减轻癌性疾病的抗体的制作方法

专利名称：减轻癌性疾病的抗体的制作方法
减轻癌性疾病的抗体 发明领域本发明涉及分离和生产减轻癌性疾病的抗体(CDMAB)，并且涉及这 些CDMAB单独或与一种或多种CDMAB/化疗药物组合在治疗和诊断过 程中的应用。本发明还涉及使用本发明的CDMAB的结合测定方法。发明背景作为癌症治疗的单克隆抗体患有癌症的每个个体都是独特的，并且 患有与其它癌症不同的癌症，正如个人的身份一样。除此之外，目前的治 疗法以相同的方法治疗患有同种类型的癌症、处于相同的阶段的所有患 者。这些患者中至少有30%将在一线治疗中失败，由此导致以后几轮的治 疗和治疗失败、转移、以及最终死亡的增加的可能性。较好的治疗方法应 该是对于特定的个体量身定制的治疗法。目前本身适于量身定制的唯一的 治疗法是手术。化疗和放射治疗不能对患者进行量身定做，并且手术本身 在大部分情形中不足以产生治愈。随着单克隆抗体的出现，由于每种抗体可以针对单个表位，则开发量 身定制的治疗法的方法的可能性变得更加现实。此外，产生针对独特限定 特定个体的肿瘤的表位群的抗体组合也是可能的。已经认识到在癌症细胞和正常细胞之间的显著不同是在于癌症细胞 包含对转化的细胞特异的抗原，科学团体长期认为单克隆抗体可以设计成 通过特异性与这些癌症抗原结合而特异性靶向转化的细胞；因此产生这样 的信心单克隆抗体可以作为"魔力子弹(Magic Bullets)"来消除癌细胞。 然而，现在广泛认识到，没有任何一种单个的单克隆抗体可以在所有癌症 情形中起作用，并且单克隆抗体可以被配置为一类作为靶向癌症治疗。已 经表明按照本文公开的发明的教导分离的单克隆抗体以有益于患者的方 式减轻癌性疾病过程，例如通过减少肿瘤负荷的方式，并且在本文中应该 不同地称为减轻癌性疾病的抗体(CDMAB)或"抗癌"抗体。目前，癌症患者通常具有很少的治疗选择。对癌症治疗法的管理方法 已经在全球存活和发病率中产生了改善。然而，对于特定的个体，这些改 善的统计学没有与他们个人情况的改善必然相关。因此，如果采用能够使执业者独立于处于同一团体中的其他患者而治 疗每种肿瘤的方法，这将允许产生仅使治疗适合该名个体的独特方法。这 样的治疗疗程将理想地增加治愈率，并且产生更好的结果，由此满足长期 渴望的需要。历史上，多克隆抗体的应用已经进行了应用，在治疗人类癌症中具有 有限的成功。已经使用人血浆治疗淋巴瘤和白血病，但是存在很少延长的 好转或反应。此外，与化疗相比，缺少再现性，并且没有任何其它的益处。 实体瘤诸如乳腺癌、黑素瘤和肾细胞癌也己经使用人血液、黑猩猩血清、 人血浆和马血清进行治疗，具有相对不可预知的和无效的结果。对于实体瘤，已经存在单克隆抗体的许多临床试验。在20世纪80年 代，对于人乳腺癌存在至少4种临床试验，其使用针对特异抗原的抗体或 基于组织选择性，在至少47名患者中仅产生一名响应者。直到1998年才 出现使用人源化的抗Her2/neu抗体(Herceptir^)与顺铂组合的成功的临床 试验。在该试验中，评估37名患者的响应，其中约四分之一具有部分响 应率，另外四分之一具有较小或稳定的疾病发展。在所述响应者中对发展 的中值时间是8.4个月，中值响应持续5.3个月。Herceptin⑧在1998年首次核准与Taxof组合用于一线应用。临床研究 结果显示，与仅接受Taxo产的组(3.0个月)相比，对于接受抗体治疗加 Taxol⑧的那些的疾病发展的中值时间(6.9个月)增加。在中值存活中也 存在稍微的增加；对于Herceptir^加Taxof治疗组相对于单独的Taxof治 疗组为22个月相对于18个月。另夕卜，与单独的Taxo产相比较，在抗体加 Taxol⑧组合组中，在完全(8%相对于2%)和部分响应者(34%相对于15%) 的数量中存在增加。然而，与单独的Taxof治疗相比较，用Herceptii^和 Taxo产治疗导致更高的心脏中毒的发生(分别为13%相对于1%)。此外， Herceptir^治疗法只对过量表达(通过免疫组化(IHC)分析确定)人表皮生 长因子受体2(Her2/neu)的患者有效，在患有转移乳腺癌的患者的大约25。/。 中有效；所述人表皮生长因子受体2是一种受体，其目前具有未知的功能或生物学重要的配体。因此，对于患有乳腺癌的患者仍然存在大量未满足的需求。即使可以受益于Herceptin⑧治疗的那些仍然需要化疗，并且因此 仍然必须处理，至少在某种程度上，处理这种治疗的副作用。研究结肠直肠癌的临床试验包括针对糖蛋白和糖脂靶点的抗体。抗体 如17-lA，其对于腺癌具有某种特异性，已经在六十多名患者中进行了 2 期临床试验，仅有1名患者具有部分响应。在其它试验中，在使用额外的 环磷酰胺的方案中，使用17-1A在52名患者中仅产生1例完全响应和2 例较小的响应。迄今为止，17-lA的III期临床试验尚未表现出作为ni期 结肠癌的辅助治疗的提高的功效。最初核准用于成像的人源化鼠单克隆抗 体的应用也没有产生肿瘤衰减。仅在最近，使用单克隆抗体的结肠直肠癌临床研究产生了一些积极的 结果。在2004年，ERBITUX⑧核准用于患有表达EGFR的转移结肠直肠 癌的患者的二线治疗，所述患者对基于伊立替康的化疗不起反应 (refractory)。来自两组(two-arm) II期临床研究和单组研究的结果表明， ERBITUX⑧与伊立替康组合分别具有23%和15%的响应率，疾病发展的中 值时间分别为4.1个月和6.5个月。来自同一两组II期临床研究和另一单 组研究的结果表明，仅用ERBITUX 治疗分别导致11%和9%的响应率， 疾病发展的中值时间分别为1.5个月和4.2个月。因此，在瑞士和美国，ERBITUX⑧与伊立替康组合治疗，并且在美国， 单独的ERBITU ^治疗，已经被核准作为在一线伊立替康治疗中失败的结 肠癌患者的二线治疗。因此，如同Herceptin⑧，在瑞士只核准治疗作为单 克隆抗体和化疗的组合。另外，在瑞士和美国只核准治疗作为二线治疗用 于患者。此外，在2004年，AVASTIN 被核准与静脉内基于5-氟尿嘧啶的 化疗组合用作转移性结肠直肠癌的一线治疗。III期临床研究结果表现出与 仅用5-氟尿嘧啶治疗的患者相比，用AVASTIN⑧加5-氟尿嘧啶治疗的患者 的中值存活延长(分别为20个月相对于16个月)。然而，同样如同 Herceptii^和ERBITUX ,治疗仅被核准作为单克隆抗体和化疗的组合。对于肺癌、脑癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌还继续存在极差 的结果。对于非小细胞肺癌的最有希望的最近的结果来自II期临床试验， 其中治疗包括与杀细胞药多柔比星缀合的单克隆抗体(SGN-15; dox-BR96,抗-唾液酸(sialyl)-LeX)，其与化疗药TAXOTERE⑧组合。TAXOTERE⑧是唯 一一种FDA核准的化疗药，用于肺癌的二线治疗。原始数据显示与单独 的TAXOTERE⑧相比提高的整体存活时间。在本研究征募的62名患者中， 三分之二接受SGN-15与TAXOTERE㊣组合，而其余三分之一接受单独的 TAXOTERE 。对于接受SGN-15与TAXOTERE 组合的患者，中值整体 存活时间是7.3个月，而与之比较的接受单独的TAXOTERE⑧的患者是5.9 个月。对于接受SNG-15加TAXOTERE⑧的患者的整体存活时间为1年和 18个月的分别为29%和18。/。，而与之比较的对于接受单独的TAXOTERE⑧ 的患者分别为24%和8%。计划了进一步的临床试验。临床前，对于黑素瘤使用单克隆抗体已经存在一些有限的成功。这些 抗体中很少己经达到临床试验阶段，并且迄今为止没有一种已经被核准或 在III期临床试验中表现出有利的结果。治疗疾病的新药的发现受到在30,000种已知的基因产物中缺少相关 靶点的鉴定的阻碍，所述30,000种已知的基因可能有助于疾病的发病机 理。在肿瘤学研究中，潜在的药物靶点通常仅由它们在肿瘤细胞中过量表 达的事实来选择。然后筛选这样鉴定的靶点与多种化合物的相互作用。在 潜在的抗体治疗的情形中，这些候选化合物通常衍生于根据Kohler和 Milstein所述的基本原理(1975,自然(Nature) , 256, 495-497, Kohler和 Milstein)的单克隆抗体产生的常规方法。从用抗原(例如，全细胞，细胞 级分，纯化的抗原)免疫的小鼠收集脾细胞，并且与无限增殖的杂交瘤配 偶体融合。筛选所得到的杂交瘤，并且针对最亲和性地与所述耙点结合的 抗体的分泌进行选择。针对癌细胞的许多治疗和诊断抗体，包括Herceptin 和RITUXIMAB，己经使用这些方法产生，并且基于它们的亲和性进行选 择。这种方法中的缺点是两方面的。首先，对治疗或诊断抗体结合选择适 当的靶点受到关于组织特异性致癌过程的极少的知识以及用于鉴定这些 靶点的所得到的过于单纯化的方法的限制，所述过于单纯化的方法如通过 过量表达进行选择。第二，与受体以最大的亲和力结合的药物分子通常具 有起始或抑制信号的最大可能性的假设可能不总是这种情形。除了对于乳腺癌和结肠癌的治疗的一些进展之外，作为单一药剂或共 同治疗的有效抗体治疗的鉴定和开发对于所有类型的癌症尚是不充足的。现有专利美国专利号5,750,102公开这样一种方法，其中来自患者肿瘤的细胞 用MHC基因转染，所述MHC基因可能克隆自来自该患者的细胞或组织。 然后，使用这些转染的细胞免疫该患者。美国专利号4,861,581公开这样一种方法，所述方法包括下列步骤 获得单克隆抗体，所述单克隆抗体对哺乳动物的肿瘤细胞和正常细胞的内 部细胞成分是特异性的，但是对外部成分不是特异性的；标记所述单克隆 抗体，使所标记的抗体与己经接受治疗的哺乳动物组织接触以杀死肿瘤细 胞；并且通过测量所标记的抗体与退化的肿瘤细胞的内部细胞成分的结合 而确定治疗的功效。在制备针对人细胞内抗原的抗体时，专利权所有人认 为恶性细胞代表这样的抗原的便利的来源。美国专利号5,171,665提供一种新型抗体以及其生产方法。具体地， 该专利教导形成这样的单克隆抗体，所述单克隆抗体具有与人肿瘤相关的 蛋白质抗原例如结肠和肺的那些强结合而与正常细胞以弱得多的程度结 合的能力。美国专利号5,484,596提供一种癌症治疗方法，所述方法包括从人癌 症患者手术取出肿瘤组织，处理所述肿瘤组织以获得肿瘤细胞，辐射所述 肿瘤细胞以成为存活的但非肿瘤发生性的，并且使用这些细胞制备用于患 者的疫苗，所述疫苗能够抑制原发瘤的复发而且同时抑制转移。该专利教 导开发与肿瘤细胞的表面抗原反应的单克隆抗体。如在第4栏45行等描 述的，专利权所有人在开发用于人肿瘤形成的表达单克隆抗体的活性特异 性免疫治疗中使用自生的肿瘤细胞。美国专利号5,693,763教导一种糖蛋白抗原，其是人癌症特有的，并 且不依赖于起源的上皮组织。美国专利号5,783,186涉及在表达Her2的细胞中诱导程序性细胞死亡 的抗-Her2抗体，产生所述抗体的杂交瘤细胞系，使用所述抗体治疗癌症 的方法和包括所述抗体的药物组合物。美国专利号5,849,876描述了用于产生针对黏蛋白抗原的单克隆抗体 的新杂交瘤细胞系，所述黏蛋白抗原由肿瘤和非肿瘤组织来源纯化。美国专利号5,869,268涉及产生人淋巴细胞的方法，所述人淋巴细胞 产生对需要的抗原特异性的抗体，产生单克隆抗体的方法，以及由所述方 法产生的单克隆抗体。该专利特别涉及有效用于癌症诊断和治疗的抗-HD 人单克隆抗体的生产。美国专利号5,869,045涉及与人癌症细胞反应的抗体、抗体片段、抗 体缀合物和单链免疫毒素。这些抗体作用的机制是两面性的，原因在于分 子与在人癌症表面上存在的细胞膜抗原反应，并且此外，原因在于所述抗 体具有在癌症细胞内部内在化的能力，随后结合，使它们特别有效用于形 成抗体-药物和抗体-毒素缀合物。在它们的未修饰形式中，所述抗体还在 特定的浓度表现出细胞毒性特征。美国专利号5,780,033公开自体抗体用于肿瘤治疗和预防的应用。然 而，这种抗体是来自年老的哺乳动物的抗核自体抗体。在这种情形中，认 为该自体抗体是在免疫系统中发现的一种自然抗体类型。因为该自体抗体 来自"年老的哺乳动物"，不存在所述自体抗体实际来自被治疗的患者的 要求。另外，该专利公开了来自年老的哺乳动物的天然和单克隆抗核自体 抗体，和产生单克隆抗核自体抗体的杂交瘤细胞系。发明概述本申请利用在U.S. 6,180,357专利中教导的生产患者特异性抗癌抗体 的方法分离杂交瘤细胞系，所述杂交瘤细胞系编码减轻癌性疾病的单克隆 抗体。这些抗体可以针对一种肿瘤特异性制备，并且因此使得癌症治疗的 量身定制成为可能。在本申请的情形中，具有杀伤细胞(细胞毒性)或抑 制细胞生长(抑制细胞)特性的抗癌抗体在下文中称为细胞毒性的。这些 抗体可以用于辅助癌症的分阶段和诊断，并且可以用于治疗肿瘤转移。这 些抗体还可以用于通过预防治疗的方式用于预防癌症。与根据传统药物发 现样本(paradigm)产生的抗体不同，以这种方式产生的抗体可以靶向这样 的分子和途径，所述分子和途径先前没有显示出对于恶性组织的生长和/ 或存活是必需的。此外，这些抗体的结合亲和力适合起始可能不易受更强 的亲和性相互作用影响的细胞毒性事件的需要。此外，将标准化疗形式如 放射性核素与本发明的CDMAB缀合也在本发明的范围内，由此集中在所述化疗药物的应用。所述CDMAB也可以与毒素、细胞毒性部分、酶例如 生物素缀合的酶、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分或造血细胞缀合， 由此形成抗体缀合物。所述CDMAB可以单独或与一种或多种CDMAB/ 化疗药物组合使用。个体化的抗癌治疗的前景将在患者的管理方式中引起改变。可能的临 床方案(scenario)是在出现时获得肿瘤样品，并且储存。从该样品，肿瘤 可以用一组预先存在的减轻癌性疾病的抗体而确定类型。将患者进行常规 分阶段，但是可用的抗体可以用于将患者进一步分阶段。患者可以立即用 现有的抗体进行治疗，并且使用本发明描述的方法或通过利用噬菌体展示 文库与本发明公开的筛选方法联合，可以产生一组对肿瘤特异性的抗体。由于其它肿瘤可能携带一些与被治疗的肿瘤相同的表位，故将产生的所有 抗体加入到抗癌抗体文库中。按照该方法产生的抗体可以有效用于治疗许 多患有与这些抗体结合的癌症的患者中的癌性疾病。除了抗癌抗体之外，患者可以选择接受目前推荐的治疗作为多形式治 疗方案的一部分。通过本方法分离的抗体对非癌症细胞是相对无毒的事实 允许以高剂量抗体组合，单独的，或与常规治疗组合。高治疗指数还允许 在短时间范围内再次治疗，这应该降低耐受治疗的细胞出现的可能性。如果患者对初始的治疗疗程没有反应或发展了转移，则可以重复产生 针对肿瘤的特异性抗体的方法，进行再次治疗。此外，所述抗癌抗体可以 与从该患者获得的红血细胞缀合，并且重新输注用于治疗转移。对于转移 癌存在很少有效的治疗，并且转移通常预示着导致死亡的最坏结果。然而， 转移癌通常充分地血管化，通过红血细胞递送抗癌抗体可以具有将所述抗 体集中在肿瘤部位的作用。甚至在转移之前，大部分癌症细胞依赖于宿主 的血液供应它们的生存，并且与红血细胞缀合的抗癌抗体还可以有效针对 原位肿瘤。备选地，所述抗体可以与其它造血细胞缀合，如淋巴细胞、巨 噬细胞、单核细胞、天然杀伤细胞等。存在5类抗体，并且每类与由其重链赋予的功能相关。通常认为由裸 抗体杀伤癌症细胞通过抗体依赖性细胞毒作用或补体依赖性细胞毒性进 行介导。例如，鼠IgM和IgG2a抗体可以通过结合补体系统的C-l成分而 激活人补体，由此激活可以导致肿瘤消退的补体激活经典途径。对于人抗体，最有效的补体激活抗体通常是IgM和IgGl 。 IgG2a和IgG3同种型的 鼠抗体有效募集具有Fc受体的细胞毒性细胞，其将导致由单核细胞、巨 噬细胞、粒细胞和某些淋巴细胞进行的细胞杀伤。IgGl禾PIgG3同种型的 人抗体介导ADCC。通过Fc区域介导的细胞毒性需要分别存在效应细胞及其相应受体、 或蛋白质，例如NK细胞、补体、和T-细胞。在缺乏这些效应子机制的条 件下，抗体的Fc部分是无活性的。抗体的Fc部分可以赋予这样的特性， 即影响抗体体内药物代谢动力学，但在体外其是无效的。我们检测抗体的细胞毒性测定不存在任何效应子机制，并且在体外执 行。这些测定不具有效应细胞(NK、巨噬细胞、或T-细胞)或补体存在。 由于这些测定完全由加在一起的内容定义，所以可以表征每种成分。本文 中使用的测定仅包含靶细胞、培养基和血清。所述靶细胞不具有效应子功 能，因为它们是癌细胞或成纤维细胞。在不存在具有效应子功能特性的外 源细胞的条件下，不存在具有该功能的细胞元件。所述培养基不包含补体 或任何细胞。用于支持靶细胞生长的血清不具有如销售商公开的补体活 性。此外，在我们自己的实验室中，我们证实了所用的血清中缺乏补体活 性。因此，我们的工作证明这样的事实，即抗体的作用完全归因于由Fab 介导的抗原结合的作用。有效地，靶细胞仅注意和与Fab相互作用，因为 它们不具有关于Fc的受体。尽管杂交瘤分泌用靶细胞检测的完整免疫球 蛋白，但是只有免疫球蛋白上与所述细胞相互作用的部分是Fab,其起抗 原结合片段的作用。关于目前要求的抗体和抗原结合片段，本申请，在提交时，证明了细 胞的细胞毒性，如表l中数据所述证明地。如以上指出地，和如本文中通 过客观证据证实地，该作用完全归因于Fab与肿瘤细胞的结合。在抗体介导细胞毒性的领域中存在充足的证据，所述抗体介导细胞毒 性归因于不依赖于通过Fc募集的效应子机制的抗体与靶抗原的直接结合。关于这一点的最好证据是不具有补充细胞或补体(从而正式排除那些机 制)的体外实验。这些类型的实验针对完整免疫球蛋白、或针对抗原结合 片段诸如F(ab)，2片段进行。在这些类型的实验中，诸如在抗-Her2和抗 -EGFR抗体的情形中，抗体或抗原结合片段可以直接诱导耙细胞的程序性细胞死亡，这两种情形均具有由US FDA为癌症治疗销售批准的抗体。抗体介导的癌症杀伤的另一种可能的机制可以通过使用催化细胞膜 中的不同化学键的水解的抗体以及其相关的糖蛋白或糖脂，即所谓的催化 抗体进行。存在3种抗体-介导的癌症细胞杀伤的其它机制。第一种是使用抗体作为疫苗来诱导机体产生针对存在于癌症细胞上的推定的抗原的免疫反 应。第二种是使用这样的抗体，所述抗体靶向生长受体，并且干扰它们的 功能，或下调所述受体，以致有效地丧失其功能。第三种是所述抗体对细 胞表面部分的直接连接的作用，所述细胞表面部分的直接连接可能导致直接的细胞死亡，诸如死亡受体如TRAIL Rl或TRAIL R2的连接，或整联 蛋白分子如ctVp3的连接等。癌症药物的临床应用基于所述药物在对患者的可接受的危险模式下 的益处。在癌症治疗中，通常是在益处之后最追求生存，然而，除了延长 生命之外，还存在许多其它公认的益处。这些其它的益处，其中治疗没有 不利地影响生存，包括症状减轻，针对不利事件的保护，复发时间的延长 或没有疾病的生存，并且延长发展的时间。这些标准通常被接受，并且管 理团体如美国食品及药品管理局(F.D.A.)核准产生这些益处的药物 (Hirschfeld等.肿瘤学/血液学的重要综述(Critical Reviews in Oncology/Hematolgy) 42:137-143 2002)。除了这些标准之外，公认还存在 其它的可以预示这些类型的益处的终点(endpoint)。部分地，由美国F.D.A. 授予的加速的核准流程承认存在可能预测患者益处的替代品。到2003年 年末，在这种流程下已经核准了 16种药物，并且这些中有4种已经继续 获得了完全的核准，即，随后的研究已经表明由替代品终点预测的直接的 患者益处。确定药物在实体瘤中的作用的一个重要的终点是通过测量针对 治疗的响应而评估肿瘤负荷(Therasse等.国家癌症研究所杂志(Journal of the National Cancer Institute) 92(3):205-216 2000)。关于所述评估的临床标 准(RECIST标准)已由癌症国际专家组实体瘤工作组的响应评估标准公布。 与适当的对照组相比较，对肿瘤负荷具有证明的作用的药物，如由RECIST 标准所述的目标响应所示，最终倾向于产生直接的患者益处。在临床前设 定中，肿瘤负荷通常更直接进行评估和记录。因为临床前研究可以转换成临床设定，在临床前模型中产生延长的生存的药物具有最大的预测临床用 途。与产生针对临床治疗的积极响应类似，在临床前设定中减少肿瘤负荷 的药物还可能对疾病具有显著的直接影响。尽管延长生存是在癌症药物治 疗的临床结果后最追求的，但是存在其它的益处，其具有临床应用，并且 清楚地，可能与疾病发展的延迟、延长的生存或二者相关的肿瘤负荷减少还可以导致直接的益处和具有临床影响(Eckhardt等.发展的治疗学目 标化合物的临床试验设计的成功与失败(Devel叩mental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds); ASCO教育书，第39次年会，2003,第209-219页)。本发明描述了 AR81A410.7的开发和应用，AR81A410.7通过其在细 胞毒性测定中和在人癌症的动物模型中的作用而鉴定。本发明描述了这样 的试剂，所述试剂与靶分子上的一个或多个表位特异性结合，且作为裸抗 体还具有针对恶性肿瘤细胞而不针对正常细胞的体外细胞毒性特性，并且 其作为裸抗体还直接介导肿瘤生长的抑制。另一个进步是使用抗癌抗体诸 如靶向表达同源抗原标记的肿瘤的抗体来获得肿瘤生长抑制，以及其它积 极的癌症治疗终点。总之，本发明教导AR81A410.7抗原作为治疗剂靶标的应用，在施用 时，其可以在哺乳动物中减少表达所述抗原的癌症的肿瘤负荷。本发明还 教导CDMAB(AR81A410.7)、以及它们的衍生物、及其抗原结合片段、和 其诱导细胞毒性的配体的应用，其在哺乳动物中靶向它们的抗原，减少表 达所述抗原的癌症的肿瘤负荷。此外，本发明还教导在癌性细胞中检测 AR81A410.7抗原的应用，所述应用可以有效用于携带表达该抗原的肿瘤 的哺乳动物的诊断、治疗预测、和预后。因此，本发明的一个目的是利用产生针对来源于特定个体的癌性细胞 或一种或多种特定的癌症细胞系的减轻癌性疾病的抗体(CDMAB)的方法， 以分离杂交瘤细胞系，和所述杂交瘤细胞系编码的相对应的分离的单克隆 抗体及其抗原结合片段，所述CDMAB对于癌症细胞是细胞毒性的，但是 同时对于非癌性细胞相对是无毒的。本发明的另一个目的是教导减轻癌性疾病的抗体，其配体和抗原结合 片段。本发明的另一个目的是产生减轻癌性疾病的抗体，其细胞毒性通过抗 体依赖性细胞毒作用介导。本发明的另一个目的是产生减轻癌性疾病的抗体，其细胞毒性通过补 体依赖性细胞毒作用介导。本发明的另一个目的是产生减轻癌性疾病的抗体，其细胞毒性是它们 催化细胞的化学键水解的能力的功能。本发明的另 一个目的是产生减轻癌性疾病的抗体，所述抗体有效用于 癌症诊断、预后和监测的结合测定。本发明的其它目的和优点将通过下述描述变得清楚，其中通过举例说 明和实施例的方式描述本发明的某些实施方案。附图简述

图1比较杂交瘤上清针对细胞系A549, NCI-H23， NCI-H460, MDA-MB-231和Hs888丄u的细胞毒性百分数和结合水平。图2描述AR81A410.7与癌症和正常细胞系的结合。将数据列表以将 平均荧光强度表示为高于同种型对照增加的倍数。图3包括针对若干癌症和非-癌细胞系的AR81A410.7和抗-EGFR抗 体的代表性FACS柱状图。图4显示在预防性BxPC-3胰腺癌模型中AR81A410.7对肿瘤生长的 作用。垂直的虚线表示施用抗体的时间期间。数据点表示平均值+Z-SEM。图5显示在预防性BxPC-3胰腺癌模型中AR81A410.7对体重的影响。 数据点表示平均值+/- SEM。发明详述一般地，当用于概述、描述、实施例和权利要求中时，下述词语或短 语具有所示的定义。术语"抗体"以最宽泛的意义使用，并且特别涵盖，例如，单一的单 克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、和中和抗体、去免疫的(de-immunized)、 鼠、嵌合的或人源化的抗体)，具有多表位特异性的抗体组合物，单链抗 体，双抗体，三链抗体，免疫缀合物和抗体片段(见下文)。当用于本发明时，术语"单克隆抗体"是指从一群基本上均一的抗体 获得的抗体，即，除了可能以较少量存在的可能天然存在的突变之外，包 括所述群体的个体抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一 的抗原位点。此外，多克隆抗体制剂包括针对不同决定簇(表位)的不同 抗体，与所述多克隆抗体制剂相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决 定簇。除了它们的特异性，因为单克隆抗体可以不被其它抗体污染地合成， 所以单克隆抗体是有利的。修饰词"单克隆"表示该抗体的特征是从基本 上均一的抗体群体获得，并且不被解释为抗体的生产需要通过任何特定的方法。例如，按照本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohler禁房然 rA^^^j， 256.195 (1975)首先描述的杂交瘤(鼠或人)方法制备，或可以通过重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)制备。"单克隆抗体"还可以从噬菌体抗体文库分离，例如，使用Clackson等，^然 ^Wm^d, 352:624-628 (1991)和Marks等，分f f激学染,泰"Mo/.伤o/.;>，222:581-597 (1991)中所述的技术。"抗体片段"包括完整抗体的一部分，优选地包括其抗原-结合或可变区。抗体片段的实例包括小于全长的抗体，Fab， Fab，， F(ab')2,和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；单链抗体，单结构域抗体分子，融合蛋白，重组蛋白和由抗体片段形成的多特异性抗体。"完整的"抗体是一种包括抗原-结合可变区以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CHl、 Ch2和Ch3的抗体。恒定结构域可以是天然序列 恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选 地，完整的抗体具有一种或多种效应子功能。取决于它们的重链恒定结构域的氨基酸序列，完整抗体可以指定为不 同的"种类"。存在5种主要类别的完整抗体IgA, IgD， IgE， IgG和IgM， 并且它们中的一些可以进一步分成"亚组"(同种型)，例如，IgGl,IgG2， IgG3， IgG4， IgA,和IgA2。与不同种类的抗体相对应的重链恒定结构域分别 叫作a， 5， e， Y，和(i。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是 公知的。抗体"效应子功能"是指归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基 酸序列变体Fc区)的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括Clq结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒 性(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调，等。"抗体依赖性细胞介导的细胞毒性"和"ADCC"是指细胞介导的反应， 其中表达Fc受体(FcRs)的非特异性细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK) 细胞，嗜中性粒细胞，和巨噬细胞)识别在靶细胞上的结合的抗体，并且 随后引起该靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞，即NK细胞，仅表达 FcyRIII，而单核细胞表达Fc^RI, FcYRII和FcyRin。 FcR在造血细胞上的 表达总结在Ravetch禾Q Kinet,免疫学年度综述(力""w. Aev. /mm""o/J 9:457-92 (1991)的第464页表3中。为了评估目的分子的ADCC活性，可 以进行体外ADCC测定，诸如在美国专利号5,500,362或5,821,337中所述 的测定。对于所述测定有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天 然杀伤(NK)细胞。备选地，或另外地，目的分子的ADCC活性可以在体 内进行评估，例如，在动物模型中，诸如在Clynes等./W^S* (USA) 95:652-656 (1998)中公开的动物模型中。"效应细胞"是表达一种或多种FcRs并且执行效应子功能的白细胞。 优选地，该细胞至少表达FcyRIII并且执行ADCC效应子功能。介导ADCC 的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC),天然杀伤(NK)细胞，单 核细胞，细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中PBMCs和NK细胞是优选 的。效应细胞可以从其天然来源分离，例如，从血液或PBMCs分离，如 本发明所述。术语"Fc受体"或"FcR"用来描述结合抗体的Fc区的受体。优选的 FcR是天然人FcR序列。此外，优选的FcR是一种结合IgG抗体的FcR (Y受体)，并且包括FqRI, FcyRII,禾卩FcYRIII亚类的受体，包括等位基 因变体和这些受体的可变剪接形式。FcYRI1受体包括FcyR!IA("激活受体") 和FcyRIIB ("抑制受体")，它们具有主要在它们的细胞质结构域不同的相 似的氨基酸序列。激活受体FcYRIIA在其细胞质结构域包含免疫受体基于 酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcyRIIB在其细胞质结构域包含免疫 受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见在M. DaSron,免疫学年度综述 Aev./mmw"o/.) 15:203-234 (1997)中的综述)。FcRs在Ravetch禾口Kinet,免疫学年度综述(A画.Rev. Immunol) 9:457-92 (1991); Capel等， ^^"学;^法(7wmw"cw^/zoAJ 4:25-34 (1994);和de Haas等,^^邀^7/秀庶 ,学染,志a丄a6. C"". MedJ 126:330-41 (1995)中综述。其它FcRs，包括 将在将来鉴定的那些，包含在本发明的术语"FcR"中。该术语还包括新生 儿受体，FcRn，其负责将母亲的IgGs转运到胎儿(Guyer等，,资学染志 "/mww"o/.力17:587 (1976)和Kim等，ff/Z/^i^^^^^YBur. / /wmw"o/. J 24:2429(1994》。"补体依赖性细胞毒性"或"CDC"是指在存在补体的条件下分子裂解 靶点的能力。补体激活途径通过补体系统的第一成分(Clq)同与同源抗原复 合的分子(例如，抗体)的结合而起始。为了评估补体激活，可以进行 CDC须ij定，例如，如在Gazzano-Santoro等，^^"学^"兹^^吉"/附mw"o/. A/"/zo^^ 202: 163 (1996)中所述。术语"可变"是指这样的事实，即，在抗体之间，某些可变结构域的 部分在序列上大量不同，并且其用于每种特定的抗体对于其特定的抗原的 结合和特异性。然而，在抗体的整个可变结构域中可变性不是均匀分布的。 它集中在在轻链和重链可变结构域内称为高变区的三个片段中。可变结构 域的更高度保守的部分称为构架区(FRs)。天然重链和轻链的可变结构域分 别包括4个FRs，其主要采取(3-折叠构型，通过三个高变区连接，其形成 环连接，并且在某些情形中形成P-折叠结构的一部分。每条链中的高变区 通过FRs紧密相邻保持在一起，并且与另一条链的高变区一起有助于形成 抗体的抗原-结合位点(见Kabat等,身资学！遂游歪A游^^ "^wem^ o/ 尸rafe/ra 0/7m附M"o/og/ca//"fems 9 ,第5/^f.公共卫生月艮务(Public Health Service),全国卫生研究所(National Institutes of Health) , Bethesda, Md. (1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出多种效应 子功能，诸如在抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)中的抗体参与。当用于本发明时，术语"高变区"是指抗体负责抗原结合的氨基酸残 基。高变区通常包括来自"互补性决定区"或"CDR"的氨基酸残基(例如， 在轻链可变结构域中的残基24-34 (LI), 50-56 (L2)和89-97 (L3)和在重链 可变结构域中的31-35 (HI), 50-65 (H2)和95-102 (H3); Kabat等，^i^学！公共卫生服务(Public Health Service),全国卫生研究所(National Institutes of Health) ,Bethesda,Md. (1991))和/或来自"高变环"的那些残基(例如， 在轻链可变结构域中的残基2632 (LI), 50-52 (L2)禾P 91-96 (L3)和在重链 可变结构域中的26-32 (HI), 53-55 (H2)和96-101 (H3); Chothia和Lesk，分 子生物学杂志a 7Wb/.万"/j 196:卯1-917 (1987》。"构架区"或"FR"残基是 除了如本文所定义的所述高变区残基之外的那些可变结构域残基。木瓜蛋 白酶消化抗体产生两种相同的抗原-结合片段，其称为"Fab"片段，每个具 有单个抗原-结合位点，并且产生残留的"Fc"片段，它的名称反应了它容易 结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原-结合位点， 并且仍然能够交联抗原。"Fv"是包含完整的抗原-识别和抗原-结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价缔合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。 正是在这种构型中每个可变结构域的三个高变区相互作用，以限定在 Vh-V^二聚体表面上的抗原-結合位点。笼统地，6个高变区赋予抗体的抗 原-结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或仅包括对抗原特异的3 个高变区的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，尽管是以比完整的 结合位点低的亲和力结合。Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第 一恒定结构域(CHI)。 Fab'片段不同于Fab片段，其通过在重链CH1结构 域的羧基端添加几个残基而不同，所述添加的残基包括来自抗体铰链区的 一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH在本发明中是Fab'的名称，其中恒定结构 域的半胱氨酸残基携带至少一个游离的巯基(thiol)基团。F(ab，)2抗体片 段最初作为一对Fab，片段产生，其在它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片 段的其它化学偶联也是已知的。基于它们的恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体 的"轻链"可以被指定为两种明显不同的类型中的一种，所述两种明显不 同的类型称为kappa (k)和lambda (X)。"单链Fv"或"scFv"抗体片段包括抗体的Vh和Vr^结构域，其中这些 结构域存在于单一的多肽链中。优选地，Fv多肽还包括在Vh和Vl結枸 域之间的多肽连接体，其使得scFv能够形成用于抗原结合的理想结构。 对于scFv的综述，参见Pliickthun，在单克隆抗体的药理学(77^/Vzarwfitco/ogy Mowoc/o"a/』M 6o<^e1siy)/7!7'巻113, Rosenburg禾口 Moore编， Springer-Verlag,纽约，第269-315页(1994)。术语"双抗体"是指具有两个抗原-结合位点的小抗体片段，所述片段包括与在同一多肽链(VH-VO中的可变轻链结构域(VL)连接的可变重链 结构域(VH)。通过使用太短而不允许在同一条链中的两个结构域之间成对的连接体，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域成对，并且产生两个抗原-结合位点。例如，在EP404,097;WO 93/11161;和Hollinger等，夷腐 M^辨学腐学叛iVa". ^cac/. ， 90:6444-6448 (1993)中更充分地描述了双抗体。术语"三链抗体"或"三价三聚体"指三个单链抗体的组合。用 或VH结构域的氨基酸末端，即不具有任何连接体序列，构建三链抗体。 三链抗体具有三个Fv头部，所述Fv头部具有以头-尾的方式环形排列的 多肽。所述三链抗体可能的构象是具有三个结合位点的平面，所述结合位 点位于彼此相差120度角的平面上。三链抗体可以是单特异性、双特异性 或三特异性的。"分离的"抗体是一种已经被鉴定并且与其天然环境的成分分离和/ 或从中回收的抗体。它的天然环境的污染成分是将干扰抗体的诊断或治疗 应用的物质，并且可以包括酶、激素、和其它蛋白或非蛋白溶质。因为将 不存在抗体天然环境的至少一种成分，分离的抗体包括在重组细胞内原位 的抗体。然而， 一般地，分离的抗体应该通过至少一个纯化步骤制备。与目的抗原"结合"的抗体是一种能够以充足的亲和力结合所述抗原 的抗体，以便所述抗体通过靶向表达所述抗原的细胞而有效用作治疗或诊 断剂。在所述抗体是一种结合抗原性部分的抗体的情形中，与其它受体相 反，它通常优先结合所述抗原性部分，并且不包括偶然发生的结合，如非 特异性Fc接触，或不包括与其它抗原所常见的翻译后修饰结合，并且可 以是一种不与其它蛋白显著交叉反应的抗体。用于检测与目的抗原结合的 抗体的方法在本领域中是公知的，并且可以包括，但不限于，如FACS、 细胞ELISA和蛋白质印迹的测定。当用于本发明时，表述"细胞"、"细胞系"和"细胞培养物"可以互 换地使用，并且所有这样的名称包括后代。还应该理解，由于故意的或偶然的突变，所有的后代在DNA内容物上可能不是精确相同的。包括在初 始转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的突变的后代。这将通 过使用不同名称的上下文变得清楚。"治疗或处理"是指治疗性治疗和预防或预防性措施，其中目的是预 防或减缓(减轻)目的病理症状或病症。需要治疗的那些包括已经患有病 症的那些，以及倾向于患有病症的那些，或要预防病症的那些。因此，在 本发明中待治疗的哺乳动物可以已经诊断患有病症或可以是倾向于或易 受病症影响的。术语"癌症"和"癌性的"是指或描述哺乳动物中的生理状况，所述 生理状况的典型特征在于失控的细胞生长或死亡。癌症的实例包括，但不 限于，癌，淋巴瘤，胚细胞瘤，肉瘤，和白血病或淋巴恶性病。所述癌症 的更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)，肺癌，包括 小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃的或胃癌(gastric or stomach cancer)，包括胃肠癌，胰腺癌，成胶质细 胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直 肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾脏或肾癌，前列 腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝的癌症，肛门癌，阴茎癌，以及头颈癌。"化疗药物"是有效用于治疗癌症的化学化合物。化疗药物的实例包 括烷基化试剂，如塞替哌和环磷酰胺(CYTOXANTM);烷基磺酸酯如白消 安，英丙舒凡，和哌泊舒凡；吖丙啶类如苯佐替派(benzod叩a),卡波醌, 美妥替哌(meturedopa),和乌瑞替哌(uredopa) ; ethylenimines禾口 methylamelamines，包括六甲蜜胺，曲他胺，三亚乙基磷酰胺，塞替哌 (triethylenethiophosphoramide)禾卩三夢5甲蜜月安(trimethylolomelamine );氮 芥 (nitrogen mustards ) 如苯丁酸氮芥,萘氮芥 (chlornaphazine ), cholophosphamide，雌莫司汀，异环磷酰胺，氮芥(mechlorethamine)，盐 酸氧氮芥，美法仑，新氮芥，苯芥胆甾醇，泼尼莫司汀，曲磷胺，乌拉莫司 汀；亚硝基脲(nitrosureas)如卡莫司汀，氯脲菌素，福莫司汀，洛莫司汀， 尼莫司汀，雷莫司汀；抗生素如阿克拉霉素(aclacinomysins),放线菌素， authramycin，偶氮丝氨酸，博来霉素，方文线菌素C， calicheamicin, carabicin, camomycin，嗜癌霉素，色霉素，放线菌素D，柔红霉素，地托比星，6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸，多柔比星，表柔比星，依索比星，伊达比星，马塞罗霉素，丝裂霉素，麦考酚酸，诺拉霉素，橄榄霉素，培洛霉素，potfiromycin， 嘌罗霉素，三铁阿霉素，罗多比星，链黑霉素，链佐星，杀结核菌素，乌苯 美司，净司他丁，佐柔比星；抗代谢物如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶 酸类似物如denopterin,甲氨喋呤，喋罗呤，三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达 拉滨，6-巯嘌呤，thiamiprine，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨，阿扎胞苷 6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，二脱氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他滨，氟尿 苷，5-FU;雄激素诸如卡普睾酮，屈他雄酮丙酸盐，环硫雄醇，美雄烷，睾 内酯；抗肾上腺药(anti-adrenals)如氨鲁米特，米托坦，曲洛司坦；叶酸补 偿物如frolinic acid;醋葡醛内酯；羟醛磷酰胺配糖(aldophosphamide glycoside) ; 5-氨基酮戊酸；安吖啶；bestrabucil;比生群；依达曲沙 (edatraxate) ; defofamine;秋水仙胺；地吖醌；elform池ine;依利醋铵；依 托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫 哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；异丙嗪(phenamet);吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide);丙卡巴肼；PSK⑧；雷佐生；西佐喃；锗螺胺; 细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2，2，,2"-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan);长春地 辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷; gacytosine;阿拉伯糖苷("Ara-C，，)；环磷酰胺；塞替哌；紫杉烷类，例如，紫 杉醇(TAXOL⑧，Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton,新泽西)和多西 他赛(TAXOTERE⑧，Aventis， Rhone-Poulenc Rorer， Antony,法国)；苯丁酸 氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物如顺铂和卡钼; 长春碱；销；依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺；丝裂霉素C;米托蒽醌；长春 新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵(ruwantrone);替尼泊苷；道诺霉素；氨 喋呤；适罗达；伊班膦酸盐；CPT-11;拓扑异构酶抑制剂RFS 2000; 二氟甲 基鸟氨酸(DMFO);视黄酸；esperamicins;卡培他滨；以及任何上述物质的 药用盐、酸或衍生物。下列物质也包含在本定义中，它们是作用调控或 抑制激素对肿瘤的作用的抗激素药剂，诸如抗雌激素药，包括例如他莫昔 芬，雷洛昔芬，抑制芳香酶的4(5)-咪唑，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬, keoxifene， LY117018，奥那司酮，和托瑞米芬(Fareston);和抗雄激素药诸 如氟他胺，尼鲁米特，比卡鲁胺，亮丙立德，和戈舍瑞林；以及任何上述物质的药用盐、酸或者衍生物。用于治疗目的的"哺乳动物"是指分类为哺乳动物的任何动物，包括 人，小鼠，SCID，或裸鼠或小鼠品系，家畜和农场动物，以及动物园、运 动或宠物动物，诸如绵羊、狗、马、猫、牛、等等。在本发明中优选地， 所述哺乳动物是人。"寡核苷酸"是长度短的、单链或双链的多脱氧核苷酸，其通过已知 方法化学合成(如磷酸三酯、亚磷酸酯、或亚磷酰胺化学，使用固相技术，如在1988年5月4日公布的EP266,032中所述的，或通过脱氧核苷H-磷 酸酯中间物，如Froehler等，rM/c/. ^c/A A仏入14:5399-5407, 1986所述)。然后在聚丙烯酰胺凝胶上纯化它们。按照本发明，非人(例如鼠)免疫球蛋白的"人源化的"和/或"嵌合 的"形式是指这样的抗体，所述抗体包含特异的嵌合免疫球蛋白、免疫球 蛋白链或其片段(如Fv, Fab， Fab，， F(ab，)2或抗体的其它抗原-结合亚序列)， 与原始抗体相比较，其导致人抗-小鼠抗体(HAMA)、人抗-嵌合抗体(HACA) 或人抗-人抗体(HAHA)反应的减少，并且所述抗体包含来源于所述非人免 疫球蛋白的、对再现所需要的作用是必需的必需部分(例如， 一个或多个 CDR(s)、抗原结合区、可变结构域等)，同时保留与所述非人免疫球蛋白 相当的结合特征。对于大部分，人源化的抗体是这样的人免疫球蛋白(受 体抗体)，其中来自该受体抗体互补性决定区(CDRs)的残基被来自非人物 种(供体抗体)CDRs的、具有需要的特异性、亲和性和能力的残基取代， 所述非人物种如小鼠、大鼠或兔。在一些情形中，人免疫球蛋白的Fv构 架区(FR)残基被相对应的非人FR残基取代。此外，所述人源化的抗体可 以包括在受体抗体和在所引入的CDR或FR序列中都找不到的残基。进行 这些修饰以进一步限定和最优化抗体性能。通常，所述人源化的抗体应该 包括基本上不少于至少一个、和典型地两个可变结构域，其中所有或基本 上所有的CDR区与非人免疫球蛋白的那些相对应，并且所有或基本上所 有的FR残基是人免疫球蛋白共有序列的那些。所述人源化抗体优化地还 应该包括至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地是人免疫球蛋白的恒 定区。"去免疫的(De-immunized)"抗体是对于给定的物种是无免疫原性的或较少免疫原性的免疫球蛋白。去免疫可以通过抗体的结构改变实现。可 以使用本领域技术人员己知的任何去免疫技术。例如，用于使抗体去免疫性的一种适宜的技术记述在于2000年6月15日公布的WO 00/34317中。 诱导"程序性细胞死亡"的抗体是一种通过任何方式诱导程序性细胞死亡的抗体，所述方式示例而不限于，膜联蛋白V的结合，胱天蛋白酶活性，DNA的片段化，细胞收縮，内质网膨胀，细胞片段化和/或膜囊泡的形成(称为凋亡小体)。当用于本文时，"抗体诱导的细胞毒性"应该理解为意指来源于由杂交瘤产生的杂交瘤上清或抗体的细胞毒性作用，所述作用不必与结合程度相关，所述杂交瘤以保藏号051206-01保藏在IDAC。在整个说明书中，备选地，杂交瘤细胞系以及由其产生的分离的单克隆抗体由它们的内部命名AR81A410.7或保藏命名IDAC 051206-01指示。当用于本文时，"抗体-配体"包括这样的部分，所述部分表现出针对 革巴抗原的至少一个表位的结合特异性，并且其可以是完整的抗体分子、抗 体片段、以及至少具有它的抗原-结合区或部分(即，抗体分子的可变部分) 的任何分子，例如，Fv分子，Fab分子，Fab，分子,F(ab，)2分子，双特异性抗 体，融合蛋白，或特异性识别和结合由分离的单克隆抗体结合的抗原的至 少一个表位的任何遗传工程分子，所述分离的单克隆抗体由命名为IDAC 051206-01 (IDAC 051206-01抗原)的杂交瘤细胞系产生。当用于本文时，"减轻癌性疾病的抗体"(CDMAB)是指这样的单克隆 抗体及其抗体-配体，所述单克隆抗体以有益于患者的方式减轻癌性疾病过 程，例如，通过减少肿瘤负荷或延长肿瘤携带个体的生存的方式。"CDMAB相关结合剂"，以其广义，理解为包括，但不仅限于，竞 争结合于至少一个CDMAB革E表位的任何形式的人或非-人抗体、抗体片 段、抗体-配体等。"竞争性结合剂"理解为包括对至少一个CDMAB耙表位具有结合亲 和力的任何形式的人或非-人抗体、抗体片段、抗体-配体等。待治疗的肿瘤包括原发肿瘤和转移瘤，以及顽固 肿瘤。顽固性肿瘤 包括对使用单独化疗药物、单独抗体、单独辐射或其组合的治疗未能应答或对其具有抗性的肿瘤。顽固性肿瘤还包括表现出受使用所述试剂治疗抑 制但停止治疗后至多5年、有时至多10年或更长复发的肿瘤。可以治疗的肿瘤包括未血管化、或尚未充分血管化的肿瘤，以及血管 化的肿瘤。可以因此治疗的实体肿瘤实例包括乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、 胰腺癌、神经胶质瘤和淋巴瘤。所述肿瘤的一些实例包括表皮样肿瘤，鳞 状细胞肿瘤，诸如头颈肿瘤，结肠直肠肿瘤，前列腺肿瘤，乳腺肿瘤，肺 肿瘤，包括小细胞和非-小细胞肺肿瘤，胰腺肿瘤，甲状腺肿瘤，卵巢肿瘤，和肝肿瘤。其他实例包括卡波西肉瘤、CNS瘤、成神经细胞瘤、毛细血管成血管细胞瘤、脑膜瘤和脑转移瘤、黑素瘤、胃肠癌和肾癌和肉瘤、横纹 肌肉瘤、成胶质细胞瘤优选多形性成胶质细胞瘤、和平滑肌肉瘤。 当用于本文时，"抗原-结合区"意指分子识别靶抗原的部分。当用于本文时，"竞争性抑制"意指使用常规的交互(reciprocal)抗体竞 争测定能够识别和结合这样的决定簇位点，所述决定簇位点是由命名为 IDAC 051206-01的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体(IDAC 051206-01抗体) 所针对的。(BelangerL., SylvestreC.和Dufour D. (1973),通过竞争性和夹 心方法对a月台蛋白的酶联免疫湖!j定(Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures). Clinica Chimica Acta 48, 15)。当用于本文时，"靶抗原"是IDAC 051206-01抗原或其部分。 当用于本文时，"免疫缀合物"意指与细胞毒素、放射性试剂、细胞 因子、干扰素、靶标或报告部分、酶、毒素、抗肿瘤药或治疗药剂化学或 生物学连接的任何分子或CDMAB，如抗体。所述抗体或CDMAB可以在 分子的任何位置处与所述细胞毒素、放射性试剂、细胞因子、干扰素、耙 标或报告部分、酶、毒素、抗肿瘤药或治疗药物连接，只要它能够结合其 靶点。免疫缀合物的实例包括抗体毒素化学缀合物和抗体-毒素融合蛋白。 适合于用作抗-肿瘤试剂的放射性试剂是本领域中那些技术人员已知 的。例如，使用131I或211At。利用常规技术使这些同位素附着于抗体(例 如Pedley等，英国癌症杂志(Br. J. Cancer) 68， 69-73 (1993))。备选地，附 着于抗体的抗-肿瘤试剂是活化前体药物的酶。可以施用这样的前体药物， 所述前体药物保持其失活形式直到其到达肿瘤位点， 一旦施用抗体复合物所述前体药物在该位点处转化为其细胞毒素形式。实际上，将抗体-酶缀合 物施用于患者并容许定位在待治疗的组织区域。然后将前体药物施用于患 者，从而使向细胞毒性药物的转化发生在待治疗组织区域中。备选地，与抗体缀合的抗-肿瘤试剂是细胞因子，诸如白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介 素-4(IL-4)或肿瘤坏死因子ot(TNF-(x)。所述抗体靶向针对肿瘤的细胞因子， 以使得细胞因子在不影响其他组织的条件下介导针对肿瘤的损伤或破坏。 利用常规重组DNA技术使细胞因子在DNA水平上与抗体融合。还可以使 用干扰素。当用于本文时，"融合蛋白"意指任何嵌合蛋白，其中抗原结合区与 生物活性分子如毒素、酶、荧光蛋白、发光标记、多肽标记物、细胞因子、 干扰素、靶标或报告部分或蛋白药物连接。本发明还预期本发明的CDMAB，靶标或报告部分与所述CDMAB相 连接。靶标部分是结合对的第一个成员。抗-肿瘤试剂，例如，与所述对的 第二个成员缀合，且由此针对抗原-结合蛋白结合的位点。所述结合对的常 见实例是抗生物素蛋白和生物素。在优选的实施方案中，生物素与本发明 CDMAB的靶抗原缀合，并由此为抗-肿瘤试剂或与抗生物素蛋白或链亲和 素缀合的其他部分提供靶标。备选地，生物素或另一种所述部分与本发明 CDMAB的靶抗原相连接，并用作，例如诊断系统中的报告分子，在所述 诊断系统中可检测的信号-生成试剂与抗生物素蛋白或链亲和素缀合。可检测的信号-生成试剂有效用于体内和体外诊断目的。信号生成试 剂产生可测量的信号，所述信号是可以通过外部方法，通常电磁辐射测量 法检测的。通常，所述信号生成试剂是酶或发色团，或由荧光、磷光或化 学发光引起的发光。发色团包括在紫外或可见区吸收光的染料，且可以是 酶催化反应的底物或降解产物。而且，在本发明范围内包括本发明CDMAB体内和体外用于研究或诊 断方法的用途，这在本领域中是公知的。为了执行如本文中所预期的诊断 方法，本发明还可以包括试剂盒，所述试剂盒包括本发明的CDMAB。所 述试剂盒应该有效用于通过检测CDMAB的靶抗原在该个体细胞中的过 量表达而确定处于某种类型癌症风险中的个体。诊断测定试剂盒预期利用处于诊断测定试剂盒形式的本发明CDMAB确定肿瘤的存 在。通常基于一种或多种肿瘤-特异性抗原，例如在生物学样品，诸如血液、 血清、尿液和/或肿瘤活组织检查中的蛋白质和/或编码所述蛋白的多核苷 酸的存在，检测患者中的肿瘤，所述样品应该是获自所述患者的。所述蛋白起指示具体肿瘤，例如结肠、乳腺、肺或前列腺肿瘤存在或 缺乏的标记的作用。还预期所述抗原应该具有检测其他癌性肿瘤的效用。在诊断试剂盒中包括包含本发明CDMAB的结合试剂或CDMAB相关结合 试剂允许检测与生物学样品中的试剂相结合的抗原水平。多核苷酸引物和 探针可以用于检测编码肿瘤蛋白的mRNA水平，其也指示是否存在癌症。 为了使该结合测定具有诊断性，产生这样的数据，即所述数据与和正常组 织中存在的抗原相比具有统计学显著性的抗原水平相关，从而能够实施识 别确定地诊断癌肿瘤存在的结合。预期许多形式应该有效用于本发明的诊 断测定，如本领域中普通技术人员己知地，从而使用结合试剂检测样品中 的多肽标记。例如，如Harlow和Lane,抗体实验室手册(Antibodies: A Laboratory Manual),冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory),第 9-14章，1988中举例说明的。还预期前述诊断测定形式的任意和全部组合、 排列或改进。患者中是否存在癌症应该典型地通过以下确定(a)使获自患者的生 物学样品与结合试剂接触；(b)检测样品中与结合试剂结合的多肽水平；和(c)比较多肽水平和预定截断值。在举例说明的实施方案中，预期该测定应该包括使用固定在固体支持物上的基于CDMAB的结合试剂结合和从样品的残余中去除多肽。结合的多肽然后可以利用检测试剂检测，所述检测试剂包含报告基团并特异性结合于结合试剂/多肽复合物。例证性检测试剂可以包括基于CDMAB的结合试剂，所述结合试剂特异性结合于多肽或抗体或特异性结合于所述结合试剂的其他试剂，诸如抗-免疫球蛋白、蛋白质G、蛋白质A或凝集素。在备选的实施方案中，预期可以使用竞争测定，其中用报告基团标记多肽， 并容许其在结合试剂与样品一起温育后结合于固定的结合试剂。样品与固定的结合试剂的反应性指示是所述样品成分抑制标记的多肽与结合试剂结合的程度。对于在所述测定中使用合适的多肽包括结合试剂对其具有结 合亲和力的全长肿瘤-特异性蛋白和/或其部分。
所述诊断试剂盒应该具有固体支持物，其可以处于本领域中普通技术 人员已知的蛋白质可以附着的任何材料形式。合适的实例可以包括微量滴 定板中的检测孔或硝化纤维或其他合适的膜。备选地，所述支持物可以是 珠或盘，诸如玻璃、玻璃纤维、乳胶或塑料材料诸如聚苯乙烯或聚氯乙烯。 所述支持物还可以是磁性粒子或光纤传感器，诸如例如美国专利号
5,359,681中公开的那些。
预期利用多种本领域中那些技术人员己知的技术将结合试剂固定在 固体支持物上，这详细地记述在专利和科学文献中。术语"固定"指非共 价缔合诸如吸附和共价附着，其在本发明的情形中，可以是所述试剂和所 述支持物官能团之间的直接连接，或可以是通过交联剂的连接。在优选但 非限制性实施方案中，通过吸附固定于微量滴定板的孔或膜是优选的。吸 附可以通过使结合试剂，在合适的缓冲液中，与固体支持物接触一段合适 的时间获得。接触时间可以随温度变化，且应该通常在约1小时-约1天的 范围内。
结合试剂与固体支持物的共价附着一般通过首先使该支持物与双功 能试剂反应实现，所述双功能试剂应该与支持物和结合试剂上的官能团， 诸如羟基或氨基基团二者反应。例如，结合试剂可以通过使用苯醌或通过 使支持物上的醛基与结合配偶体上的胺和活性氢縮合共价附着于具有合 适聚合物涂层的支持物。
还预期所述诊断测定试剂盒应该采用双-抗体夹心式测定的形式。该 测定可以通过首先使抗体，例如本发明公开的固定在固体支持物，通常是 微量滴定板的孔上的CDMAB，与样品接触进行，从而容许该样品中的多 肽结合于固定的抗体。然后从固定的多肽-抗体复合物中去除未结合的样 品，并加入包含报告基团的检测试剂(优选地，能够结合于多肽上不同位 点的第二抗体)。然后使用适合于特异性报告基团的方法确定保持与固体 支持物结合的检测试剂的量。
在特殊实施方案中，预期抗体一旦固定在如上所述的支持物上，应该 通过使用本领域中普通技术人员已知的任何合适封闭剂，诸如牛血清清蛋白或吐温2()TM (西格玛化学公司(Sigma Chemical Co.) ， St. Louis， Mo.)
封闭支持物上剩余的蛋白质结合位点。然后使固定的抗体与样品一起温 育，且容许多肽结合于所述抗体。温育前，可以用合适的稀释剂，诸如磷 酸盐缓冲液(PBS)稀释样品。通常，合适的接触时间(即温育时间)应 该进行选择以对应于这样的时间期，所述时间期足以检测获自患有特定选 择的肿瘤的个体的样品中多肽的存在。优选地，接触时间足以获得在结合 和未结合多肽之间平衡时获得的结合水平的至少约95%的结合水平。本领 域中那些普通技术人员应该承认获得平衡所需的时间可以容易地通过测 定经过一段时间发生的结合水平来确定。 ' 还预期未结合的样品应该然后通过用合适的缓冲液清洗固体支持物 而去除。然后应该将包含报告基团的二次抗体加入固体支持物。然后进行 检测试剂与固定的抗体-多肽复合物在一起温育一段足以检测结合的多肽 的时间量。随后，然后去除未结合的检测试剂，并利用报告基团检测结合 的检测试剂。用于检测报告基团的方法必须特异于所选报告基团的类型， 例如，针对放射性基团，闪烁计数或放射自显影法通常是适合的。光谱法 可以用于检测染料、发光基团和荧光基团。生物素可以利用与不同报告基 团(通常，放射性或荧光基团或酶)偶联的抗生物素蛋白检测。酶报告基 团可以通常通过添加底物(通常进行一段特定时期)，随后进行反应产物 的光谱或其他分析来检测。
为了使用本发明的诊断测定试剂盒确定是否存在癌症，诸如前列腺 癌，通常将从保持与固体支持物结合的报告基团检测到的信号与对应于预 确定截断值的信号相比较。例如，用于检测癌症的例证性截断值可以是当 使固定的抗体与来自无癌症患者的样品一起温育时获得的平均信号。通 常，认为产生高于预确定截断值约3个标准偏差的信号的样品是癌症阳性 的。在备选的实施方案中，按照Sackett等，临床流行病学(Clinical Epidemiology).临床医学基本禾斗学(A Basic Science for Clinical Medicine), 利特尔布朗公司(Little Brown and Co.) , 1985, p. 106-7的方法，截断值可 以利用接受者操作曲线(Receiver Operator Curve)确定。在该实施方案中， 截断值可以从对应于关于诊断检测结果的每种可能的截断值的正阳性率 (即灵敏性)和假阳性率(100%-特异性)对的图表确定。在最接近左上角的图表中的截断值(即包含最大面积的值)是最准确的截断值，且可以 认为产生高于由该方法确定的截断值的信号的样品是阳性的。备选地，截 断值可以沿着图表向左移动，从而最小化假阳性率，或向右移动，从而最 小化假阴性率。 一般，认为产生高于由该方法确定的截断值的信号的样品 对癌症是阳性的。
预期可通过所述试剂盒进行的诊断测定应该以流通式或试验纸检验 (striptest)形式进行，其中结合试剂固定在膜，诸如硝化纤维膜上。在流通 式检测中，当样品流经膜时，样品中的多肽结合于固定的结合试剂。第二 种标记的结合试剂在包含该第二种结合试剂的溶液流经该膜时，再结合于 结合试剂-多肽复合物。结合的第二种结合试剂的检测可以然后如上所述进 行。在试验纸检验形式中，将结合试剂结合的膜的一端浸没在包含样品的 溶液中。该样品沿该膜移动经过包含第二种结合试剂的区域，并到达固定 的结合试剂的区域。所述第二结合试剂在固定的抗体区域处的浓度指示癌 症的存在。在结合位点形成可以视觉读取的图案，诸如线，指示阳性检测。 缺乏所述图案指示阴性结果。 一般，选择固定在膜上的结合试剂的量，从 而在生物学样品包含足以在处于上述形式的双-抗体夹心式测定中产生阳 性信号的多肽水平时，产生视觉可辨别的图案。对于在本诊断测定中使用 的优选结合试剂是目前公开的抗体，其抗原-结合片段、和如本文中所述的
任何CDMAB相关结合试剂。固定在膜上的抗体的量应该是有效引起诊断 测定的任意量，且可以在约25毫微克_约l微克的范围内。典型地，所述 检测可以利用非常小量的生物学样品进行。
另外，本发明的CDMAB由于其识别其靶抗原的能力，可以用在进行 研究的实验室中。
为了更充分地理解本文所述的本发明，进行了下述描述。
本发明提供特异性识别和结合IDAC 051206-01抗原的CDMAB (即， IDAC 051206-01 CDMAB)。
通过以保藏号051206-01保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆 抗体的CDMAB可以以任何形式存在，只要它具有这样的抗原-结合区， 所述抗原-结合区竞争性抑制由杂交瘤IDAC 051206-01产生的分离的单克 隆抗体与其靶抗原的免疫特异性结合。因此，具有与IDAC 051206-01抗体相同的结合特异性的任何重组蛋白(例如，融合蛋白，其中所述抗体与 第二蛋白如淋巴因子或肿瘤抑制性生长因子结合)均落入本发明的范围 内。
在本发明的一个实施方案中，所述CDMAB是IDAC 051206-01抗体。 在其它实施方案中，所述CDMAB是抗原结合片段，其可以是Fv分 子(如单链Fv分子)、Fab分子、Fab，分子、F(ab，)2分子、融合蛋白、双特 异性抗体、异种抗体或具有IDAC 051206-01抗体的抗原-结合区的任何重 组分子。本发明的CDMAB针对所述IDAC 051206-01单克隆抗体针对的 表位。
本发明的CDMAB可以在分子内进行修饰，即，通过氨基酸修饰，以 产生衍生物分子。化学修饰也可以是可能的。通过直接突变、亲和力成熟 方法、噬菌体展示或链改组的修饰也可以是可能的。
亲和力和特异性可以通过突变CDR和/或苯丙氨酸色氨酸(FW)残 基和筛选具有所需特征的抗原结合位点进行改进或改良。(例如，Yang等; 分子生物学杂志(J.Mol.Biol.) ,(1995)254:392-403)。 一种方法是随机化 各个残基或残基的组合，从而在其它方面相同的抗原结合位点群中，2-20 个氨基酸的子集存在于特定位置处。备选地，突变可以通过易错PCR方 法在一定范围的残基中诱导(例如，Hawkins争，分子生物学杂志(J. Mol. Biol.) ，(1992) 226:889-96)。在另一个实例中，包含重链和轻链可变区基 因的噬菌体展示载体可以在大肠杆菌(￡. co/O突变菌株中增殖(例如，Low 等,分子生物学杂志(J. Mol. Biol.) , (1996) 250: 359-68)。这些诱变方法 是许多本领域中技术人员己知方法的例证。
增加本发明抗体亲和力的另一种方式是进行链改组，其中重链或轻链 与其他重链或轻链随机配对，从而制备具有较高亲和力的抗体。抗体中的 多种CDR也可以利用其他抗体中相对应的CDR改组。
衍生物分子将保留所述多肽的功能特性，即，具有这样的取代的分子 仍然允许所述多肽与所述IDAC 051206-01抗原或其部分结合。
这些氨基酸取代包括，但不必要限于，本领域内已知为"保守的"氨 基酸取代。
例如，充分确定的蛋白质化学原理认为，通常可以在蛋白质内进行称为"保守氨基酸取代"的特定的氨基酸取代，而不改变该蛋白质的构象或 功能。
这样的变化包括用异亮氨酸(I)，缬氨酸(V),和亮氨酸(L)中的任一种
取代这些疏水性氨基酸中的任意其它一种；用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)， 并且反之亦然；用谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N),并且反之亦然；并且用丝 氨酸(S)取代苏氨酸(T)，并且反之亦然。其它取代也可以被认为是保守的， 这取决于特定氨基酸的环境及其在蛋白质的三维结构中的作用。例如，甘 氨酸(G)和丙氨酸(A)通常可以互换，同样丙氨酸和缬氨酸(V)也可以互换。 相对疏水性的甲硫氨酸(M)通常可以与亮氨酸和异亮氨酸互换，并且有时 可以与缬氨酸互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)通常在这样的情形中互换，在 所述情形中，氨基酸残基的重要特征是其电荷，并且这两种氨基酸残基的 不同的pK，s并不显著。在特定的情形中，还有其它的变化可以被认为是 "保守的"。
实施例1
杂交瘤生产----杂交瘤细胞系AR81A410.7
依据布达佩斯条约，杂交瘤细胞系AR81A410.7于2006年12月5日 保藏在加拿大国际保藏机构(the International Depository Authority of Canada, IDAC)，加拿大卫生部微生物局(Bureau of Microbiology, Health Canada)(加拿大，马尼托巴省，温尼伯，Arlington街1015， R3E3R2)， 保藏号为051206-01。依据37 CFR 1.808，保藏者保证在授予专利时，施 加在所保藏的材料的公众可获得性上的所有约束均不能撤回。如果保藏机 构不能发放存活的样品，替换保藏品。
为了产生生产抗癌抗体AR81A410.7的杂交瘤，在PBS中制备冷冻的 肺腺癌肿瘤组织(Genomics Collaborative, Cambridge, MA)的单细胞混悬 液。通过轻轻混合制备IMMUNEASY (Qiagen, Venlo,荷兰)佐剂用于使 用。通过皮下注射在50微升的抗原佐剂中的200万个细胞而免疫5-7周龄 的BALB/c小鼠。在初次免疫后2和5周，用新鲜制备的抗原佐剂对免疫 的小鼠进行腹膜内加强，浓度为200万个细胞/50微升。在最后一次免疫 后3天，使用脾脏进行融合。通过将分离的脾细胞与NSO-l骨髓瘤配偶体融合而制备杂交瘤。对杂交瘤亚克隆，检测来自融合物的上清。
为了确定该杂交瘤细胞分泌的抗体是IgG还是IgM同种型，使用
ELISA测定。在4。C在ELISA平板中加入100微升/孔的山羊抗-小鼠IgG + IgM (H+L)过夜，所述山羊抗-小鼠IgG + IgM (H+L)在包被缓冲液(0.1 M 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH 9.2-9.6)中，浓度2.4微克/mL。将平板用洗 涤缓冲液(PBS + 0.05n/。吐温)洗涤3次。向平板加入100微升/孔的封闭 缓冲液(在洗涤缓冲液中5%牛奶)，在室温下1小时，然后在洗涤缓冲液 中洗涤3次。加入100微升/孔的杂交瘤上清，并且将平板在室温下温育1 小时。平板用洗涤缓冲液洗涤3次，并且加入山羊抗-小鼠IgG或IgM辣 根过氧化物酶缀合物的1/100，000稀释液(稀释在含有1%牛奶的PBS中)， 100微升/孔。在将平板在室温下温育l小时后，将平板用洗涤缓冲液洗涤 3次。将100微升/孔的TMB溶液在室温下温育1-3分钟。加入50微升/ 孔2M H2S04终止颜色反应，并且用Perkin-Elmer HTS7000平板读数仪在 450nm下对平板读数。如在图1中所示，AR81A410.7杂交瘤主要分泌IgG 同种型的抗体。
为了确定由所述杂交瘤细胞分泌的抗体的亚类，使用小鼠单克隆抗体 同种型试剂盒(HyCult生物技术(HyCult Biotechnology) , Frontstraat,荷 兰)进行同种型分型实验。将500微升缓冲液加入到包含大鼠抗-小鼠亚类 特异性抗体的检测试验纸。将500微升杂交瘤上清液加入到检测管，并通 过轻轻搅动浸没。通过与胶体粒子偶联的第二大鼠单克隆抗体直接检测捕 获的小鼠免疫球蛋白。这两种蛋白质的组合产生用于分析同种型的视觉信 号。抗-癌抗体AR81A410.7是IgG2a、 k同种型的。
在一轮限制性稀释后，在细胞ELISA测定中检测杂交瘤上清的与靶 细胞结合的抗体。检测了三种人肺癌细胞系、 一种人乳腺癌细胞系和一种 人非-癌肺细胞系分别为A549, NCI-H23, NCI-H460, MDA-MB-231禾口 Hs888丄u。所有细胞系均从美国典型培养物保藏中心(ATCC， Manassas, VA) 获得。在使用前将接种的细胞固定。在室温下，用含有MgCl2和CaCl2的 PBS洗涤平板三次。向每个孔中加入100微升稀释在PBS中的2%低聚甲 醛，在室温下10分钟，然后倒掉。将平板再在室温下用含有MgCl2和CaCl2 的PBS洗涤三次。在室温下用100微升/孔在洗漆缓冲液(PBS + 0.05。/。吐温)中的5%牛奶封闭1小时。将平板用洗涤缓冲液洗涤三次，并且以100 微升/孔加入杂交瘤上清，在室温下1小时。将平板用洗涤缓冲液洗涤3
次，并且加入100微升/孔与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗-小鼠IgG抗体 的1/25,000稀释液(稀释在含有1%牛奶的PBS中)。在室温下温育1小 时后，将平板用洗涤缓冲液洗涤3次，并且将100微升/孔的TMB底物在 室温下温育1-3分钟。用50微升/ L 2M H2S04终止反应，并且用 Perkin-ElmerHTS7000平板读数仪在450nm下对平板读数。列在图1中的 结果表示为与内部(in-house) IgG同种型对照相比高出背景的倍数，所述 内部IgG同种型对照先前已经表明不与所检测的细胞系结合。来自杂交瘤 AR81A410.7的抗体显示出与MDA-MB-231乳腺癌细胞系的强结合，与肺 癌细胞系NCI-H23和NCI-H460或正常肺细胞系Hs888丄u的较弱结合。
与检测抗体结合联合，在下述细胞系中检测杂交瘤上清的细胞毒性作 用(抗体诱导的细胞毒性)A549, NCI-H23， NCI-H460, MDA-MB-231和 Hs888丄u。钙荧光素AM从分子探针(Molecular Probes) (Eugene, OR)获 得，并且按照下文所述进行测定。在测定前将细胞以预先确定的适当的密 度接种。2天后，将来自杂交瘤微量滴定板的100微升上清转移到细胞平 板中，并且在5% C02培养箱中温育5天。抽空作为阳性对照的孔，加入 100微升溶解在培养基中的叠氮钠(NaN3， .01%,西格玛(Sigma), Oakville, ON)或放线菌酮(CHX, 0.5微摩尔，西格玛(Sigma) , Oakville, ON)。在处 理5天后，然后通过倒置将平板倒空，并且吸干。从多通道挤压瓶向每个 孔中分配含有MgCl2和CaCl2的室温DPBS (Dulbecco's磷酸盐缓冲液)，轻 敲3次，通过倒置倒空然后吸干。向每个孔中加入50微升稀释在含有MgCl2 和CaCl2的DPBS中的荧光钙荧光素染料，并且在37°C在5% C02培养箱 中温育30分钟。在Perkin-Elmer HTS7000荧光平板读数仪中对平板读数， 并且在Microsoft Excel中分析数据。结果列在图1中。来自AR81A410.7 杂交瘤的上清对NCI-H23肺癌细胞产生43%的特异性细胞毒性。这是分 别用阳性对照叠氮钠和放线菌酮得到的细胞毒性的86%和391%。 AR81A410.7还对NCI-H460肺癌细胞产生12%特异性细胞毒性，这是分 别用阳性对照叠氮钠和放线菌酮得到的细胞毒性的17%和52%。
来自图1的结果证明AR81A410.7的细胞毒性作用不直接与癌细胞类型上的结合水平相关。尽管用MDA-MB-231乳腺癌细胞检测到最高结合， 在NCI-H23和NCI-H460肺癌细胞上检测到细胞毒性。如图1中列表， AR81A410.7不在Hs888丄u正常人肺细胞系中产生细胞毒性。已知的非-特异性细胞毒性试剂放线菌酮和NaN3通常如预料地产生细胞毒性。
实施例2 体外结合
通过在CL-1000烧瓶(BD生物科学(BD Biosciences), Oakville, ON) 中培养杂交瘤而生产AR81A410.7单克隆抗体，收集和再接种以两次/周进 行。接着使用蛋白质G琼脂糖4 Fast Flow(Protein G Sepharose 4 Fast Flow) (安玛西亚生物科学(Amersham Biosciences), Baie d，Urfd， QC)进行标准的 抗体纯化步骤。使用去免疫的、人源化的、嵌合的或鼠单克隆抗体在本发 明范围之内。
通过流式细胞计数(FACS)评估AR81A410.7与肺(A549， NCI-H23， NCI-H322M, NCI-H460,和NCI-H520)、结肠(Lovo)、乳腺(MDA-MB-231)、 胰腺(BxPC-3)、前列腺(PC-3)和卵巢(OVCAR-3)癌，和来自皮肤(CCD-27sk) 和肺(Hs888丄u)的非-癌细胞系的结合。除肺癌细胞系NCI-H322M夕卜，全 部细胞系获自美国典型培养物保藏中心(American Type Tissue Collection) (ATCC， Manassas, VA)。 NCI-H322M获自NCI-弗雷德里克癌症DCTD肿 瘤/细胞系保藏中心(NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository )(弗雷德里克(Frederick) ,MD)。
通过最初用DPBS (无Ca—和Mg++)清洗细胞单层，为FACS准备细 胞。然后使用细胞解离缓冲液(Invitrogen, Burlington, ON)在37。C将细胞从 它们的细胞培养板中移出。离心和收集后，将细胞在4°C重新混悬在包含 MgCl2,CaCl2和2。/。胎牛血清的DPBS中(染色培养基)并计数，等分为适 当的细胞密度，离心沉淀细胞并在存在检测抗体(AR81A410.7)或对照抗体 (同种型对照，抗-EGFR)的条件下，在4。C，重新混悬在染色培养基中。 在冰上，以20微克/mL评估同种型对照和检测抗体，而以5微克/mL评估 抗-EGFR30分钟。加入AlexaFluor 546-缀合的二次抗体前，用染色培养 基清洗细胞一次。然后，在4。C，添加染色培养基中的AlexaFluor546-缀合抗体30分钟。再最后清洗细胞一次并重新混悬在固定培养基(包含1.5%
低聚甲醛的染色培养基)中。通过利用FACSarray 系统软件在 FACSarray 上运行样品评估细胞的流式细胞计数采样(BD生物科学(BD Biosciences), Oakville, ON)。通过调节FSC和SSC检测器上的电压和振幅 增加设置细胞正向(FSC)和侧向扩散(SSC)。通过运行未染色的细胞调节 用于荧光(Alexa-546)通道的检测器，从而使细胞具有约1-5单位中等荧光 强度的一致的峰。对于每份样品，获得约10,000门控事件(染色的固定细 胞)以进行分析，并将结果显示在图2中。
图2显示超过同种型对照的平均荧光强度倍数增加。图3编辑 AR81A410.7抗体的代表性柱状图。AR81A410.7证明了与肺癌细胞系 NCI-H23 (3.5-倍)，乳腺癌细胞系MDA-MB-231 (1.6-倍)，胰腺癌细胞系 BxPC-3 (2.6-倍)，卵巢癌细胞系OVCAR-3 (2.5-倍)，前列腺癌细胞系PC-3 (2.5-倍)，皮肤非-癌细胞系CCD-27sk (1.9-倍)和肺非-癌细胞系Hs888丄u (2.7-倍)的可检测结合。这些数据还证明AR81A410.7结合于具有不同抗原 表达水平的一些不同细胞系。
实施例3
使用BxPC-3细胞进行体内肿瘤实验
实施例1和2证明AR81A410.7具有针对对若干不同癌症指示剂具有 可检测结合的人癌细胞系的抗癌特性。参考图4和5，对8-10周龄雌性 SCID小鼠通过在颈部后颈处皮下注射而植入在100微升PBS溶液中的500 万人胰腺细胞(BxPC-3)。将小鼠随机分成2个处理组，每组6只。在植 入后那天，在用含有2.7 mM KC1, 1 mM KH2P04, 137 mM NaCl和20 mM Na2HP04的稀释剂从储备的浓縮液稀释后，对每组腹膜内施用300微升体 积的20mg/kg的AR81A410.7检测抗体或缓冲液对照。然后，在研究持续 时间内，以相同的方式每周一次施用所述抗体和对照样品。约每隔7天用 测径器测量肿瘤生长。在8剂量抗体注射后，结束本研究。在研究持续时 间内，每周一次记录动物的体重。在研究结束时，按照CCAC指导将所有 动物处死。
AR81A410.7在人胰腺癌BxPC-3体内预防模型中减少肿瘤生长。如在第56天，即最后给药抗体后6天时确定地，与缓冲液-处理的对照组相
比，用ARIUS抗体AR81A410.7处理以71.5。/。减少BxPC-3肿瘤生长(图 4)。该结果未能达到显著性(p-0.14,t-检验)，这归因于各组中低小鼠数量， 但是抗体-处理组中的肿瘤尺寸在与赋形剂对照比较时，在每个时间点均较 低。在第41天，当所有小鼠仍然存活时，肿瘤生长受到75%的抑制03=0.104, t-检验)。
在整个研究过程中，不存在临床毒性迹象。以每周时间间隔测量的体 重是健康和不能健壮生长(thrive)的替代品(surrogate)。从研究的开始 到结束，各组的体重没有显著差别(对照，p^.OOO，t-检验；AR81A410.7， p二0.2094，t-检验)。然而，在研究结束时，第62天，各组间存在显著差别 (p=0.0396， t-检验)(图5)。
总之，在这种人胰腺异种移植模型中，AR81A410.7是很好耐受的， 并且减少肿瘤负荷。
实施例4
竞争性结合剂的分离
给定抗体，本领域普通技术人员可以产生竞争性抑制CDMAB，例如 竞争性抗体，其是一种识别相同表位的抗体(BelangerL筝C/z'm'ca On'm/ca JctaM:/5-7S(1973))。 一种方法需要(entails)用这样的免疫原进行免疫，所 述免疫原表达被所述抗体识别的抗原。样品可以包括，但不限于，组织、 分离的蛋白或细胞系。得到的杂交瘤可以使用竞争测定进行筛选，所述竞 争测定是一种鉴定抑制测试抗体的结合的抗体的测定，诸如ELISA,FACS 或蛋白质印迹。另一种方法可以使用噬菌体展示抗体文库，和淘选 (panning)识别所述抗原的至少一个表位的抗体(Rubinstein JL等.年度生 物化学"加/说oc/zew) 314:294-300(2003))。在每种情形中，基于抗体置 换初始标记抗体与其靶抗原的至少一个表位的结合的能力，选择抗体。因 此，这样的抗体将如初始抗体一样具有识别抗原的至少一个表位的特征。
实施例5
克隆AR81A410.7单克隆抗体的可变区可以确定由AR81A410.7杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体的重链(VH) 和轻链(VO的可变区的序列。使用标准方法，包括使用异硫氰酸胍进行的 细胞溶解(Chirgwin等.生物化学(Biochem) .18:5294-5299(1979))，可 以从受试杂交瘤提取编码免疫球蛋白重链和轻链的RNA。通过本领域内 已知的PCR方法(Sambrook等编，分子克隆(Molecular Cloning)，第14 章，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor laboratories Press)，纽约. (1989))，可以使用mRNA制备cDNA，随后分离Vh和Vl基因。可以通 过自动Edman测序独立地确定重链和轻链的N端氨基酸序列。还可以通 过VH和Vl片段的氨基酸测序而确定CDRs和侧翼FRs的其他片段。然后， 设计合成的引物，用于从AR81A410.7单克隆抗体分离VH和V^基因，并 且可以将分离的基因连接到适当的载体中进行测序。为了产生嵌合的和人 源化的IgG，可以将可变轻链和可变重链结构域亚克隆到适当的载体中进 行表达。
在另一个实施方案中，AR81A410.7或其去免疫的、嵌合的或人源化 的形式通过在转基因动物中表达编码所述抗体的核酸产生，从而表达并可 以回收抗体。例如，抗体可以以促进回收和纯化的组织特异性方式表达。 在该实施方案中，本发明的抗体表达在乳腺中，从而在哺乳期过程中分泌。 转基因动物包括但不仅限于小鼠、山羊和兔。
(i)单克隆抗体
使用常规方法容易地分离并测序编码单克隆抗体(如在实施例1中所 述)的DNA (例如，通过使用能够特异性结合编码所述单克隆抗体重链 和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞作为这样的DNA的优选来 源。当分离时，所述DNA可以置于表达载体内，然后将其转染到宿主细 胞中，如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO) 细胞、或骨髓瘤细胞中，所述细胞不另外产生免疫球蛋白，以在重组宿主 细胞中获得单克隆抗体的合成。也可以修饰所述DNA，例如，通过取代 人重链和轻链恒定结构域编码序列替换同源鼠序列。也可以使用合成蛋白 质化学中的已知方法，包括含有交联剂的那些方法，体外制备嵌合抗体或 杂交抗体。例如，可以使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键构建免疫毒素。用于这一 目的的适当试剂的实例包括亚氨基硫羟酸盐(iminothiolate) 和甲基-4-巯基butyrimidate。
(ii) 人源化的抗体 人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些
非人氨基酸残基通常称为"引入"的残基，其典型地来自"引入的"可变 结构域。可以通过Winter及合作者的方法用啮齿类CDRs或CDR序列取 代相对应的人抗体序列(Jones等，自然(Nature) 321:522-525 (1986); Riechmann等，自然(Nature) 332:323-327 (1988); Verhoeyen等，科学 (Science) 239:1534-1536 (1988);在Clark,今日免疫学(Immunol. Today) 21:397-402 (2000)中的综述)进行人源化。
可以通过使用母体和人源化序列的三维模型分析母体序列和不同概 念人源化产物的方法而制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是本领 域技术人员可获得的和熟悉的。图解和展示所选候选免疫球蛋白序列的可 能的三维构象结构的计算机程序是可获得的。这些展示的观察允许分析残 基在所述候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选免 疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以这种方式，可以从共有和引入序 列中选择FR残基且组合FR残基，以便获得需要的抗体特征，如对靶抗 原增加的亲和性。通常，CDR残基直接且最显著地(most substantially) 参与影响抗原结合。
(iii) 抗体片段
已经开发了生产抗体片段的各种技术。这些片段可以通过重组宿主细 胞产生(参考Hudson,现代免疫学观点(Curr.Opin. Immunol.) 11:548-557 (1999); Little等，今日免疫学(Immunol. Today) 21:364-370 (2000))。例如， Fab，-SH片段可以直接从大肠杆菌回收，并且化学偶联以形成F(ab')2片段 (Carter等,生物技术(Biotechnology) 10:163-167 (1992》。在另一个实施 方案中，使用亮氨酸拉链GCN4促进F(ab')2分子的组装而形成F(ab')2。 根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物分离Fv, Fab或F(ab，)2 片段。实施例6
包括本发明的抗体的组合物
本发明抗体可以用作预防/治疗癌症的组合物。所述包括本发明抗体的 用于预防/治疗癌症的组合物是低毒性的，并且它们可以采用液体制剂的形 式施用，或作为适用于人或哺乳动物(例如，大鼠、兔、绵羊、猪、牛、 猫、犬、猿猴、等等)的制剂的药物组合物口服或肠胃外(例如，静脉内、 腹膜内、皮下、等等)施用。本发明抗体可以以本身施用，或可以作为适 当的组合物施用。用于所述施用的组合物可以包含药用载体，和本发明抗 体或其盐，稀释剂或赋形剂。这样的组合物以适于口服或肠胃外施用的药 物制剂的形式提供。
用于肠胃外施用的组合物的实例是可注射制剂、栓剂等。可注射制剂 可以包括这样的剂型，诸如静脉内、皮下、皮内和肌内注射，滴注，关节 内注射等等。这些可注射制剂可以通过公知方法制备。例如，可注射制剂 可以通过将本发明抗体或其盐溶解、混悬或乳化在常规用于注射的无菌水 性介质或油性介质中而制备。对于水性注射介质，存在如生理盐水，含有 葡萄糖和其他辅助试剂的等渗溶液等，其可以与适当的增溶剂如醇(例如 乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂(例如，聚
山梨酸酯80, HCO-50 (氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50 mols)加合物))等组合使 用。对于油性介质，使用例如芝麻油、大豆油等，其可以与增溶剂如苯甲 酸苄酯、苯甲醇等组合使用。这样制备的注射剂通常装在适当的安瓿中。 用于直肠施用的栓剂可以通过将本发明抗体或其盐与常规用于栓剂的基 质混合而制备。用于口服施用的组合物包括固体或液体制剂，具体为片剂
(包括糖衣和薄膜包被的片剂)，丸剂、粒剂、粉末制剂、胶囊(包括软 胶囊)、糖浆、乳液、混悬液等。这样的组合物通过公知方法制备，并且 可以包含常规用在药物制剂领域中的赋形剂(vehicle)、稀释剂或赋形剂
(excipient)。用于片剂的赋形剂(vehicle)或赋形剂(excipient)的实例 包括乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁等。
有利地，将上述用于口服或肠胃外应用的组合物制备成适于符合活性 成分剂量的单位剂量的药物制剂。所述单位剂量制剂包括，例如，片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂、等等。所包含的前述化合物的量通
常为5 - 500 mg/剂量单位形式；优选地特别是在注射液形式中含有约5-约 100 mg的上述抗体，并且对于其他形式含有10-250 mg的上述抗体。
前述包括本发明抗体的预防性/治疗性药剂或调节剂的剂量可以取决
于下列各项而不同被施用的受试者，目的疾病，病症，施用途径等等。
例如，当用于治疗/预防目的时，例如，治疗/预防成年人中的乳腺癌时，
有利地以约0.01-约20mg/kg体重、优选地约0.1-约10mg/kg体重且 更优选地约0.1 -约5 mg/kg体重的剂量静脉内施用本发明的抗体，约1 -5次沃，优选约1 - 3次沃。在其他肠胃外和口服施用中，所述药剂可以 以与上述剂量相对应的剂量施用。当病症特别严重时，可以依据病症增加 剂量。
本发明抗体可以以其自身或以适当组合物的形式施用。用于施用的组 合物可以包含药用载体与前述抗体或其盐，稀释剂或赋形剂。这样的组合 物以适于口服或肠胃外施用(例如，血管内注射、皮下注射等)的药物制 剂的形式提供。上述每种组合物还可以包含其他活性成分。此外，本发明 抗体可以与其他药剂联合使用，所述其他药剂例如垸基化试剂(例如，环磷 酰胺，异环磷酰胺，等)，代谢拮抗剂(例如，甲氨喋呤,5-氟尿嘧啶，等)，抗 肿瘤抗生素(例如，丝裂霉素，阿霉素，等)，植物来源的抗肿瘤药(例如，长 春新碱，长春地辛，泰素，等)，顺铂，卡铂，依托泊苷，伊立替康，等。本发 明抗体和上述药物可以同时或以交错的次数施用给患者。
本文中所述的治疗方法，特别是对于癌症的，也可以利用施用其他抗 体或化疗药物进行。例如，也可以施用针对EGFR的抗体，诸如ERBITUX (西妥昔单抗(cetuximab))，特别是当治疗结肠癌时。ERBITUX⑧还显示 出有效治疗银屑病。其他组合使用的抗体包括Herceptin (曲妥单抗)(特别 是当治疗乳腺癌时)，AVASTn^(特别是当治疗结肠癌时)，禾Q SGN-15(特 别是当治疗非-小细胞肺癌时)。施用本发明的抗体和其他抗体/化疗药物可 以同时，或者分别，通过相同或不同的途径进行。
使用的化疗药物/其他抗体方案包括认为最佳适合于治疗患者病症的 任何方案。不同的恶性肿瘤可以需要使用特异性抗-肿瘤抗体和特异性化疗 药物，所述特异性抗-肿瘤抗体和特异性化疗药物应该基于具体患者确定。在本发明的优选实施方案中，化学治疗与抗体治疗同时，或更优选地，化 学治疗在抗体治疗后施用。然而，应该强调的是，本发明不局限于任何具 体的施药方法或途径。
大量的事实表明AR81A410.7通过与癌症细胞系上存在的表位连接而 介导抗癌作用。此外，可以表明，AR81A410.7抗体可以用于检测表达与 所述抗体特异性结合的表位的细胞；这使用所示的但不限于FACS、细胞 ELISA或IHC的技术。
本说明书中提及的所有专利和出版物象征本发明所属领域技术人员 的水平。所有的专利和出版物通过引用结合于此，以如同每篇单独的出版 物通过引用特别且独立地指明结合的相同程度结合。
应该理解，尽管示例了本发明的某些形式，但是不限于本文所述和所 示的部分的特定形式或安排。对于本领域技术人员来说，在不背离本发明 的范围的条件下可以进行各种变化，并且本发明不应该被视为限于在本说 明书中所示和所述的内容，这是显而易见的。
本领域技术人员应该容易地理解本发明充分适合实施所述目标并且 获得所提及的目的和益处以及其中固有的那些。本发明所述的任何寡核苷 酸、肽、多肽、生物相关的化合物、方法、步骤和技术代表目前的优选实 施方案，意欲是示例性的，并且不意欲作为对范围的限制。本领域技术人 员应该实施其中的变化和其他应用，所述变化和其他应用包括在本发明的 精神内，并且由后附的权利要求的范围限定。尽管己经联合特定优选实施 方案对本发明进行了描述，但是应该理解所要求的本发明不应该不适当地 限于所述特定实施方案。实际上，对于本领域技术人员是明显的实施本发 明的所述模式的各种改进意欲被包括在后附权利要求的范围内。加拿大国际保藏机构
国家微生物实验室，加拿大公共健康厅
1015Arlington Street
Winnipeg, Manitoba Canada R3E 3R2
国际表格IDAC/BP/4
电话(204)789-6030 传真(204)789-2018
原始保藏情形中的收据 (按照布达佩斯条约细则Rule 7.1发布) 附加原始保藏文本和存活证明复印件
本国际保藏机构接受以下指定的微生物的保藏，其接收日期为2006
年12月5日_
为(保藏者名称)Valerie Harris,阿里乌斯研究公司_
地址55 York Street,Suite 1600，多伦多，ON M5J 1R7_
保藏鉴定
保藏者分配的参考纖1A410.7_
本IDA分配的保藏号051206-01_
以上证明的保藏物伴随科学描述(详列)_提议的分类命名(详列):
授权代表IDAC的人员签名
日期2006年12月5日
原始保藏情形中的收据1/1 文件093 (06)加拿大国际保藏机构
国家微生物实验室，加拿大公共健康厅
1015Arlington Street
Winnipeg, Manitoba Canada R3E 3R2
电话(204)789-6030 传真(204)789-2018
国际表格IDAC/BP/9
存活证明
(按照布达佩斯条约细则Rule 7.1发布) 发给存活证明的团体
名称 Ferris Lander_
地址2855 PGA Boulevard, Palm Beach Gardens, Florida 33410_
保藏者
名称Valerie Harris, 阿里乌斯研究公司_
地址55 York Street,Suite 1600，多伦多，ON M5J 1R7_
保藏鉴定
国际保藏机构给出的保藏号051206-01_
原始保藏日期(或最近的相关日期) 2006年12月5日_
存活测试
在(最近的测试日期)测试的以上鉴定的保藏物的存活性
在以上指定的日期，该培养物是 存活 [] 不再存活
进行存活测试的条件(如果需要该信息并且测试的结果是阴性的，则填
写)_
授权代表IDAC的人员签名
日期2006年12月20日
存活证明1/1 文件093 (06)
权利要求
1.由以保藏号051206-01保藏在IDAC的杂交瘤生产的分离的单克隆抗体。
2. 权利要求1的分离的单克隆抗体的抗体-配体。
3. 由以保藏号051206-01保藏在IDAC的杂交瘤生产的分离的单克隆 抗体的人源化形式，或由所述人源化抗体产生的抗原结合片段。
4. 权利要求3的人源化抗体的抗体-配体。
5. 由以保藏号051206-01保藏在IDAC的杂交瘤生产的分离的单克隆 抗体的嵌合形式，或由所述嵌合抗体产生的抗原结合片段。
6. 权利要求5的嵌合抗体的抗体-配体。
7. 权利要求1、 2、 3、 4、 5或6中任一项的分离的抗体或其抗体-配 体，所述分离的抗体或其抗体-配体与选自由下列各项组成的组中的成员缀 合细胞毒性部分、酶、放射性化合物、细胞因子、干扰素、靶标或报告 部分和造血细胞。
8. 以保藏号051206-01保藏在IDAC的分离的杂交瘤细胞系。
9. 在选自人肿瘤的组织样品中起始抗体诱导的癌细胞细胞毒性的方 法，所述方法包括提供来自所述人肿瘤的组织样品；提供由以保藏号051206-01保藏在IDAC的杂交瘤生产的分离的单克 隆抗体，由以保藏号051206-01保藏在IDAC的杂交瘤生产的分离的单克 隆抗体的人源化抗体，由以保藏号051206-01保藏在IDAC的杂交瘤生产 的分离的单克隆抗体的嵌合抗体，或其抗体-配体，所述抗体-配体特征在 于竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力；和使所述分离的单克隆抗体、所述人源化抗体、所述嵌合抗体或所述其 抗体-配体与所述组织样品接触；其中所述分离的单克隆抗体、所述人源化抗体、所述嵌合抗体或所述 其抗体-配体与所述组织样品的结合诱导细胞毒性。
10. 在哺乳动物中治疗易受抗体诱导的细胞毒性影响的人肿瘤的方法，其中所述人肿瘤表达这样的抗原的至少一个表位，所述抗原特异性结合由以保藏号051206-01保藏在IDAC的杂交瘤生产的分离的单克隆抗体 或其抗体-配体，所述抗体-配体特征在于竞争性抑制所述分离的单克隆抗 体与其耙抗原结合的能力，所述方法包括对所述哺乳动物以有效导致所述哺乳动物肿瘤负荷减小的量施用所述单克隆抗体或所述其抗体-配体。
11. 权利要求10的方法，其中所述分离的单克隆抗体与细胞毒性部分缀合。
12. 权利要求11的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
13. 权利要求10的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其抗体-配体 激活补体。
14. 权利要求10的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其抗体-配体 介导抗体依赖性细胞毒作用。
15. 权利要求10的方法，其中所述分离的单克隆抗体是分离的单克隆 抗体的人源化形式。
16. 权利要求10的方法，其中所述分离的单克隆抗体是分离的单克隆 抗体的嵌合形式。
17. —种单克隆抗体，其能够特异性结合与由以保藏号051206-01保 藏在IDAC的杂交瘤生产的分离的单克隆抗体结合的表位相同的一个或多 个表位。
18. 在哺乳动物中治疗人肿瘤的方法，其中所述人肿瘤表达这样的抗 原的至少一个表位，所述抗原特异性结合由以保藏号051206-01保藏在 IDAC的杂交瘤生产的分离的单克隆抗体或其抗体-配体，所述抗体-配体 特征在于竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述 方法包括对所述哺乳动物以有效导致所述哺乳动物肿瘤负荷减小的量施 用所述分离的单克隆抗体或其抗体-配体。
19. 权利要求18的方法，其中所述分离的单克隆抗体与细胞毒性部分缀合
20. 权利要求19的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
21. 权利要求18的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其抗体-配体 激活补体。
22. 权利要求18的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其抗体-配体 介导抗体依赖性细胞毒作用。
23. 权利要求18的方法，其中所述分离的单克隆抗体是分离的单克隆 抗体的人源化形式。
24. 权利要求18的方法，其中所述分离的单克隆抗体是分离的单克隆 抗体的嵌合形式。
25. 在哺乳动物中治疗人肿瘤的方法，其中所述人肿瘤表达这样的抗 原的至少一个表位，所述抗原特异性结合由以保藏号051206-01保藏在 IDAC的杂交瘤生产的分离的单克隆抗体或其抗体-配体，所述抗体-配体 特征在于竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述 方法包括对所述哺乳动物以有效导致所述哺乳动物肿瘤负荷减小的量施 用与至少一种化疗药物联合的所述单克隆抗体或其抗体-配体。
26. 权利要求25的方法，其中所述分离的单克隆抗体与细胞毒性部分 缀合。
27. 权利要求26的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
28. 权利要求25的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其抗体-配体 激活补体。
29. 权利要求25的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其抗体-配体 介导抗体依赖性细胞毒作用。
30. 权利要求25的方法，其中所述分离的单克隆抗体是分离的单克隆 抗体的人源化形式。
31. 权利要求25的方法，其中所述分离的单克隆抗体是分离的单克隆 抗体的嵌合形式。
32. 确定在选自人肿瘤的组织样品中的癌细胞存在的结合测定方法， 所述癌细胞特异性结合由具有IDAC保藏号051206-01的杂交瘤细胞系 AR81A410.7生产的分离的单克隆抗体、由以保藏号051206-01保藏在 IDAC的杂交瘤生产的分离的单克隆抗体的人源化抗体、或由以保藏号 051206-01保藏在IDAC的杂交瘤生产的分离的单克隆抗体的嵌合抗体， 所述结合测定方法包括提供来自所述人肿瘤的组织样品；提供至少一种所述分离的单克隆抗体、所述人源化抗体、所述嵌合抗体或其抗体-配体，其识别与由具有IDAC保藏号051206-01的杂交瘤细胞 系AR81A410.7生产的分离的单克隆抗体所识别的那些相同的一个或多个 表位；使至少一种所述提供的抗体或其抗体-配体与所述组织样品接触；和 确定所述至少一种所提供的抗体或其抗体-配体与所述组织样品的结由此指示所述癌细胞在所述组织样品中的存在。
33. 单克隆抗体用于减小人肿瘤负荷的应用，其中所述人肿瘤表达这 样的抗原的至少一个表位，所述抗原特异性结合由以保藏号051206-01保 藏在IDAC的杂交瘤生产的分离的单克隆抗体或其抗体-配体，所述抗体-配体特征在于竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其耙抗原结合的能力， 所述应用包括对所述哺乳动物以有效导致所述哺乳动物人肿瘤负荷减小 的量施用所述单克隆抗体或其抗体-配体。
34. 权利要求33的方法，其中所述分离的单克隆抗体与细胞毒性部分 缀合。
35. 权利要求34的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
36. 权利要求33的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其抗体-配体 激活补体。
37. 权利要求33的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其抗体-配体 介导抗体依赖性细胞毒作用。
38. 权利要求33的方法，其中所述分离的单克隆抗体是分离的单克隆 抗体的人源化形式。
39. 权利要求33的方法，其中所述分离的单克隆抗体是分离的单克隆 抗体的嵌合形式。
40. 单克隆抗体用于减小人肿瘤负荷的应用，其中所述人肿瘤表达这 样的抗原的至少一个表位，所述抗原特异性结合由以保藏号051206-01保 藏在IDAC的杂交瘤生产的分离的单克隆抗体或其抗体-配体，所述抗体-配体特征在于竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其耙抗原结合的能力， 所述应用包括对所述哺乳动物施用所述单克隆抗体或其CDMAB;其以有效导致所述哺乳动物人肿瘤负荷减小的量与至少一种化疗药物联合施用。
41. 权利要求40的方法，其中所述分离的单克隆抗体与细胞毒性部分 缀合。
42. 权利要求41的方法，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。
43. 权利要求40的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其抗体-配体 激活补体。
44. 权利要求40的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其抗体-配体 介导抗体依赖性细胞毒作用。
45. 权利要求40的方法，其中所述分离的单克隆抗体是分离的单克隆 抗体的人源化形式。
46. 权利要求40的方法，其中所述分离的单克隆抗体是分离的单克隆 抗体的嵌合形式。
47. 有效用于治疗人癌性肿瘤的组合物，所述组合物以组合方式包括 权利要求1，2,3,6,7，8,或17中任一项的抗体或抗体-配体； 所述抗体或其抗原结合片段的缀合物，所述抗体或其抗原结合片段与选自由下列各项组成的组的成员缀合细胞毒性部分、酶、放射性化合物、 细胞因子、干扰素、靶标或报告部分和造血细胞；和 需要量的药用载体；其中所述组合物有效用于治疗所述人癌性肿瘤。
48. 用于检测人癌性肿瘤存在的测定试剂盒，其中所述人癌性肿瘤表 达抗原的至少一个表位，所述抗原特异性结合由以保藏号051206-01保藏 在IDAC的杂交瘤生产的分离的单克隆抗体或其抗体-配体，所述抗体-配 体特征在于竞争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所 述试剂盒包括由以保藏号051206-01保藏在IDAC的杂交瘤生产的分离的 单克隆抗体或其抗体-配体，和用于检测所述分离的单克隆抗体，或其抗体 -配体是否结合多肽的工具，所述多肽以特定截断值水平存在时，是所述人 癌性肿瘤存在的诊断。
全文摘要
本发明涉及使用新型筛选样本生产减轻癌性疾病的抗体的方法。通过使用癌细胞的细胞毒性作为终点分离抗癌抗体，该方法使得生产用于治疗和诊断目的的抗癌抗体成为可能。所述抗体可以用于辅助对癌症进行分段和诊断，并且可以用来治疗原发瘤和肿瘤转移。所述抗癌抗体可以与毒素、酶、放射性化合物、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分以及造血细胞缀合。
文档编号C12N5/18GK101622342SQ200880002982
公开日2010年1月6日 申请日期2008年1月23日 优先权日2007年1月23日
发明者戴维·S·F·扬, 海伦·P·芬德利, 苏珊·E·哈恩, 莉萨·A·波普 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司