专利名称：：生产l-氨基酸的微生物和l-氨基酸的生产方法
技术领域：
：本发明涉及使用微生物的L-氨基酸生产方法，特别是L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸等L-氨基酸的生产方法。L-谷氨酸作为调味品、L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-色氨酸作为动物饲料用添加剂、健康食品成分或氨基酸输液等，在产业上是有用的L-氨基酸。
背景技术：
：L-氨基酸是通过使用各种微生物的发酵方法来进行工业生产的。例如，L-谷氨酸主要是通过使用属于短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)的所谓才奉杆菌型细菌中的L-谷氨酸生产菌或其突变林的发酵法来进行生产(参照例如非专利文献l)。作为通过使用其它微生物的发酵法进行的L-谷氨酸生产方法，已知有使用芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉属(Streptomyces)、青霉属(Penicillium)等的微生物(参照例如专利文献1),假单胞菌属(Pseudomonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、假丝酵母属(Candida)等的微生物(参照例如专利文献2)，芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属、产气气杆菌(Aerobacteraerogenes)(现称产气肠杆菌(Enterobacteraerog印es)')等的微生物(参照例如专利文献3),大肠奸菌突变抹(参照例如专利文献l)等的方法。此外，还公开了使用属于克雷伯氏菌属(Klebsiella)、欧文氏菌属(Erwinia)或泛菌属(Pantoea)、肠杆菌属的微生物的L-谷氨酸生产方法(参照例如专利文献24)。为了通过诸如上述的使用微生物的发酵法生产L-氨基酸等目的物质，可以采用使用野生型微生物(野生抹)的方法、使用从野生抹衍生的营养缺陷型抹的方法、使用从野生株作为各种药物抗性突变抹衍生的代谢调节突变抹的方法、使用具有营养缺陷型抹和代谢调节突变抹这两者的性质的菌抹的方法等。而且，近年来在目的物质的发酵生产中采用了重组DNA^R术。例如，4通过增强L-氨基酸生物合成体系酶编码基因的表达(专利文献5、专利文献6)、或增强L-氨基酸生物合成体系的碳源供给(专利文献7)来提高微生物的L-氨基酸生产性能。kdp系统是在钾离子摄入中起作用的P型ATP酶(非专利文献2)。kdp系统由kdp操纵子编码，当培养基中的钾离子为低浓度时、或在高渗透压下进行培养时，能够衍生其表达(非专利文献3)。此外，已知该表达受双成分调控体系之一的KdpD、KdpE调控(非专利文献4)。然而，目前为止，关于kdp系统强化与L-氨基酸生产之间的关系，尚无研究。专利文献1特开平5-244970号公报专利文献2美国专利第3,563,857号说明书专利文献3特^H召32-9393号7>才艮专利文献4特开2000-189175号公报专利文献5美国专利第5168056号说明书专利文献6美国专利第5776736号说明书专利文献7美国专利第5906925号说明书非专利文献1明石邦彦等著《了$/酸発酵》、学会出版t:/夕一、195—215页、1986年非专利文献2LaimonisA丄aimins，Proc.Natl.Acad,Sci.USA，1978July;75(7):3216-19非专利文献3LaimonisA.Laimins,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1981Jan.;78(l):464-68非专利文献4MarkO.Walderhaug,J.Bacteriol"1992Apr.;174(7):2152-59
发明内容发明所要解决的问题本发明的课题是提供能够高效地生产L-氨基酸的属于肠杆菌科的微生物，和使用该微生物来高效地生产L-氨基酸的方法。解决问题的手段本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现通过使用增强了kdp系统的微生物能够高效地生产L-氨基酸，从而完成了本发明。即，本发明如下所述。(1)属于肠杆菌科的微生物，其具有L-氨基酸生产能力，并且经过修饰而增强了kdp系统。(2)前文所述的微生物，其中，kdp系统是通过增加kdp操纵子或构成该操纵子的1种或2种以上基因的表达量和/或通过增加kdp操纵子或所述基因的翻译量而增强的。(3)前述的微生物，其中，kdp系统是通过提高kdp操纵子或构成该操纵子的1种或2种以上基因的拷贝数、修饰该操纵子的表达调节序列，而增强的。(4)前述的微生物，其中，kdp操纵子至少包含kdpA基因、kdpB基因和kdpC基因。(5)前述的微生物，其中，kdpA基因是编码具有SEQIDNO:2或8所示氨基酸序列的蛋白质的基因，或者是编码kdp系统的A亚单位的基因，所述kdp系统的A亚单位具有在SEQIDNO:2或8中取代、缺失、插入或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。(6)前述的微生物，其中，kdpB基因是编码具有SEQIDNO:3或9所示氨基酸序列的蛋白质的基因，或者是编码kdp系统的B亚单位的基因，其中，kdp系统的B亚单位具有在SEQIDNO:3或9中取代、缺失、插入或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。(7)前述的微生物，其中，kdpC基因是编码具有SEQIDNO:4或10所示氨基酸序列的蛋白质的基因，或者是编码kdp系统的C亚单位的基因，其中，所述kdp系统的C亚单位具有在SEQIDNO:4或10中取代、缺失、插入或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。(8)前述的微生物，其中，所述kdp操纵子为下述(a)~(d)中任一项所述的DNA:(a)包含SEQIDNO:l的碱基编号546~48"所示的碱基序列的DNA;(b)与SEQIDNO:l的;威基编号546-4871所示的碱基序列或与可从该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，并且编码kdp系统的DNA;(c)包含SEQIDNO:7的石威基编号543-4853所示的石咸基序列的(b)与SEQIDNO:7的石咸基编号543~4853所示的石咸基序列或与可从该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，并且编码kdp系统的DNA。(9)前述的微生物，其中，所述L-氨基酸是选自L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸和L-半胱氨酸中的一种或二种以上的L-氨基酸。(10)前述的微生物，其中，前述属于肠杆菌科的微生物为埃希氏菌属细菌、肠杆菌属细菌或泛菌属细菌。(11)L-氨基酸的生产方法，其特征在于，在培养基中培养前述的微生物，从而在该培养基中或菌体内生成和蓄积L-氨基酸，并且从该培养基或菌体回收L-氨基酸。(12)前述的方法，其中，所述L-氨基酸为选自L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸和L-半胱氨酸中的一种或二种以上的L-氨基酸。图1显示辅助质粒RSF-Red-TER的构造的图。图2显示辅助质粒RSF-Red-TER的构建的图。图3显示LacZ基因上游的尸.a"朋加/s染色体区域的构造的图。图4显示kdp操纵子启动子l^代抹在酸性条件下的试管培养中的生长的图。图5显示kdp操纵子启动子取代株的L-谷氨酸生产性能的图。图6显示尸a"toea(SEQIDNO:8)与大肠杆菌(SEQIDNO:2)的KdpA的氨基酸序列的比对、以及它们的共有序列(SEQIDNO:57)的图。图7显示a"a"ato(SEQIDNO:9)与大肠杆菌(SEQIDNO:3)的KdpB的氨基酸序列的比对、以及它们的共有序列(SEQIDNO:58)的图。图8显示尸a"toeaaw"打a他(SEQIDNO:10)与大肠杆菌(SEQIDNO:4)的KdpC的氨基酸序列的比对、以及它们的共有序列(SEQIDNO:59)的图。实施发明的最佳模式以下，对本发明进行详细说明。<1>本发明的微生物本发明的微生物是具有L-氨基酸生产能力、并且经过修饰而增强了kdp系统的属于肠杆菌科的微生物。这里的L-氨基酸生产能力是指将本发明的微生物在培养基中培养后，在培养基中或菌体内生成L-氨基酸并将其蓄积到可从培养基或菌体回收的程度的能力。而且，本发明的^f效生物也可以具有多种L-氨基酸的生产能力。作为具有L-氨基酸生产能力的微生物，可以是本身具有L-氨基酸生产能力的微生物，也可以是通过利用突变法或重组DNA技术对如下文所述的微生物进行修饰而具有了L-氨基酸生产能力的微生物。对于L-氨基酸的种类没有特殊限制，可以列举出L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-瓜氨酸等碱性氨基酸，L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-甘氨酸等脂肪族氨基酸，L-苏氨酸、L-丝氨酸等羟基单氨基羧酸形式的氨基酸，L-脯氨酸等环式氨基酸，L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸等芳香族氨基酸，L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-曱硫氨酸等含硫氨基酸，L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺等等酸性氨基酸，特别优选L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸。本发明的微生物可以具有2种以上氨基酸的生产能力。<1-1〉L-氨基酸生产能力的赋予以下，对赋予微生物以L-氨基酸生产能力的方法，以及可在本发明中使用的被赋予了L-氨基酸生产能力的微生物进行例示。但是，只要具有L-氨基酸生产能力，不限于这些微生物。作为用于本发明的微生物，只要是埃希氏菌属、肠杆菌属、泛菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属、沙门氏菌属(5W/mo"e〃a)、摩根氏菌属(Mo^aw"/a)等属于肠杆菌科的微生物且具有L-氨基酸生产能力即可，没有特殊限制。具体地，可以利用根据NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)数据库所述的分类属于肠杆菌科的微生物(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgiid=91347)。作为用于修饰的肠杆菌科的亲本抹，其中希望使用埃希氏菌属细菌、肠杆菌属细菌、泛菌属细菌、欧文氏菌属、肠杆菌属或克雷伯氏菌属。作为用于获得本发明的埃希氏菌属细菌的埃希氏菌属细菌亲本^K，没有特殊限制，具体地可以利用Neidhardt等的著作(Backmann,B.J.1996.DerivationsandGenotypesofsomemutantderivativesofEscherichiacoliK-12，p.2460-2488,表1.于F.D.Neidhardt(编)，EscherichiacoliandSalmonellaCellularandMolecularBiology/SecondEdition,AmericanSocietyforMicrobiologyPress,Washington,D.C.—书中)中列举的那些。这其中，可以列举出例如大肠杆菌C&cfen'c/^co//)。作为大肠杆菌,具体地可以列举原型野生4朱K12冲朱来源的大肠4干菌W3110(ATCC27325)、大肠杆菌MG1655(ATCC47076)等。这些菌株可以从例如美国典型培养物保藏中心(地址12301ParklawnDrive,Rockville，Maryland20852P.O.Box1549,Manassas,VA20108,UnitedStatesofAmerica)通过分售获得。即，对各菌抹给予了对应的注册号，可以利用该注册号通过分售获得(参照http:〃www.atcc.org/)。对应于各菌4朱的注册号见美国典型培养物保藏中心的目录。作为肠才干菌属纟田菌,可以列举成团肠4干菌(五"fera6acferagg/o)、产气肠杆菌(五"fera6flcferaeragew&s)等，作为泛菌属细菌，可以列举朋朋ato。而且，成团肠杆菌最近基于16SrRNA碱基序列分析等被重新分类为成团；乏菌(agg/omerara)或Pa"toea^、其斤氏:乏菌(尸awtoe(3他丽W!7)。在本发明中，只要是分类为肠杆菌科即可，可以是属于肠杆菌属或泛菌属中任何一个属的细菌。特别地，泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌和肠杆菌属细菌是分类为，变形细菌O-Proteobacteria)的细菌，它们在分类学上的亲缘关系非常近(JGenApplMicrobiol1997Dec;43(6)355-361、InternationalJournalofSystematicBacteriology,Oct.1997,pl061-1067)。近年来，依据DNA-DNA杂交实验等，属于肠杆菌属的细菌中，有些被重新分类为成团泛菌(尸""toe"agg/o膨ra"力或必/erya等(InternationalJournalofSystematicBacteriology,July1989;39(3).p.337-345)。此外，属于欧文氏菌属的细菌中，有些#皮重新分类为菠萝泛菌、斯氏泛菌CPa"toea他丽"/z')(参照InternationalJournalofSystematicBacteriology,Jan1993;43(l).p.l62-173)。肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(^^en6a"eragg/owera似)、产气肠杆菌C&^Y^a"eraeroge"^)等。具体地，可以使用欧洲专利申请/>开952221号说明书示例的菌抹。作为肠杆菌属的代表性菌抹，可以列举出成团肠杆菌ATCC12287林。作为泛菌属细菌的代表性菌抹，可以列举出P朋toefl<7"""油>、斯氏泛菌、成团泛菌、柠檬泛菌(尸a;^o^c洽ea)。具体地，可以列举下述菌抹。尸a"to^awa船^AJ13355林(FERMBP-6614)(欧洲专利申请公开0952221号说明书)尸朋to^a朋"a^AJ13356抹(FERMBP-6615)(欧洲专利申请公开0952221号说明书)AJl3601抹(FERMBP-7207)(欧洲专利申请公开0952221号说明书)这些菌林在分离出来时被鉴定为成团肠杆菌，并作为成团肠杆菌保藏。但是，如上述，通过16SrRNA的碱基序列解析等被重新分类为尸antoea。作为欧文氏菌属细菌，可以列举出解淀粉欧文氏菌(ErWm'flamy/ovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(￡nWm'acarafovora);作为克雷伯氏菌属细菌，可以列举出植生克雷伯氏菌(《/eZwW/"p/a""co/a)。具体地，可以列举出下述菌抹。解淀粉欧文氏菌ATCC15580抹胡萝卜软腐欧文氏菌ATCC15713抹植生克雷伯氏菌AJ13399林(FERMBP-6600)(欧洲专利申请公开955368号说明书)植生克雷伯氏菌AJ13410抹(FERMBP-6617)(欧洲专利申请公开955368号说明书)以下，说明对属于肠杆菌科的微生物赋予L-氨基酸生产能力的方法，或增强如上所述的微生物的L-氨基酸生产能力的方法。为了赋予L-氨基酸生产能力，可以使用在棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌等的选育中沿用至今的方法，如获取营养缺陷突变体、类似物抗性菌抹或代谢调节突变菌抹，创建L-氨基酸生物合成系统酶表达增强的重组菌抹等等(参见《7S乂酸発酵》，(株)学会出版ir乂夕一，1986年5月30曰首次出版发行，第77-100页)。这里，在L-氨基酸生产菌的选育中，所赋予的营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变等性质可以是单独一种，也可以是两种或者三种以上。此外，表达被增强的L-氨基酸生物合成系统酶可以是单独一种，也可以是两种或三种以上。另外，可以将营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变等性质的赋予与生物合成系统酶的增强组合进行。具有L-氨基酸生产能力的营养缺陷突变体菌林、L-氨基酸类似物抗性菌抹或代谢调节突变菌抹可如下获得对亲本菌株或野生型菌抹施以常规突变处理，即X-射线或UV照射或用诱变剂例如N-曱基-N，-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或曱磺酸乙酯(EMS)等处理；其后，从所得的突变菌抹中选择显示营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变并且还具有L-氨基酸生产能力的菌冲朱。以下，示例出L-氨基酸生产菌或其构建方法。L-谷氨酸生产菌首先，作为L-氨基酸生产菌，对L-谷氨酸生产菌进行示例。用于衍生本发明的L-谷氨酸生产菌的亲本林的例子包括、但不限于大肠杆菌(E.coli)VL334thrC+(EP1172433)等属于埃希氏菌属的菌株。大肠杆菌VL334(VKPMB-1641)是L-异亮氨酸和L-苏氨酸营养缺陷型菌抹，并且在thrC和ivA基因有突变(美国专利4，278，765)。利用可在野生型大肠杆菌菌抹K12(VKPMB-7)细胞中增殖的噬菌体P1，通过常规转化方法来转移thrC基因的野生型等位基因。结果，获得了L-异亮氨酸营养缺陷型的L-谷氨酸生产菌VL334thrC+(VKPMB-8961)。作为通过修饰来赋予细菌以L-谷氨酸生产能力或者增强细菌的L-谷氨酸生产能力的方法，可以列举例如通过对细菌进行修饰使得编码L-谷氨酸生物合成相关酶的基因的表达增强的方法。作为L-谷氨酸生物合成相关酶，可以列举出例如谷氨酸脱氢酶(以下也称"GDH")(gdhA)、谷氨酰胺合酶(glnA)、谷氨酸合酶(gltAB)、异柠檬酸脱氢酶(icdA)、顺乌头酸水合酶(acnA,acnB)、柠檬酸合酶(以下也称"CS，，)(gltA)、曱基柠檬酸合酶(乂夕/P夕工y酸、乂y夕一if)(以下也称"PRPC，)(prpC)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(以下也称"PEPC，，)(ppc)、丙酮酸羧化酶(pyc)、丙酮酸脱氢酶(aceEF，lpdA)、丙酮酸激酶(pykA，pykF)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油变位酶(pgmA，pgml)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)、丙糖磷酸异构酶(tpiA)、果糖二磷酸醛缩酶(fbp)、磷酸果糖激酶(pfkA,pfkB)、葡糖磷酸异构酶(pgi)等。此外，酶名称后的括号内为基因名称(以下同)。这些酶中，优选CS或PRPC、PEPC和GDH中的1种以上，更优选全部这3种。(参照WO2006/051660号小册子)。以下，针对修饰细菌以增强目的基因表达的方法进行示例。第一种方法是提高目的基因的拷贝数的方法。例如，通过将目的基因克隆在适当的质粒上，并用所得的质粒转化宿主细菌，可以提高该基因的拷贝数。例如，当使用编码CS的基因(gltA基因)或者编码PRPC的基因(prpC基因)、编码PEPC的基因(ppc基因)和编码GDH的基因(gdhA基因)作为目的基因时，这些基因的碱基序列在埃希氏菌属细菌和棒杆菌属细菌中已经阐明(Biochemistry、第22巻、5243-5249页、1983年;J.Biochem.、第95巻、卯9-916页、1984年；Gene、第27巻、193~199页、1984年；Microbiology,第140巻、1817~1828页、1994年；Mol.Gen.Genet.、第218巻、330-339页、1989年；MolecularMicrobiology、第6巻、317~326页、1992年)，因此可以基于各碱基序列来合成引物，以染色体DNA为模板，通过PCR法从属于肠杆菌科的细菌中取得。作为用于转化的质粒，可以列举出能够在属于肠杆菌群的细菌中自主复制的质粒，例如pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29(pHSG、pSTV可从TAKARABio公司获得)、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218(pMW可从NIIPONGENE公司获得)等。而且，还可以以噬菌体DNA代替质粒作为载体使用。作为用于同时增强上述CS或PRPC、PEPC和GDH的活性的质粒，可以列举出整合了gltA基因、ppc基因和gdhA基因的RSFCPG(参照欧洲专利申请公开第0952221号说明书)、和将RSFCPG的gltA基因替换成prpC的RSFPPG(参见实施例)。作为转化方法，可以使用例如用氯化钙处理受体菌细胞来增加DNA的透过性的方法(如Mandel，M.和Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)报道该方法用于大肠杆菌K-12),或者由处于增殖阶段的细胞制备感受态细胞并导入DNA的方法(如Duncan,C.H.，Wilson,G.A.和Young,F.E.，Gene，1，153(1977)报道该方法用于枯草芽孢杆菌(丑"c/〃wsswZ)"to))。或者，还可以应用将DNA受体菌的细胞制备成容易导入重组DNA的原生质体或原生质球的状态，再将重组DNA导入DNA受体菌的方法(如Chang，S.和Choen,S.N"Molec.Gen.Genet"168,111(1979);Bibb，M丄，Ward,J.M.和Hopwood，O.A.,Nature,274，398(1978);Hinnen,A.，Hicks，J.B.和Fink,G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,751929(1978)报道该方法用于枯草杆菌、放线菌类和酵母)。此外，采用电脉冲法(特开平2-207791号公报)能够进行微生物的转化。提高基因的拷贝数可以通过向微生物的染色体DNA上导入多个拷贝的目的基因来实现。为了将多个拷贝的目的基因导入到微生物的染色体DNA来进行(ExperimentsinMolecularGenetics,ColdSpringHarborLab.(1972))。作为染色体DNA上以多拷贝存在的序列，可以利用重复DNA(repetitiveDNA)、存在于转座元件端部的反向重复序列。或者，可以如特开平2-109985号公报所述那样，将目的基因加载在转座子上，使其发生转移，从而将多个基因拷贝导入染色体DNA上。另外，还可以通过使用Mu噬菌体的方法(特开平2-109985号)将目的基因整合到宿主染色体上。第2种方法是在染色体DNA上或质粒上、将目的基因的启动子等表达调节序列替换为更强力的表达调节序列来增强目的基因的表达的方法。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、PR启动子、lacUV启动子等是已知的强力启动子。此外，还可以如国际公布WO00/18935所公开的那样，在基因的启动子区域导入数个碱基的碱基取代，将其修饰成更强力的启动子。启动子强度的评价方法和强力启动子的例子记载于Goldstein等的论文(Prokaryoticpromotersinbiotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.,1995，1，105-128)等中。表达调节序列的替换例如可以按照与使用温度敏感型质粒的基因替换相似的方式进行。作为可以在本发明的属于肠杆菌科的细菌中使用的、具有温度敏感型复制起点的载体，可以列举出例如WO99/03988号国际公布小册子所述的质粒pMAN997等。13而且，已知核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔序列、特别是起始密码子紧邻上游的序列中数个核苷酸的取代对mRNA的翻译效率有非常大的影响，可以对它们进行修饰来提高翻译量。而且，表达调节序列的修饰可以与上述的提高基因拷贝数的方法组合使用。作为进行如上述的基因取代的方法，有下述方法例如，称为"Red驱动整合(Red-drivenintegration)"的方法(Datsenko,K.A，和Wanner,B,L,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97:6640-6645(2000))，组合使用Red驱动整合法与X嗟菌体来源的切出系统(Cho，E.H.，Gumport,R.I.,Gardner,J.F.J.Bacteriol.184:5200-5203(2002))的方法(参照WO2005/010175号)等使用线性DNA的方法，或者使用含温度敏感型复制起点的质粒、可接合转移的质粒的方法，利用在宿主内不含复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号说明书，或特开平05-007491号公报)。而且，Red驱动整合中，如参考例l所示，适合使用对XRed基因产物有抗性的菌抹例如a"a"a"sSCH(0)林。该抹于2005年9月21保藏于1我罗斯国立工iM鼓生物保藏中心(RussianNationalCollectionofIndustrialMicroorganisms(VKPM)，GNIIGenetika)(所在地Russia,1175451Moscow,1Dorozhnyproezd.l)，保藏号VKPMB-9246。作为经采用以上方法进行修饰而增强了柠檬酸合酶基因、甲基柠檬酸合酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达的微生物，可以例示出特开平2001-333769号公报、特开2000-106869号公报、特开2000-189169号公报、特开2000-333769、特开2006-129840、国际公布2006/051660号小册子等中记载的微生物。此外，L-谷氨酸生产能力也可以通过增强6-磷酸葡糖酸脱水酶活性、或2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶活性、或者这两者的活性来赋予。作为提高了6-磷酸葡糖酸脱水酶活性、2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶活性的4敬生物，可以列举出特开2003-274988公开的樣t生物。赋予或增强L-谷氨酸生产能力的修饰可以通过减少或缺损催化从L-谷氨酸生物合成途径中分支并合成L-谷氨酸以外的化合物的反应的酶的活性来进行。催化从L-谷氨酸生物合成途径中分支并合成L-谷氨酸以外的化合物的反应的酶的实例包括2-氧化戊二酸脱氢酶(a-酮戊二酸脱氢酶)(sucA)，异柠檬酸裂合酶(aceA)，磷酸乙酰转移酶(pta)，乙酸激酶(ack)，乙酰羟酸合酶(ilvG)，乙酰乳酸合酶(ilvl),曱酸乙酰转移酶(pfl)，乳酸脱氬酶(ldh)，谷氨酸脱羧酶(gadAB)、1-吡咯啉5-羧酸脱氢酶(putA)等。这其中，特别优选降低或缺损2-氧化戊二酸脱氬酶活性。为了降低或缺损上述酶的活性，可以采用常规突变处理法、或者基因工程方法在上述酶的基因中导入能够使得细胞中对应酶的活性降低或缺损的突变。作为突变处理法，包括例如照射X射线或紫外线的方法、或用N-曱基一N，一硝基-N-亚硝基胍等突变剂进行处理的方法等。基因中导入突变的位点可以是编码酶蛋白的编码区域，也可以是启动子等表达调控区域。此外，.在基因工程方法方面，可以采用例如基因重组法、转化法、细胞融合法等方法。细胞中目的酶活性的降低或缺损及活性降低的程度可以通过测定候选林的菌体提取液或纯化级分的酶活性，并与野生抹相比较来确认。例如，2-氧化戊二酸脱氢酶活性可以按照Reed等的方法(L丄Reed和B.B.Mukherjee,MethodsinEnzymology1969,13，p.55-61)来观寸定。作为缺损了2-氧化戊二酸脱氢酶活性或降低了2-氧化戊二酸脱氢酶活性的属于埃希氏菌属的细菌，可以列举出以下的菌林(美国专利第5,378，616号和第5,573,945号)。大肠杆菌W3110sucA::Kmr大肠杆菌AJ12624(FERMBP-3853)大肠杆菌AJ12628(FERMBP-3854)大肠杆菌AJ12949(FERMBP-4881)大肠杆菌W3110sucA::Kmr是通过破坏大肠杆菌W3110的2-氧化戊二酸脱氢酶基因(sucA基因)而得到的菌抹。该菌抹的2-氧化戊二酸脱氢酶完全缺损。作为缺损或降低了2-氧化戊二酸脱氢酶活性的其它细菌，具体地可以列举出如下菌抹。尸a"toeaAJ13601(FERMBP-7207欧洲专利^公开说明书1078989)尸朋to^朋a""/^AJ13356(FERMBP-6615美国专利6.331,419号)SC17sucA(FERMBP-8646国际公布小册子15WO2005/085419号)植生克雷伯氏菌AJ13410(FERMBP-6617美国专利6,197,559号)而且，SC17sucA抹是这样得到的菌株作为低pH下能够在含L-谷氨酸和碳源的培养基中增殖的菌抹，从自然界分离出AJ13355抹，从而获得了粘液低生产性突变抹(SC17),然后破坏了该菌抹的2-氧化戊二酸脱氬酶基因(sucA)。AJ13601抹是这样得到的菌抹在SC17sucA林中导入包含大肠杆菌来源的gltA、ppc和gdhA基因的质粒RSFCPG,以及包含乳发酵短杆菌来源的gltA基因的质粒pSTVCB,而得到SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB抹；再从该SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB抹中选择低pH下显示出对高浓度L-谷氨酸的抗性的菌株，进一步选择增殖度、L-谷氨酸生产能力高的菌抹，而得到AJ13601抹(欧洲专利申请公开0952221号说明书)。AJ13356抹是AJ13355抹的a-KGDH-El亚单位基因(sucA)缺失后得到的菌抹。此外，实施例所述NP106抹是从AJ13601抹脱去质粒RSFCPG+pSTVCB而得到的菌林。AJ13355抹和AJ13356抹已于平成10年(1998年)2月19日保藏于曰本通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(现名称为产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址邮政编码305-8566茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号分别为FERMP-16644和FERMP-16645,并于平成11年(1999年)1月11日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，并给予保藏号FERMBP-6614和FERMBP-6615。SC17sucA抹的内部编号为AJ417抹，已于平成16年(2004年)2月26日保藏于产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址邮政编码305-8566茨城县筑波市东l丁目l番地1中央第6)，保藏号FERMBP-08646。AJ13601抹已于1999年8月18曰保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(现名称为产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址邮政编码305-8566茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6),保藏号为FERMP-17516，并且于2000年7月6日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，并给与保藏号FERMBP-7207。上述尸""toe"""a""/"AJ13355抹、AJ13356株、AJ13601抹、和前述的植生克雷伯氏菌AJ13399林具有于酸性条件下培养后在液体培养基中蓄积超过L-谷氨酸饱和浓度的量的L-谷氨酸蓄积能力。此外，为了提高肠杆菌科的L-谷氨酸生产能力，还可以采用缺损arcA基因的方法(美国专利7,090,998号公报)、扩增谷氨酸分泌基因yhfK基因的方法(WO2005/085419小册子)。上述的增强或缺损酶活性的方法对于以下所示的其它氨基酸的生产菌也同样适用。L-苏氨酸生产菌作为用于衍生本发明的L-苏氨酸生产菌的亲本株的例子，可以列举出:大肠杆菌TDH-6/pVIC40(VKPMB-3996)(美国专利第5,175,107号、美国专利第5,705,371号)、大肠杆菌472T23/pYN7(ATCC98081)(美国专利第5,631,157号)、大肠杆菌NRRL-21593(美国专利第5,939,307号)、大肠杆菌FERMBP-3756(美国专利第5,474,918号)、大肠杆菌FERMBP-3519和FERMBP-3520(美国专利第5,376,538号)、大肠杆菌MG442(Gusyatiner等，Genetika(俄语)，14，947-956(1978》、大肠杆菌VL643和VL2055(EP1149911A)等属于埃希氏杆菌属的菌抹，但不限于此。TDH-6菌林缺失thrC基因，是蔗糖同化型，并且ilvA基因有泄漏突变(leakymutation)。该菌林的rhtA基因也有突变，该突变赋予对高浓度的苏氨酸或高丝氨酸的抗性。B-3996菌抹携带pVIC40质粒，pVIC40是通过将含有突变的thrA基因的thrA*BC操纵子插入到由RSF1010获得的载体中而获得。这种突变的thrA基因编码的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I对苏氨酸的反馈抑制基本上已解除。B-3996菌株在1987年11月19曰被保藏于All-UnionScientificCenterofAntibiotics(全联盟抗生素科学中心)(NagatinskayaStreet3-A，117105Moscow,Russia),登录号为RIA1867。该菌抹也在1987年4月7日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(RussianNationalCollectionofIndustrialMicroorganisms(VKPM)，GNIIGenetika)(1Dorozhnyproezd.,1Moscow117545,Russia),登录号为B-3996。还可以使用大肠杆菌VKPMB-5318(EP0593792B)作为用于衍生本发明的L-苏氨酸生产菌的亲本抹。B-5318菌抹是非异亮氨酸营养缺陷型的，并且温度敏感的入噬菌体CI阻遏物和PR启动子取代了pVIC40质粒中的苏氨酸操纵子的调控区域。VKPMB-5318菌林在1990年5月3日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，登录号为VKPMB-5318。此外，本发明的细菌优选是经过修饰而增加了下列基因中l种以上的表达的细菌-突变thrA基因，其编码对苏氨酸的反馈抑制具有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I;-thrB基因，其编码高丝氨酸激酶；-thrC基因，其编码苏氨酸合酶；-rhtA基因，其编码推定的跨膜蛋白；-ascl基因，其编码天冬氨酸=(3=半醛脱氢酶；-aspC基因，其编码天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)。编码大肠杆菌天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因已经阐明(核苷酸编号337至2799，GenBank登录号NC—000913.2,gi:491759卯)。thrA基因位于大肠杆菌K-12染色体上thrL基因和thrB基因之间。编码大肠杆菌高丝氨酸激酶的thrB基因已经阐明(核苷酸编号2801至3733，GenBank登录号NC—000913.2,gi:49175990)。thrB基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrA基因和thrC基因之间。编码大肠杆菌的苏氨酸合酶的thrC基因已经阐明(核香酸编号3734至5020,GenBank登录号NC—000913.2，gi:49175990)。thrC基因位于大肠杆菌K-12染色体上thrB基因和yaaX开放阅读框之间。所有这3个基因作为单独的一个苏氨酸操纵子发挥功能。为增加苏氨酸操纵子的表达，优选从操纵子中将影响转录的弱化子区域去除(W02005/049808，WO2003/097839)。编码对苏氨酸的反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变thrA基因，加上thrB和thrC基因，可以作为一个操纵子从熟知的pVIC40质粒中获得，该质粒存在于苏氨酸生产抹大肠杆菌VKPMB-3996菌抹中，在美国专利No.5,705,371中有详述。rhtA基因在大肠杆菌染色体上的18min处，靠近编码谷氨酰胺转运系统的成分的glnHPQ操纵子。rhtA基因与ORF1(ybiF基因，核苷酸编号764至1651,GenBank登录号AAA218541,gi:440181)相同，位于pexB与ompX基因之间。已将表达由ORJF1编码的蛋白的单位命名为rhtA基因(rht:对高丝氨酸和苏氨酸抗性)。此外，已经证明rhtA23突变是在相对ATG起始密码子的-1位置上的G—A取代(ABSTRACTSofthe17thInternationalCongressofBiochemistryandMolecularBiologyinconjugationwithAnnualMeetingoftheAmericanSocietyforBiochemistryandMolecularBiology(第17界国际生物化学与分子生物学大会暨美国生物化学与分子生物学协会年会摘要)，SanFrancisco,California,1997年8月24-29日，摘要号457,EP1013765A)。大肠杆菌的asd基因已经阐明(核苷酸编号3572511至3571408,GenBank登录号NC—000913.1,gi:16131307),并且可以利用根据该基因的碱基序列制备的引物通过PCR(参见White,T丄等，TrendsGenet，5,185(1989))来获得。其它微生物的asd基因也可以通过类似方式获得。此外，大肠杆菌的aspC基因已经阐明(核香酸编号983742至984932，GenBank登录号NC—000913.1，gi:16128895)，并且可以通过PCR获得。其它微生物的aspC基因也可以通过类似方式获得。L-赖氨酸生产菌属于埃希氏菌属的L-赖氨酸生产菌的实例包括对L-赖氨酸类似物具有抗性的突变抹。L-赖氨酸类似物可抑制属于埃希氏菌属的细菌的生长，但是这种抑制当L-赖氨酸共存于培养基中时会被全部或部分解除。L-赖氨酸类似物的实例包括、但不限于，氧代赖氨酸，赖氨酸氧肟酸(lysinehydroxamate),S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)，^甲基赖氨酸，a-氯代己内酰胺等。将属于埃希氏菌属的细菌进行常规的人工诱变处理可以得到对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变抹。可用于L-赖氨酸生产的菌林的具体实例包括大肠杆菌AJ11442(FERMBP-1543，NRRLB-12185;参见美国专利4,346,170号)和大肠杆菌VL611。在这些微生物中，L-赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制已被解除。可将WC196菌抹用作大肠杆菌的L-赖氨酸生产菌。这种菌林是通过赋予源自大肠杆菌K-12的W3110菌4朱以AEC抗性而培育的。该菌4朱#1命名为大肠杆茵AJ13069菌林，并于1994年12月6日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心，305-8566,日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，取得登录号FERMP-14690。其后根据布达佩斯条约的规定于1995年9月29日转为国际保藏，并取得登录号FERMBP-5252(美国专利第5,827,698号)。用于衍生本发明的L-赖氨酸生产菌的亲本抹的实例还包括下述菌抹，在所述菌抹中编码L-赖氨酸生物合成酶的1种以上基因的表达增加。这样的基因的实例包括，但不限于，二氢吡咬二羧酸合酶基因(dapA)、天冬氨酸激酶基因(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶基因(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh)(美国专利第6，040，160号)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)和天冬氨酸酶基因(aspA)(EP1253195A)。此外，亲本菌抹中涉及能量效率(energyefficiency)的基因(cyo)(EP1170376A)、编码烟酰胺核苦酸转氬酶的基因(pntAB)(美国专利第5,830,716号)、ybjE基因(WO2005/0733卯)或它们的组合的表达水平增加也是可以的。作为用于衍生本发明的L-赖氨酸生产菌的亲本林的例子，可列举催化通过从L-赖氨酸生物合成途径分支而生成L-赖氨酸以外的化合物的反应的酶的活性减少或缺损的菌抹。作为催化通过从L-赖氨酸生物合成途径分支而生成L-赖氨酸之外的化合物的反应的酶的例子，可以列举出高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(美国专利第5,827,698号)、和苹杲酸酶(WO2005/010175)。L-半胱氨酸生产菌用于衍生本发明的L-半胱氨酸生产菌的亲本抹的实例包括、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌抹，如用编码反馈抑制抗性丝氨酸乙酰转移酶的多种cysE等位基因转化的大肠杆菌JM15(美国专利6，218,168，俄罗斯专利申请第2003121601号)，具有编码适于向细胞分泌有毒物质的蛋白的过表达基因的大肠杆菌W3110(美国专利第5，972,663号)，半胱氨酸脱巯基酶(cysteinedesulfohydrase)活性减少的大肠杆菌菌抹(JP11155571A2);由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正向转录调控物活性增强的大肠杆菌W3110(WO0127307Al)，等等。L-亮氨酸生产菌用于衍生本发明的L-亮氨酸生产菌的亲本林的实例包括、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌抹，如对亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌林(例如，菌抹57(VKPMB-7386,美国专利第6,124,12:1号))或对亮氨酸类似物(包括(3-2-噻吩丙氨酸、3-羟基亮氨酸、4-氮亮氨酸、5,5,5-三氟亮氨酸等)有抗性的大肠杆菌菌抹(特公昭62-34397号和特开平8-70879号);通过WO96/06926中描述的遗传工程方法获得的大肠杆菌菌抹；大肠杆菌H-9068(特开平8-70879号)，等等。可以通过增加涉及L-亮氨酸生物合成的一种以上的基因的表达来改进本发明的细菌。这些基因的实例可优选列举以编码对L-亮氨酸反馈抑制具有抗性的异丙基苹果酸合酶的突变leuA基因为代表的leuABCD操纵子中的基因(美国专利第6,403,342号)。此外，可以通过增加编码乂人细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白的一种以上的基因的表达来改进本发明的细菌。这类基因的实例包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041A2)。L-组氨酸生产菌用于衍生本发明的L-组氨酸生产菌的亲本抹的实例包括、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌抹，如大肠杆菌24菌林(VKPMB-5945,RU2003677);大肠杆菌80菌抹(VKPMB-7270,RU2119536);大肠杆菌NRRLB-12116—B12121(美国专利4,388，405);大肠杆菌H-9342(FERMBP-6675)和H-9343(FERMBP-6676)(美国专利6，344,347);大肠杆菌H-9341(FERMBP-6674)(EP1085087);大肠杆菌AI80/pFM201(美国专利6，258,554)等等。用于衍生本发明的L-组氨酸生产菌的亲本林的实例还包括如下菌抹，所述菌抹中编码L-组氨酸生物合成系统酶的1种以上的基因的表达增加。这些基因的实例包括ATP磷酸核糖基转移酶基因(hisG)、磷酸核糖基AMP环化水解酶基因(hisl)、磷酸核糖基-ATP焦磷酸水解酶基因(hisIE)、磷酸核糖基亚氨曱基-5-氨基咪唑氨甲酰核糖核苷酸异构酶基因(hisA)、酰胺转移酶基因(hisH)、组氨醇磷酸氨基转移酶基因(hisC)、组氨醇磷酸酶基因(hisB)、组氨醇脱氢酶基因(hisD)等。已知hisG和hisBHAFI编码的L-组氨酸生物合成酶被L-组氨酸所抑制，因此还可以通过向ATP磷酸核糖基转移酶基因(hisG)中引入诱导对反馈抑制有抗性的突变来有效地增加生产L-组氨酸的能力(俄罗斯专利2003677和2119536)。具有L-组氨酸生产能力的菌抹具体实例包括大肠杆菌FERM-P5038和5048,其已经导入了携带编码L-组氨酸生物合成酶的DNA的载体(特开昭56-005099号)，导入了用于氨基酸输送的rht基因的大肠杆菌菌株(EP1016710A)，赋予了磺胺胍、DL-l,2,4-三唑-3-丙氨酸和链霉素抗性的大肠杆菌80菌抹(VKPMB-7270，俄罗斯专利2119536),等等。L-苯丙氨酸生产菌用于衍生本发明的L-苯丙氨酸生产菌的亲本抹的例子包括、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌纟朱，如大肠杆菌AJ12739(tyrA::Tn10,tyrR)(VKPMB-8197);具有突变型pheA34基因的大肠杆菌HW1089(ATCC55371)(美国专利5,354，672);大肠杆菌MWEC101-b(KR8903681);大肠杆菌NRRLB-12141,NRRLB國12145，NRRLB-12146和NRRLB-12147(美国专利4,407，952)等。此夕卜，也可以使用大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAB](FERMBP-3566),大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERMBP-12659)，大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERMBP-12662)和命名为AJ12604的大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4,pACMAB](FERMBP-3579)作为亲本菌林(EP488424Bl)。此外，还可使用由yedA基因或yddG基因编码的蛋白活性增加的属于埃希氏菌属的L-苯丙氨酸生产菌(美国专利申请公开MO3/0148473Al和^O3/0157667Al)。L-色氨酸生产菌用于衍生本发明的L-色氨酸生产菌的亲本抹的实例包括、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌^f朱，如大肠杆菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123),其色氨酰-tRNA合成酶缺陷，该酶由突变的trpS基因编码(美国专利5,756,345);大肠杆菌SV164(pGH5),其具有编码对丝氨酸反馈抑制有抗性的磷酸甘油酸脱氬酶的serA等位基因和编码对色氨酸反馈抑制有抗性的邻氨基苯曱酸合酶(anthranilatesynthase)的trpE等位基因(美国专利6,180,373);色氨酸酶缺陷的大肠杆菌AGX17(pGX44)(NRRLB-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRLB-12264)(美国专利4,371,614);磷酸烯醇丙酮酸的生产能力增加的大肠杆菌AGX17/pGX50,pACKG4-pps(WO9708333,美国专利6，319,696)等等。此外，还可以使用由yedA基因或yddG基因编码的蛋白活性增强的产生L-色氨酸的埃希氏菌属细菌(美国专利申请公开2003/0148473Al和2003/0157667Al)。用于衍生本发明的L-色氨酸生产菌的亲本抹的实例还包括选自邻氨基苯曱酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脱氢酶(serA)和色氨酸合酶(trpAB)中的1种以上的酶活性增加的菌抹。邻氨基苯曱酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶两者受L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，因此可以向这些酶中引入导致反々贵抑制解除的突变。具有此类突变的菌株的具体实例包括具有脱敏的邻氨基苯曱酸合酶的大肠杆菌SV164菌抹和通过将质粒pGH5(WO94/08031)转入大肠杆菌SV164获得的菌抹，所述质粒pGH5包含突变的serA基因，该突变的serA基因编码对反馈抑制脱敏的磷酸甘油酸脱氢酶。用于衍生本发明的L-色氨酸生产菌的亲本抹的实例还包括导入了色氨酸操纵子的菌抹，所述色氨酸操纵子包含编码脱敏的邻氨基苯曱酸合酶的基因(特开昭57-71397号，特开昭62-244382号，美国专利4,371,614)。此外，可以通过增加色氨酸操纵子(trpBA)中编码色氨酸合酶的基因的表达来赋予L-色氨酸生产能力。色氨酸合酶由a和P亚基组成，这两种亚基分別由trpA和trpB编码。另外，可以通过增强异柠檬酸裂合酶-苹果酸合酶操纵子的表达来改进L-色氨酸生产能力(W02005/103275)。L-脯氨酸生产菌用于衍生本发明的L-脯氨酸生产菌的亲本抹实例包括、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌抹，如ilvA基因缺陷并且能够产生L-脯氨酸的大肠杆菌702ilvA(VKPMB誦8012)(EPU72433)等。可以通过增强涉及L-脯氨酸生物合成的1种以上的基因的表达来改进本发明的细菌。用于L-脯氨酸生产菌的优选基因的实例包括编码解除了L-脯氨酸反馈抑制的谷氨酸激酶的proB基因(德国专利第3127361号)。此外，可以通过增加编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白的l种以上的基因的表达来改进本发明的细菌。这些基因包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041A2)。具有L-脯氨酸生产能力的属于埃希氏菌属的细菌的实例包括下列大肠杆菌菌抹NRRLB-12403和NRELB-12404(英国专利第2075056号)，VKPMB-8012(俄罗斯专利申请2000124295)，德国专利第3127361中描述的质粒突变体，BloomF.R.等描述的质粒突变体(The15thMiamiwintersymposium(第15届迈阿密冬季研讨会)，1983,第34页)等等。L-精氨酸生产菌用于衍生本发明的L-精氨酸生产菌的亲本抹包括、但不限于下述属于埃希氏菌属的菌抹，如大肠杆菌237菌抹(VKPMB-7925)(美国专利申请公开2002/058315Al)及其带有突变的N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamatesynthase)的衍生菌抹(俄罗斯专利申请2001112869),大肠杆菌382菌抹(VKPMB-7926)(EP1170358A1)，引入了编码N-乙酰谷氨酸合成酶(N-acetylglutamatesynthetase)的argA基因的精氨酸生产4朱(EP1170361A1),等等。用于衍生本发明的L-精氨酸生产菌的亲本菌抹的实例还包括编码L-精氨酸生物合成酶的1种以上基因的表达增加的菌抹。相关基因的实例包括N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶基因(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶基因(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶基因(argD)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶基因(argF)、精氨琥珀酸合成酶基因(argG)、精氨琥玉白酸裂合酶基因(argH)和氨曱酰基磷酸合成酶基因(carAB)。L-缬氨酸生产菌用于衍生本发明的L-缬氨酸生产菌的亲本抹的实例包括但不限于经修饰而过表达ilvGMEDA操纵子的菌抹(美国专利5,998,178)。优选将衰减所需的ilvGMEDA操纵子的区域移除以使操纵子的表达不会被产生的L-缬氨酸所削弱。此外，优选将操纵子中的ilvA基因破坏从而降低苏氨酸脱氨酶的活性。用于衍生本发明的L-缬氨酸生产菌的亲本抹的实例还包括具有氨酰t-RNA合成酶突变的突变株(美国专利5,658,766)。例如，可以使用大肠杆菌VL1970,该菌抹在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变。已将大肠杆菌VL1970在1988年6月24日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(1DorozhnyProezd.,1Moscow117545,Russia),登录号为VKPMB画4411。此外，还可以使用生长需要硫辛酸(lipoicacid)的突变抹和/或缺乏H+-ATP酶的突变株(WO96/06926)作为亲本抹。L-异亮氨酸生产菌用于衍生本发明的L-异亮氨酸生产菌的亲本林的实例包括、但不限于对6-二曱基氨基嘌呤有抗性的突变林(特开平5-304969号)，对异亮氨酸类似物如硫代异亮氨酸(thiaisoleucine)和异亮氨酸氧肟酸具有抗性的突变抹，以及对DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突变林(特开平5-130882号)。此外，还可以使用以编码涉及L-异亮氨酸生物合成的蛋白(如苏氨酸脱氨酶、乙酰羟酸合酶(acetohydroxatesynthase)等)的基因转化的重组菌林(特开平2-458号，FR0356739,和美国专利第5,998,178号)作为亲本林。<l-2>kdp系统的增强本发明的微生物可以通过对诸如上述的具有L-氨基酸生产能力的属于肠杆菌科的微生物进行修饰使得kdp系统增强而得到。但是，也可以在进行修饰使kdp系统增强后，再赋予L-氨基酸生产能力。而且，kdp系统的增强，可以如下文所述地通过进行》I^H吏得kdp^^从子或构成该操纵子的1种或2种以上的基因的表达量增加来实现，它们的表达量的增加可以是表达调节区域修饰(如启动子修饰)等所致内因性基因表达增加，也可以是包含操纵子或各基因的质粒的导入等所导致的外因性基因表达增加。而且，这些还可以组合使用。此外，通过增加kdp操纵子或构成该操纵子的各基因的翻译量，也可以增强kdp系统。在本发明中，"kdp系统"是指在钾离子摄入系统(high-affinitypotassiumtransportsystem)中起作用的P型ATP酶(potassium-transportingP-typeATP酶，钾转运P型ATP酶)(EC3.6.3.12)。此外，"经过修饰而增强了kdp系统"意思是基于所述P型ATP酶的钾离子摄入增强，更具体地是指微生物经过修饰而增强了所述P型ATP酶的活性。这相当于，例如，与野生4朱或非修饰林相比较，平均每个细胞的P型ATP酶分子数增加，或者平均每个P型ATP酶分子的活性上升。优选进行修饰，使得与野生抹或非修饰株相比较，P型ATP酶活性提高至每个菌体平均150%以上、优选200%以上，更希望提高至每个菌体平均300%以上。此外，作为比较对象的属于肠杆菌科的野生型微生物，可以列举出例如大肠杆菌MG1655(ATCC47076)、/W画麵融、AJ13355(FE腹BP-6615)等。kdp操纵子的表达量上升与否的确认可以通过将kdp操纵子的mRNA的量与野生型或者非修饰林相比较来确认。作为表达量的确认方法，可以列举出Northern杂交、RT画PCR(Molecularcloning(ColdspringHarborLaboratoryPress,ColdspringHarbor(USA),2001))。只要与野生抹或者非修^饰抹相比较表达量上升即可，优选例如与野生抹、非修饰抹相比，上升1.5倍以上、更优选2倍以上、更优选3倍以上。P型ATP酶活性例如可以这样测定从具有kdp系统的微生物中提取kdp系统并进行纯化(参照Siebers，A.等，Eur丄Biochem.178，131(1988)),然后测定其ATP酶活性的方法(参照Arnold,A.等，Anal.Biochem.71,209(1976》。kdp系统由kdp操纵子所编码的3个亚单位构成，在大肠杆菌中，各亚2单位基因的注释如下。kdpA高亲和性钾转运系统的ATP酶，A链kdpB高亲和性钾转运系统的ATP酶，B链kdpC高亲和性钾转运系统，P-型ATP酶，C链本发明中的"kdp操纵子"是指编码所述P型ATP酶的A亚单位、B亚单位、C亚单位的基因群，A亚单位由kdpA基因编码，B亚单位由kdpB基因编码，C亚单位由kdpC基因编码。在本发明中，kdp操纵子还可以包含kdpA、kdpB和kdpC基因以外的基因。大肠杆菌kdp操纵子的碱基序列如SEQIDNO:l所示。该操纵子包含下述的6个基因，它们在SEQIDNO:l的编码区域(含终止密码子)的位置分别如下。kdpA、kdpB、kdpC、kdpD和kdpE所编码的氨基酸序列分别如SEQIDNO:2-6所示。kdpF:457~546kdpA:546-2219kdpB:2242-4290kdpC:4299-4871kdpD:4864-7548kdpE:7545-8222尸awtoe"的kdp操纵子的碱基序列如SEQIDNO:7所示。该操纵子包含下述的4个基因，它们在SEQIDNO:7的编码区域(含终止密码子)的位置分别如下。kdpA、kdpB、kdpC和kdpD所编码的氨基酸序列分别如SEQIDNO:8~11所示。kdpA:543-2225kdpB:2228~4273kdpC:4284-4853kdpD:4867-7542此外，arawa^s的kdpE基因的石威基序列和该基因编码的氨基酸序列分别如SEQIDNO:12、13所示。在本说明书中，有时将kdpA、kdpB、kdpC、kdpD和kdpE编码的蛋白质分别记作KdpA、KdpB、KdpC、KdpD和KdpE。户awtoea与大肠杆菌的KdpA、KdpB、KdpC的氨基酸序列的分别比对如图6~8所示。与大肠杆菌中共有的序列显示在比对的下部。此外，KdpA、KdpB、KdpC各自的共有序列如SEQIDNO:5759所示。与大肠杆菌的KdpA、KdpB、KdpC的同源性分别为75.36%、81.35%、59.57%。埃希氏菌的kdpA基因登录于GenBankNP_415226.1Reportspotassium-transpo…[gi:16128674],kdpB基因登录于NP—415225.Reportspotassium-transpo…[gi:16128673]，kdpC基因登录于NP—415224.Reportspotassium-transpo…[gi:16128672],kdpD基因登录于NP—415223.ReportsfUsedsensoryhis…[gi:16128671],kdpE基因登录于NP—415222.ReportsDNA-bindingrespo…[gi:16128670]。而且，kdp操纵子也可以基于与上述示例的基因间的同源性，从埃希氏菌属、泛菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属、耶尔森氏菌属(Yersinia)等属于肠杆菌科的微生物中克隆。可用于本发明的kdp搡纵子还可以这样取得基于序列已经阐明的属于肠杆菌科的微生物的碱基序列制作引物，使用该引物通过以属于肠杆菌科的微生物的染色体DNA为模板的PCR法(PCR:聚合酶链式反应；参照White,T丄等，TrendsGenet5，185(1989))，可以获取kdp操纵子及其相邻区域(包括其上游区域的表达调控区域)。其它微生物的kdp操纵子的同源物也可以同样获得。kdp操纵子同源物是指其它微生物来源的、与大肠杆菌或户""^e"的kdp操纵子显示高相似性、且编码摄入钾离子的P型ATP酶的基因。其它微生物来源的kdpA基因、kdpB基因和kdpC基因是指下述基因，所述基因与SEQIDNO:2、3、4、8、9和10的氨基酸序列全长具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、特别优选97。/。以上的同源性，并且编码构成具有摄入钾的P型ATP酶活性的蛋白质的亚单位。各亚单位也可以是编码具有在SEQIDNO:2、3、4、8、9和10的氨基酸序列中1个或数个位置上取代、缺失、插入或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列的保守变体的基因，只要不损害它们所构成的P型ATP酶的活性即可。这里，"数个，，是指虽然因氨基酸残基的种类或其在蛋白质的立体结构中的位置而异，但优选为220个、更优选2-10个、特別优选2~5个。此外，这样的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等还包括因基于携带kdp操纵子的微生物的个体差异、种间差异等情形而天然发生的突变(mutant或variant)而产生的那些取代、缺失、插入、添加或倒位。上述取代优选为保守取代，所述保守取代是一种功能上无变化的中性突变。关于保守突变，当取代位点是芳香族氨基酸时为Phe、Trp和Tyr之间、当取代位点是疏水氨基酸时为Leu、lie和Val之间、当是极性氨基酸时为Gln和Asn之间、当是.碱性氨基酸时为Lys、Arg和His之间、当是酸性氨基酸时为Asp和Glu之间、当是具有羟基的氨基酸时为Ser和Thr之间的相互耳又代的突变。作为保守取代可列举用Ser或Thr取代Ala;用Gln、His或Lys取代Arg;用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn;用Asn、Glu或Gln取代Asp;用Ser或Ala取代Cys;用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln;用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu;用Pro取代Gly;用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His;用Leu、Met、Val或Phe耳又4<lie;用Ile、Met、Val或Phe取4戈Leu;用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys;用Ile、Leu、Val或Phe取代Met;用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe;用Thr或Ala取代Ser;用Ser或Ala取代Thr;用Phe或Tyr取代Trp;用His、Phe或Trp取代Tyr;和用Met、Ile或Leu取代Val。此外，kdp操纵子随宿主微生物的不同而具有不同的基因筒并性，因此，可以替换成在kdp搡纵子所导入的宿主中容易使用的密码子。相似地，kdp操纵子只要能够通过扩增来提高L-氨基酸生产即可，编码出的各亚单位的N末端侧和/或C末端侧可以延长或削减。例如延长、削减的长度以氨基酸残基计为50个以下、优选20个以下、更优选10个以下、特别优选5个以下。更具体地，可以从SEQIDNO:2、3、4、8、9和10的氨基酸序列的N末端侧延长或削减50个氨基酸5个氨基酸、或者从C末端侧延长或削减50个氨基酸~5个氨基酸。kdp操纵子还可以是这样的DNA，所述DNA与具有与SEQIDNO:l或7的碱基序列或该碱基序列中的各编码区域的碱基序列互补的序列的DNA、或可从具有这些碱基序列的DNA制备的探针在严格条件下杂交，并且编码具有kdp系统即摄入钾离子的P型ATP酶的活性的蛋白质。这里，"严格条件，，是指形成所谓特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件。将该条件明确的数值化是困难的，举一实例，有这样的条件在该条件下，具有高同源性的DNA，例如具有70%以上，优选80。/。以上，更优选90%以上，甚至更优选95%以上，特别优选具有97%以上同源性的DNA相互杂交，而同源性较之为低的DNA则不互相杂交；或者是这样的条件在与常规Southern杂交的洗涂条件即60°C,lxSSC、0.1%SDS优选0.1xSSC、0.1。/。SDS相当的盐浓度下进行杂交。探针可以具有kdp操纵子的部分序列。这样的探针可以采用本领域技术人员知晓的方法，以基于各基因的碱基序列制备的寡核苷酸为引物，以包含各基因的DNA片段为模板，通过PCR反应来制备。而且，当作为探针使用300bp左右长度的DNA片段时，作为在上述条件下进行杂交后的洗涤条件，可以列举出50。C、2xSSC,0.1%SDS中洗涤1次或2-3次的条件。这样的与kdp操纵子同源的基因，例如可以通过采用定点突变方法对SEQIDNO:l或7的碱基序列中的编码区域进行修饰来获得，所述修饰使得编码的蛋白的特定位点的氨基酸残基包含取代、缺失、插入或增加。此外，还可以通过诸如以下的传统^^知的突变处理来获得。可以采用下述方法作为突变处理通过基因重组人为地在kdp操纵子中导入突变，来获得编码高活性kdp系统的操纵子，所述方法有用羟胺等对SEQIDNO:l或7的碱基序列或该碱基序列中的编码区域的序列进行体外处理的方法，对保持该基因的微生物例如属于肠杆菌科的微生物采用紫外线或使用N-曱基-N，-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或甲磺酸乙酯(EMS)等在常规突变处理中使用的突变剂来进行处理的方法，易错(error-prone)PCR(Cadwell，R.C.PCRMeth.Appl.2，28(1992))、DNA改组(Stemmer，W.P.Nature370，389(1994))和SffiP-PCR(Zhao,H.NatureBiotechnol.16,258(1998))。这些kdp操纵子的同源物是否编码P型ATP酶，例如可以通过下述方法来确定将这些基因导入具有L-氨基酸生产能力的属于肠杆菌科的微生物，测定L-氨基酸的生产能力是否提高，或者按上述方法测定P型ATP酶活性。而且，上述关于变体和同源物的描述也适用于后述的kdpD基因和kdpE基因。对属于肠杆菌科的微生物进行修饰使得kdp操纵子或构成该操纵子的1种或2种以上基因的表达量增加，可以按照前述的、对细菌进行修饰使得目的基因的表达增强的方法来进行。即，可以通过提高kdp操纵子或构成该操纵子的各基因的表达的拷贝数、和/或将该操纵子的启动子等表达调节序列更换成强力的启动子等表达调节序列、或者将构成该操纵子的各基因置于强力表达调节序列的调控下，来增强该操纵子或各基因的表达。构成kdp操纵子的各基因的表达的增强可以以操纵子单元的形式进行，此外还可以各基因分别进行，优选以操纵子单元的形式进行。当各基因分别地增强表达时，增强的基因可以是构成kdp操纵子的任何基因，优选至少为kdpA、kdpB和kdpC基因中的任何1种或2种以上，更优选增强kdpA、kdpB和kdpC基因全部这三个基因的表达。此外，对各基因的核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔区的序列进行修饰，使得构成kdp操纵子的各基因的翻译量增加，这样也可以增强kdp系统。而且，已知kdp操纵子的表达受kdpD基因和kdpE基因编码的双成分调控系统KdpDE的调控(J.Bacteriol"1992Apr.;174(7):2152-59.),通过增加kdpD基因和kdpE基因的表达量也可以增加kdp操纵子的表达量。<2〉本发明的L-氨基酸的生产方法通过在培养基中培养本发明的微生物，使L-氨基酸生成并蓄积在该培养基中，并且从该培养基中收集L-氨基酸，能够生产L-氨基酸。用于培养的培养基可以使用含有碳源、氮源、无机盐类以及视需要的氨基酸、维生素等有机微量营养元素的常规培养基。可以使用合成培养基或者天然培养基。培养基中使用的碳源和氮源可以是任意种类的，只要所培养的菌抹能够利用即可。碳源可以使用糖类，如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和糖蜜，此外也可以单独使用或者与其它碳源组合使用有机酸，如乙酸和柠檬酸，以及醇，如乙醇。作为氮源，可以使用氨、铵盐如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵或乙酸铵，或者使用硝酸盐。作为有机痕量营养物，可以使用氨基酸、维生素、脂肪酸和核酸，以及包含这些营养物的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白水解物等，并且在使用生长需要氨基酸等营养物的营养缺陷型突变菌抹时，优选补充所需要的营养物。特别是，当使用调整为能够使L-谷氨酸析出的条件的液体培养基时，在培养基中添加泛酸，能够更有效地晶析(WO2004/111258号小册子)。无机盐类可以使用磷酸盐、镁盐、钾盐、铁盐、锰盐等。培养优选控制在发酵温度2045。C、pH3-9的条件下进行通气培养。当培养中pH下降时，可以例如添加碳酸钙，或用氨气等碱来中和。在这样的条件下，优选进行约10120小时左右的培养，在培养液中蓄积目的氨基酸。此外，可以使用调整为能够析出L-谷氨酸的条件的液体培养基，在使L-谷氨酸在培养基中析出的同时进行培养。作为L-谷氨酸析出的条件，可以列举出例如pH5.0-4.0、优选pH4.5-4.0、更优选pH4.3~4.0、特别优选pH4.0。此外，当使L-谷氨酸在培养基中析出时，预先添加L-谷氨酸、L-赖氨酸晶体作为晶种，能够更有效地进行晶析(欧洲专利1233069号、欧洲专利申请公开1624069号)。作为从培养结束后的培养液中收集L-氨基酸的方法，可以采用公知的回收方法来进行。例如，可以采用从培养液中除去菌体后进行浓缩晶析的方法，或者通过离子交换色谱等来收集。当在能够使L-谷氨酸析出的条件下进行培养时，析出到培养液中的L-谷氨酸可以采用离心分离或过滤等来收集。这种情况下，可以在使溶解在培养基中的L-谷氨酸晶析后，一并进行分离。而且，在生产^咸性氨基酸时，可以采用通过下述方法进行发酵、并回收目的碱性氨基酸的方法来进行生产将培养中的pH调控为6.5-9.0、将培养结束时的培养基的pH调控为7.2-9.0,将发酵中发酵罐内压力调控为正，或者向培养基中供给二氧化碳气或含二氧化碳气的混合气体，使得存在培养基中的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子至少为2g/L以上的培养期，将所述碳酸氬根离子和/或碳酸根离子作为以碱性氨基酸为主的阳离子的抗衡离子(参照特开2002-065287号、美国专利申请公开第2002025564号)。实施例以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明。〔参考例1〕对人Red基因产物具有抗性的尸^mtoea菌抹的构建为了在a"a"a^s中进行kdp4喿纵子的扩增，构建了用于高效率地进行称作"Red驱动整合"或"Red介导整合，，的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97.6640-6645(2000))的受体菌。首先，构建了表达入的gam、bet和exo各基因(以下称"入Red基因，，)的新辅助质粒RSF-Red-TER(图1)。详细描述见参考例2。该质粒可以用于具有不同基因背景的广域宿主。理由是l)其具有在许多革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌甚至植物中都能够稳定保持的RSFIOIO广宿主域质粒的复制子(Scholz，等，1989;Buchanan-Wollaston等，1987)，2从Red基因、gam、bet和exo基因受到能够被许多细菌的RNA聚合酶识别的PlacUV5启动子的调节(例如、Brunschwig，E.和Darzins，A.,Gene,111，1,35-41(1992);Dehio,M.等，Gene,215,2，223-229(1998))，3)自调节因子PlacUV5-lacI、以及大肠杆菌rrnB操纵子的p非依赖性转录终止子(TrrnB)降低入Red基因的本底表达水平(Skorokhodova，A.Yu等，Biotekhnologiya(俄语)，5,3-21(2004))。而且，RSF-Red-TER质粒包含果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因(sacB)，利用该基因，可以在含蔗糖的培养基中从细胞回收质粒。在大肠杆菌中，PCR反应生成的DNA片段与由RSF-Red-TER质粒提供的短侧翼区域一起发生整合的频率与使用pKD46辅助质粒(Datsenko，K.A.,Wanner,B丄.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97，6640-6645,(2000))时一样高。然而ARed基因的表达对awa"a";显示毒性。用RSF-Red-TER辅助质粒转化的细胞在含IPTG(异丙基-P-D-硫代半乳糖苷，lmM)和适当抗生素(氯霉素25吗/ml或卡那霉素40昭/ml)的LB培养基上显示非常低的生长速度，XRed介导的重组(、Red-mediatedrecombination)的效率即使能够观察到，也是非常低的(10-s)。选择了对XRed基因的全部3个基因的表达均具有抗性的户a"toea突变菌才朱。为此，通过电穿孔将RSF-Red-TER质粒导入Pa"toeaSC17抹(美国专利第6，596，517号)。培养18小时后，得到了约106个转化抹，有10个克隆的菌落尺寸大，其余的菌落都非常小。培养18小时后，大菌落为约2mm，小菌落为约0.2mm。将培养延长至24小时，小菌落不再继续生长，而大菌落继续生长。将对XRed基因的全部3个基因(gam、bet和exo)的表达均具有抗性的大菌落Pawtoeaa"cma^突变菌抹中的一个用于进一步分析。从1个大菌落克隆和数个小菌落克隆中分离出RSF-Red-TER质粒DNA，用其再次转化大肠杆菌MG1655，考察了质粒合成Red基因的活性产物的能力。由所得转化体中Red依赖性整合的对照实验可知，只有从大菌落克隆分离的质粒可引起Red依赖性整合所必需的人Red基因的表达。为了考察所选的大菌落克隆中是否发生Red介导的整合，使用PCR反应生成的下述线性DNA片段进行了电穿孑L，所述DNA片段设计为包含Km11标记和与hisD基因同源的40bp侧翼区域，并且整合到朋a朋^的hisD基因的Smal识别位点。将2个小菌落的克隆用作对照。的hisD基因的核苷酸序列示于SEQIDNO:14。PCR中使用SEQIDNO:15和16的寡核苷酸作为引物，使用pMW118-(XattL-Kmr-XattR)质粒作为模板。使用对XRed基因不具有抗性的2个小菌落的克隆作为对照。pMW118-(XattL-Km""-XattR)质粒的构建在参考例3中详细描述。RSF-Red-TER质粒能够通过该质粒上的lacl基因诱导Red基因的表达。对两种诱导条件进行了考察。在第1组中，电穿孔1小时前添加IPTG(lmM);在第2组中，在用于制备可电穿孔细胞的培养开始时添加IPTG。携带来自大菌落克隆的RSF-Red-TER的细胞的后代的生长速度并不显著地低于不带有SC17质粒的菌抹。添加IPTG仅使这些培养物的生长速度有些许降低。另一方面，小菌落克隆的后代在未添加IPTG的条件下生长非常緩慢，而加以诱导后，生长基本上停止。对大菌落克隆的后代的细胞进行电穿孔后，有许多Kn/克隆(短诱导时间为18个克隆，延长诱导时间后为约100个克隆)生长。考察的全部100个克隆均具有His-表现型，通过PCR对20个克隆进行了确认，结果确认了这些细胞的染色体结构与预想的相同。另一方面，对小菌落克隆的后代的细胞即使进行电穿孔也未能得到整合的菌林。使所得大菌落克隆在含7%蔗糖的平板上生长，并使质粒脱落，用RSF-Red-TER再次进行转化。将不携带质粒的菌抹命名为SC17(0)。该菌抹已于2005年9月21保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(RussianNationalCollectionofIndustrialMicroorganisms(VKPM)，GNIIGenetika)(地址Russia,117545Moscow,1Dorozhnyproezd.1)，保藏号VKPMB-9246。上述再次转化后生长出的全部克隆均与亲本菌抹克隆SC17(0)—样具有较大的菌落尺寸。在用RSF-Red-TER质粒再次转化的SC17(0)抹中进行了Red介导的整合实验。对于所得的3个独立转化抹，使用与前述实验所用的相同的DNA片段进行了考察。采用了短诱导时间(电穿孔1小时前)。在各实验中，生长出超过10个的Kn^克隆。测试的全部克隆均具有His-表现型。这样，选择出突变菌抹，将其命名为对XRed基因的表达具有抗性的SC17(0)。该菌抹可以作为用于对a"a"a^染色体的Red依赖性整合的合适受体菌。〔参考例2〕辅助质粒RSF-Red-TER的构建辅助质粒RSF-Red-TER的构建方案如图2所示。作为构建的最初步骤，设计了RSFsacBPlacMCS载体。为此，分别使用SEQIDNO:17、18、19、20的寡核苷酸，通过PCR扩增了包含pACYC184质粒的cat基因和枯草芽孢杆菌的sacB基因的结构部分的DNA片段。这些寡核苷酸的5'末端分别包含对进一步克隆而言必需且便利的BglII、SacI、Xbal、和BamHI限制酶位点。将所得1.5kb的sacB片段克隆到此前获得的pMWl19-Placlacl载体的XbaI-BamHI位点。该载体是依照与pMW118-PlaclacI载体的相关描述(Skorokhodova,A.Yu等，Biotekhnologiya(俄语)，5,3-21(2004))相同的方法构建的。只是该载体包含来自pMW219而不是pMW218质粒的多接头位点。接下来，将上述的1.0kb的cat片段用BglII和Sacl处理，并克隆到在先步骤中所得的RSF-PlaclacIsacB质粒的BamHI-SacI位点。所得质粒pMW-PlaclacIsacBcat包含PlacUV5-lacI-sacB-cat片段。为了将该片段亚克隆到RSF1010载体，将pMW-PlaclacIsacBcat用BglII消化，并用DNA聚合酶I克列诺片段处理使末端平滑化，然后用Sacl切割。从1%琼脂糖凝胶中洗提出pMWP^lacIsacBcat质粒的3.8kb的BglII-SacI片段，将其与用Pstl和Sacl处理的RSF1010载体连接。用连接混合液转化大肠杆菌TG1，将其在含氯霉素(50mg/L)的LB培养基上铺板。对从生长出的克隆中分离的质粒进行限制酶分析，得到了RSFsacB质粒。为了构建RSFsacBPlaeMCS载体，以SEQIDNO:21和22的寡核苷酸为引物，以pMWl19-PlaclacI质粒为模板，通过PCR扩增了包含P^uv5启动子的DNA片段。将所得的146bp片段用Sacl和Notl消化，将其与RSFsacB质粒的Sacl-Notl大片段连接。然后，以SEQIDNO:23和24的寡核香酸为引物，以pKD46质粒(Datsenko,K.A.，Wanner,B丄.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，6640-6645，(2000))为冲莫板，通过PCR扩增了包含、Reda(3Y基因和转录终止子tL3的2.3kb的DNA片段。将所得片段克隆到RSFsacBPlacMCS载体的Pvul-Notl位点。这样，设计了RSFRed质粒。为了排除Red基因的通读转录，将大肠杆菌rrnB操纵子的p-依赖性转录终止子插入到cat基因与PlacUV5启动子之间。为此，以SEQIDNO:25和22的寡核苷酸为引物，以大肠杆菌BW3350的染色体为模板，通过PCR扩增了包含P,^vs启动子与TrrnB终止子的DNA片段。将所得的这些片段用Kpnl处理，并进行连4妄。然后，以SEQIDNO:22和26的寡核苷酸为引物，通过使用寡核苷酸的PCR扩增了包含PiacUV5*TrrnB这两者的0.5kb片段。将所得DNA片段用EcoRI消化，并用DNA聚合酶I克列诺片段处理使末端平滑化，然后用BamHI切割，将其与RSFsacBPlacMCS载体的Ecll36II-Bamffl大片段连接。将所得质粒命名为RSF-Red-TER。〔参考例3〕pMW118-(XattL-KmLXattR)质粒的构建pMW118-(人attL-Kmr-、attR)质粒是这样构建的在pMW118-attL-Tc-attR(WO2005/010175)质粒中，用pUC4K质粒的卡那霉素抗性基因取代四环素抗性标记基因。为此，将pMW118-attL-Tc-attR质粒的EcoRI-HindIII大片段与pUC4K质粒的HindlII-Pstl(676bp)和EcoRI-HindlII(585bp)这2个片段连接。作为基础的pMWl18-attL-Tc-attR是通过连接以下4个片段而得到的。1)使用引物PI(SEQIDNO:27)和P2(SEQIDNO:28)从大肠杆菌W3350(包含人原噬菌体)染色体的相当于attL的区域通过PCR扩增得到的具有attL(SEQIDNO:29)的BglII-EcoRI片段(l14bp)。这些引物包含BglII和EcoRI的附加识别位点。2)使用引物P3(SEQIDNO:30)和P2(SEQIDNO:31)从大肠杆菌W3350(包含X原噬菌体)染色体的相当于attR的区域通过PCR扩增得到的具有attR(SEQIDNO:32)的PstI-HindIII片段(182bp)。这些引物包含PstI和HindIII的附加识别位点。3)pMW118-ter—rrnB的BglII誦HindIII大片l殳(3916bp)。质粒pMWl18-ter—rrnB是通过连接以下3个DNA片段而得到的。.pMW118的具有AatII-EcoRI片段的大片段(2359bp)。该片段是通过用EcoRI消化pMW118、并用DNA聚合酶I克列诺片段进行处理、再用AatII进行消化而得到的。具有氨千青霉素抗性(ApR)的基因bla的pUC19的AatII-BglII小片1殳(1194bp)。该片段是《吏用引物P5和P6(SEQIDNO:33和34)对pUC19质粒的相应区域进行PCR扩增而得到的。这些引物中包含PstI、AatII和BglII的附加识别位点。-转录终止子ter—rrnB的BglII-PstI小片段(363bp)。该片段是通过使用引物P7和P8(SEQIDNO:35和36)对大肠杆菌MG1655染色体的相应区域进行PCR扩增而得到的。这些引物包含PstI、BgH和Pstl的附加识别位点。4)具有四环素抗性基因和ter一thrL转录终止子的pML-Tc-ter—thrL的EcoRI-PstI小片段(1388bp)(SEQIDNO:37)。pML-丁c-ter—thrL质粒是通过如下的2个步骤获得的。-将pML-MCS质粒(Mashko,S.V.等，Biotekhnologiya(俄语)，2001，no.5，3-20)用Xbal和BamHI消化，然后将大片段(3342bp)与包含ter—thrL终止子的XbaI-BamHI片段(68bp)连接。该包含terJhrL终止子的片段是使用引物P9和P10(SEQIDNO:38和39)对大肠杆菌MG1655染色体的相应区域进行PCR而得到的。这样，得到了pML-ter—thrL质粒。这些引物包含Pstl、Xbal和BamHI的附加识别位点。.将pML-ter—thrL质粒用Kpnl和Xbal消化，然后用DNA聚合酶I克列诺片段处理，再与具有四环素抗性基因的pBR322的EcoRI-Van911小片段(1317bp)连接，从而得到了pML-Tc-ter—thrL质粒。而且，将pBR322用EcoRI和Van911消化，然后再用DNA聚合酶I克列诺片段进行了处理。〔实施例1〕kdp操纵子的启动子取代抹的取得(l)谷氨酸生产质粒RSFPPG的构建构建了L-谷氨酸生物合成系统基因，prpC基因(国际公布2006/051660号小册子)、ppc基因、gdh基因(欧洲申请公布0999282号说明书)被扩增的质粒RSFPPG。设计了引物}(SEQIDNO:40)和引物2(SEQIDNO:41)，用于扩增RSFCPG(欧洲申请公开1233068号说明书)的gltA基因的ORF以外的部分。使用该引物，以RSFCPG为模板进行PCR,获得了约i4.9kb的片段。另一方面，对于prpC,使用引物3(SEQIDNO:42)和引物4(SEQIDNO:43),36以大肠杆菌W3110抹的染色体DNA为模板进行PCR,获得了约1.2kb的片段。将两PCR产物分别用BglII和Kpnl处理并进行连接，然后转化大肠杆菌JM109抹。收集出现的所有菌落，以混合物的形式提取质粒。用该质粒混合物转化柠檬酸合酶(CS)缺损林大肠杆菌ME8330抹，将其涂布于含50mg/L尿嘧啶、5mg/L硫胺-HCl的M9极限培养基(1L纯水中含葡萄糖5g、硫酸镁2mM、磷酸二氢钾3g、氯化钠0.5g、氯化铵lg、磷酸氢二钠6g的培养基)。从出现的菌抹中提取质粒，命名为RSFPPG。在L-谷氨酸生产菌NP106抹中导入上述质粒RSFPPG，构建了L-谷氨酸生产菌NP106/RSFPPG(本菌株称为"NA1抹")。NP106抹是如下述地获得的。将前文例示的尸tmtoeaa"a""toAJ13601抹在LBGM9液体培养基中于34'C振荡培养一夜，稀释到每个平板为100200个菌落，将其涂布在含四环素12.5mg/L的LBGM9平板上。对于出现的菌落，将其转印到含四环素12.5mg/L和氯霉素25mg/L的LBGM9平板上，选择氯霉素敏感性的菌株，从而获得了pSTVCB脱落的菌抹，将其命名为G106S。而且，将G106S抹在LBGM9液体培养基中于3fC振荡培养一夜，稀释到每个平板为100~200个菌落，将其涂布在不含药物的LBGM9平板上。对于出现的菌落，将其转印在含四环素12.5mg/L的LBGM9平板和不含药物的LBGM9平板上，选择四环素敏感性菌林，从而获得了RSFCPG脱落的菌抹，将其命名为NP106。这样获得的NP106抹不再具有AJ13601抹所携带的RSFCPG和pSTVCB这2个质粒。(2)kdp操纵子的启动子已更换成tac启动子的菌抹的取得i)P.ananatisSCH(0)抹的构建(其冲，将Ptac启动子连接到XattL-KmR-人attR的下游而得到的序列(？iattL-KmRAattR-Ptac)被整合到lacZ基因的上游)将Ptac启动子整合到户."加"afeSC17(0)抹染色体上的lacZ基因的上游。LacZ基因上游的P.染色体区域的结构如图3所示。尸朋toea麵"如的yghU、scrK、和lacZ基因的碱基序列如SEQIDNO:44、45和46所示。Ptac启动子的-35区的序列为ttgaca。IDNO:48)、以及作为模板的pDR540质粒(法玛西亚公司，瑞典)，通过PCR扩增了Ptac启动子片段。两个引物均在5'末端包含BglII识别序列。此外，引物2包含Ptac的3'末端位点的46个核芬酸、SD序列和lacZ基因的编码区域的最初部分。而且，以pMWl18-(XattL-KmR-入attR)为模板，使用引物3(SEQIDNO:49)和引物4(SEQIDNO:50)通过PCR扩增了包含与？i的attL和attR位点相邻的可除去的Km抗性基因的DNA片段。所得片段在一个末端具有用于与tac启动子片段连接的BglII识别位点，在另一个末端具有与awawafe染色体同源的、用于整合到细菌基因组的、相当于位于scrK基因的上游的序列的位点(图3)。将2个PCR生成生成片段用BglII进行处理，用T4DNA连接酶在体外进行连接。将连接反应液用于针对染色体的X依赖性整合。将辅助质粒RSF-Red-TER用作人噬菌体Red基因的载体。为了得到户a"/oea的电转化感受态细胞，用RSF-Red-Ter质粒进行转化，将SC17(0)抹在含50吗/ml氯霉素的LB培养基上于34。C培养一夜。接下来，将培养液用含50吗/ml氯霉素的新鲜LB培养基稀释100倍，34。C通气下进行生长使得OD6o。为0.3。然后，添加lmM的IPTG，继续培养至OD,为0.7。将10mM的样品用等量的去离子水洗涤3次，悬浮在40|!1的冷10%甘油中。在即将开始电穿孔之前，将溶解在5ji1去离子水中的体外扩增DNA片段100-200ng添加到细胞悬浮液中。操作使用细菌电穿孔装置("BioRad"美国、商品号165-2089，版本2-89)进行。使用的脉沖的参数为电场强度20kV/cm，脉冲时间5毫秒。电穿孔后，立即在细胞悬浮液中添加补充有葡萄糖(0.5%)的LB培养基lml。然后，使细胞在34。C通气下生长2小时，在含40吗/ml的氯霉素的LB固体培养基上进行铺板，34。C温育一夜。用选择出的KmK的整合体在添加了IPTG(lmM)和蔗糖(5g/L)的LB培养基平板上划线，34。C进行生长，从而形成单个菌落。为了将RSF-Red-TER辅助质粒从整合体中除去，分离了KmR、CmS变体。通过碱基序列测定确认了选择出的KmR、CmS菌落的染色体结构。ii)用tac启动子取代kdp操纵子启动子采用常规方法合成了如SEQIDNO:51和52所示的2条合成DNA引物。SEQIDNO:51所示的引物的结构是在a"a"a^s的kdp操纵子上游的同源序列上连接XattL-KmR-、attR-Ptac的5'端的同源序列。SEQIDNO:52的引物的结构是在a"a"a^的kdp操纵子的包含最初的起始密码子的5'端的互补序列上连接？tattL-KmR-XattR-Ptac的3'端的互补序歹'J。使用这些引物、并使用i)中选择出的菌抹的染色体DNA作为模板，进行PCR，扩增得到了约1.6kbp的片段，其中，XattL-KmR-^attR-Ptac的序列的5，端上连接了kdp操纵子上游的同源序列，并且？iattL-KmR-iattR-Ptac的序列的3'端上连接了kdp操纵子的包含最初的起始密码子的5'端的同源序列。对上述PCR片段进行纯化，按照常规方法通过电穿孔导入SC17(0)/RSF-Red-TER中。将导入了PCR片段的SC17(0)/RSF-Red-TER林在含40mg/L卡那霉素的L培养基(细菌蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl5g、琼脂15g溶于纯水1L而成的培养基，pH7.0)进行选择，得到了约20个菌落作为转化体。使用SEQIDNO:53和SEQIDNO:54所示的2条合成DNA引物进行PCR，确认了kdp操纵子上游插入了上述片段，将确认了片段插入的菌林命名为SC17(0)::Ptac-kdp。从该菌斗朱抽提基因组DNA，通过电穿孔转化NAl/pSTV-yhfK抹。NAl/pSTV-yhfK株是这样得到的从AJ13601林(参照特开平2001-333769号公报)中除去RSFCPG和pSTVCB这2个质粒，并导入L-谷氨酸生产用的质粒RSFPPG和pSTV-yhfK(参照特开平2005-278643号^Sf艮)这2个质粒。RSFCPG和pSTVCB的这两个质粒见特开平2001-333769号公报中的描述。RSFCPG是包含大肠杆菌来源的gltA、ppc、gdhA各基因的质粒。pSTVCB是在pSTV29(宝酒造(抹))中插入乳发酵短杆菌来源的gltA基因而成的质粒。此外，pSTV-yhfk是在pSTV29(宝酒造(抹))中插入a"aw加、来源的yhfk基因而成的质粒。将导入了SC17(0)::Ptac-kdp的基因组DNA的NAl/pSTV-yhfK抹在平板上进行选择，得到了约20个菌落作为转化体；其中所述平板是向L培养基(细菌蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl5g、琼脂15g溶于纯水1L而成的培养基，pH7.0)中添加基础培养基成分(葡萄糖0.5g、硫酸镁2mM、磷酸二氢钾3g、氯化钠0.5g氯化铵lg磷酸氢二钠6g;容于纯水1L中而成的培养基)和40mg/L卡那霉素、12.5mg/L四环素盐酸盐、25mg/L氯霉素而得到的。这些菌抹中，在kdp操纵子上游均插入了XattL-KmRAattR-Ptac片段，选择其中的l个克隆，将其命名为NAl::Ptac-kdp/pSTV-yhfK。(3)kdp操纵子启动子取代株的试管培养评价接下来，为了研究kdp操纵子的强化对生长的影响，进行了试管培养。使用NAl::Ptac-kdp/pSTV-yhfK林和作为对照的NAl/pSTV-yhfK株，研究了酸性条件下的生长。D-葡萄糖0.5%Na2HP046.0g/LKH2P043.0g/LNaCl0.5g/LNH4Cll.Og/LMgS04.7H202.0mMs-二氨基庚二酸200mg/LL-赖氨酸盐酸盐200mg/LDL-曱硫氨酸200mg/LL-谷氨酸30g/L四环素盐酸盐12.5mg/L氯霉素25mg/L用氨水调整至pH4.5或pH4.9后，用滤器进行过滤。将NA1::Ptac-kdp/pSTV-yhfK林和NAl/pSTV-yhfK抹用在L培养基(细菌蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaC15g、琼脂15g溶于纯水1L而成的培养基，pH7.0)中添加基主培养基成分(葡萄糖0.5g、硫酸镁2mM、磷酸二氢钾3g、氯化钠0.5g、氯化铵lg磷酸氢二钠6g溶于纯水1L而成的培养基)和12.5mg/L四环素盐酸盐、25mg/L氯霉素而得到的培养基进行前培养，刮下1/8平板的菌体用生理食盐水清洗2次，最后悬浮于生理食盐水lml中，取其中的2(Hd接种到装有试管培养用培养基5mL的试管中，34。C下振荡培养，同时用自动OD测定器(TN1506BIOPHOTORECORDERADVANTEC公司制)，每30分钟测定一次OD(660nm)。结果如图4所示。与作为对照的NAl/pSTV-yhfK株相比，kdp强化株NAl::Ptac-kdp/pSTV-yhfK抹中，观察到了pH4.5和pH4.9的酸性条件下的生长的改善。因此，由这些结果可知kdp操纵子的强化对生长改善效果和L-谷氨酸生产速度的提高是有效果的。(4)kdp操纵子启动子取代株的S-jar培养评价接下来，为了研究kdp操纵子的增强对L-谷氨酸生产的影响，使用NAl::Ptac-kdp/pSTV-yhfK林和NAl/pSTV-yhfK抹，进行了L-谷氨酸生产培养。培养分形成菌体的种子培养和生成L-谷氨酸的主培养这2个阶段进行。种子培养用以下的培养基组成进行。〔种子培养培养基组成〕蔗糖50g/LMgS04'7H200.4g/LGDI13(消泡剂)0.1mL/L(NH4)2S044.0g/LKH2P042.0g/L酵母提取物4.0g/LFeS04.7H200.01g/LMnS04-5H200,01g/L柠檬酸0.02g/LL-赖氨酸盐酸盐0.4g/LDL-曱硫氨酸0.4g/Ls-二氨基庚二酸0.4g/L泛酸钙18mg/L四环素盐酸盐12.5mg/L氯霉素25mg/L120°C、蒸汽灭菌20分钟。将NA1::Ptac-kdp/pSTV-yhfK林和NAl/pSTV-yhfK抹用在L培养基(细菌蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl5g、琼脂15g溶于纯水1L而成的培养基，pH7.0)中添加基主培养基成分(葡萄糖0.5g、硫酸镁2mM、磷酸二氢钾3g、氯化钠0.5g、氯化铵lg磷酸氢二钠6g溶于纯水1L而成的培养基)和12.5mg/L四环素、25mg/L氯霉素而得到的培养基进行前培养，将1张平板的量接种到装有上述组成的培养基300mL的IL容量的微型罐中，34°C、pH6.0进行搅拌调控约12小时，使得通气1/lvvm、氧浓度为3°/。以上。添加氨气进行调整使得培养中的pH为6.0。培养基中的糖的耗尽为指标，结41束种子培养。主培养培养基组成如以下所示。〔培养培养基组成〕(接种20%种子培养液后的浓度)蔗糖100g/LMgS04.7H200.4g/LGDI13O.lmL/L(NH4)2S045,0g/LKH2P046.0g/L酵母提取物6.0g/LFeS04-7H200.02g/LMnS04-5H200.02g/L柠檬酸0.02g/L甜菜碱*2.0g/LL-赖氨酸盐酸盐0.8g/LDL-甲硫氨酸0.6g/Ls-二氨基庚二酸0.6g/L泛酸4丐18mg/L四环素盐酸盐25mg/L氯霉素25mg/L*:N-N-N-三曱基甘氨酸将种子培养所得的菌体60mL注入装有上述组成的培养基240mL的1L容量的微型罐中，pH4.7进行培养。主培养开始16小时后结束培养。随时间测定了培养液中的菌体浓度和L-谷氨酸浓度。菌体浓度通过使用用水稀释至101倍的培养液、用分光光度计(U-2000A日立制作所)测定620nm的浊度来考察。L-谷氨酸浓度通过将培养液上清用水稀释适当倍率后、使用BIOTECHANALYSER(生物技术分析仪)(AS-210SAKURA精机)来测定。结果如表1和图5所示。可以判明与比较对照抹NA1/pSTV-yhfK相比，kdp操纵子强化抹NAl::Ptac-kdp/pSTV-yhfK抹的生长提高，L-谷氨酸的蓄积、L-谷氨酸的生产速度也提高。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>〔实施例2〕蓄积L-苏氨酸的大肠杆菌中kdp操纵子的扩增(1)kdp操纵子扩增用质粒的构建为了在埃希氏菌属细菌中导入kdp操纵子，使用公知的质粒pMW218(宝酒造(抹))，构建了kdp操纵子扩增用质粒。首先，将pMW218用限制酶HindIII和BamHI进行消化，加入苯酚-氯仿溶液并混合来停止反应。将反应液离心分离后，回收上层，通过乙醇沉淀回收DNA。另一方面，以从大肠杆菌MG1655中抽提的染色体作为模板，使用SEQIDNO:55和56所示的DNA引物进行PCR(变性94。C-10秒、退火60°C-30秒、延伸反应72°C-120秒)扩增kdp操纵子。PCR反应中使用PyrobestDNA聚合酶(宝酒造(抹))。将所得kdp操纵子片段用限制酶Hindlll和BamHI进行消化，加入苯酚-氯仿溶液并混合来停止反应。将如上述制备的pMW218消化物和kdpABC基因区域片^史用DNALigationKitVer.2(宝酒造(抹))进行连接。用该连接反应溶液转化大肠杆菌(E.coliJM109感受态细胞、宝酒造(抹))，将其涂布于含50mg/L卡那霉素的LB琼脂培养基，37。C保温一夜。将琼脂培养基上出现的菌落接种在含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37。C振荡培养8小时。采用碱-SDS法从各培养液提取质粒DNA，通过用限制酶进行消化来确认结构，得到pMW218kdp。(2)将pMW218kdp导入蓄积苏氨酸的大肠杆菌B-3996以及氨基酸生产将如上述获得的pMW218kdp通过电穿孔法(CanadianJournalofMicrobiology,43.197(1997))导入VKPMB-3996。对于所得转化抹(本菌株称为"B-3996/pMW21汰dp")和作为对照的导入了pMW218的菌抹(本菌抹称为"B-3996/pMW218"),如下地进行培养，考察培养上清中的L-苏氨酸浓度。将各转化抹接种到含50mg/L卡那霉素和20mg/L链霉素的LB液体培养基3mL中，37。C试管培养一夜，然后将培养液200(iL接菌到含50mg/L卡那霉素和20mg/L链霉素的苏氨酸生产培养基(20ml)中，37。C振荡培养24小时。培养结束后，离心分离除去菌体，使用氨基酸分析装置(L-8500曰立制作所)测定了培养上清中的L-苏氨酸浓度。与作为对照的B-3996/pMW218株相比较，可知在kdp操纵子扩增林B-3996/pMW218kdp中，培养基中的L-苏氨酸蓄积量提高。〔苏氨酸生产培养基〕D-葡萄糖40g/L(NH4)2S0416g/LKH2P04l.Og/LMgS04-7H20l.Og/LFeS(V7H200.01g/LMnS04,7H200.01g/LL-异亮氨酸50mg/LDL-曱硫氨酸500mg/L碳酸4丐0.6g/L链霉素20mg/L卡那霉素50mg/L用氢氧化钾调整至pH7.5。115°C、蒸汽灭菌10分钟。〔序列表的说明〕SEQIDNO:l:大肠杆菌的kdp操纵子的碱基序列(kdpA、kdpB、kdpC的氨基酸序列一并记载)kdpF:457~546kdpA:546-2219kdpB:2242-42%kdpC:4299-4871kdpD:4864-7548kdpE:7545-8222SEQIDNO:2:KdpA的氨基酸序列kdpA:546-2219kdpB:2242-4290kdpC:4299~4871kdpD:4864-7548kdpE:7545-8222SEQIDNO:2SEQIDNO:3SEQIDNO:4SEQIDNO:5SEQIDNO:6SEQIDNO:5SEQIDNO:7KdpA的氨基酸序列KdpB的氨基酸序列KdpC的氨基酸序列KdpD的氨基酸序列KdpE的氨基酸序列KdpD操纵子的碱基序列(SDHC的氨基酸序列一并记载)kdp才喿纟从子的i威基序歹寸(kdpA、kdpB、kdpC、kdpD的氨基酸序列一并记载)kdpA:543-2225kdpB:2228-4273kdpC:4284-4853kdpD:4867~7542SEQIDNO:8:KdpA的氨基酸序列SEQIDNO:9:KdpB的氨基酸序列SEQIDNO:10:KdpC的氨基酸序列KdpD的氨基酸序列jPa"toeaa"awa^s的kdpE基因的；威基序歹'jKdpE的氨基酸序列尸aw/oeaawawafe的hisD基因的石咸基序歹寸用于将Kn/基因组合入hisD基因的片段的扩增用引物用于将Kn^基因组合入hisD基因的片段的扩增用引物cat基因扩增用引物cat基因扩增用引物sacB基因扩增用引物sacB基因扩增用引物含PlacUV5启动子的DNA片段扩增用引物SEQIDNO:ll:SEQIDNO:12:SEQIDNO:13:SEQIDNO:14:SEQIDNO:15:SEQIDNO:16:SEQIDNO:17:SEQIDNO:18:SEQIDNO:19:SEQIDNO:20:SEQIDNO:21:SEQIDNO:28:SEQIDNO:29:SEQIDNO:30:SEQIDNO:31:SEQIDNO:32:SEQIDNO:33:SEQIDNO:34:SEQIDNO:35:SEQIDNO:36:SEQIDNO:37:SEQIDNO:38:SEQIDNO:39:SEQIDNO:40:SEQIDNO:41:SEQIDNO:42:SEQIDNO:43:SEQIDNO:44:SEQIDNO:45:SEQIDNO:46:SEQIDNO:47:SEQIDNO:48:SEQIDNO:49:SEQIDNO:50:SEQIDNO:51:SEQIDNO:52:SEQIDNO:53:SEQIDNO:54:SEQIDNO:55:SEQIDNO:56:SEQIDNO:57:共有序列attL扩增用引物attL的;咸基序列attR扩增用引物attR扩增用引物attR的》威基序列含bla基因的DNA片段扩增用引物含bla基因的DNA片段扩增用引物含ter—rrnB的DNA片段扩增用引物含ter—rrnB的DNA片段扩增用引物含ter一thrL终止子的DNA片段的碱基序列含ter—thrL终止子的DNA片段扩增用引物含ter—thrL终止子的DNA片段扩增用引物用于扩增gltA基因的ORF以外的部分的引物用于扩增gltA基因的ORF以外的部分的引物prpC基因扩增用引物prpC基因扩增用引物尸a"toeacwawato的yghU基因的石咸基序歹寸尸awtoea的scrK基因的石咸基序歹1]aw(3wato的lacZ基因的石咸基序歹寸含Ptac启动子的DNA片段扩增用引物含Ptac启动子的DNA片段扩增用引物含Km抗性基因的DNA片段扩增用引物含Km抗性基因的DNA片段扩增用引物连接有tac启动子的kdp操纵子上游序列扩增用引物连接有tac启动子的kdp操纵子上游序列扩增用引物kdp操纵子上游结构确认用引物kdp操纵子上游结构确认用引物kdp操纵子扩增用引物kdp操纵子扩增用引物与大肠杆菌的KdpA的氨基酸序列的46SEQIDNO:58:a"a"a^与大肠杆菌的KdpB的氨基酸序列的共有序列SEQIDNO:59:a加"a^与大肠杆菌的KdpC的氨基酸序列的共有序列工业实用性通过使用本发明的微生物，可以高效率地发酵生产L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-苏氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、或L-半胱氨酸、L-谷氨酸等L-氨基酸。在优选方式中，本发明的微生物的L-氨基酸生产量和生产速度均良好。权利要求1.一种属于肠杆菌科的微生物，其具有L-氨基酸生产能力，并且经过修饰而增强了kdp系统。2.权利要求1所述的微生物，其中，kdp系统是通过增加11#:纵子或构成该操纵子的1种或2种以上基因的表达量和/或通过增加kdp操纵子或所述基因的翻译量而增强的。3.权利要求2所述的微生物，其中，kdp系统是通过提高kdp操纵子或构成该操纵子的1种或2种以上基因的拷贝数、修饰该操纵子的表达调节序列而增强的。4.权利要求2或3所述的微生物，其中，kdp操纵子至少包含kdpA基因、kdpB基因和kdpC基因。5.权利要求4所述的微生物，其中，kdpA基因是编码具有SEQIDNO:2或8所示氨基酸序列的蛋白质的基因，或者是编码kdp系统的A亚单位的基因，所述kdp系统的A亚单位具有在SEQIDNO:2或8中取代、缺失、插入或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。6.权利要求4或5所述的微生物，其中，kdpB基因是编码具有SEQIDNO:3或9所示氨基酸序列的蛋白质的基因，或者是编码kdp系统的B亚单位的基因，所述kdp系统的B亚单位具有在SEQIDNO:3或9中取代、缺失、插入或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。7.权利要求4-6中任一项所述的微生物，其中，kdpC基因是编码具有SEQIDNO:4或10所示氨基酸序列的蛋白质的基因，或者是编码kdp系统的C亚单位的基因，所述kdp系统的C亚单位具有在SEQIDNO:4或10中取代、缺失、插入或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列。8.权利要求4-7中任一项所述的微生物，其中，所述kdp操纵子为下述(a)(d)中任一项所述的DNA:(a)包含SEQIDNO:l的碱基编号546~4871所示的碱基序列的DNA;(b)与SEQIDNO:l的碱基编号546-4871所示的碱基序列或与可从该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，并且编码kdp系统的DNA;(c)包含SEQIDNO:7的碱基编号543~4853所示的碱基序列的DNA;(b)与SEQIDNO:7的碱基编号543-4853所示的碱基序列或与可从该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，并且编码kdp系统的DNA。9.权利要求1~8中任一项所述的微生物，其中，所述L-氨基酸为选自由L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸和L-半胱氨酸组成的群组中的一种或二种以上的L-氨基酸。10.权利要求1-9中任一项所述的微生物，其中，属于肠杆菌科的微生物为埃希氏菌属细菌、肠杆菌属细菌或泛菌属细菌。11.一种生产L-氨基酸的方法，其特征在于，在培养基中培养权利要求1~10中任一项所述的微生物，从而在该培养基中或菌体内生成并蓄积L-氨基酸，并且从该培养基或菌体回收L-氨基酸。12.权利要求11所述的方法，其中，所述L-氨基酸为选自由L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸和L-半胱氨酸组成的群组中的一种或二种以上的L-氨基酸。全文摘要通过在培养基中培养具有L-氨基酸生产能力并且经过修饰而增强了kdp系统的属于肠杆菌科的微生物，在该培养基中或菌体内生成和蓄积L-氨基酸，并且从该培养基或菌体回收L-氨基酸，来生产L-氨基酸。文档编号C12N1/21GK101627110SQ200880002790公开日2010年1月13日申请日期2008年1月11日优先权日2007年1月22日发明者原吉彦,泷川里绘申请人:味之素株式会社