物进行选择(Kaufman et al., 1986)或 用突变的或细菌的d/ /^基因进4亍选才奪(Simonsen and Levinson， 1983; Asselbergs and Widmer， 1995)。
在选择条件下，异源DHFR表达使转染细胞存活并增殖。但未有人披 露，DHFR除了作为选择标记物，还可在非选择条件下提供生长优势。
W/r基因属于扩增标记物，允许叶酸类似物氨曱蝶呤(MTX)处理后外源 基因一起扩增(Schimke"a/., 1978; Alt " a/.' 1978; Pallavicini " a/.' 19卯)。有 确凿的证据表明，GOI与—起扩增不要求这两个基因位于同一质粒中 (Kaufman and Sharp, 1982)。因此，产生重组抗体的表达策略，在一些报道 中是4吏两条抗体链与d/ /^基因位于同一 DNA质粒中(Page and Sydenham,
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1991) ,但只有一条链与^斤表达盒功能性偶联(Fouserd"/,， 1992)，在另一 些报道中是将在共整合的另 一质粒中编码(Wurm and Jordan, 2003)。
一些报道指出，基因与GOI在同一 DNA质粒上结构相连并不是共 扩增的前提，因为不同的共转染的DNA构建体都倾向于共整合到相邻的染 色体座位上(Wurm,F.M. and Jordan,M. 2003. Gene Transfer and Gene Amplification in Mammalian Cells. In: Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, ed. S.C.Makrides Elsevier Science B.V.， 309-335)。重要且值 得注意的是，同样是在该模式中，DHFR起外源GOI的选择标记物和/或扩 增标记物的作用，它们不管是不是在结构上相连都构成功能上的联系。
相反，本发明是基于发现异源DHFR除了用作GOI的选择/扩增标记物 的公知作用外，还显示出促进细胞生长的完全独立的功能。
有趣的是，有若干报道认为，高DHFR表达与细胞生长下降有关，从 而削弱了异源基因扩增的有益效果。之前用大肠杆菌(^yc/7en'c/z/a co")和酿 酒酵母(&cc/Mramyc^ cwev/Wae)作研究发现，随着W/r基因拷贝数的扩增， 比生长速率下降。(Bailey rfa/， 1986)。 Guetal.发现，在通过MTX处理扩增 dhfr基因后，表达p-半乳糖苷酶的CHO-DG44细胞生长速率下降(Gu " a/,
1992) 。Pendse et al.使用与DHFR偶联的病毒转基因，报道了类似数据(Pendse Wa/, 1992)。很明显，这两项研究都没有包括仅表达DHFR的细胞，因此无 法得出所用的多个转基因各自的作用。重要的是，它们只比较了表达dhfr 的扩增及非扩增细胞的生长特性，而没有包括未转染的CHO-DG44细胞。 Snapka et al.发现，在NIH3T:3-衍生细胞中，随^斤基因拷贝数增加，细胞 生长下降(Snapka"a/， 1997)。有趣的是与提示的机制相背离，他们还发现 在MTX介导的函/r扩增后，另一粘附细胞系生长到较高细胞密度。他们将 此效应归因于接触抑制下降，而这与悬浮生长的细胞是无关的。
总而言之，本发明首次证明，DHFR异源表达导致改进CHO细胞，尤 其是CHODG44和CHODUXX-(Bll)细胞的生长特性。DHFR的此种作用 也可用于加快其它阴性或减少的细胞系的细胞生长速度。
附图简述
图1:通过异源DHFR而改进的生长
9(a) 补料分批方法的细胞生长曲线。在摇瓶中培养细胞5天，从第3天 开始每24小时补料一次。每天用CEDEX系统进行活细胞计数(VCC)。比 较下列细胞野生型(WT)CHO细胞O-; n=4); dhfr阴性DUX-Bll(-A-; n=2) 和来自不同来源的两种DG44细胞系(-國-；n=4);用含新霉素抗性基因(11=6, 数据未显示)、噪呤霉素抗性基因(n二6，数据未显示)或dhfr基因(-夸-,n=9) 的载体稳定转染的DG44细胞群体。图中显示了从5个独立试验得出的代表 性生长曲线。
(b) 如(a)所示细胞的相对IVC。 WT水平设为100%，计算第5天的整 合细胞面积并绘图。误差条代表了至少3个独立试验的标准差。
(c) 长期培养过程中的生长特性。将细胞保持在0.3-2.5 E06细胞/ml的 密度，每2-3天分裂(split)—次，共8代。计算野生型CHO、 DG44和dhfr 转染的DG44细胞的生长速率(黑条)和倍增时间(阴影条)并绘图。
图2:剂量依赖性生长增强效应
(a) DHFR转染的亚克隆中细胞生长增强。通过在CHO DG44细胞中引 入异源DHFR表达盒，制备6个稳定的DHFR转染的细胞群体。通过基于 FACS的单细胞克隆，从这些细胞群体获得克隆化的细胞群体，并进行补料 分批发酵。设定亲代DG44细胞系的IVC为1,计算DHFR克隆在第6天 的IVC并绘图。
(b) DHFR相对表达。从上述细胞分离总RNA，并进行定量实时PCR， 以测定DHFR特异性mRNA转录物。用^-微管蛋白进行标准化
发明内容
定义
"包含，，或"含有"包括"由…组成"。而且单、复数形式使用时不表示限制。 本发明所用的术语有如下含义。
术语"DHFR缺乏，，意义与"DHFR阴性"相同。此术语描述了不具有表达 DHFR酶的功能的细胞。这可能由于DHFR基因的纯合缺失或突变造成。 术语"DHFR减少，，指内源性DHFR水平低的细胞，如DHFR基因杂合
的细胞。术语"一段时间内的活细胞总浓度，，(IVC)指， 一段时间内作图得出的细 胞生长曲线的曲线下面积，它是常用于描述例如数天乃至数周的生产过程 中细胞生长的表现的参数。
术语"细胞培养物，，指培养在一个容器中处于适合细胞生长条件下的多 个细月包。
本发明所指的"宿主细胞"是细胞，如仓鼠细胞，优选BHK21，BHKTKf, CHO， CHO腳Kl, CHO-DUKX, CHO画DUKX Bl,及CHO-DG44细胞，或任一 种所述细胞系的衍生细胞或后代。特别优选的是CHO-DG44, CHO-DUKX， CHO-K1及BHK21,甚至更优选CHO-DG44及CHO-DUKX细胞。在本发
明的另一个实施方案中，宿主细胞也指鼠骨髓瘤细胞，优选NS0和Sp2/0 细胞或任一种所述细胞系的衍生细胞或后代。本发明中可用的鼠和仓鼠细 胞的汇总见表l。然而，这些细胞的衍生细胞或后代，其它哺乳动物细胞， 包括但不限于人、小鼠、大鼠、猴和啮齿动物的细胞系，或真核细胞，包 括但不限于酵母、昆虫和植物细胞，也可用于本发明，特别是用于产生生 物药蛋白质。
表l:生产用的仓鼠和鼠细胞系
细胞系序号
NS0ECACC No. 85110503
Sp2/0-Ag14ATCC CRL-1581
BHK21ATCC CCL-10
BHK TK-ECACC No. 85011423
HaKATCC CCL-15
2254-62.2 (BHK-21衍生细胞)ATCC CRL-8544
CHOECACC No. 8505302
CHO-K]ATCC CCL-61
CHO-DUKX(= CHO duk—, CHO/dhfr—)ATCC CRL-卿6
CHO-DUKX BllATCC CRL-9010
CHO-DG44Urlaub et al., Cell 33[2], 405-412, 1983
CHO Pro-5ATCC CRL-1781
V79ATCC CCC-93
B14AF28-G3ATCC CCL-14
CHLECACC No. 87111906
11宿主细胞最优选是在无血清条件下，任选在无任何动物源性蛋白质/肽
的培养基中，建立、适应、以及充分培养的细胞。可商购的培养基如Ham's F12 (Sigma, Deisenhofen, Germany), RPMI-1640 (Sigma), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Sigma), Minimal Essential Medium (MEM; Sigma), Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM; Sigma)， CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA), CHO-S-Invtirogen),无血清CHO培养基(Sigma)，及无蛋白质 的CHO培养基(Sigma)是合适的营养方案的例子。必要时，这些培养基的任 一种都可以补充多种化合物，例如激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁 蛋白、表皮生长因子、胰岛素样生长因子)，盐(如氯化钠、4丐盐、镁盐、磷 酸盐)，緩冲液(如HEPES),核苷(如腺苷，胸苷)，谷氨酰胺、葡萄糖或其它 等效能源、抗生素、微量元素。可以本领域技术人员已知的合适浓度加入 任何其它必需的补充物。本发明中，优选^f吏用无血清培养基，但补充了适 量血清的培养基也可用于培养宿主细胞。为了培养并选择经过遗传修饰而 表达选择基因的细胞，可将合适的选择剂加入培养基中。
术语"蛋白质，，与氨基酸残基序列或多肽可互换使用，并指任何长度的 氨基酸聚合物。这些术语也包括通过反应进行了翻译后修饰的蛋白质，所 述反应包括但不限于糖基化、乙酰基化、磷酸化或蛋白质加工。可在多肽 结构中进行修饰和改变，例如与其它蛋白质融合，氨基酸序列替换、缺失 或插入，但使分子仍保持其生物功能活性。例如，可在多肽或其核酸编码 序列中进行某些氨基酸序列替换，并获得具有类似性质的蛋白质。
含有编码目的蛋白的目的基因的表达载体也可含有选择性扩增标记基因。
术语"选择条件，，指不含相应选择标记物的细胞不能生长或存活的条 件。选择条件的产生可以通过使用含添加物如抗生素或缺少生长必需组分 的培养基。
术语"选择标记物"或"选择性标记物"指允许细胞在选择条件下生长/存 活的标记物。在选择标记物为噤呤霉素N-乙酰基转移酶(PAC)的例子中，只 有含PAC基因的细胞会在含抗生素嘌呤霉素的选择培养基中存活。
术语"可扩增标记物"或"扩增标记物"是指，在有选4奪剂、或用该选4奪剂 (如氨曱蝶呤(MTX))处理后，使标记物(如DHFR)及周围DNA区域的基因拷 贝数增加，从而被扩增(如两倍、三倍、多倍扩增)的基因。"选择性扩增标记基因"常编码真核细胞在这些条件生长所需的酶。例
如，所述选择性扩增标记基因可编码DHFR，当用该基因转染的宿主细胞在 选择剂氨曱蝶呤(MTX)存在时生长，该基因扩增。不限于表3的选择性基因 的例子也是可扩增标记基因，它们可用于实现本发明。列于表3的选择性 扩增标记基因的综述见Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-566 (1990),在此引入本文作为参考。因此，本发明范围内包括用本文所述任何 方法遗传修饰的宿主细胞，其中选择性扩增标记基因编码具有如下酶功能 的多肽二氢叶酸还原酶(DHFR)、谷氨酰胺合成酶、CAD、腺苷脱氨酶、 腺苷酸脱氨酶、UMP合成酶、IMP5'-脱氢酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移 酶、HGPRTase、胸香激酶、胸芬酸合成酶、P糖蛋白170、核糖核苷酸还原 酶、天冬酰胺合成酶、精氨基琥珀酸合成酶、鸟氨酸脱羧酶、HMGCoA还 原酶、乙酰氨基葡糖转移酶(glucosaminyl transferase)、苏氨酰基-tRNA合成 酶或Na+K+-ATPase。
优选的选择性扩增标记基因是编码二氬叶酸还原酶(DHFR)的基因，它 是生物合成噤呤所必需的。缺乏DHFR基因的细胞不会在缺乏嘌呤的培养 基中生长。因此，DHFR基因可用作显性选择标记来选择并扩增在缺乏嘌呤 的培养基中生长的这些细胞中的基因。与DHFR基因联用的选择剂是氨曱 蝶呤(MTX)。
术语"DHFR基因，，或"^7/r"指任何编码二氢叶酸还原酶活性蛋白质的核 酸。其包括含一或多个内含子的基因组DHFR序列、cDNA序列或所谓的"微 基因(minigene)"，包含DHFR调控序列及编码序列，有或无内含子。
表3:选择性扩增标记基因
选择性扩增标记基因登录号选择剂
二氢叶酸还原酶Ml9869 (仓鼠) E00236 (小鼠)氨曱蝶呤(MTX)
金属碌L蛋白D10551 (仓鼠) Ml3003 (人) M1I794 (大鼠)
CAD (氨甲酰基-磷酸合成酶M23652 (仓鼠)N-磷酸乙酰基-L-天冬氨酸
天冬氨酸转氨曱酰基二氢乳D78586 (人)
清酸酶)
腺苷脱氨酶K02567 (人)Xyl-A-或腺苷、2'脱氧柯福霉素
M10319 (小鼠)(2 'deoxycoformycin)
13AMP (腺普酸)脱氨酶D12775(人) J02811 (大鼠)腺嘌呤、重氮丝氨酸(azaserine)、柯 福審素
UMP合成酶J03626 (人)6-氮尿苷、吡唑呋喃菌素 (pymzofliran)
IMP 5'脱氢酶J04209 (仓鼠) J04208 (人) M33934 (小鼠)霉酚酸
黄噪呤鸟噤呤磷酸核糖转移酶X0022](大肠杆菌)霉盼酸及有限的黄嘌呤
突变的HGPRTase或 突变的胸香激酶J00060 (仓鼠) Ml3542, K0258(人) J00423, M68489(小鼠) M63983 (大鼠) M36160 (疱渗病毒)次黄。票呤、氨基蝶呤与胸苷(HAT)
胸芬酸合成酶D00596 (人) M13019(小鼠) L12138(大鼠)5氟尿嘧啶脱氧核苷
P糖蛋白]70(MDR1)AF06535 (人) J03398 (小鼠)多重药物，如阿霉素(adriamycin)、 长春if斤A威(vincristine)、 -大水仙素 (colchicine)
核糖核普酸还原酶M124223, K02927 (小鼠)阿非迪霉素(Aphidicolin)
谷氨酰胺合成酶AF150961 (仓鼠) U09114, M60803 (小鼠) M29579(大鼠)蛋氨酸亚氨基代砜(Methionine sulfoximine, MSX)
天冬酰胺合成酶M27838 (仓鼠) M27396 (人) U38940 (小鼠) U07202 (大鼠)p-天冬氨酰异羟肟酸、合欢氨酸 (Albizziin)、 5'氮杂胞苦
精氨基琥珀酸合成酶X0630(人) M31690(小鼠) M26198 (牛)刀豆氨酸(Canavanine)
鸟氨酸脱羧酶M3415S(人) J03733 (小鼠) M16982(大鼠)a-二氟甲基鸟氨酸 (a-Difluoromethylomithine)
HMG-CoA还原酶L00183, M12705 (仓鼠) M11058 (人;i康帕丁(Compactin)
乙酰氨基葡糖转移酶M 5 5621 (人)衣霉素(Tunicamycin)
苏氨酰基-tRNA合成酶M63) 80 (人)疏螺旋体素(Borrelidin)
Na'K'-ATPaseJ05096 (人) JVH45U (大鼠)毒毛旋花戒(Ouabain)
14适于用编码DHFR的基因作为选择性可扩增标记物的合适宿主细胞是 哺乳动物细胞，优选鼠骨髓瘤或仓鼠细胞。更优选缺乏DHFR活性的 CHO-DUKX (ATCC CRL-9096)及CHO-DG44 (Urlaub et al., Cell 33[2], 405 — 412, 1983)细胞。为了将DHFR扩增方法扩展到其它细胞种类，编码氨曱蝶 呤敏感性降低的蛋白质的DHFR突变基因可与含正常数量的内源性野生型 DHFR基因的宿主细胞联用(Simonsonet al., 1983; Wigler et al., 1980; Haberet al., 1982)。
本发明适于产生用于生成生物药多肽/蛋白质的宿主细胞。本发明特别 适合由生产力强的细胞高产表达多种不同目的基因。
"目的基因"(GOI)、"选定序列"、或"产物基因"在本文有相同含义，它 们指编码目的产物或"目的蛋白"或术语"所需产物"的任何长度的多核苷酸 序列。选定序列可以是全长或截短的基因、融合或标记的基因，还可能是 cDNA、基因组DNA或DNA片段，优选是cDNA。它可以是天然序列，即 天然存在形式的，或可以是根据需要突变的或修饰的。这些修饰包括使密 码子的使用在选定的宿主细胞中最优化的密码子最优化、人源化或标记。 选定序列可编码分泌的、胞质的、核的、膜结合的或细胞表面的多肽。
"目的蛋白"包括蛋白质、多肽、其片段、肽，它们都能在选定的宿主 细胞中表达。所需蛋白质可以是，例如抗体、酶、细胞因子、淋巴因子、 粘附分子、受体，及它们的衍生物或片段，以及任何其它可用作激动剂或 拮抗剂和/或具有治疗或诊断用途的多肽。下文也给出所需蛋白质/多肽的例 子。
在更复杂分子如单克隆抗体的情况中，GOI编码两条抗体链或之一。 "目的产物"也可以是反义RNA。
如上已提到了目的蛋白或所需蛋白质。特别是，所需蛋白质/多肽或目 的蛋白例如是，但不限于胰岛素、胰岛素样生长因子、hGH、 tPA、细胞因 子，如白介素(IL)如IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6， IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18，干扰素(IFN)-a、 IFN-(3、 IFN-y、 IFN-co或IFN-t、肺瘤坏死因子(TNF),如TNF-a和TNF-卩、TNP-y、 TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1和VEGF。其中也包括促红细胞生 成素或任何其它激素生长因子的制备。本发明的方法也可优先用于制备抗体或其片段。这些片段包括例如Fab片段(抗原结合片段二Fab)。 Fab片段由 两条链的可变区组成，这两条链则通过相邻的恒定区维持在一起。它们可 以用蛋白酶(如木瓜蛋白酶)消化常规抗体而形成，而相似的Fab片段也可用 遗传工程来制备。其它抗体片段，包括F(ab'》片段，可通过蛋白水解用胃 蛋白酶剪切来制备。
优选从培养基回收呈分泌多肽形式的目的蛋白，或者如果表达的目的 蛋白无分泌信号，可从宿主细胞裂解物回收它。必须从其它重组蛋白质及 宿主细胞蛋白质纯化目的蛋白，从而获得基本均质的目的蛋白制备物。第 一步，从培养基或裂解物中去除细胞和/或颗粒细胞碎片。之后从污染的可 溶蛋白质、多肽及核酸纯化目的产物，例如，通过在免疫亲和柱或离子交 换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、琼脂糖(Sephadex)层析、在二氧 化硅或阳离子交换树脂如DEAE上层析。通常，教导一般技术人员纯化宿 主细胞异源表达的蛋白质的方法是本领域公知的。例如，这些方法描述于 Harris and Angal, Protein Purification Methods, in Rickwood and Hames eds., The Practical Approach Series, IRL Press (1995)或Robert Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag (1988)中，它们都引入本文作为参考。
使用遗传工程方法，可以制备仅由重链可变区(VH)及轻链可变区(VL) 组成的缩短的抗体片段。它们被称为Fv片段(Fv二可变部分的片段)。因为这 些Fv片段缺乏两条链的恒定区的半胱氨酸所构成的链间共价^建，所以Fv 片段常需稳定化。可将重链可变区与轻链可变区通过短肽片段容易地连接， 所述短肽片段如由10-30个氨基酸，优选15个氨基酸组成。用这种方式， 可获得由VH和VL组成的、由肽接头连接的单条肽链。此类抗体蛋白质已 知为单链Fv(scFv)。现有技术已知的此类scFv抗体蛋白质的例子，见Huston et al. (1988, PNAS 16: 5879-5883)的描述。
近年来，已经开发了多种策略来制备多聚衍生物形式的scFv。这是为 了 ，特别为了得到药物动力学及生物分布性质提高并且结合亲和力提高的 重组抗体。为了实现scFv的多聚化，制备具有多聚化结构域的融合蛋白形 式的scFv。所述多聚化结构域可以是，例如IgG的CH3区或巻曲螺旋结构 (螺旋结构)，如亮氨酸拉链结构域。然而，也有一些策略利用scFv的VH/VL 区之间相互作用实现多聚化(如二价体(diabody)、三价体(tribody)、和五价体 (pentabody))。 二价体在本领域指scFv的二价、同二聚体形式的衍生物。将
16scFv分子中的接头缩短为5-10个氨基酸会使形成的同二聚体出现链间 VH/VL-重叠(superimposition)。还可通过掺入二硫键使二价体稳定化。对现 有才支术中的二价体-抗体蛋白质的描述可见于Perisic et al. (1994, Structure 2: 1217-1226)。
对于本领域技术人员，微型抗体指二价的同二聚体形式的scFv衍生物。 它由融合蛋白组成，其包含免疫球蛋白优选IgG最优选IgGl的CH3区作 为二聚化区，该二聚化区经铰链区(如也来自IgGl)及接头区与scFv相连。 对现有技术中的微型抗体-抗体蛋白质的描述可见于Hu et al. (1996, Cancer Res. 56: 3055-61)。
对于本领域技术人员，三价体指三价的同三聚体形式的scFv衍生物 (Kortt et al. 1997 Protein Engineering 10: 423-433)。 VH-VL直接融合而不需接 头序列的ScFv衍生物会形成三聚体。
本领域技术人员会熟悉所谓的具有二价、三价或四价结构并衍生自 scFv的微型抗体。多聚体化由二聚体化、三聚体化或四聚体化的巻曲螺旋 结构来实现(Pack et al., 1993 Biotechnology ll:， 1271-1277; Lovejoy et al. 1993 Science 259: 1288-1293; Pack et al.， 1995 J. Mol. Biol. 246: 28-34)。
引入宿主细胞的任何序列或基因，即使它们与宿主细胞中的内源性序 列或基因相同，相对宿主细胞也都被定义为"异源序列"或"异源基因"或"转 基因"。
异源基因序列可用"表达载体"，优选真核的，甚至更优选哺乳动物的表 达载体引入靶细胞。用于构建载体的方法对于本领域技术人员是公知的， 并描述在多份出版物中。在构建合适载体的特定技术中，包括对于功能组 分如启动子、增强子、终止子及多腺苷酸化信号、选择性标记物、复制起 点及剪接信号的描述，都相当详尽地综述于Sambrook et al., 1989及其中所 引用的参考文献中。载体可包括但不限于质粒载体、噬菌粒、粘粒、人工/ 微型染色体、或病毒载体如杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、 单纯疱渗病毒、逆转录病毒(retrovimses)、细菌p藍菌体。真核表达载体通常 也包含利于载体在细菌中繁殖的原核序列，如复制起点，及用于在细菌中 进行选择的抗生素抗性基因。多种真核表达载体中包含了可操作地连接了 多核苷酸的克隆位点，这些表达载体是本领域公知的， 一些可从Stratagene,La Jolla, CA; Invitrogen, Carlsbad, CA; Promega, Madison, WI 或 BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA等公司购买到。
优选实施方案中，表达载体包含至少一个核酸序列，该序列为转录和 翻译编码目的肽/多肽/蛋白质的核苷酸序列必需的调控序列。
本文所用的术语"表达"指宿主细胞内异源核酸序列的转录和/或翻译。 对宿主细胞中所需产物/目的蛋白的表达水平的测定，可基于细胞中存在的 相应mRNA的量，或基于本发明实施例中选定序列所编码的所需多肽/目的 蛋白的量。例如，从选定序列转录的mRNA可用Northern印迹杂交、核糖 核酸酶RNA保护、与细胞RNA原位杂交或PCR来定量(参见Sambrook et al.， 1989; Ausubel et al., 1987更新)。选定序列所编码的蛋白质可用多种方法定 量，所述方法如ELISA、 Western印迹、放射免疫测定、免疫沉淀、对蛋白 质生物活性的测定、免疫染色蛋白质然后是FACS分析(参见Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1987更新)、或均相时间分辨焚光(HTRF)。
用多核苦酸或表达载体"转染"真核宿主细胞，得到遗传修饰的细胞或转 基因细胞，这可用本领域公知的任何方法实现，对其的描述见于，例如 Sambrook et al.， 1989或Ausubel et al., 1987 (updated)。转染方法包4舌^旦不限 于脂质体-介导的转染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、多聚阳离子(如DEAE-葡聚 糖)-介导的转染、原生质体融合、病毒感染及显微注射。优选地，该转染是 稳定转染。在特定宿主细胞系及类型中，异源基因转染效率及表达最佳的 转染方法是优选的。可用常规步骤确定合适的方法。为了使转染稳定，构 建体可整合到宿主细胞的基因组或人工染色体/微型染色体中，或可处于游 离位置，从而能稳定地保持在宿主细胞中。
除非特别指出，实施本发明会用到本领域技术人员掌握的常用细胞生
物学、分子生物学、细胞培养、免疫学等等技术。这些技术在现有文献中 已经完全乂〉开。参见例^口 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1987， updated); Brown ed., Essential Molecular Biology, IRL Press (1991); Goeddel ed., Gene Expression Technology, Academic Press (1991); Both well et al. eds., Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes， Bartlett Publ. (1990); Wu et al., eds.， Recombinant DNA Methodology, Academic Press (1989); Kriegler， Gene
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本发明涉及促进细胞系细胞生长的方法，其特征在于所述细胞系的 DHFR活性增加。
本发明的优选实施方案中，所述方法的特征在于所述细胞系是DHFR 缺乏的或DHFR减少的细胞系。
本发明进一步的实施方案中，所述方法的特征在于将编码DHFR的基 因与编码所需产物的目的基因(GOI)先后引入所述细胞系。
本发明的另一个实施方案中，所述方法的特征在于DHFR表达盒是唯 一在所述先后引入步骤中引入所述细胞系的哺乳动物表达单位。
本发明的另一个特定实施方案中，所述方法的特征在于在无氨曱蝶呤 (MTX)时选择编码所需产物的目的基因。
本发明进一步的实施方案中，所述方法的特征在于DHFR的基因剂量 增力口。
本发明进一步的特定实施方案中，所述方法的特征在于所述细胞系的 细胞包含至少l个，优选至少3个拷贝的DHFR基因。
本发明进一步的特定实施方案中，所述方法的特征在于所述细胞系的 细胞包含至少5个、至少IO个或至少25个拷贝的DHFR基因。
本发明另一个的特定实施方案中，所述方法的特征在于DHFR的表达 ' 水平增力口。本发明进一步的实施方案中，所述方法的特征在于DHFR的表达水平 增加至少2倍。
本发明进一步的实施方案中，所述方法的特征在于DHFR的表达水平 增加至少3 4咅，4倍，5^f咅，64咅，7倍，8倍，9倍，10倍，15倍或20倍。
本发明的特定实施方案中，所述方法的特征在于由于引入与所述细胞 系不同物种的异源DHFR基因、DHFR微型基因、DHFR突变体或DHFR 编码序列而使DHFR活性增加。
本发明进一步的实施方案中，所述方法的特征在于所述细胞系已经转 染了目的基因(GOI)。
本发明进一步的实施方案中，所述方法的特征在于所述细胞系是哺乳 动物细胞系如CHO细胞系。
本发明的优选实施方案中，所述方法的特征在于所述细胞系是 CHO-DG44或CHO-DUKX-B11,优选CHO陽DG44。
本发明另一个实施方案中，所述方法的特征在于在存在次黄嘌呤和胸 苦(HT)而不存在MTX时选^^奪编码所需产物的目的基因。
本发明另一个特定的实施方案中，所述方法的特征在于DHFR在与编 码所需产物的目的基因不同的质粒上转染进入细胞系，而且其中DHFR对 目的基因不起选择标记物和/或扩增标记物的作用。
本发明进一步的实施方案中，所述方法的特征在于所述含DHFR的质 粒与含目的基因的质粒先后或同时进行转染。
本发明的优选实施方案中，所述方法的特征在于所述含DHFR的质粒 与含目的基因的质粒先后进行转染。
本发明的另一个优选实施方案中，所述方法的特征在于所述细胞系之 前已用含目的基因的第一个质粒转染，所述目的基因与DHFR之外的选择 标记物是功能偶联的。
本发明进一步的实施方案中，所述方法的特征在于所述细胞系含有异 源DHFR及至少一个其它的扩增标记物，如谷氨酰胺合成酶(GS)、腺苷脱 氨酶(ADA)或胞苷脱氨酶(CDA)。
本发明进一步的特定实施方案中，所述方法的特征在于所述细胞系含 有异源DHFR及GS。
20本发明其它的特定实施方案中，所述方法的特征在于所述细胞系含有
异源DHFR及至少一个其它的选择标记物，如噪呤霉素、新霉素或博来霉素。
本发明进一步的实施方案中，所述方法的特征在于所述稳定转染的细 胞用与目的基因功能偶联的选择标记物来选择。
本发明进一步的实施方案中，所述方法的特征在于所述稳定转染的细
胞用与目的基因功能偶联的选择标记物来选择，所述目的基因不是DHFR。 本发明的优选实施方案中，所述方法的特征在于所述稳定转染的细胞
系达到的细胞密度比相应的未转染细胞系高至少2倍。
本发明进一步涉及生产型宿主细胞系的产生方法，其特征在于如下步
骤
a. 用位于至少一个第一质粒上的至少一个编码所需产物的目的基因转 染宿主细胞，所述基因与DHFR之外的选择标记物和/或扩增标记物是功能
偶联的，
b. 如同步骤a，引入位于另一个质粒上的DHFR表达盒，
c. 用步骤a的选择标记物选择稳定转染的细胞，
其中所述细胞比相应的未转染细胞系的生长特性更优异，达到的细胞 密度也更高。
优选，本发明涉及生产型宿主细胞系的产生方法，其特征在于如下步
骤
a. 用位于至少一个第一质粒上的至少一个编码所需产物的目的基因转 染DHFR缺乏的或DHFR减少的宿主细胞，所述基因与DHFR之外的选才奪 标记物和/或扩增标记物是功能偶联的，
b. 如同步骤a，引入位于另一个质粒上的DHFR表达盒，
c. 用步骤a的选择标记物选择稳定转染的细胞，
其中所述细胞比相应的未转染细胞系的生长特性更优异，达到的细胞 密度也更高。
本发明的优选实施方案中，所述方法的特征在于步骤a与b的顺序互换。 本发明的优选实施方案中，所述方法的特征在于步骤a与b的顺序颠倒。 本发明的优选实施方案中，所述方法的特征在于DHFR是在步骤b中 引入所述细胞系的唯一哺乳动物表达单位。本发明进一步涉及用上述任一种方法可获得的宿主细胞。 本发明的特定实施方案中，所述方法的特征在于所述细胞是哺乳动物 宿主细胞如CHO细胞。
本发明的优选实施方案中，所述方法的特征在于所述细胞是
CHO-DG44或CH0画DUKX-B11 。
本发明进一步涉及在细胞系中制备蛋白质的方法，所述细胞系如哺乳 动物细胞系，所述方法的特征在于如下步骤
(a) 用上述任一种方法，产生含有编码目的蛋白的目的基因的宿主细
胞，
(b) 在允许细胞增殖的条件下培养所述细胞，
(c) 收获目的蛋白，如通过从上清中分离所述细胞，及
(d) 纯化目的蛋白。
优选，本发明涉及在DHFR缺乏的或DHFR减少的细胞系中制备蛋白 质的方法，所述细胞系如哺乳动物细胞系，所述方法的特征在于如下步骤
(a) 用上述任一种方法，产生含有编码目的蛋白的目的基因的宿主细
胞，
(b) 在允许细胞增殖的条件下培养所述细胞，
本发明的特定实施方案中，所述方法的特征在于所述目的蛋白是分泌
的蛋白质。
本发明进一步的实施方案中，所述方法的特征在于所述细胞还含有编 码细胞内或膜结合(membrane standing)蛋白质的转基因。
本发明的优选实施方案中，所述方法的特征在于所述转基因与DHFR 表达盒位于同一质粒。
本发明的进一步优选的实施方案中，所述方法的特征在于所述转基因 编码抗凋亡基因或转录因子。
本发明的特定优选实施方案中，所述方法/宿主细胞的特征在于它们在 悬浮培养基中进行/生长。
本发明的特定优选实施方案中，所述方法/宿主细胞的特征在于它们在 无血清培养基中进行/生长。上述概括描述的发明参照如下实施例将会更易于理解，所包括的实施 例仅仅是为了阐述本发明的某些实施方案，它们无论如何都不会限制本发明。
实施例
材冲+和方法
细胞培养
将制备和开发规模所用的所有细胞系保持在连续的原种(seedstock)培 养物中，培养在培养箱(Thermo， Germany)中的表面通气的T形瓶(Nunc, Denmark)中或摇瓶中(Nunc, Denmark),培养温度为37°C，培养环境含5%
的co2。
将原种培养物每2-3天转种一次，接种密度达到2-3E5细胞/mL。用血 细胞计数器测定所有培养物的细胞密度。用台盼蓝排除法评价活力。将所 有产CHO的细胞培养在BI-专用培养基(BI-proprietary)中，这里未显示该培 养基的组成。
补料分批培养
将3E05细胞/ml的细胞接种到125 ml摇瓶中的30 ml BI-专用生产培养 基中，该培养基中无抗生素或MTX (Sigma-Aldrich, Germany)。以120 rpm 在37。C， 5。/。C02的条件搅拌培养物，第3天后C02降至2。/。。每天测定培 养物参数，包括pH， p02, pC02,葡萄糖，乳酸，及谷氨酰胺的浓度，需要 时，用NaC03将pH调节到7.0。每24小时加入30 ml/L*d的BI-专用补料 溶液。用台盼蓝排除法使用自动CEDEX细胞计数系统(Innovatis)测定细胞 密度及活力。
单个细胞分选
FACS Vantage (Becton Dickinson)流式细胞仪配备有脉冲处理、分选增 强模块、及自动细胞沉积单元，将其用于分析及细胞分选。在前向及侧向 的分散器(FSC/SSC)所作的点图上，围绕单个活细胞点设置gate。用自动细 胞沉积单元将分选的细胞沉积到96孔樣"离板的各孔中，每孔一个细胞，且 每孔含200 pL/细胞的生长培养基。为进行无菌分选，对细胞分选仪的管道
23进行清洗并灭菌，方法是用下述每种溶液作为鞘液(sheath fluid)各处理1小 时O.lNNaOH; 0.1% Triton画X-100; 70%乙醇。然后，将含PBS的无菌鞘 液瓶(sheath tank)与细胞分选仪相连。
RNA分离及RT-PCR
用TRIzo,试剂(Invitrogen, Germany)依照生产商的说明从正在生长的 细胞分离認A,之后用DNase I在37。C处理30分钟。从3|ag总RNA和 oligo(dT)寡核芬酸开始进行第一链cDNA合成，其中用到Cloned AMV First-Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, Germany)。 dhfr转录水平的量化 差异通过实时PCR测定，其中用到Absolute QPCR SYBR Green Fluorescein Mix (ABgene， Surrey, UK)以及受MyIQ Real Time Detection專欠j牛 (BioRad,Germany)控制的热循环仪。所有试验都进行一式三份。用下述寡核 苷酸制备DHFR特异性扩增物，并相对微管蛋白表达水平进行定量dhfr (有 义)SEQ ID NO.l 5陽ATGGTTCGACCGCTGAACTGC-3，； dhfr (反义)SEQ ID NO.2 5，-CCACTGAGGAGGTGGTGGTCATT-3，；微管蛋白(有义)SEQ ID NO.3 5'-CTCAACGCCGACCTGCGCAAG陽3，及微管蛋白(反义)SEQ ID NO.4 5，-ACTCGCTGGTGTACCAGTGC-3'。
实施例1:
异源DHFR的表达促进细胞生长
缺乏DHFR的CHO-DG44 (Urlaub & Chasin， Cell 33, 405-412; 1983)和 CHO DUKX-Bll (ATCC CRL-9010)分别稳定转染了含有针对噤呤霉素及新 霉素的选择标记物的DNA构建体，或/和DHFR基因的表达质粒。在含有 对应抗生素(嘌呤霉素或遗传霉素)的培养基中或在无HT的选择培养基中选 择细胞。
比较原种培养物中及摇瓶补料分批培养期间产生的稳定细胞群体的生 长特性，所述摇瓶补料分批培养代表一种成熟的规模缩减式(down-scale model)发酵/生产过程[Liu C and HongL; Biochem. Eng. J. (2001) 7:121-125]。
令人惊讶的是，缺乏CHO的DG44细胞显示，其生长相对亲代CHO 野生型(wt)细胞受损严重(图1)。它们在补料分批培养物中生长较慢，并且达到的最大细胞密度也较低(图la， b)，这与在原种培养期间测量的生长速
率下降是一致的(图lc)。
有趣的是，用异源DHFR (SEQ ID NOs.5+6)表达来补偿DG44他&-/-细 胞则完全拯救了此表型。重新引入DHFR转基因不仅缩短了倍增时间，而 且4吏IVC增加到野生型水平或更高。在两种不同DG44细胞系中，以及在 用功能性DHFR基因转染的CHODUKXB11细胞中，均可观察到生长促进 效应。然而，用含有嘌呤霉素或新霉素抗性盒的表达构建体转染不会使细 胞的生长特性发生改变。这表明生长促进不是由于选择和/或培养稳定转染 体造成的，而是由于dhfr阴性CHO细胞中功能性DHFR表达的重建造成的。
实施例2:
DHFR以剂量依赖方式促进细胞生长
为了调查重新引入DHFR所引起的生长效应是否是剂量依赖的，制备 稳定表达DHFR(SEQIDNOs.5+6)的亚克隆，并进行基于FACS的单细胞克 隆，来获得同源表达DHFR的克隆群。随后，在补料分批发酵中分析这些 DHFR克隆的生长特性。如图2a所示，转染了 DHFR的亚克隆达到的IVC 水平比CHO-DG44细胞高很多，该差距在6天内达到2.5-6倍。
为4笨讨IVC水平增加是否与DHFR转录物水平增加相关，从DHFR亚 克隆及亲代CHO-DG44细胞系分离总RNA,进行定量PCR来分析DHFR 表达(图2b)。在80%以上的被分析克隆中，测量的IVC与DHFR表达强度 良好相关，意味着DHFR转录水平最高的克隆在发酵过程中IVC最高。这 些数据提示，在CHO-DG44细胞中异源DHFR表达以剂量依赖方式促进细 胞生长。参考文献列表
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序列表
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aatUcgcgc caaacttggg ggaagcacag cgUcaggct gcctaggtga tcgctgctgc 60
tgtcatggU cgaccgctga actgcatcgt cgccgtgtcc cagaaUtgg gcatcggcaa 120
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gatctatgagtuttctttcttUgagagggaUgttaggaagatgtat ttgttttgtgg780
taccagagatggaacctg798
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<400〉 6 ggggcggggcctUgctgcgcaagtggtacacagctcagggetgegatttcgcgccaaac60
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ccccccccccccccccccccccccccc104权利要求
1.促进细胞系进行细胞生长的方法，其特征在于所述细胞系的DHFR活性增加。
2. 权利要求1的方法，其中所述细胞系是DHFR缺乏的或DHFR减少 的细胞系。
3. 权利要求1或2的方法，其中将编码DHFR的基因与编码所需产物 的目的基因(GOI)先后引入所述细胞系。
4. 权利要求3的方法，其中在引入DHFR的先后步骤中引入所述细胞 系的唯一哺乳动物表达单位是DHFR表达盒。
5. 权利要求1-4的方法，其中在无氨甲蝶呤(MTX)时选择编码所需产物 的目的基因。
6. 权利要求1-5的方法，其中DHFR的基因量增加。
7. 权利要求1-6的方法，其中所述细胞系的细胞包含至少1个，优选 至少3个拷贝的DHFR基因。
8. 权利要求1-7的方法，其中DHFR的表达水平增加。
9. 权利要求8的方法，其中DHFR的表达水平增加至少2倍。
10. 权利要求l-9的方法，其中由于引入与所述细胞系不同物种的异源 DHFR基因、DHFR微型基因、DHFR突变体或DHFR编码序列而使DHFR 、活'性i曽力口。
11. 权利要求1-10的方法，其中所述细胞系已经转染了目的基因(GOI)。
12. 权利要求1-11的方法，其中所述细胞系是哺乳动物细胞系如CHO 细胞系。
13. 权利要求12的方法，其中所述细胞系是CHO-DG44或 CHO-DUKX-B11，优选CHO-DG44。
14. 权利要求2-13的方法，其中在存在次黄嘌呤和胸苷(HT)而不存在 MTX时选择编码所需产物的目的基因。
15. 权利要求1-14的方法，其中DHFR与编码所需产物的目的基因通 过不同的质粒转染进入细胞系，且DHFR不作为目的基因的选择标记物和/ 或扩增标记物。
16. 权利要求15的方法，其中所述含DHFR的质粒与含目的基因的质 粒先后或同时进行转染。
17. 权利要求16的方法，其中所述含DHFR的质粒与含目的基因的质 粒先后进行转染。
18. 权利要求17的方法，其中所述细胞系之前已用含目的基因的第一 质粒转染，且所述目的基因与除DHFR之外的选择标记物是功能性偶联的。
19. 权利要求1-18的方法，其中所述细胞系含有异源DHFR及至少一 种其它的扩增标记物如谷氨酰胺合成酶(GS)、腺苷脱氨酶(ADA)或胞苷脱氨 酶(CDA)。
20. 权利要求19的方法，其中所述细胞系含有异源DHFR及GS。
21. 权利要求1-20的方法，其中所述细胞系含有异源DHFR及至少一 种其它的选择标记物如嘌呤霉素、新霉素或博来霉素。
22. 权利要求3-21的方法，其中稳定转染的细胞是用与目的基因功能 性偶联的选择标记物来选择的。
23. 权利要求22的方法，其中所述稳定转染的细胞系达到的细胞密度 比相应的未转染细胞系高至少2倍。
24. 生产型宿主细胞系的产生方法，其特征在于如下步骤(a) 用至少一种编码所需产物的目的基因转染DHFR缺乏的或DHFR减 少的宿主细胞，所述基因位于至少一个第一质粒上、且与除DHFR之外的 选择标记物和/或扩增标记物是功能性偶联的，(b) 按照步骤a,引入位于另一个质粒上的DHFR表达盒，(c) 用步骤a的选择标记物选择稳定转染的细胞，其中所述细胞比相应的未转染细胞系的生长特性更优异，达到的细胞密度也更高。
25. 权利要求24的方法，其中步骤a与b的顺序互换。
26. 权利要求24或25的方法，其中DHFR是在步骤b中引入所述细胞 系的唯一的哺乳动物表达单位。
27. 用权利要求1-26任一项的方法获得的宿主细胞。
28. 权利要求27的宿主细胞，其中所述细胞是哺乳动物宿主细胞如 CHO细胞。
29. 权利要求28的宿主细胞，其中所述细胞是CHO-DG44或 CHO-DUKX-Bll。
30. 在DHFR缺乏的或DHFR减少的细胞系中制备蛋白质的方法，所 述细胞系如哺乳动物细胞系，所述方法的特征在于如下步骤(a) 产生权利要求27-29任一项的宿主细胞，所述宿主细胞含有编码目 的蛋白的目的基因，(b) 在允许细胞增殖的条件下培养所述细胞，(c) 收获目的蛋白，如通过从上清中分离所述细胞来进行收获，及(d) 纯化目的蛋白。
31. 权利要求30的方法，其中所述目的蛋白是分泌的蛋白质。
32. 权利要求30或31的方法，其中所述细胞还含有编码胞内蛋白或膜 结合蛋白的转基因。
33. 权利要求32的方法，其中所述转基因与DHFR表达盒位于同一质粒上。
34. 权利要求32或33的方法，所述转基因编码抗凋亡基因或转录因子。
全文摘要
本发明涉及细胞培养技术领域。它涉及促进细胞生长，特别是促进产生生物药的宿主细胞的生长的方法。本发明还涉及用所述方法所制备的细胞来产生蛋白质的方法。
文档编号C12N5/10GK101589140SQ200880003045
公开日2009年11月25日 申请日期2008年1月22日 优先权日2007年1月24日
发明者埃里克·贝克, 希托·考夫曼, 洛尔·弗洛林 申请人:贝林格尔英格海姆法玛两合公司