掺入十八碳四烯酸的食品组合物的制作方法

专利名称：掺入十八碳四烯酸的食品组合物的制作方法
专利说明掺入十八碳四烯酸的食品组合物 发明领域 本发明涉及在功能食品产品的开发中转基因得到的十八碳四烯酸(stearidonic acid)的应用。更具体来说，涉及通过使用源自转基因植物的十八碳四烯酸来改善食品产品的营养品质和货架期。

背景技术：
本发明涉及通过利用源自植物的十八碳四烯酸(“SDA”)来改善食品的方法。具体来说，本发明人提供在食品中利用改善营养品质的源自植物的SDA的技术和方法。在过去，膳食脂肪被认为是无价值或甚至是有害的膳食组分。许多研究已经证明了膳食脂肪与肥胖症和其他病理(如动脉粥样硬化)的生理联系。由于这种低营养价值的认知，在很多医疗机构是不鼓励消耗脂肪的。
然而，近期研究确定，尽管它们具有相对简单的生物学结构，但存在一些类型的脂肪，其似乎以某些方式改善身体功能，并且事实上可能是某些生理过程所必须的。更宽泛的脂肪分子类型包含脂肪酸、异戊二烯醇、类固醇、其他脂质和脂溶性维生素。在这其中有脂肪酸。脂肪酸是其“骨架”中具有2至26个碳的羧酸，在其碳水化合物结构中没有或具有各种数目的不饱和键。它们通常具有约4.5的解离常数(pKa)，这表明在正常的身体条件(生理pH为7.4)下，大多数将处于解离形式。
随着脂肪，尤其脂肪酸在营养状态中的改善，食品工业中的许多已经开始集中于脂肪酸和脂质技术，将它们作为食品生产的新焦点。这种焦点尤其集中于生产ω-3脂肪酸并将它们掺入到饮食中。ω-3脂肪酸是长链多不饱和脂肪酸(链长18-22个碳原子)，其中第一个双键(“不饱和键”)从第三个碳原子开始。它们被称为“多不饱和的”，因为它们的分子在其碳水化合物链中具有两个或多个双键“不饱和键”。它们被称为“长链”脂肪酸，因为它们的碳骨架具有至少18个碳酸子。除了十八碳四烯酸“SDA”之外，ω-3家族脂肪酸还包括α-亚麻酸(“ALA”)、二十碳五稀酸(“EPA”)和二十二碳六烯酸(“DHA”)。ALA是“基础”ω-3脂肪酸，在体内通过一系列酶促反应，从其制备EPA和DHA，包括产生SDA。大多数营养学家指出DHA和EPA是生理上最重要的ω-3脂肪酸。这种来自ALA的合成过程分别称为“延长”(分子通过结合新的碳原子而变长)和“去饱和”(产生新的双键)。在自然界中，ALA首先发现于某些植物种子(如，亚麻)中，而EPA和DHA则大多数存在于冷水掠食性鱼类(如，金枪鱼、鳟鱼、沙丁鱼和鲑鱼)的组织中以及它们摄食的一些藻类或微生物中。
还不广为人知的是，用于ω-3目的收获的冷水性海水鱼以及它们作为食品的用途实际上不产生必需ω-3PUFA(EPA和DHA)。而是长链PUFA由微生物或藻类生物合成并传递到食品链中，在掠食性物种的组织中收集。目前，有两种市售的富含DHA的海洋单细胞油，它们由美国公司-Martek制备，一种来自异养性沟鞭藻(隐甲藻(Crypthecodinium cohnii))，另一种来自海洋破囊壶菌(裂殖壶菌(schizochytrium sp.))。遗憾的是，生产成本简直太贵了而不能在商业上决定大范围生产，并且可利用来源仍然很少。
除了简单确保ω-3脂肪酸供应的困难之外，将ω-3脂肪酸加工到食品产品中的成本是困难的。甚至在收获之后，这些成本也是限制食品公司的因素。额外的加工成本的原因是EPA和DHA在化学上相对不稳定。这些ω-3脂肪酸可以被迅速氧化导致不期望的气味和味道。为了降低氧化速率，食品加工机因此必须在冷冻条件下分配油或将所需的脂肪酸包胶囊，每种方法都会大大地增加加工成本并因此增加消费者的成本。尽管有这种增加的费用，食品公司还是对供应ω-3脂肪酸感兴趣，因为他们相信如果可以开发可靠供应，有健康意识的消费者可能愿意支付小笔额外费用来改善饮食。
随着食品公司转向开发必需脂肪和油来作为健康饮食的重要组分，政府已开始建立了条例来促进在饮食中采用PUFA。满足这些需要的困难是不能发展足够大的ω-3油供应以符合增长的市场需求。如已经提到的，人们认为ω-3脂肪酸具有最高的价值，EPA和DHA也会随时间迅速化学降解，这限制了商业获得性。重要的是，在EPA和DHA氧化的迅速过程期间，这些长链脂肪酸产生腐臭或完全不令人满意的感官性质，使得它们从商业上可以接受的前景看，难以或不可能包括入许多食料中。此外，随着对ω-3脂肪酸需求的增加，人们意识到已经耗尽的全球鱼类储存不能满足未来人们对ω-3的营养需求的显著增长。这些在供应、稳定性和来源上的限制大大增加了成本并相应限制了膳食ω-3的可利用性。
因此，对提供大范围稳定的可以商业上可接受的方式包含在食品和饲料配制品中的ω-3脂肪酸或其关键前体供应存在需求。本发明提供鱼或微生物提供的ω-3脂肪酸的替代物并且使用化学上相对较稳定的ω-3脂肪酸SDA作为来源来提供中性的味道、经济的产品以及丰富的来源，如源自转基因植物。SDA是α-亚油酸(“ALA”)的中间代谢产物，并且一旦在体内就容易代谢成EPA。具体包括在那些能够提供需求的植物种类是大豆、玉米和油菜(canola)，但是也可以根据需要包括其他植物。一旦制备，本发明的SDA可以用于改善多种食品产品的健康特性。这种制备还可以根据需要扩大，以降低对收获野生鱼类储备的需要并且为水产养殖操作提供必需脂肪酸组分，这两者都缓解了全球渔业的压力。
重要的是，现有技术显示，当配制成用于商业规模和消费者消费的食品和/或饮料时，含有α-亚麻酸的食品组合物不会以任何生理上显著的程度转化成EPA。此处的困难是相对于合理体积的消费食料所需的ALA体积。获得生理相应量的EPA或DHA的传统方法包括添加鱼油或藻类油，它们具有异味和较差稳定性的负面属性。为了含有将在体内产生生理上显著浓度的EPA和DHA的ALA浓度，需要过量的ALA，这导致了配制食品产品中的困难和完全不能实施的食品大小。
令人吃惊的是，本发明人已发现，来自本发明转基因植物源的SDA浓度在给定的食品或饮料产品中需要低得多的浓度来达到生理上显著，这些范围完全在典型食品产品的可接受体积参数之内。与其他获得相似益处的方法(如直接加入含有油(如鱼油)的DHA)相比，所发现的另一个益处在于增强味道和稳定性。因此，本发明的SDA组合物是特别合适用于健康和稳定的食品组合物的脂肪酸。
发明概述 本发明包括从转基因大豆制备油，用于食品产品中，以改善终端消费者的健康，所述转基因大豆经设计(engineered)含有大量十八碳四烯酸(18:4ω3)。使足量的富含SDA的大豆生长以允许递送具有大量SDA组分的大豆油。相对于任一ω-3油来源，这种“SDA油”提供初始清新的风味、较长的货架期稳定性以及增强的营养品质。也已开发了在贮存期间保持油品质的方法。已经制造出一些由SDA油制备的食品产品，并且发现它们与传统的油(如大豆油)制成的产品相比具有类似的口味和感官性质。
同样根据本发明，还已进行了食品产品的货架期测试，并且相对于其他含ω-3的产品，植物来源的SDA油具有实质性改善的货架期特性。因此，本发明的优选实施方式是通过转基因植物制备的SDA油在用于人消费的食品产品生产中的应用。
营养研究已显示，相比于α-亚麻酸，SDA在体内以约5倍更有效地转化成EPA。因此，在本发明的另一个实施方式中，源自植物的SDA可以用作某些病理状况的营养补充剂或膳食添加剂。
具体来说，本发明证明可用十八碳四烯酸制备可接受的食品产品，以使它们的货架期增加超过有竞争力的PUTA油的货架期。
此外，本发明的方法还提供最优化食品配制物，以使终端消费者的健康改善最优化，所述食品配制物的形式为食用油、加工油或油组合物、用于豆浆配制物的全大豆提取物或用作部分提取大豆粉型组合物(partialextraction flour-type composition)。
在本发明的另一个实施方式中，由转基因植物制备的SDA油可以形成水产养殖鱼类的日粮基础和/或来自这些鱼的产品的基础。
在本发明的另一个实施方式中，由转基因植物制备的SDA油可以形成肉用牛(beef cattle)的日粮基础以改善牛肉和/或牛肉产品的营养特性。本发明的其他实施方式还可以改善繁殖功能。
在本发明的另一个实施方式中，由转基因植物制备的SDA油可以形成猪的日粮基础以改善猪肉和/或猪肉产品的营养特性。本发明的其他实施方式还可以改善繁殖功能。
在本发明的另一个实施方式中，由转基因植物制备的SDA油可以形成鸡的日粮基础以改善鸡肉和/或鸡肉产品的营养特性。本发明的其他实施方式还可以改善繁殖功能。
参考附图，在下面本发明的优选实施方式的详细描述中，本发明的其他特点和优点将变得显而易见。
附图简述

图1显示PUFA代谢的生物合成途径。
图2显示意大利调料A-E的感官信息的时间点测试。
图3显示牧场式(Ranch)调料A-E的感官信息的时间点测试。
图4显示蛋黄酱A-D的感官信息的时间点测试。
图5显示豆浆A-B的感官信息的时间点测试。
图6显示水果思木西(Fruit Smoothies)A-C的感官信息的时间点测试。
图7显示表示ω-3脂肪酸相对生物活性的图。
图8显示豆浆制备的工艺流程图。
图9显示香草豆浆制备的工艺流程图。
图10显示麦淇淋制备的工艺流程图。
图11显示十八碳四烯酸的模型。
优选实施方式详述 下面的缩写在说明书中具有指定的含义 缩写关键词 AA 花生四烯酸 ALA α-亚麻酸 DHA 二十二碳六烯酸 DNA 脱氧核糖核酸 EPA 二十碳五稀酸 GLA γ-亚麻酸 LA 亚麻酸 mRNA信使核糖核酸 PUFA多不饱和脂肪酸 SDA 十八碳四烯酸 术语解释 表达-产生相应的mRNA并翻译该mRNA以产生相应的基因产物(即，肽、多肽、或蛋白)的基因转录过程。
饲料-可用于饲喂动物的物料，其非限制性地包括草料(forage)、粗饲料(fodder)和浓缩料。
食品-被人摄取并且含有可以代谢产生能量的营养素的物质。
基因-染色体DNA、质粒DNA；cDNA；合成DNA；或编码肽、多肽、蛋白质的其他DNA、或RNA分子。
宿主或宿主有机体-细菌细胞、真菌、动物和动物细胞、植物和植物细胞、或任何植物部分或组织，包括原生质体、愈伤组织、根、块茎、种子、茎、叶、苗、胚和花粉。
口感-是指物质在人口中的感觉如何。在风味测试特征方面，这是指所测试物质的粘度、质地和光滑度。
营养食品棒-如本文所用，术语“营养食品棒”是指设计用于促进健康的食品棒。
转化-是指将核酸引入接受宿主。
转基因-通过技术插入细胞或其祖系体并成为由该细胞发育而来的植物或动物基因组的一部分的任何核酸分子片段。此类转基因可以包括对转基因植物或动物部分或完全外源(即，外来)的基因，或者可以代表与植物或动物的内源基因具有同一性的基因。
转基因的-包括通过技术插入细胞或其祖系体并成为由该细胞发育而来的植物或动物基因组的一部分的核酸分子的任何细胞。
详述 本发明涉及用于制备十八碳四烯酸以及将其掺入人和牲畜的膳食以努力改善人健康的改进方法的系统。这种制备是通过利用经设计以高产率产生SDA，以允许其商业并入食品产品中的转基因植物而进行的。就本发明的目的而言，脂肪酸的酸和盐形式(如丁酸和丁酸盐、花生四烯酸和花生四烯酸盐被认为是可以互换的化学形式。
转向图1，所有高等植物都具有合成主要的18碳PUFA、LA和ALA，以及一些情况下合成SDA(C18:4n3，SDA)的能力，但是极少数能够进一步将这些延长并去饱和，以产生AA、EPA或DHA。因此在高等植物中合成EPA和/或DHA需要引入数种编码将LA转化成AA、或将ALA转化成EPA和DHA所需的所有生物合成酶的基因。考虑到PUFA在人类健康中的重要性，根据本发明，成功地制备转基因含油种子中的PUFA(尤其是n-3类)可以提供这些用于膳食用途的必需脂肪酸的持续来源。在大多数合成PUFA的真核有机体中进行的“常规的”需氧途径是以LA和ALA两者的Δ6去饱和产生γ-亚麻酸(GLA，183n6)和SDA开始的。
确立油的组成 转向表1a，提供相对于本发明的油组合物的构成油组成的“正常”范围的基础是重要的。用于建立食用油和重要的脂肪的基础组成标准的数据重要来源为农业、渔业和食品部(Ministry of Agriculture，Fisheries and Food(MAFF))和位于英国的利兹海德食品研究协会(Leatherhead FoodResearch Association)的油、种子和脂肪协会联盟(Federation of oil，Seedsand Fats)(FOSFA)。
为了建立有意义的标准数据，必需从代表性的地理起源收集足够的样品并且油是纯的。在MAFF/FOSFA的工作中，针对11种植物油中的每一种，对超过600份的已知来源和历史的植物含油种子的可信商业样品(通常具有10个不同的地理起源)进行了研究。分析所提取的油，以测定它们的总体脂肪酸组成(“FAC”)。合适时测定甘油三酯、固醇和生育酚组合物2-位处的FAC；甘油三酯的碳数目和碘值、油中的蛋白值、熔点和固体脂肪含量。
1981年之前，FAC数据不包含在公布的标准内，这是因为得不到足够品质的数据。1981年，采用了包括FAC范围来作为强制组成标准的标准。MAFF/FPSFA的工作提供了以后对这些范围修订的基础。
一般来说，随着更多数据变得可用，有可能提出比1981年所采用的那些窄得多并且因此更具体的脂肪酸范围。表1a给出了在1981年食品法典委员会(Codex Alimentarius Commission(CAC))采用的油的FAC的实例和1993年举行的脂肪和油法典委员会(Codex Committee on Fats and Oils(CCFO))会议所提出的相同油的范围。
表1a-油的脂肪酸组成标准
来源食品法典委员会，1983和1993。
鉴于上述和根据本发明，在重组含油种子植物中产生的富含SDA的油提供食品制造商先前得不到的油组合物。它提供在食品产品中掺入ω-3油，在本发明之前，该ω-3油不以明显量存在于通常的植物油之中。此外，当这些油从鱼类或藻类来源传递时，有可能使用这种ω-3油而没有对食品感官品质或货架期的传统关心。在传递该油之后，可以使用和利用它来制备焙烤食品、乳制品、涂抹食品、麦淇淋、运动食品、营养棒和婴儿配方食品、饲料、水产养殖、营养药物(neutrceutical)和医疗用途。每种都具有增强的营养含量。
转向表1b，为举例说明本发明的实用性，已选择/正选择代表宽范围的食品种类的各种食品，以测定SDA和其他ω-3油对产品风味和货架期的影响。
如由接受的货架期感官测试所测定，氧化稳定性是确定脂肪和油的有效期和风味特征的重要PUFA特征。脂肪和油中的氧化变质可以通过湿化学法评估，如过氧化值(PV，其测量由初级氧化所得的过氧化物)和p-茴香胺值(AV，其主要测量由次级氧化所得的2-alkenal)；或者食品中的氧化变质可以通过感官品尝测试来评估。所选的食品种类和产品如下 表1b
根据本研究，掺入转基因SDA的食品产品的开发提供了一些配制物和方法。已进行的另外的开发和研究用于最优化风味和增强货架期特征。例如，可以含有本发明SDA组合物的食品或饮料包括焙烤食品和焙烤食品混合物(如，蛋糕、果仁巧克力蛋糕(brownies)、松饼、甜酥饼、发面点心、馅饼和馅饼皮)、起酥油和油产品(如，起酥油、麦淇淋、煎炸油、烹调油和色拉油、爆米花油、色拉调料和蛋黄酱)、油炸食品(如，薯片、玉米片、玉米粉饼(tortilla)片、其他油炸的含淀粉小吃食品、炸薯条、煎面团和炸鸡)、乳制品和人造乳制品(如，黄油、冰淇淋和其他含脂肪冷冻甜品、酸奶和奶酪(包括天然奶酪、加工奶酪、奶油干酪、酪农干酪、奶酪食品和奶酪涂抹食品)、牛奶、奶油、酸奶油、酪乳、和咖啡奶精)、肉制品(如，汉堡、热狗、维也纳香肠、香肠、大红肠(bologa)和其他午餐肉、罐头肉(包括面食/肉制品)、炖肉、三明治涂抹食品和罐头鱼)、人造肉、豆腐和各种蛋白涂抹食品、甜品和甜食(如，糖果、巧克力、巧克力糖果、糖霜和糖衣、糖浆、奶油馅和水果馅)、果仁油和各种汤、蘸料、沙司和肉汤。上述各实例包括本发明的不同实施方式。
本发明将其配制品基于每种食品产品的ω-3油的目标水平。这些水平基于SDA产品的生物等价性来确定。下面表2a中的信息确定基于每份计的目标ω3水平。
表2a 根据该信息，开发具有适当的十八碳四烯酸水平的本发明的SDA优选配制物，以便以每份为基础传递目标水平。由于每份食品大小存在不同，所添加的量在不同的应用之间有所变化。
下面的表2b-d反应本发明SDA油组成的范围。
表2b SDA油变体(variant)-1(由本发明的转基因植物产生)

表2c SDA油变体-1(由本发明的转基因植物产生)


表2d SDA油变体-1(由本发明的转基因植物产生)


对于本发明，十八碳四烯酸的主要来源是从转基因大豆提取的油，所述转基因大豆经过设计，以产生高水平的十八碳四烯酸。所述大豆在油加工设备中加工，并且按照美国专利申请2006/0111578和2006/0111254所述的方法提取油。除了油之外，在从转基因和对照大豆制备面粉，所述对照大豆在加工全脂大豆粉中的工业实践是典型的。使用本发明SDA的食品配方的一个实例参见下面的表3a-3c和图2a-2e。表4a-4c中提供了根据本发明优选实施方式的意大利风味调料的一般特性。
表3a意大利色拉调料-货架期特性
表3a续意大利色拉调料-货架期特性
表3b意大利色拉调料-货架期特性
表3b续意大利色拉调料-货架期特性
表3c意大利色拉调料-货架期特性
表4a意大利色拉调料

表4b意大利色拉调料

表4c意大利色拉调料 货架期生产 分析/微生物结果 意大利调料 根据本发明的方法，将各种色拉调料样品提交给合约食品实验室用于本发明各实施方式的证实研究和分析。货架期测试的一般方法是5个特性评味员品尝所述调料并对于每种调料的特性和强度(15pt等级-0为没有，15为极度)达成共识。评味员所鉴别的特性列表在所附的文件中。另外的特性根据保证(warranted)鉴别。特性测试的特征在下表5中提供，连同不同时间点的感官测试数据在下表6中提供。
表5SDA调料的感官特性定义 外观 黄色样品中黄色的强度，从淡黄色到深黄色 香味/口味 总香味 样品的总香味强度 总风味 样品的总风味强度，包括基本味道。
总油任何类型油(包括氧化油)的香味/风味强度 氧化油 氧化油的香味/风味的强度，其被描述为已经历过氧化的 陈油，表征为纸板味、豆腥味、着色或鱼腥味。
总异味/风味 据信在产品中不希望的香味/风味的强度，包括氧化油和 其他异味记录(off notes)。所述异味记录的性质将被描 述 蛋黄酱/乳制品 与蛋黄酱或乳制品相关的香味/风味强度 醋 白醋或醋酸的香味/风味强度 洋葱/大蒜/药草 与洋葱、大蒜和所有干燥且新鲜的绿色药草相关的香味/ 风味强度。
酸味四种基本味道之一，主要在舌的侧面感知；一般指酸。
咸味四种基本味道之一，主要在舌的侧面感知；一般指氯化 钠(食盐)。
感觉因素 辛辣通过嗅闻样品(如辣根)所产生的鼻腔的灼烧或刺激的 量 质感 口感粘度当在口中处理时感知到的样品粘稠程度 油腻的口涂覆量 在口的软组织上感知到的涂覆量 (oily mouthcoating) 余味 总余味 样品总的余味强度 实施例1 色拉调料 上面的表格表示开发用于本发明优选实施方式的数据。还请参见图2a-2e关于至4个月(out to four months)的数据图示。根据本文所提供的数据，含SDA的样品的异味明显比相应的鱼和藻类ω-3油配制物小，其提供存在ω-3配制物的益处而没有实质性缩短的货架期和限制的稳定性。由于辛辣风味和极为讨厌的气味，源自鱼和藻类的油完全不能被测试并且从3个月加速评价期移除，而本发明的SDA组合物则不是这样。总体上，本发明SDA组合物表现出改进的稳定性、降低的降解和随之增强的货架期，用于与将有益的ω-3传递入膳食中相结合的商业应用。
关于具体的色拉调料实施方式，开发用于加强的牧场调料的本发明SDA组合物在室温下储存6个月之后比鱼油和藻类油更长久保持其风味特征。对于意大利调料，更复杂的风味系统确实起到一定的遮掩，但是本发明的含SDA的调料的异味同样比同等(comparable)的基于鱼/藻类的调料少。
意大利色拉调料 根据本发明，通过4个月完成室温下的货架期研究和加速(accelerated)货架期研究。在食品实验室中，由经过训练的特性评味员(attribute panel)对每一样品于室温下在第0、2和4个月进行评价，以及在加速温度(accelerated temperature)(95°F)下于第1、2和3个月进行评价。对于牧场调料，鱼油和藻类油样品由于其在2个月时间点时的高异味和特性，仅在第3个月闻味。所有其他样品(包括含有本发明SDA油的那些)在第3个月进行评价。这对于加速货架期评价来说是典型的。
根据本发明的方法，就风味而言，相对于其他含ω-3的测试对象，意大利调料显示显著的稳定性。通过在95°F下4个月的测试完成了加速测试。在这一点，所有产品都表现出异味，其中鱼油显示最强的异味记录。值得注意的是，本发明的SDA配制物与大豆油参考类似。
根据本发明的方法，根据感官参数牧场型调料相对于含有其他ω-3的鱼油和藻类油配制物显示显著的改善。同样根据本发明，已完成加速测试。在两个月时鱼和藻类样品中产生了高强度的异味，而本发明的SDA油和参考大豆油可以在3个月时根据感觉参数来评价。参考和亚麻样品显示比本发明SDA油更多的特征风味和更少的异味。本发明的SDA油显示比鱼和藻类样品更多的特征风味和更少的异味。这表明SDA相对于鱼油和藻类油具有改善的货架期。此外，通过4个月完成根据本发明的配制物的室温测试。结果显示，本发明的SDA样品表明相对于其他ω-3来源(包括鱼油和藻类油)，本发明的SDA产品具有显著较低的异味和讨厌气味特征。
意大利和牧场型调料的数据和显示评价特征的图表附在表1-11和图2和3中。
实施例2 牧场式色拉调料 表6a-牧场色拉调料货架期特性

等级＝0至15 注意颜色表明与初始时间点参考豆油的差异；黄色＝+/-1.0，橙色＝+/-1.5至2.0，红色＝/＜2.5 表6a-牧场式色拉调料货架期特性

等级＝0至15 注意颜色表明与初始时间点参考豆油的差异；黄色＝+/-1.0，橙色＝+/-1.5至2.0，红色＝/＜2.5 表6b-牧场色拉调料货架期特性

等级＝0至15 注意颜色表明与初始时间点参考豆油的差异；黄色＝+/-1.0 表7a SDA色拉调料配方--牧场

表7b
表7c 货架期生产 分析/微生物结果 牧场式调料

货架期测试的一般方法是5位经过训练的特性评味员品尝所述调料并并对于每种调料的特性和强度(15pt等级-0为没有，15为极度)达成共识。评味员所鉴别的特性列表在所附的文件中。另外的特性根据保证鉴别。
对于本实施例，上面的表提供关于风味和稠度的重要数据。在牧场式调料的情况下，由于其更加敏感的风味，用SDA制成的调料和竞争的对应物之间的差异更加明显。上面的表格表示开发用于本发明优选实施方式的数据。还请参见图3a-3h关于使用牧场式调料的数据图示。根据本文所提供的数据，含SDA的样品的异味明显比那些含鱼油和藻类油的小，其提供存在ω-3配制物的益处而没有实质性缩短的货架期和限制的稳定性。由于辛辣风味和极为讨厌的气味，源自鱼和藻类的油完全从3个月加速评价期移除，而SDA则不是这样。证实了改进的稳定性、降低的降解和随之增强的货架期。
实施例3 蛋黄酱 根据本发明，用本发明的含ω-3的油制备蛋黄酱，并进行测试，所提供的数据适用于以各种方法(胶体磨、油炸磨等)制备的所有蛋黄酱和可以匙舀取色拉调料变体(variants)。
表8a SDA-蛋黄酱，配制物

表8h 本发明的组合物-与基于鱼油的蛋黄酱比较 表8c 本发明的组合物-与基于藻类油的蛋黄酱比较 表8d 本发明的组合物-与基于亚麻油的蛋黄酱比较
表9a SDA蛋黄酱配方和方法
表9b 蛋黄酱工艺-中试设备 2.将胶体磨设置在30. 3.先加入水，再在EDTA中混合 4.加入蛋黄，混合3min 5.将芥末粉、糖和盐预混合。缓慢加入预混物直到溶解并均匀分散 6.添加到油中混合3min，将Dixie混合槽速度设定在35hz 7.缓慢添加到醋中 8.混合直到所有成分都分散。关闭Dixie搅拌器的搅拌，使空气逸出 9.开启胶体磨。打开混合槽、阀门，将泵速设置在30hz. 10.包装成单独包装 根据本发明，货架期测试的一般方法是5位经过训练的特性评味员品尝所述调料并对于每种调料的特性和强度(15pt等级-0为没有，15为极度)达成共识。评味员所鉴别的特性列表在所附的文件中。另外的特性根据保证鉴别。
表9c 值 等级参考 外观 颜色 0.0 白色(纸) 7.5 马尼拉纸夹(Manila Folder) 香味/口味 鸡蛋味8.0/6.0 碎的煮老的鸡蛋 醋香味6.5 100％亨氏(Heinz)蒸馏醋溶液 醋风味4.0 2％亨氏蒸馏醋溶液 总异味3.5 毛豆、生大豆 氧化的乳制品/油(香味 4.0 低芥酸菜子油(9/05打开) 和风味) 5.0 威臣(Wesson)植物油(11/22/04打开) 8.0 卡夫(Kraft)巴马干酪(有效期2001) 甜味 2.0 2.0％蔗糖水溶液 5.0 5.0％蔗糖水溶液 酸味 2.0 0.025％柠檬酸水溶液 5.0 0.04％柠檬酸水溶液 咸味 2.0 2.0％氯化钠水溶液 5.0 5.0％氯化钠水溶液 口感因素 辛辣(香味)8.0 100％亨氏蒸馏醋溶液 质地 口感粘度 8.0 Lucerne重奶油与卡夫(Kraft)蛋黄酱 的50∶50混合物 11.0 卡夫蛋黄酱 油腻口感 8.0 卡夫蛋黄酱 根据本发明，下列数据在初始评价之后所得。与色拉调料实施例类似，含SDA的蛋黄酱的初始风味与对照类物似。亚麻样品与其他比较物的差异最大。
根据本发明的方法，完成室温和加速储存条件下的两个月货架期研究。在加速温度研究中所有样品都具有明显的异味，其中藻类油样品具有最高的异味记录。SDA表现优于其他含ω-3的油来源。对于室温研究，藻类油表现出比本发明的SDA油程度高得多的异味。参见上面表12-14和图4a-4e中的数据。
实施例4 豆浆 根据本发明，可用两种不同的方式制备豆浆。在第一种中，将富含SDA的大豆去皮，脱落成片，然后制成全脂豆粉。通过以下方法配制豆浆首先将豆粉溶解在水中，混合，并进行加工以灭活酶。将大豆基础过滤，以去除额外的固体并脱气。加入剩余的成分，混合，然后在两级匀浆器中使产品均质化，随后通过超高温(UHT)热处理装置处理。包装所得产品并冷藏，其典型的货架期为12周。下面表10中提供了配方，还参见图6的工艺流程图。
表10 所用的实例还可以应用于不同类型的均质化和热处理装置(直接蒸汽、间接蒸汽等)。可以相同方式制备不同的豆浆风味，包括普通(plain)、巧克力、苹果、橘子、浆果等风味。
业已发现，与由经相同方法加工但未经本发明SDA强化的豆粉制备的豆浆相比，所得产品具有可接受的风味和口“感”性质。根据9个月货架期之后追踪本发明所得的数据，在用转基因SDA组合物强化的本发明实施方式与含有不含ω-3脂肪酸的非转基因大豆油的对照组合物之间，风味上仅存在轻微差异。对豆浆和水果思木西都进行了该追踪。注意，这些物质在大多数商业环境(commercial settings)中冷藏保存并且仅具有3个月的货架期。
本实施例的第二种方式是使用大豆分离蛋白，并加入富含SDA的大豆油，以获得新的产品组合物。下面是表11中提供的配方，其相应的流程图在图7中。
表11 根据本发明，上面使用的所提供的实施例还可以应用于不同类型的均质化和热处理装置(直接蒸汽、间接蒸汽等)。可以相同方式制备不同的豆浆风味，包括普通、巧克力、苹果、橘子、浆果等风味。业已发现，与用精制、漂白和脱臭的大豆油制备的豆浆相比，所得产品具有可接受的风味和口感性质。


实施例5 水果思木西 根据本发明的优选实施方式，从豆浆开发水果思木西。在另选实施方式中，SDA油的其他来源也可用于开发水果思木西。还根据本发明，开发用于制备水果思木西的方法考虑了SDA油增强健康和营养的独特性质。开发了两种思木西类型的产品，已确定两种产品都具有延长的货架期性质。在涉及使用超高温巴氏灭菌法、冷藏储藏的处理期间，具有其他冷藏饮料的典型的12周货架期。尽管本文描述了混合浆果原样(prototype)，但是可开发其他风味，包括草莓、葡萄、酸果蔓、橘子、柠檬、苹果、菠萝、芒果、草莓-香蕉风味和任何其他水果风味组合。
在第一种方法中，按照实施例4的第一部分所述使用富含SDA的大豆粉制备豆浆。其他成分(包括稳定剂、调味剂和水果)在均质化之前添加。下面是用于该产品的配方 表13 混合浆果水果思木西-基于大豆 根据实施例4所述的方法制备大豆基础(soybase)部分，产品的其余部分的加工如下所述 表14 本发明开发的第二种方法是将富含SDA的油添加到含分离大豆蛋白的配制物中。在该实施方式中，开发了混合浆果产品，但是可以将其扩展到上述其他风味。下面是本发明实施方式中所用的基础配方。
表15 混合浆果水果思木西-基于大豆 产品根据本发明的方法开发，并且具有下列配方 表16 从该实施例中的两种方法所得的产品是典型的本发明水果风味的思木西实施方式，其冷藏货架期为12月，如本发明所开发。
上述数据和技术显示了根据本发明方法从豆浆制备混合浆果思木西。根据本发明的实施方式，本发明的SDA油相对于其他含ω-3样品具有显著差异。数据显示在表17-21中，显示结果的图在图6a-6b中。


实施例6 麦淇淋型涂抹食品 表18 70％脂肪的麦淇淋型涂抹食品 根据本发明的优选实施方式，典型的麦淇淋加工是将水、盐、苯甲酸钠和黄油调料混合成水相。转向图9，可以将牛奶成分(如乳清粉、酪蛋白酸钠或奶粉)添加到水相中。混合油、卵磷脂、甘油单酯和甘油二酯、维生素、和调料，与水相合并，并混合。使混合乳液通过一系列刮板式表面换热器(scraped surface heat exchangers)、销钉式搅拌器(pin mixers)和静止试管(resting tubes)(分别为A、B和C单元)以达到所需的填充温度和稠度。
实施例7 甜酥饼面团(cookie dough) 根据本发明，本发明的SDA油还可以开发包括甜酥饼的食品产品。下面提供用于此类应用的一种配方。
表19 重组植物制备 一种重组制备感兴趣蛋白的方法可以将编码转基因蛋白的核酸引入宿主细胞。重组宿主细胞可以用于制备转基因蛋白，包括可以在目标植物的种子、籽皮或其他部分中分泌或保持的合意的脂肪酸(如SDA)。编码转基因蛋白的核酸可以例如通过同源重组引入宿主细胞。在大多数情况下，将编码感兴趣的转基因蛋白的核酸整合到重组表达载体中。
具体来说，本发明还涉及转基因植物和转化的宿主细胞，其包含以5’至3’方向的可操作连接到异源结构核酸序列的启动子。还可以将额外的核酸序列与启动子和结构核酸序列一起引入植物或宿主细胞。这些额外的序列可以包括3’转录终止子、多聚腺苷酸化信号、其他未翻译核酸序列、转运序列或靶向序列、可选择的标记物、增强子和操作子。
上文描述了本发明的优选核酸序列，包括重组载体、结构核酸序列、启动子和其他调控元件。制备此类重组载体的方法是本领域所熟知的。例如，制备特别适于植物转化的重组载体的方法描述于美国专利No.4940,835和4,757,011中。
可用于在细胞和高等植物中表达核酸的典型载体在本领域内是熟知的，并且包括源自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体。可用于植物转化的其他重组载体也已在文献中有所描述。
转化的宿主细胞一般可以是与本发明相匹配的任何细胞。转化的宿主细胞可以是原核细胞，更优选为细菌细胞，甚至更优选为土壤杆菌属(Agrobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(pseudomonas)细胞，并且最优选为大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。或者，转化的宿主细胞优选为真核细胞，更优选为植物、酵母或真菌细胞。酵母细胞优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)或毕赤酵母(Pichia pastoris)。植物细胞优选为紫花苜蓿、苹果、香蕉、大麦、豆、嫩茎花椰菜、卷心菜、油菜、胡萝卜、木薯、芹菜、柑橘、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、大蒜、葡萄、亚麻籽、瓜、燕麦、橄榄、洋葱、棕榈、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、萝卜、菜籽(非低芥酸菜籽)、大米、黑麦、高粱、大豆、菠菜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、烟草、西红柿或小麦细胞。转化的宿主细胞更加优选为油菜、玉米或大豆细胞；并且最优选为大豆细胞。大豆细胞优选为优良大豆细胞品系。“优良品系”是由育种和对优良农学性能的选择而得到。
本发明的转基因植物优选为紫花苜蓿、苹果、香蕉、大麦、豆、嫩茎花椰菜、卷心菜、油菜、胡萝卜、木薯、芹菜、柑橘、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、大蒜、葡萄、亚麻籽、瓜、燕麦、橄榄、洋葱、棕榈、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、萝卜、菜籽(非低芥酸菜籽)、大米、黑麦、红花、高粱、大豆、菠菜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、烟草、西红柿或小麦植物。转化的宿主植物更加优选为油菜、玉米或大豆细胞；并且这些中最优选的是大豆植物。
制备转基因植物的方法 本发明还涉及制备能够产生实质量的SDA的转基因植物的方法，该转基因植物包含5’至3’方向的与异源结构核酸序列可操作连接的启动子。包含SDA序列的核酸序列被翻译并转录成氨基酸形式。其他结构核酸序列也可以与启动子和结构核酸序列一起引入植物。这些其他结构核酸序列可以包括3’转录终止子、3’多聚腺苷酸化信号、其他未翻译核酸序列、转运序列或靶向序列、可选择的标记物、增强子和操作子。
该方法一般包括选择合适的植物细胞，用重组载体转化植物细胞，获得转化的宿主细胞，以及在有效产生植物的条件下培养转化宿主细胞。
本发明的转基因植物一般可以为任何类型的植物，优选具有农艺、园艺、观赏、经济或商业价值的植物，并且更优选为紫花苜蓿、苹果、香蕉、大麦、豆、嫩茎花椰菜、卷心菜、油菜、胡萝卜、木薯、芹菜、柑橘、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、花旗松、桉树、大蒜、葡萄、火炬松、亚麻籽、瓜、燕麦、橄榄、洋葱、棕榈、欧洲防风草(parsnip)、豌豆、花生、胡椒、白杨、马铃薯、萝卜、辐射松、菜籽(非低芥酸菜籽)、大米、黑麦、红花、高粱、南方松、大豆、菠菜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、枫香(Sweetgum)、茶、烟草、西红柿、草皮或小麦植物。转化的植物更优选为油菜、玉米或大豆细胞；并且最优选为大豆植物。大豆植物优选为优良大豆植物。优良植物是来自优良品系的任何植物。优良品系在上文有所描述。
从转化的植物原生质体或外植体的再生、发育和培养植物在本领域中被充分教导(Gelvin等人，PLANT MOLECULAR BIOLOGY MANUAL，(1990)；以及Weissbach和Weissbach，METHODS FOR PLANTMOLECULAR BIOLOGY(1989))。在该方法中，转化子一般在选择性培养基的存在下培养，所述培养基选择成功转化的细胞并诱导所需植物枝条的再生。这些枝条通常在2个月至4个月内获得。
然后将枝条转移到适当的根诱导培养基中，该培养基含有选择性试剂和防止细菌生长的抗生素。许多枝条将发育根。然后将这些移植到土壤或其他培养基中以使根继续发育。所概述的方法一般根据具体所采用的植株而变化。
优选地，再生的转基因植物为自花传粉的，以提供纯合的转基因植物。或者，得自再生转基因植物的花粉可以与非转基因植物(优选经济上重要物种的近交系)杂交。相反，来自非转基因植物的花粉可用于对再生的转基因植物授粉。
转基因植物可以将编码感兴趣蛋白的核酸序列传递给其后代。转基因植物优选就编码感兴趣蛋白的核酸而言是纯合的，并且作为有性繁殖的结果将该序列传递给其所有的后代。后代可以由转基因植物所产生的种子长成。然后这些另外的植物可以自花传粉，以产生植物的纯育品系。
对来自这些植物的后代评价基因表达等。基因表达可以通过一些常用方法检测(如，蛋白质印记、免疫沉淀和ELISA)。
调控序列包括在许多类型的宿主细胞中指导(direct)核苷酸序列的组成性表达的那些；仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列的表达的那些(如，组织特异性调控序列)；和以可调控的方式(如，仅在诱导剂的存在下)指导表达的那些。本领域的技术人员将了解，表达载体的设计可以取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需转基因蛋白的表达水平等因素。可以将转基因蛋白表达载体引入宿主细胞，从而产生核酸编码的转基因蛋白。
本文所用的术语“转化”和“转染”是指将外来核酸(如，DNA)引入宿主细胞的各种本领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染、电穿孔、显微注射和病毒介导的转染。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以参见Sambrook等人(MolecularCloningA Laboratory Manual，第二版，Cold spring harbor Laboratorypress(1989))和其他实验室手册。
本领域的技术人员可以参考用于详细描述本文所讨论的已知技术或等同技术的一般参考文献文本。这些文本包括Ausubel等人，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(编辑，John Wiley & Sons，N.Y.(1989))；Birren等人，GENOME ANALY SISA LABORATORYMANUAL 1ANALYZING DNA，(Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1997))；Clark，PLANT MOLECULAR BIOLOGYALABORATORY MANUAL，(Clark，Springer-Verlag，Berlin，(1997))；以及Maliga等人，METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY，(ColdSpring Harbor，N.Y.(1995))。当然，制备或使用本发明的某一方面时也可以参考这些文本。应了解，本发明的任何试剂都可以为基本纯化的和/或有生物活性的和/或为重组体。
亚油酸的减少 已知ω-3和ω-6脂肪酸是人体营养所需的脂肪酸。ω-6脂肪酸包括亚油酸及其衍生物。这些油被认为是人体营养所必需的，因为这些脂肪酸必须在膳食中消费，这是由于人不能从其他的膳食脂肪或营养素制造它们，并且它们不能在体内储存。这种脂肪酸提供能量，并且还是神经细胞、细胞膜的成分，且被转化成称为前列腺素的激素样物质。
参见图1，亚油酸是含有两个双键的18-碳长链多不饱和脂肪酸。其第一个双键位于自ω端的第六个碳上，因而将其归类为ω-6油。随着亚油酸在人体内吸收和代谢，它被转化成衍生脂肪酸，γ亚油酸(GLA)，该脂肪酸被转化成二-高-γ-亚油酸(DGLA)和花生四烯酸(AA)。然后，DGLA和AA通过添加2个碳分子和去除氢分子而转化成两类前列腺素。存在三种前列腺素家族，PGE1、PGE2和PGE3。DGLA转化成PGE1，而AA转化成PGE2。PGE3通过ω-3脂肪酸的转化生成。
在人类中，ω-6油相对于ω-3油消耗的过度消耗可能导致产生炎症的前列腺素(PGE2)的过量产生，以及抗炎性前列腺素(PGE1和PGE2)的缺乏。这继而可能导致各种其他的健康问题。进一步讲，由于在目前市售的普通烹调植物油和加工食品中存在ω-6脂肪酸，消费者对ω-6脂肪酸的日消耗量可能是过量的。在西方的膳食中，ω-6与ω-3脂肪酸的消耗比率通常可以达到20∶1。为达到更合意的比率，本发明的一个实施方式在转基因含油种子植物中增加了SDA的产生，同时降低了LA的产生。所得的油含有较低含量的LA，同时提供显著量的SDA，并且在食品工业中可用于从烹调油到食品成分的各种用途。
生育酚含量的提高 生育酚是在植物油中发现的膳食中的天然抗氧化剂和必需营养素。这些抗氧化剂保护细胞膜和身体的其他脂溶性部分(如低密度脂蛋白(LDL)胆固醇)不受损害。其还似乎保护身体抵抗心血管疾病和某些形式的癌，并且显示免疫增强作用。根据本发明，增强转基因含油种子植物的油中生育酚的存在量对该油的消耗者将是有益的。相对于本发明的目的，在本发明各种实施方式中存在浓度提高的生育酚作为油产品的一部分将是有益的，并且还可以降低SDA的氧化。
尽管为了理解，上述发明已经通过具体说明和实施例较详细地进行了描述，但是对本领域技术人员显而易见的是，可以进行某些变化和修改。因此，说明和实施例不应理解为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求描述。
因此，应当理解，在此提供了用于食品的改进的SDA来源的本发明实施方式不应当限于具体的实施例。这些实施例说明本发明普遍适用于各种各样食料。在包含SDA的情况下，这些食品以相同的或更好的感官品质制造，同时显著提高了为人类消费而生产的食品的营养品质。
此外，本文所提供的实施例仅举例说明本发明原则的应用。根据上述说明，显然所公开的源自植物的要素的形式、使用方法和应用上的变化可用于不直接与人类消费有关的应用。包括在该领域中的是源自植物的SDA用于开发动物生产行业中使用的营养增强饲料的应用，其通常包括但不限于牛肉生产、家禽生产、猪肉生产；和或水产养殖。可以在不背离本发明的精神或所附权利要求的范围下采取这些变体的应用。
引用和并入作为参考的文献
通过相关引用它们所提供的补充步骤或其他细节将这些参考文献具体并入。
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申请
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发明者理查德·S·威尔克斯 申请人:孟山都技术有限公司