来自球栗薯的功能性r基因的制作方法

专利名称：：来自球栗薯的功能性r基因的制作方法来自球栗薯的功能性R基因本发明涉及分离自J求栗薯(S.bulbocastanum)的抗性基因。此外，本发明涉及所述抗性基因例如在克隆功能性同源物中的应用，以及所述(一种或多种)抗性基因在用来在植物中增加或赋予对卵菌感染的至少部分抗性的方法中的应用。更具体地，本发明才是供了一种肯^句多i曾力口或贝武予只于疫審(Phytophthora)(侈'J^口至丈病疫審(Phytophthorainfestans))的至少4卩分4元'性的4元'性基因。由卵菌致病疫霉引起的晚疫病是全世界马铃薯生产中最严重的疾病之一。它是19世纪中叶爱尔兰马铃薯々几荒的原因，其导致百万人死亡。虽然在4空制病原体方面已^f寸出大量努力，4旦^j"至丈病疫霉的化学控制仍然是主要的作物管理战略，然而环境安全正变得更重要并且该病原体有时能够进化而耐化学性。因此，在现代马4令薯品种中引入抗性是控制该疾病的最^寺久战略。在上个世纟己，墨西哥六4咅体物种落果薯(5b/a"wmt/em/x^m)被广泛用于马铃薯的晚疫病抗性育种中。起初，描述了源于落果薯的一系列的11i基因。在这些基因中，7/、i2、/"/6、76和W7已,皮定位在马4令薯的基因图i普上。然而，这些W基因赋予种特异性^t'l"生(race-specificresistance)并且那些-参入马铃薯品种中的基因，主要为i7、72、W3、i^、以及A/0，净皮病原体快速克月良。因此，需要抗性的新来源，并且目前，已报道几种其他野生茄属(5Wa丽mJ物种，作为抗性的潜在来源，目前其中已有许多得到遗传学表征(表1)。球栗薯，一种来自墨西哥的自交不亲和二倍体物种，被认为是H免疫病^元'I"生的来源。通过3求栗薯(5*.61//Zocastom/m)、无茎薯(51.acaw/e)、富利亚薯(S.//mre/a)、以及马铃薯(S.^6eraswm)之间的种间桥杂交(bridgecross)已实现J求栗薯源抗性的引入(HermsenandRama腿，Euphytica22:457-466,1973),得到广泛用于马铃薯晚疫病育种的所谓的ABPT材冲牛。另外，Helgeson等人(Theor.Appl.Genet.96:738-742,1998)在J求栗薯与培才直马铃薯之间形成体细胞杂种(somatichybrids)。该体细胞杂种形成能育植物(fertileplant),该能育植物保留了抗性并且可以用于育种。对引起抗性的基因进行分子克隆并随后将该基因引入马铃薯品种中是第三种方法，该方法可以避开先前两种策略中所遇到的许多问题。迄今为止，已克隆来自球栗薯的两种W基因，在第8号染色体上的等^立基因禾口(Songetal,Proc.Natl.Acad.Sci100:9128-9133,2003;vanderVossenetal.PlantJournal36:867-882，2003)以及在第6号染色体上的尺p,'-6/Z^(vanderVosseneta/.PlantJournal44:208-222,2005)。如表5所示，争'掘7以及一-猫2提供保护以免受多组致病疫霉分离菌(isolates)的影响。直到本发明，没有描述疫霉分离菌可以扩繁于具有(harboring)A/,:-WW的才直物，因此属性'广语抗性基因，用来描述由这种基因赋予的保护。然而，如在表5中所4皮露的，疫霉分离菌99189能够生长在7//-WW植物上，并因此'中断，抗性，这提示具有种族特异性。虽然用AS以及和获得的最初结果是有希望的，但仍然需要另外的R基因。本发明描述了从球栗薯中克隆第三种晚疫病7基因。在种内J求栗薯作图群体(mappingpopulation)中，ip/-WW基因被定位于第4号染色体上的A基因热点。高度连接于i&"WW的标记用来产生W基因座的物理图i普。輩巴向包含基因座的两种BAC克隆中的一种上存在的两种R基因候选物(RGC)用于互补分析，其中之一证明是功能性W^-WW基因。出人意料地，Rpi-blb3与来自4以南芥(JraZzWo;w&Aa/zVma)的RPP13具有最高氨基酸序列同一性(34.9%)以及与在茄科(5b/a"flceae)内先前鉴定的任何i基因具有非常小的同源性。如表5所示，克隆自球栗薯的3个R基因对于分离菌99177和99189产生差异反应(differentialreaction)，因此推断这3种R基因在功能上是不同的。此外，由于较大的序列差异，3种R基因很可能识别来自疫霉的不同效应子(效应物，effectors)。这通过以下事实来i正实Rpi-bib1识另'JipiO，而两种其他R基因产物并不识别这种疫霉效应子。在第一种实施方式中，本发明才是供了一种分离或重组核酸序列，其包含一种斗亥S臾序列，该核S臾序列编石马图6的氨基S菱序列Rpi-blb3或其功能性片断或功能性同源物，即，如图6所示的氨基序列的功能性片断或功能性同源物。术语"核酸"是指单《连或双链DNA或RNA分子。还包括本文描述的核香酸序列的互补序列。术语"其功能性片断"通常用来指Rpi-blb3蛋白的片断，其能够在茄科家族植物中才是供至少部分抗性或增加抗性来^fe抗卵菌感染。这样的片断是Rpi-blb3蛋白的截短的变体，如图6所示。Rpi-blb3蛋白的截短的变体/片断是这样的片断，其小于847个氨基酸并且优选包含LRR结构域的更大部分(即，更大部分的富含亮氨酸的重复结构域，其从Rpi-blb3的约氨基酸512延伸到氨基酸827)和/或Rpi-blb3蛋白的N端部分。7术语"功能性同源物"通常用来指本文描述的Rpi-blb3蛋白的变体，该变体能够在茄科家族植物中提供至少部分抗性或增加抗性来抵抗卵菌感染。包括至少部分地保持Rpi-blb3蛋白的效应的人工改变或氨基酸残基替代。例如，某些氨基酸残基可以常MJ也被具有相当特性的其他氨基酸残基替换，例如，碱性残基被另一种碱性残基替换，酸性残基一皮另一种酸性残基替换，疏水残基^皮另一种疏水残基替换，等等。疏水氨基酸的实例是缬氨酸、亮氨酸以及异亮氨酸。苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸是具有芳族侧链的氨基酸的实例，而半胱氨酸以及蛋氨S臾(methonine)是具有含石危侧链的氨基酸的实例。丝氨酸和苏氨酸包含脂族羟基基团并且被认为是亲水的。天冬氨酸和谷氨酸是具有酸性侧链的氨基酸的实例。简言之，术语"其功能性同源物"包括Rpi-blb3蛋白的变体，其中部分氨基酸已常头见地被替换并且其至少部分地保持Rpi-blb3蛋白的效应(即，在茄科家族才直物中至少部分地一是供或增加对卵菌感染的抗性)。还包4舌在术语"其功能性同源物"中的是同源序列。优选地，这样的同源物在氨基酸水平上具有至少40%同一性。更优选地，氨基酸同源性百分比为至少86%或90%。甚至更优选的是91%、92%、93%、94%或95%的氨基酸同源性百分比。最优选的是96%、97%、98%或99°/0的氨基酸同源性百分比。同源核酸序列是编力马力口上所述同源蛋白的核S臾序列。同源蛋白和它们各自的核苷酸序列是，例如，命名为Rpi-abpt、R2-样(R2-like)以及R2的基因，参见图6(氨基酸序列)以及图9-11(核香S臾序列)。可以例如通过4吏用计算才几程序如BLAST、ClustalW或ClustalX来确定同源性百分比。多个核酸序列编码如图6所述的100%相同于Rpi-blb3蛋白的蛋白质。这是因为在核普酸三联体中的第三核苷酸可以变化而不会改变相应的氨基酸(核苷酸三联体中的摆动位置)。因此，在没有影响蛋白质的氨基酸序列的情况下，编码该蛋白质的核苷酸序列可以被改变。然而，在一种优选的实施方式中，本发明提供了一种分离或重组的核S吏序列，如图8中所示。用小写字体(2944-5487)突出2544bp的Rpi画blb3编码区。上游2732nt(211-2942)和下游882nt(5488-6370)提供调节序列。在一种优选的实施方式中，本发明提供了一种分离或重组的核酸，其表示Rpi-blb3蛋白的编码序列(CDS)，即，图8的核苷酸2944-5487或其功能性部分或功能性同源物。可以例如通过利用才艮癌农杆菌瞬时分析(ATTA)和/或通过利用离体叶片(detachedleaf)分析来测试本文描述的Rpi-blb3基因和蛋白质的片断以及同源物的功能性。实验部分例如描述了一种利用根癌农杆菌瞬时分析(ATTA)来测试候选基因的功能性筛选，借此用包含候选/^z'-6/W同源物的土:泉杆菌(爿graZ^cten't/m)4朱系浸润4周龄的野生型本氏烟草(7V/co&"w"Ze"//2"m/or"")才直才朱。在离体叶片分才斤中，在;旻润后一天随后用对本氏烟草具有毒性的致病疫霉菌才朱，例如IPO-C或90128激发(challenge)经浸润的叶片。该系统同样适用于测试的候选同源性片断。ATTA测定法利用了瞬时表达。瞬时基因表达是一种高水平表达有用蛋白质的快速、灵活且可重现的方法。在才直物中，才艮癌农杆菌(Jgro6acten'M/77^/7e/a"'e"5)的重纟且菌才朱可以用于瞬日于表达已4翁入到细菌Ti质4立的T-DNA区中的基因。细菌i喬养物一皮浸润到叶片中，并在T-DNA转移以后，在植物细胞中存在感兴趣的基因的异位表达。然而，系统的效用受到限制，因为在2-3天以后异位蛋白表达会停止。这表明，转录后基因沉默(PTGS)是这种缺少效能的主要原因。基于基因沉默的病毒编码抑制剂(番茄丛矮病毒(TBSV)的pl9蛋白)的共表达的系统可以防止浸润组织中PTGS的发生并允许高水平的瞬时表达。在存在pl9的情况下，一定范围的蛋白质的表达被增强50倍或更多，使得可由少至100mg的浸润叶片材料实现蛋白质纯化。尽管，p19的使用明显具有优点，但没有p19的ATTA也可以用来测试J美选片断和同源物的功能'I"生。可替换地，輩巴向每种候选基因(例如是片断或同源物)构建物，用于转化至易感马铃薯品种，例如底西瑞(Desiree)。在离体叶片分析中利用例如分离菌IPO-0、IPO-C或90128激发初级转化体(primarytransformant)。而于4元这些分离菌的專争<匕体具有<列^口A//-6/63的功能'I"生片断或同源物。在又一种实施方式中，本发明提供了一种载体，该载体包含如本文^是供的核酸，即，能够在茄科家族植物中才是供至少部分抗性或增加抗性以抵抗卵菌感染的核酸。更具体地，本发明提供了一种载体，该载体包4舌分离或重组的核酸序列，该分离或重组的核酸序列包含编码图6的氨基酸序列Rpi-blb3的核酸序列或其功能性片断或功能性同源物。本发明还提供了一种载体，该载体包括如图8所示的核酉灸序列，伊C选图8的编石马序列，即，才亥苦酉l2944-5487。适宜载体的实例是pBeloBACII、pBINPLUS、pKGW-MG或4壬何商业上可获得的克隆载体。如下文将概述的，存在多种方式，其中本发明的核酸可以被转移至才直物。寿争移的一种适宜方式是通过土i裏详干菌(Jgra6acterm,M)介导，其中待转移的核酸是二元载体的一部分，因此优选上述载体是二元载体。本发明进一步提供一种宿主细胞，其包含如本文描述的核酸或如本文描述的载体。优选的宿主细月包的实例是适合于BAC克隆(例如，DH10B)的大肠杆菌(￡.co/Z)细胞或土壤杆菌(宿主)细胞。在另一种实施方式中，所述宿主细胞包括植物细胞。一种优选的才直物细胞是源自茄科家族成员的细胞，并且甚至更优选的所述4直物细胞包括来自马铃菩(5b/awwm似6emsw附J或番(Solanumlycopersicum)，以前^M乍西纟工才巿(Lycopersiconesculentum)的细月包。由这样的细胞，通过技术人员已知的方法(例如再生方案)可以获得转基因或基因改造植物(例如马铃薯或番茄植物)。本发明进一步纟是供了一种如本文所描述的基因改造才直物的叶片、块茎、果实或种子或部分或子代。在又一种实施方式中，本发明^是供了一种由本文描述的分离或重组核酸编码的蛋白质或其功能性片断或功能性同源物。在一种优选的实施方式中，本发明提供了一种由图8中所示的核酸序列编码的蛋白质，优选由核苷酸2944-5487编码的蛋白质。在又一种优选的实施方式中，本发明提供了一种包含图6的氨基酸序列的蛋白质或其功能性片断或功能性同源物。本文描述的Rpi-blb3蛋白包含847个氨基酸，而Rpi-blb3的LRR结构域由14个不完全的重复(imperfectrepeats)构成(图6)。有趣的是，Rpi-blb3与来自拟南芥(爿ra^,Wo;^^//^/^"tz)的RPP13蛋白具有最高同源性(表3)(Bittner-Eddyetal.,PlantJournal21:177-188,2000)。Rpi-blb3的不同结构i或与RPP13的相应结构i或具有不同程度的同源性(表3)。NBS结构域是最保守的(48.2%氨基酸同一性)，接着是CC结构域(34.4%氨基酸同一'性)。LRR结构域保守性最差(21.5%氨基酸同一性)(表3)。在拟南芥中的W尸尸/3ii基因4空制只十卵菌病原体寄生霜霉(Hyaloperenosporaparasitica)的抗性。如已经描述的，Rpi-blb3的功能性片断或功能性同源物是能够在茄科家族植物中提供至少部分抗性或增加抗性以抵抗卵菌感染的片断或同源物。上文已提供了用来测试Rpi-blb3的功能性片断或功能性同源物的功能性的方式。利用这些分析，本发明的发明人，例如通过等位基因挖掘(allelmining),发现了另外的功能性同源物。这些同源物命名为Rpi-abpt、R2-样以及R2(参见图6)。表5中报道的功能性测试表明这些基因的转基因对于致病疫霉具有抗性。然而，还似乎是，在这些同源物之间可辩别抗性谱的细微差别，尤其是对于致病疫霉分离菌99190、99183以及99189。基于本文描述的核酸序列，本发明还才是供了纟笨针和引物(即，互补于如本文描述的(互补)DNA链之一的寡核苦酸序列)。探针例如可用于Southern或Northern分才斤，而引物例如可用于PCR分析。基于本文描述的4亥S复序列的引物对帮助才直物育种学家(活3夭在传统育种和/或通过基因改造植物的核酸内含物进行育种(优选地所述植4勿是马铃薯或番^S(Solanumlycopersicum),以前牙尔4乍西纟工才审(Lycopersiconesculentum)的4页i或中)在选才奪能句多表达Rpi-blb3的才直物方面是非常有用的。因此，在一种进一步的实施方式中，本发明才是供了一种结合分子，该结合分子能够结合至如本文描述的核酸或其互补核酸。在一种优选的实施方式中，所述结合分子是引物或探针。如所提及的，这样的结合分子对于植物育种学家是非常有用的，因此本发明进一步提供了一种对于其对卵菌感染的易感性或抗性来选4奪才直物或植物材冲+或其子代的方法，所述方法包4舌以下步4聚测试至少部分的所述植物或植物材料或其子代是否存在如本文描述的核酸，例如编码Rpi-blb3的核酸。在一种优选的实施方式中，所述方法进一步包括提供如本文描述的结合分子，如引物或纟罙针。在又一种优选的实施方式中，待测试植物的核酸分离自所述植物，并且使获得的分离的核酸与一种或多种(优选不同的)结合分子4妄触。可以例如4吏用PCR分析来测试植物在才直物基因组中是否存在Rpi-blb3。通过技术人员已知的方式，本文描述的Rpi-blb3蛋白还可以用来诱导抗体。因此本发明还提供了一种(特异性地)结合于由本文描述的分离或重组核酸(例如图8的核酸序列以及尤其是核苷酸2944-5487)编码的蛋白质的抗体，或一种(特异性;也)结合于如图6所示的蛋白质或其功能性片断或功能性同源物的抗体。这样的抗体例如可用于蛋白质分析方法如蛋白质印迹或ELISA。基于本文提供的核酸序列，本发明还提供了在植物中引入或增加对卵菌感染的抗性的方式。因此本发明还提供了一种方法，该方法用于在植物中提供至少部分抗性或增加抗性以抵抗卵菌感染，其中包括向植物或其部分提供-分离或重组核酸序列，其包括一种编码图6的Rpi-blb3氨基酸序列或其功能性片断或功能性同源物的核酸序列，或-如图8所示的分离或重组核酸序列，或-载体，其包含本文描述的核酸序列，或-如本文描述的宿主细月包。菌感染的方法涉及将DNA转移到4直物中，即，涉及用于转化才直物细胞的方法，该方法包括向所述一直物细胞^是供如本文描述的核酸或如本文描述的载体或如本文描述的宿主细胞。存在多种方式，其中重组核酸可以一皮转移至植物细胞，例如土壤杆菌介导的转化。然而，当希望实施本发明时，除了通过土壤杆菌感染之外，还存在有效地将DNA递送至受体;ti物细胞的其他方将DNA引入细月包的1"壬4可方法，如通过直才妄递送DNA如通过原生质体的PEG介导專争4匕、通过脱7K/卞P制(desiccation/inhibition)介导的DNA摄耳又(Potrykusetal"Mol.Gen.Genet"199:183-188,1985)、通过电穿孔(美国专利第5,384,253号)、通过利用碳化硅纤维进行搅4半(Kaeppleretal.,1990;美国专利第5,302,523号；以及美国专利第5,464,765号)、以及通过DNA涂^1颗粒的加速(美国专利第5,550,318号;美国专利第5,538,877号；以及美国专利第5,538,880号)。通过使用如上述的技术，几乎来自任何植物物种的细胞可以被稳定地转化，并且这些细胞可发展成转基因植物。在使用土壤杆菌介导的转移的情况下，优选4吏用基本为毒性(virulent)的土土裏才干菌^口才艮癌农才干菌(Aftwe/ac/em"),"i口通过菌才朱A281或由其衍生的菌抹或本领域可获得的另一种毒性菌4朱所举例说明的。这些土壤杆菌菌抹携带源自Ti质粒pTiBo542(包含virB、virC以及virG基因)的毒性区的DNA区。才艮癌农才干菌的毒性(vir)基因产物协调T-DNA的加工以及其转移进入才直物细胞。vir基因表达受virA和virG的控制，借此virA在感知诱导信号后通过石粦酸化激活virG。VirG又i秀导virB、C、D、E的表达。这些基因编码与DNA的转移有关的蛋白质。pTiBo542的增强的毒性被认为是由该Ti质粒上的超毒力(hypervimlent)virG基因引起的(Chenetal.Mol.Gen.Genet230:302-309，1991)。在核酸转移到才直物或才直物细力包中以后，必须确定哪些才直物或才直物细胞已被提供有所述核酸。这是例如通过利用选纟奪性标记或才艮告基因来完成的。在最广泛用于植物转化的选择性标记或选择基因中有细菌新霉素磷酸转移酶基因(nptl、nptll以及nptIII基因)，其赋予对选冲奪剂卡那霉素的抗性，其在EP131623中4是出，以及在EP186425中提出的细菌aphIV基因，其赋予对潮霉素的抗性。EP2759574皮露了来自纟录色产色4连霉菌(5V"/tom少c"wV^/oc/romoge"^)的乙酰转移酶基因的应用，其赋予针对除草剂草胺膦(phosphinotricin)的抗性。在EP218571中4是出了赋予对除草剂草甘膦的相对抗性的才直物基因。该抗性是基于编码5-蹄醇丙酮莽草酸_3—磷酸合成酶(EPSPS)的基因的表达，其相对耐受N-磷酸甲基甘氨酸。某些氨基酸如赖氨酸、苏氨酸、或赖氨酸衍生物氨基乙基半胱氨酸(AEC)以及色氨酸类似物如5-曱基色氨酸也可以用作选择剂，这是由于当以高浓度施用时它们能够抑制细胞生长。在该选择系统中，选择性标记基因的表达导致转基因细胞过度产生氨基酸，其允许在选^f奪下转基因进行生长。报告基因的适宜实例是P-葡萄糖苷酸酶(GUS)、P-半乳糖苷酶、荧光素酶以及绿色荧光蛋白(GFP)。在一种优选的实施方式中，本发明提供了一种用于在才直物中提供至少部分抗性或增加抗性以纟氏抗卵菌感染的方法，该方法包4舌向植物或其部分提供-分离或重组核酸序列，其包括一种编码图6的Rpi-blb3氨基酸序列或其功能性片断或功能性同源物的核酸序列，或-如图8所示的分离或重组核酸序列，或—载体，其包含本文描述的核酸序列，或-如本文描述的宿主细胞，其中所述卵菌包4舌疫霉，优选致病疫霉和/或其中所述才直物包4舌来自茄科家族的植物，优选马铃薯或番茄植物。本发明还才是供了一种才直物，其可以通过利用如上所述的用于在植物中提供至少部分抗性或增加抗性以抵抗卵菌感染的方法来获得。一种优选的植物是来自茄科家族的植物，并且甚至更优选地所述才直4勿是马铃薯或番茄(Solanumlycopersicum),以前-尔4乍西纟工碎乖(Lycopersiconesculentum)。因A匕本发明还才是供了一种才直4勿，i亥才直物已被提供有编码Rpi-blb3蛋白或其功能性片断或功能性同源物的核酸。植物是否已被提供有如本文描述的核酸是例如通过利用纟笨针或引物(其已基于本文描述的核酸序列加以设计)来确定的。还可以使用(特异性地)结合于编码的Rpi-blb3蛋白的抗体。本发明进一步提供了基因改造的植物的叶片、块茎、果实或种子或部分或子^，其包含一种核S臾，该核酸编码图6的Rpi-blb3氨基酸序列或其功能性片断或功能性同源物。在一种优选的实施方式中，本文描述的核酸被转移至非球栗薯的马铃薯品种中，即本文描述的核酸优选被转移至非球栗薯背景(background)中，优选转移至商业上感兴趣的品种如手指薯(或宾杰，Bintje)、底西J离(Desiree)或Premiere、其斤朋达(Spunta)、Nicola、费乌瑞它(Favorit)、净曷色布尔^王克(RussetBurbank)、Aveka或LadyRosetta。在又一种优选的实施方式中，本文描述的核酸对于宿主细胞是外源的(foreign)。术语"外源的"在本文中用来描述这^f的情况，其中本文描述的核酸对于宿主细月包是异源的(即，源于具有不同基因组背景的细胞或生物体)或本文描述的核酸对于所使用的宿主细16月包是同源的但4立于与所述核酸的天然存在的对应物不同的基因组环境中(例如并不位于自然基因座或位于不同基因之间)。在又一种实施方式中，本发明提供了一种用于在植物中提供至少部分抗性或增加抗性以^氏抗卵菌感染的方法，该方法包4舌向才直物或其部分提供-分离或重纽—核酉臾序列，其包4舌一种核S臾序列，该核S交序列编码图6的Rpi-blb3氨基酸序列或其功能性片断或功能性同源物，或-如图8所示的分离或重组核酸序列，或_载体，其包含本文描述的核酸序列，或-如本文描述的宿主细月包，其中所述4直物在,皮^是供有核酸(其编码Rpi-blb3或其功能性部分或功能性同源物)以前至少部分i也易感于卵菌感染(例如至丈病疫霉)。植物部分地易感/部分地抗卵菌感染的事实可以是天然存在于所述植物中的基因的结果，但它也可以是已经引入的(其他)抗性基因的结果。本发明进一步提供了包含编码图6的Rpi-blb3氨基酸序列或其功能性片断或功能性同源物的核酸序列的分离或重组核酸序列的应用；或如图8所示的分离或重组核酸序列的应用；或包含任《可所述核酸序列的载体的应用；或包含任何所述核酸序列或所述载体的宿主细胞在向植物4是供对卵菌感染的至少部分抗性中的应用。在一种优选的实施方式中，所述卵菌包4舌疫霉，并且甚至更优选致病疫霉。在又一种优选的实施方式中，所述4直物包括马铃薯或番茄17(/_yco/era/cwm),以前-尔4乍西纟工一乖(Z^coperaz'ccw^cw/gw,wm)。在又一种实施方式中，本发明提供了一种用于生产Rpi-blb3蛋白或其功能性片断或功能性同源物的方法，该方法包4舌将如本文描述的核酸功能性连接于调节序列并4吏所述核酸可以表达在宿主细胞中。调节序列的实例是启动子和/或终止子序列。本发明进一步提供了i^z'-Z/W的启动子和/或终止子序列(参见图8)。图8示出了克隆Blb25-B2(8461bp)的牙玄苷酉臾序列，其包含/戸'-WW基因和调节序列。2544bp的Rpi-blb3编石马区用小写字体突出(2944-5487)。上游2732nt(211-2942)和下游882nt(5488-6370)提供调节序列，其确保基因的正确表达。技术人员完全能够克隆所述调节序列(的部分)并测试它们在转录中的效能。在以下非限制性实施例中将更详细地i兌明本发明。实验部分结果这里，我们描述了来自马铃薯的第4号染色体上的主要晚疫抗性基因座的7^/-Z/W、^7/-W/f、^^以及72的克隆和功能性表征(Parketal2005a,2005b,2005c;Lietal.1998)。为了克隆i^z'-WW和Ap/-,利用分别源于抗性克隆Blb99画256-3和707TG11-1的DNA构建了两个BAC文库。对于每个文库，获得了大约74000个克隆，其具有85kb的平均插入片段大小，相当于8个基因组当量。起初用SCAR标记Th21(表2)筛选这些文库，分别在1396和1383Fl子代4直物的作图群体中与抗性共分离(Parketal.2005)。以这种方式，分别鉴定了BAC克隆Blb22和TG9(图1)。通过对这两种BAC的末端进行测序，开发了新标记(表2)，其用来更精确地限定R基因座的遗传间距以及再筛选BAC文库以鉴定与最初BAC克隆重叠的克隆。以这种方式，基因座被限定于0.3cM(Blb22S-Blb25T;4/1396重组体)间距，其物理上蜂皮两个部分重叠的BAC克隆Blb22和Blb25所^夸越(图1A)。在A戸'-^^基因座的情况下，鉴定了部分重叠的BAC克隆TG9和TG77。重叠群(或邮匕连群，contig)的一端与抗性共分离(TG77S),而另一端定^立于邻近^^-"Z^/(TG9S)0.1cM(图1B)。为了深入了解所研究的A基因座的分子结构，BAC克隆Blb22和TG9被测序至6x覆盖率(coverage)。这揭示了，克隆Blb22并不包含任《可R基因同源物(RGH),而克隆TG9包含两种RGH,其与存在于经测序的番茄BAC克隆AF411807L中的RGH(vanderHoevenetal.2002)具有显著的同源性。随后通过PCR分析，对BAC克隆Blb25和TG77筛选RGH特异序列的存在，其中利用引物4-PLOOP-F和4-GLPL-R(表2)，其是通过序列对比克隆AF411807L的RGH序列与在BAC克隆TG9上存在的那些RGH序列而i殳计的。BAC克隆Blb22、Blb25、TG9以及TG77的Southern分析(其中利用扩增自BAC克隆Blb25的RGH特异性PCR片断作为^笨4十)鉴定了在BACBlb25和TG9上的最少两种RGH以及在TG77上的一种RGH(图1)。因此具有8-10kb的随才几重叠二元亚克隆的文库由BAC克隆Blb25和TG9产生。利用引物GL02-F和-R(表2),对每文库总共1152个克隆筛选RGH的存在。基于PCR片断的限制酶切分析，将RGH阳性亚克隆分为单独的类别，对于6/63为和5/Z3G/Z-S、对于为JZp/G//-」和v4Z^/G/7-S。在8-13kb亚克隆内确定RGH的相对位置以后，靶向来自每类的候选物，以转4匕至易感马铃薯品种底西瑞(Desiree)。用亚克隆Blb25-A3、Blb25-B2、TG9-A1以及TG9-B2(分别具有候选物5/WG/f-^、5/WG/Z-S、以及进行转化实-睑，得到许多初级转化体。利用分离菌IPO-0和90128进行的离体叶片分析揭示了，用Blb25-A3、TG9-A1以及TG9-B2转化的所有才直物均易感于两种分离菌，但所测试的转基因植物(具有Blb25-B2)中的大多数(7/8)与两种分离菌具有超萄t反应(HR)(图2)。鉴于初级转化体(具有和S/Z3G//-S)之间的差异反应，我们指定为为了鉴定W/7Z-^^/的另外的候选基因，用TG77S筛选//^-flZ^特异性BAC文库，导致TG77重叠BAC克隆TG92的鉴定(图1B)。用不同组的用来扩增、爿6;^G//-5、或T^z'-6仏3的引物来筛选这种BAC克隆导致第三7^/-^/^候选基因，J6WG//-C的鉴定(图IB),当被转变成特异性标记(AbptGH-C;表2和图IB)时，其也与抗性共分离。利用AbptGH-C扩增子作为探针的DNA印迹分析揭示了克隆TG92仅包含单RGH。基于^3/-WW的起始和终止密码子(Blb3-start和Blb3-end，表2)设计的引物随后用来乂人克隆TG92扩增全长AbptGH-C扩增子，其,皮克隆到Gateway进入载体pDONR221。利用多位点Gateway4支术，y^//G//-C扩增子随后在2723nt和883nt的尺^-WW源启动子和终止子序列之间,皮克隆到二元pKGW-MG目的载体中，其一皮克P套到pDONRTMP4-P1R和pDONRP2R-P3中(图3)。利用根癌农杆菌瞬时分析(ATTA)在本氏烟草中进行互补分析，<昔此用包含pKGW-AbptGH-C的土i裏杆菌才朱COR308浸润(infiltrate)4周龄野生型本氏烟草植^朱。分别包含原始基因组W/^-Z/Z)3基因构建物和多^f立点Gateway⑧重组的i^/-6/63基因构建物的二元克隆pBP-Rpi-blb3和pKGW-Rpi-blb3用作阳'I"生乂寸照，而pBP-AbptGH-A用作阴性对照。在离体叶片分析(DLA)中，在两天以后，用致病疫霉菌4朱PY23或IPO-复合体激发经浸润的叶片。用pKGW國AbptGH-C、pBP画Rpi-blb3以及pKGW画Rpi-blb3〉、曼润的叶片在4妻种部位产生HR，而野生型叶片和那些用pBP-AbptGH-A浸润的叶片则易感于分离菌PY23。如预期的，所有4妄种有IPO-C的叶片是易感的(图4)。鉴于这些结果，爿6/^G^-C是指定的W/z'-"Z/^。通过Blb3GH等位基因挖掘来克隆和(^2-,汰eJ和7戸'-^^属于在第4号染色体上的主要晚疫(MLB)^元')"生基因座，其还具有72禾口/^陽^^(Lietal.,1998;Parketal.,2005c)。鉴于在尺A-WW、i2、以及尺2-^^的基因图i普之间的保守标i己次序(markerorder)和7见测到的等4立基因4呆守性(Parketal.,2005c)、以及和W/^'-aZ/^之间的高序列4呆守性，我们通过W^-Z)/W等位基因挖掘策略开始克隆72和用来从BAC克隆TG92扩增候选基因的相同引物用来从抗性亲代基因型BET95-4200-3(MaR2)和AM3778-16(分别具有和扩增全长Blb3GH。预计大小的扩增子#皮克隆到pDONR221中并一皮完全测序。总计，由AM3778-16获得8种独特的序歹'J(R2-冲羊GH),而由BET95-4200-3获得19种独特的序列(R2GH),其中Rpi-blb3和新型Blb3GH之间的氨基酸同一'l"生对于R2-样GH为86.4%至97.3%,而对于R2GH为83.8%至94.2%(表3)。所有可获得的氨基酸序列的系统进化分析，与功能性基因和W/"'-a6pf—起在进化枝中簇集一种R2-样GH和五种R2GH(图5)。R2-才羊GH-8的氨基酸序列与Rpi-blb3具有97.3%的氨基酸同一'l"生。R2GH-2、R2GH-8、R2GH-G3、R2GH-D3以及R2GH-65与Rpi-blb3分别具有94.2%、91%、92.6%、89.7%、以及92.8%的氨基酸同一'性(表3)。靶向该组候选基因用于功能性分析，并因此在i^Z-WW启动子和终止子序21列之间将其克隆到二元载体pKGW-MG中，如上文4十对W^-aZ^基因所描述的。在本氏烟草中的瞬时互补分析表明，A2G^-G3和i^-摔WG^-S将抗性赋予适当的品种(race),而W2G//-2、A2G//-S、以及7^G/7-65是非功能性的(图4)。因此7^G/7-G^和72-^^,皮分别指定为i2和i2-^^。基因结构和功能性W//-W63、"Z)/,、以及7^-/#编石马2538-2544核苷酉菱(nt)的ORF,其编码845-847个氨基酸(具有为LZ-NBS-LRRR蛋白特征性的所有识别标志序列)的蛋白质(图6)。有趣的是，关于已知的功能性R蛋白，Rpi-blb3、Rpi-abpt、R2、以及R2-样与来自拟南芥(爿ra&Wo/w/5Aa/,'awa)的RPP13具有最高同源性(34.9%氨基酸同一性)(Bittner-Eddyetal.,2000),其赋予对寄生霜霉(//j^/operewo^oraparw'"ca)的4元寸生。与NBS结构i或中的RPP13残基的最高同源性具有49.3%的序列同一性，而与LRR结构i或中的RPP13残基具有最^f氐同一'1"生(34.3%)。Rpi-blb3、Rpi-abpt、R2、以及R2-样的LRR结构域是高度同源的并且包含14个不完全的重复(图6)。LZ和NBS结构i或是更加多态的，R2的那些结构^^则是最趋异(或多才羊化，divergent)的。除LRR2和LRR3之间的序列以外，Rpi-abpt和R2-样是相同的，其中Rpi-abpt包含一段氨基酸，其相同于R2的一l史氨基酸。除氨基酸残基774以外，R2的LRR结构;或相同于Rpi-abpt的结构J或(图6)。四种功能性基因的核苦酸序列和四种另外的别WG//的核苷酸序列的比对以及对信息多态性位点(IPS)(即，其中两种或更多基因携带相同核普酸的位点(Parniskeetal.,1997))的随后分析揭示了基因家族的不同成员之间的序列相关性(或序列联系，sequence22affiliation)的明显区块(图7),这表明fi/WAG之间的序列交4灸事件已参与基因家族的进化(图7)。有趣的是，在5，-末端中观察到的序列相关性，一半基因延伸整个LZ和NBS结构域，而在LRR结构域中的序列相关性才是示LRR的特定组合的交4灸，这强调了R蛋白的才莫块净寺寸生(modularnature)。为了试图估计观察到的序列交换事件相对于抗性谱的生物相关性，在离体叶片分析中用17种不同的致病疫霉分离菌(表4和5)激发亲本克隆，其具有7^/-WW(Blb99-256-3)、Ap/-W/7"707TG11)、W2(BET95-4200-3(MaR2)>>(、Ai^-/^(AM-3778-16)。对于14种分离菌，所有四种克隆呈现相同的特异性。然而，对于三种分离菌，观察到不同的相互作用(表5)。分离菌99190和99189乂于于Blb99-256-3、AM-3778-16以及BET95-4200-3(MaR2)是毒性的，4旦对于707TG11-1则是无毒性的。此外，分离菌99183对于BET95-4200-3(MaR2)和707TG11是毒性的，<旦对于AM-3778-16和Blb99-256-3则是无毒性的。这些数据表明，所研究的四种基因反映了三种识别特异性，由此i^/-和具有相同的抗性i普。当考虑到i^/-6/63、W2-yf与a6/^之间乂见察到的序列相关'l"生时，令人感兴趣的是，4偉观'JLRR2和LRR3之间的多态序列可以解孝奪i^-WW和W2-^^的同等功能性以及/zle和W//-a6;^之间的4元性i普的差异。可替换地，四种克隆的不同抗性谱可以反映另外的尺基因的存在。四种功能性基因的氨基酸序列与R2GH-2的非功能性序列的氨基酸序列的比较揭示了，大多数R2GH-2特异性氨基酸集中在LRR11-LRR13的推断的溶剂暴露残基中(图6),其位于LRR结构i或的3，-最大重组区块(recombinationblock)内(图7)，这表明这些LRR在决定R2特异性中起重要作用。然而，R2特异性溶剂暴露残基的存在对于R2特异性而言并不是足够的，如由非功能性同源物R2GH-D3所i兌明的，其包含R2特异性LRR11-LRR13序列但_在具有LRR3-LRR10的区域中不同于四个功能性基因，其位于LRR结构域的中心重组区块中(图7)。后者观察结果说明，LRR结构域内以及可能在LRR结构域和LZ或NBS结构域之间的推测分子内相互作用在确定功能性Blb3GH的功能性中起关4建作用。材料与方法控參/#^^口致病瘦#分离在该研究中，我们-使用了四种晚疫4元性克隆Blb99-256-3、707TG11-1、AM3778-16以及BET95-4200-3，其分另'J具有,掘3、a6/^、W2-^^、以及尺2。马4令薯栽i咅品种底西瑞(Desiree)用于转4匕。罢予生型本氏烟草(7WcW,'awa6eW/^m&m/)才直才朱用于瞬时互才卜分冲斤(transientcomplementationassays)。在该研究中使用的致病疫霉分离菌的特征及起源示于表4中。克隆Blb99-256-3和707TG11-1用作构建BAC文库的DNA来源。^口由RouppevanderVoort等人(1999)戶斤4笛述的，进4亍高分子量DNA制备和BAC文库构建。每个文库获得具有相当于8个基因组当量的85kb的平均插入片段大小的大约74000个克隆。BAC克隆一皮存储为包含大约700至1000个白色菌落的细菌池。利用无菌玻璃涂布器，通过/人琼脂平4反将菌落刮到包含18%甘油和12.5figml"氯霉素的LB培养基中来产生这些白色菌落。这些所谓的超级池(superpools),皮存放在-80。C下。首先通过利用标准碱裂解方案从每个池分离质粒DNA而完成BAC文库的标记筛选，然后进4亍PCR以鉴定阳性池。稀释对应于阳性池的细菌并平皿接种在包含氯霉素(12.5jugml")的LB琼脂平板上。单独的白色菌落被4兆选到384孑L微量滴定4反中，随后通过标记筛选来鉴定单阳性BAC克隆，^口由RouppevanderVoort等人(1999)所描述的。分离自超级池的BAC克隆的名称带有前全褒Blb(例3口，Blb25)或TG(例3口，TG9)。候遞差^的^^發如下从BAC克隆BLB25和TG9中亚克隆候选RGA。用0.03U的Sau3Al限制酶对大约1樣￡克BACDNA等分试样消化10分^K在室温下、在0.5XTAE中利用1-10秒的线性增加脉沖时间以及90Vcm-l的场强，-使部分消4匕的BACDNA经受电泳6小时。在电泳以后，用溴化乙。定染色琼脂糖凝胶以定位包含大约10Kbp大小的DNA片断的凝胶的区域。从凝月交切除该区域并按照制造商i兌明用GELASE(EpicentreTechnologies,USA)进4亍处理。将所选大小的DNA连4妻至BamHl消化且去石粦酸化的二元载体pBINPLUS(VanEngeleneta/"1995),才妾着转化至ElectroMAX大肠沖干菌DH10B感受态细月包(Lifetechnologies,UK)。4惑马發#品神的脊化将具有候选基因的二元质粒转化至根癌农杆菌(A"/we/ac/e"s)菌才朱COR308(Hamiltonet1996)。在i正实了它们在土^a杆菌中的稳定性以后，这些克隆被转化到易感马铃薯品种底西瑞(Desiree)。经转化的才艮癌农杆菌菌4朱的过夜i咅养物用来转化来自体夕卜生长才直4勿的节间4悉条(internodalcuttings)(Heilersig,H丄Beta/.,2006)。总共200个外植体用于每次转化。将初级转化体(primarytransformants)转移至温室。藩j测《#在为、浙利用鸟枪法克隆策略进行BAC克隆测序。利用染料终止循环测序反应i式剂盒(Perkin-Elmer，PtBiosystem,Warrington,UK)、M13通用正向和反向引4勿、以及ABI377自动测序4义(AppliedBiosystem,LaJolla，CA,USA)进行测序反应。利用ATADEN序列和分析牙呈序(DearandStaden,1991)拼接序歹'J重叠群。利用引物移步策略(700bpx700bp)对二元亚克隆进^f亍测序。利用FGENESH++(Softberry)3于基因结构进4亍预观'J。利用CIAJSTALX1.81(Thompsonetal.，1997)进4亍多序歹'Jt匕3于。矛J用局部相似性基本查询工具(BLAST)对i^/-WW的同源基因进4亍4叟索。利用Swiss-Prot(InterProScan,EMBL-EBI，ExPASy，SAPS)鉴定保守结构i或。离体叶片分析用来确定初级转化体和本氏烟草叶片的抗性表型。对于互补分析，用分离菌IPO-0和90128测试初级转化体(图2)。如由Vleeshouwers和合作者(1999)所描述的，进行接种物制备和寸妄种。接种后6天，确定植物表型。在4妻种点没有呈现症状或局部坏死的叶片i平<介为4元性而那些具有明显3包子形成病变(spomlatinglesion)的叶片评价为易感。在本/^乂塔革^的键〃^^Y,对本氏烟草进行土壤杆菌瞬时转化分析(ATTA)。在补充有5mg/L四环素和50mg/L卡那霉素(用于COR308构建物)的LB培养基(1升MQ水中10克细菌蛋白胨、10克NaCl以及5克酵母才是耳又物)中生长重组才艮癌农杆菌培养物。在一天或两天以后，3于于所有菌抹，将计算量的培养物(根据在600nm处的OD0.5)转移到补充有卡那霉素的YEB培养基(1升MQ水中5克牛肉提取物、5克细菌蛋白胨、5克蔗#唐、l克酵母才是耳又物、2ml1MMgS04)中。在一天以后，将过夜细胞以3500rpm离心，然后再悬浮在补充有1ml200mM乙酰丁香酮的MMA培养基(20克蔗糖、5克MS盐以及1.95克MES)中至最终OD为0.2并借助于3ml注射器浸润进入4周龄植物。在两天以后，在离体叶片分析(DLA)中随后用致病疫霉菌抹IPO-复合体和PY23激发(或挑战，challenge)经浸润的叶片。接种后的第4至第8天对超敏反应(HR)或致病疫霉(/^'"/eW"朋)3包子形成进4亍评^介。爭位差^^r孩基于Rpi-blb3序列i殳计32个核苷酸的引物，其中正向引物开始于起始密码子(ATG)，而反向引物开始于终止密码子(TGA)。包含i^Z-a6/^的BAC克隆TG92-4-H3以及亲本克隆AM3778-16和BET95-4200-3(分别包含R2-样和R2)的基因组DNA用作长《连PCR反应(95°C:2，40，，，30X[94°C:20",56.8°C:25",64.3°C:7,]，64.3°C:25，)中的才莫玲反，其中4吏用高4果真DNA聚合酶/yMrw^o⑧(Stratagene)。在琼脂糖凝胶上分离PCR产物并利用来自Qiagen的QIAquickGelExtractionKit()疑月交4是耳又i式剂盒)进4亍纟屯4匕。才要照由Untergasser等人描述的程序，将经纯化的Blb3GH池与供体质粒pDONR221—起用于BP反应Chttp:〃www.untergasser.de/lab/protocols/bp—gateway—reactionii—v1—O.shtml)。BP反应产物,皮專争移到DH10B大肠4干菌感受态细月包中，随后被平亚接种在包含适当抗生素的LB琼脂平板上。在包含适当抗生素的LB液体上/中培养经转化的克隆并利用由Sambrook等人(第2版)改进的标准微量制备方案分离质粒DNA,其中利用来自Qiagen的PI、P2、P3溶液。借助于多个LR反应，将具有候选Blb3GH的克隆克隆到二元表达载体pKGW-MG(在调控元件之间)中，其中利用具有i^Z-WZ3启动子的pDONR-P4P1R质粒、具有W^-WZ3乡冬止子的pDONR-P2RP3质粒、以及具有感兴趣的4矣选基因的pDONR221质粒。在通过限制酶切分析;险查构建物的完整性以后，即将具有感兴趣的基因的pKGW-MG质粒转移至大肠杆菌，并且随后转移到适当的4艮癌农杆菌菌^^,例如，COR308或AGL1中。表表1.关于野生茄属(So/amwt)物种所报道的针对晚疫抗性的R基因和数量性状基因座野生物种基因座类型或名称染色体腺毛薯(S.berthaultii)QTL(4)I、III、VII以及XIXVIIJ求栗薯(S.bulbocastanum)VIII，掘2VIIVS.C3ripsnssQTL(2)未指定落果菩(S.demissum)尺/V尺2IVi，脱i7XIXIXIXIXI小拱薯(S.Microdontum)QTL(3)IV、V以及xQTL未指定S.mochiquense々、IXS.paucisssctumQTL(3)X、XI以及XII富利亚薯(S.phureja)IXS.pinnatisectumVII一."芽叶薯(S.Vernei)QTL(多个)VI、VIII、IX与马4令薯(S.tuberosum)的杂交种IV摔(A2-/汰e)IVQTL(多个)多个IV表2.用于定^f立和克隆的标i己和引物的扭克述标记Th21Blb22-SBlb22-TBlb25-SBlb25-TRGH引物RGH1RGH2RGH34-PLOOP4-GLPL4-GL02Blb3-开始(Blb3匿start)Blb3-结束(Blb3匿end)Blb3-启动子(Blb3-prom)Blb3-终止子(Blb3-ter)Blb3-LRR-l-8Blb3-启动子-结束(Blb3-prom-end)Blb3-orf-bgSto-orf-bgBlb3-spe类型PCR引物(5'至3')SCARF:ATTCAAAATTCTAGTTCCGCCR:AACGGCAAAAAAGCACCACCAPSF:GTTTGATGTATGTTTGTTCTTGCR:TAATGCACTAATAACTAACTAGGSCARF:CTTTATTAGTTCCAAGAGCTACR:ACCCATCCCTTTTTCCTTATCCAPSF:ACAGATGCTACGTCCATCACR:CTCCACATGCGATGCAAAAAGCAPSF:TTTCGATTATGGTGAGCCTTCR:TAGAAAAAGGGTGGTTGTGACCAPSF:GGSAAGACCACTCTTGCAAGR:GGTTTTTAAGCTGCTAATGTTGSCARF:GGSAAGACCACTCTTGCAAGR:TGGTYATAATYACTCTGCTGCCAPSF:ATGRCTGATGCMTTTRTGTCR:CCYAAGTASAGAAAACACTGCF:GGiATGGGiGGiYTiGGiARGACR:TACiACAATiGCAAGiGGTAAMCCF:GTGTCTCTCAAGAGTACAACACR:GCTCGAACATCAAGTAGTTTCC酵bTma(Enzymeb)56Mspl5656Alul56Hpyl8850HpyCH4IV50a.s.50HaeIIl6856F:ATGGCTGATGCCTTTCTRTCATTTG55R:TCAGGAATCTCCTTTAAATTTGGACF:TCTTCCTTAGCATTCGTAGC55R:CTTTAGGAATACTAGTTTTGATTGF:AGCTTTTCTGCCAAGCACATTGG55R:GTACCCTCCGTTTGTCGTTTGATCF:CTCTTTATGTATCAGACATGGC55R:CAACATCTTTCCACTGATCACF:CCCCAAGTTGTATAATGGTTG55R:TGCTTGAGTGATTGAATCTCCR:GGCCATATTCAGACTGGGAGF:AGCTTTTTGAGTGTGTAATTGG55R:GTAACTACGGACTCGAGGG表3.Rpi-blb3和Rpi-blb3基因同源物(包括Rpi-abpt、R2以及R2-样)之间的氨基S臾序列同一'性。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表4在该研究中使用的致病疫霉分离菌的特性、以及它们的推测毒性分布。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>*PY23:野生型致病疫霉分离菌88069的不产生INF-1的布亍生物(Kamounetal;1998;vanWestetal;1999)。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>附图+兌明图1.7^/-6/^(八)和^^-^/《8)基因座的基因和物理图^普。示出了标记的相对位置、在标记之间鉴定的重组体的数目、3争越R基因座的重叠BAC克隆、以及《夷选基因(Blb3GH和AbptGH)的才目乂于^立置，其草巴向用于互补分析。图2.晚疫易感性的遗传互补。用致病疫霉(Phytophtorainfestans)分离菌90128的孢嚢孢子悬浮液接种后8天的典型疾病表型。Blb-99-256-3:抗性亲本克隆；栽培种底西瑞(cv.Desiree):用于转化的马铃薯栽培种；Blb25A-2-4和Blb25A-2-5:具有RGH-Blb25A的初级转化体；Blb25B-2-1和Blb25B-2-2:具有RGH-Blb25B的初级转化体(Rpi画blb3)。图3.用来克隆Rpi-abpt、R2以及R24羊的Gateway策略。携带DNA片断Rpi-blb3启动子、候选基因、以及Rpi-blb3终止子的三种进入克隆与多位点Gateway目的二元载体pKGW-MG的LR重组，导致功能性基因表达克隆。图4.在本氏》因草(iV/co"artaZ^"Aam/a"a)口十片中的瞬曰于互才卜。在用致病疫霉分离菌IPO-0(无毒性)、90U8(无毒性)以及IPO-C(除Rpi-sto之外，对所有都是毒性的)的孢嚢孢子悬浮液接种后7天的典型疾病表型。只于照罢予生型本氏》因草(wtTV.Z^"Aam/awa);pBP-Rpi—blb3:基因组Rpi-blb3基因构建物；pKGW-Rpi-blb3、-abpt、-R2-才羊、-R2、Rpi-stol:多位点Gateway基因构建物，其中通过Rpi-blb3启动子和终止子序列来调节基因表达。图5.系统树，该系统树基于Rpi-blb3、Rpi-blb3基因同源物的氨基酸序列，其扩增自晚疫抗性马铃薯克隆，这些克隆具有Rpi画abpt(AbptGH)、R24羊(R2-才羊GH)或R2(R2GH)、存在于番^BAC克隆AF411807、RPPB-Nd以及Rpi-blbl上的RGH。才匡中的是包含Rpi-blb3、Rpi-abpt、R2以及R2-才羊的簇。图6.Rpi-blb3、Rpi-abpt、R2-样、R2、以及非功能性R2基因同源物R2GH-2的氨基酸序列比对。示出了Rpi-blb3和同源物的全氨基酉臾序列。示出的是14个LRR重复(1-14),其中以4且体示出了亮氨酸(样)残基。图7.Rpi-blb3基因同源物之间的序列相关性分析。示出的仅是7种Rpi-blb3同源物(包4舌^//-6仏3、7^"^/"i^以及7^-一f)的核苷酸序列的信息多态性位点(IPS)。在每列顶部的垂直数字表明在全共有序歹'J(fullconsensussequence)中只于应的才亥苷酉臾4立置。突出的是不同于Rpi-blb3序列的IPS。在底部示出的是结构域，每个IPS源于此(LZ、NBS或LRR)，以及四个4,测的重组区块(区i或A-D)的相对位置。图8.克隆Blb25—B2(8461bp)(包含6/63基因禾口i周节序歹寸)的核苦酸序列。以小写字体(2944-5487)突出2544bp的Rpi-blb3编码区。上游2732nt(211-2942)和下游882nt(5488-6370)才是供调节序列。图9.的cds的核香酸序列。图10.的cds的核香酉臾序列。图11.W2-^^的cds的碎亥苦S菱序列。参考文献Bendahmane,A.,Kanyuke,K.andBaulcombe,D.C.1997.High-resolutiongeneticalandphysicalmappingoftheRxgeneforextremeresistancetopotatovirusXintetraploidpotato.TheorApplGenet95:153-162.Bittner-Eddyetal"2000.RPP13isasimplelocusinArabidopsisthalianaforallelesthatspecifydownymildewresistancetodifferentavirulencedeterminantsinPerenosporaparasitica.ThePlantJourna]21，177-188.Hamilton,C.M.，A.Frary,C.Lewis,andS.D.Tanksley.1996.StabletransferofintacthighmolecularweightDNAintoplantchromosomes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:9975-9979.Heilersig,H丄B.;Loonen,A.E.H.M.;Bergervoet-vanDeelen，丄E.M.van;Wolters,A.M.A.;Visser，R.G.F.(2006)Post-transcriptionalgenesilencingofGBSSIinpotato:effectsofsizeandsequencesoftheinvertedrepeats.PlantMolecularBiology60(2006)5.-ISSN0167-4412-p.647-662.Helgeson，丄P.，Pohlman,J.D.，Austin,S.，Haberlach，G.T.,Wielgus,S.M.，Ronis,D.,Zambolim,L.，Tooley,P.,McGrath，J.M.,James,R.V.andStevenson,W.R.1998.SomatichybridsbetweenSolanumbulbocastanumandpotato:anewsourceofresistancetolateblight.TheorApplGenet96:738-742.Hermsen,J.G.T.H.andRamanna,M.S.1973.Double-bridgehybridsofSolanumbulbocastanumandcultivarsofSolanumtuberosum.Euphytica22:457-466.Li,X.,VanEck,H丄,RouppevanderVoort,J.N.A.M.,Huigen,D丄,Stam，P.andJacobsen,E.1998.AutotetmploidsandgeneticmappingusingcommonAFLPmarkers:theR2alleleconferringresistancetoPhytophthorainfestansmappedonpotatochromosome4.TheorApplGenet96:1121-1128.Michelmore，R.W.,Paran,I.andKesseli,R.V.1991.Identificationofmarkerslinkedtodisease-resistancegenesbybulkedsegregantanalysis:Arapidmethodtodetectmarkersinspecificgenomicregionsbyusingsegregatingpopulations.Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:9828-9832.ParkT,H.,VleeshouwersV.G.A.A.,HuttenR.C.B.,vanEckH.J.,vanderVossenE.A.G.，JacobsenE.andVisserR.G.F.2005aHigh-resolutionmappingandanalysisoftheresistancelocusRpi-abptagainstPhytophthorainfestansinpotato.MolecularBreeding16，33-39.ParkT.-H.,VleeshouwersV.G.A.A.，HuigenD.,vanderVossenE.A.G.,vanEckH.J.andVisserR.G.F.2005b.Characterizationandhigh-resolutionmappingofalateblightresistancelocussimilartoR2inpotato.TheoreticalandAppliedGenetics111,591-597.ParkT.-H.,GrosJ.,SikkemaA.,VleeshouwersV.G.A.A.MuskensM.,AllefsS.,JacobsenE.,VisserR.G.F.andvanderVossenE.A.G.2005c.ThelateblightresistancelocusRpi-blb3fromSolanumbulbocastanumbelongstoamajorlateblightRgeneclusteronchromosome4ofpotato.MolecularPlant-MicrobeInteractions18(7),722-729.Rose,L.E.，etal..2004.ThemaintenanceofextremeaminoacidresistancediversityatthediseaseresistancegeneRPP13inArabidopsisthaliana.Genetics166,1517-1527.RouppevanderVoort,J.,Kanyuka,K.,VanderVossen，E.，Bendahmane,A.,Mooijman,P.,Klein國Lankhorst,R.,Stiekema,W.,Baulcombe,D.andBakker,J.1999.TightphysicallinkageofthenematoderesistancegeneGpa2andthevirusresistancegeneRxonasinglesegmentintrogressedfromthewildspeciesSolanumtuberosumsubsp.andigenaCPC1673intocultivatedpotato.MPMI12:197-206.Sandbrink，J.M.,Colon,L.T"Wolters,P丄C.C.andStiekema,W.J.2000.TworelatedgenotypesofSolanummicrodontumcarrydifferentsegregatingallelesforfieldresistancetoPhytophthorainfestans.MolecularBreeding6:215-225.vanderHoeven,R.,Ronning,C.,Giovannoni，J.,Martin,G.andTanksley，S.2002.Deductionsaboutthenumber,organization,andevolutionofgenesinthetomatogenomebasedonanalysisofalargeexpressedsequencetagcollectionandselectivegenomicsequencing.ThePlantCell14:1441-1456.vanderVossen,E.A.,Sikkema,A.,Hekkert,,B.T丄.，Gros,J.，Stevens,P.,Muskens,M.,Wouters,D.,Pereira,A.,Stiekema,W丄andAllefs，S.200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