专利名称：：构象约束多肽序列的组合文库的制作方法构象约束多肽序列的组合文库发明领域本发明涉及构象约束多肽序列(conformationallyconstrainedpolypeptidesequence)的组合文库(combinatoriallibrary)及其用途。具体地，本发明涉及构象性表位(conformationalepitope)的组合文库及其用途。
背景技术：
：限定单克隆抗体结合位点的需要已经导致表位文库的开发。如此，Parmley和Sm池，Gene73:305318(1988)开发了噬菌体表达载体，其可用于构建大的噬菌体集合，所述噬菌体在其表面上展示短的肽序列。然后可通过生物淘选来纯化展示外来表位的噬菌体，如例如由Parmley和Smith,见上文；Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:63786382(1990);Scott和Smith,Science249:386390(1990);Christian等，J.Mol.Biol.227:711718(1992);Smith和Scott,MethodsinEnzymology217:228257(1993)所记载的。随后此技术延伸至通过生物淘选表位文库来鉴定抗体的肽配体，所述肽配体可在例如疫苗开发和表位作图中使用(Scott,J.K.,TrendsinBiochem.Sci.17:241245(1992)。用于生物淘选表位文库的已知方法已经导致了短的(通常长至约6个氨基酸)线性表位序列或不存在于天然蛋白质序列内而是模拟天然线性表位的肽序列的鉴定。然而，线性表位是不连续的或构象性的表位的片段，而且具有比它们为其中一部分的构象性表位低的功能效力。因此，会想要展示构象性表位或模拟构象性表位的本质特性，后者通过接近地放置采取或近似构象的不连续表位而由于其结构支持元件(structuralsupportelement)的4妄近性或存在来实现。此类构象性表位文库可包括所有构象性表位的物理上可选择的展示(physicallyselectabledisplay),用于选择针对所有构象性表位的抗体，并会具有许多别的益处和效用。发明概述本发明至少部分基于如下认识，即接近地放置不连续表位和/或使用结构支持元件能重建构象性表位的本质特性，而且类似的方法可延伸至重建蛋白质的其它三维结构或功能元件，诸如受体的配体结合区、酶的底物结合区等。如此，一方面，本发明涉及一种物理上可选择的展示，其包含一种或多种天然或变异多肽的离散或随机片段的串联或多聚体装配物(tandemormultimericassembly),或模拟所述片段的序列的串联或多聚体装配物，其中至少一些所述装配物形成构象约束多肽靶物，并且其中至少一些所述片段不同于抗体片段。另一方面，本发明涉及一种筛选方法，包括Ca)提供物理上可选择的展示，其包含一种或多种天然或变异多肽的离散或随机片段的串联或多聚体装配物，或模拟所述片段的序列的串联或多聚体装配物，其中至少一些所述装配物形成构象约束多肽靶物，并且其中至少一些所述片段不同于抗体片段；(b)使所述展示与候选结合配偶体的文库在如下条件下接触，其中彼此具有结合亲和力的构象约束多肽靶物和候选结合配偶体形成靶物-结合配偶体复合物；并(c)检测至少一些所形成的靶物-结合配偶体复合物。在一个实施方案中，所述方法可包括额外的步骤(d)鉴定参与至少一些所检测出的靶物-结合配偶体复合物形成的靶序列。在另一个实施方案中，鉴定参与所有所检测出的靶物-结合配偶体复合物形成的靶序列。在又一个实施方案中，所述候选结合配偶体是抗体、抗体片段或抗体模拟物。在一个进一步的实施方案中，另外鉴定参与至少一些所述靶物-结合配偶体复合物形成的抗体、抗体片段或抗体模拟物序列。在一个更进一步的实施方案中，上述方法进一步包括在步骤(d)之前富集和分开参与至少一些所述耙物-结合配偶体复合物形成的靶序列和抗体、抗体片段或抗体模拟物序列的步骤。在一个别的实施方案中，所述方法进一步包括在所述富集和分开之后且在步骤(d)之前独立地回收参与至少一些所述靶物-结合配偶体复合物形成的耙序列和抗体、抗体片段或抗体模拟物序列的步骤。在一个不同的实施方案中，参与至少一些所述耙物-结合配偶体复合物形成的靶序列是构象性表位的一部分。又一方面，本发明涉及一种方法，包括(a)提供物理上可选择的展示，其包含一种或多种天然或变异多肽的离散或随机片段的串联或多聚体装配物，或模拟所述片段的序列的串联或多聚体装配物，其中至少一些所述装配物形成构象性表位；(b)使所述展示与抗体文库在如下条件下接触，其中彼此具有结合亲和力的构象性表位和抗体文库成员形成构象性表位-抗体复合物；并(c)检测至少一些所形成的构象性表位-抗体复合物。在一个具体的实施方案冲，所述构象性表位是通过基因片段或其模拟物的串联或多聚体装配物的表达而获得的。在另一个实施方案中，所述基因片段起源于靶定的生物学相关来源，其中所述靶定的生物学有关来源可以例如选自下组细胞、组织、器官和生物体。其它生物学有关来源包括干细胞、活化的免疫细胞、患病的组织、器官和病理性生物体。在一个进一步的实施方案中，通过分析靶定的生物学有关来源中的基因表达数据来鉴定至少一些所述基因片段。下列具体的实施方案应用于本发明的所有方面。在所有方面，优选的物理上可选择的展示是构象性表位文库。在多个实施方案中，所述展示可含有超过一种天然或变异多肽的离散或随机片段的串联或多聚体装配物，或模拟此类片段的序列的串联或多聚体装酉己4勿。在其它实施方案中，至少一些所述串联或多聚体装配物包含两种或更多种来自相同多肽的不同部分的序列，其中所述序列可包括胞内序列。在一个具体的实施方案中，每个串联或多聚体装配物包含两种或更多种来自相同多肽的不同部分的序列，其中所述序列可包括胞内序列。在一个进一步的实施方案中，所述串联或多聚体装配物包含抗体或抗体片段，和抗体或抗体片段的配体。在进一步的实施方案中，在所述串联或多聚体装配物中，至少一些所述片段或模拟序列是彼此直接融合的。在不同的实施方案中，在所述串联或多聚体装配物中，至少一些所述片段或模拟序列是由外源连接序列偶联的。在别的实施方案中，在所述串联或多聚体装配物中，至少一些所述片段或模拟序列由结构支持元件组成或包含结构支持元件，所述结构支持元件可以是例如一种或多种蛋白质家族的特征性基序，诸如螺旋束(helicalbundle)、卩-片层结构(卩-sheetstructure)、三叶结构(trifoilstructure)、跨膜螺旋(membrane-spanninghelix)、或月包夕卜环(extracellularloop)。在另一个实施方案中，至少一些所述构象约束多肽靶物是由于所述串联或多聚体装配物中所存在的所述片段的接近性而形成的。或者/另外，至少一些所述构象约束多肽靶物可以是由于所述串联或多聚体装配物中所述结构支持元件的存在而形成的。在所有方面，可使用合适的展示系统来展示构象约束多肽靶物和/或候选结合配偶体，所述合适的展示系统包括但不限于病毒的、真核生物的和细菌的及体外展示系统，诸如例如噬菌体、哺乳动物、酵母、细菌细胞和孢子展示系统、核糖体、mRNA和DNA展示。在一个具体的实施方案中，孢子展示系统是枯草芽孢杆菌CSacz7/ws或苏云金芽孢杆菌CSac/〃wf/z駅77g7'e肌》孑包子展示。在所有方面，抗体片段可以是但不限于Fab、Fab，、F(ab，)2、scFv、(scFv)2、和dAb片段、线性抗体、单链抗体分子、迷你抗体(minibody)、双抗体(diabody)、或由抗体片段形成的多特异性抗体，而抗体模拟物可以是例如亲和体(affibody)或适体(aptamer)。本发明进一步涉及用于制备本文中物理上可选择的展示的方法和手段，包括但不限于合适的编码序列、载体、和重组宿主细胞。附图简述图l显示了用于在本发明的展示中呈现构象性表位的两种方法。在第一种方法(类型I)中，两个多肽片段由柔性接头(flexiblelinker)彼此连接，并与展示媒介物系在一起(tethered)。在此情况中，由两种片段的接近性和折叠能力(由于柔性连接接头)来促进构象性表位的形成。在第二种方法(类型II)中，两个多肽片段由结构支架连接，并与展示媒介物系在一起，其中由结构支架来促进构象性表位的形成。图2显示了用于同时选择构象性表位和抗体文库的方法，其中使用孢子展示来呈现构象性表位文库，而抗体文库是噬菌粒文库。图3显示了促红细胞生成素(EPO)交换环(crossoverloop)、促血小板生成素(TPO)交换环和EPO/TPOC-D交换环嵌合构建体，其可用于呈现EPO和/或TPO的构象性表位。图4显示了使用图3中所显示的EPO/TPOC-D交换环嵌合构建体来鉴定构象性表位指导的针对促血小板生成素(TPO)的抗体，接着选择也在图3中所显示的天然TPO交换环。图5显示了配体诱导的构象性表位稳定化，其使用系在一起的抗原-抗体展示来实现。图6显示了用于同时选择构象性表位和抗体文库的方法，其中使用噬菌体展示来呈现这两种文库。发明详述A.定义除非另有定义，本文中所使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常理解相同的含义。Singleton等，DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology第2版，J.Wiley&Sons(NewYork,NY1994)为本领域技术人员提供了本申请中所使用的许多术语的一般指导。本领域技术人员会认识到与本文中所描述的方法和材料类似的或等同的许多方法和材料，它们能在本发明的实施中使用。确实，本发明决不局限于所描述的方法和材料。出于本发明的目的，下文定义了如下术语。术语"表位"，如本文中所使用的，指至少约3-5个、优选至少约5-10个或至少约5-15个氨基酸，且通常不超过约500个或约1,000个氨基酸的序列，所述氨基酸限定如下序列，其自身或作为更大序列的一部分而结合应答所述序列所生成的抗体。表位不限于具有与衍生其的亲本蛋白质那部分相同的序列的多肽。确实，病毒基因组处于不断变化的状态，而且在隔离群之间展现出相对高度的变异性。如此，术语"表位"涵盖与天然序列相同的序列，以及对天然序列的修饰，诸如删除、替代和/或插入。一般而言，此类》务饰本质上是保守的，但还涵盖非保守的修饰。该术语明确包括"模拟表位"(mimotope)，即如下序列，其不鉴定连续的线性天然序列或不必在天然蛋白质中存在，但在功能方面模拟天然蛋白质上的表位。术语"表位"明确包括线性和构象性表位。如本文中所使用的，术语"构象性表位"指由蛋白质的不连续部分所形成的，具有正确折叠的全长天然蛋白质中相应序列的结构特征的表位。限定表位的序列(包括构成构象性表位的不连续部分的序列)的长度可以有极大的变化，因为这些表位是由蛋白质的三维结构所形成的。如此，限定表位的氨基酸可以是数目上相对较少的，沿着分子的长度广泛地分散，经由折叠而变成正确的表位构象。限定表位的残基之间的蛋白质部分对于表位的构象结构可能不是至关重要的。例如，对这些居间序列的删除或替代可能不影响构象性表位，只要维持对表位构象至关重要的序列。如此，"构象性表位"，如本文中所定义的，不要求与天然构象性表位相同，而是包括重建(展现)天然构象性表位的本质特性(诸如定性的抗体结合特性)的构象约束结构。"线性表位"是不连续的或构象性的表位的片段。给定多肽中包括表位的区域可使用本领域中公知的许多表位作图技术来鉴定。参见侈'B口EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology,巻66(GlennE.Morris,编，1996)HumanaPress,Totowa，N.J。短语"构象约束多肽靶物，，指由蛋白质的不连续部分或不存在于天然蛋白质中的人工序列所形成的，具有正确折叠的全长天然蛋白质中相应序列的结构特征的结合序列。该术语明确包括构象性表位，但还有受体、酶及其它蛋白质的结合区(袋)，包括模拟此类结合区的序列。在所有情况中，限定构象约束多肽靶物的序列可以有极大的变化，因为这些构象约束结合区是由蛋白质的三维结构所形成的。如此，限定构象约束多肽靶物的氨基酸可以是数目上相对较少的，沿着分子的长度广泛地分散，经由折叠而变成正确的构象。限定结合区的残基之间的蛋白质部分对于构象结构可能不是至关重要的。例如，对这些居间序列的删除或替代可能不影响构象性结合区，只要维持对正确的构象至关重要的序列。如此，"构象约束多肽靶物"，如本文中所定义的，不要求与存在于天然蛋白质中的结构元件相同，而是包括重建(展现)此类天然结构的本质特性(诸如结合特性)的构象约束结构。术语"结合配偶体"在本文中以最广义使用，指在体外和/或体内条件下能够通过共价连接或通过非共价结合而彼此连接的两个或更多个多肽序列。此类结合配偶体的例子包括但不限于抗体与抗原、配体与受体、酶与底物、有配体的抗体(ligandedantibody)与识别此类有配体的抗体的抗免疫球蛋白抗体、抗独特型抗体与它所结合的抗体，它们可以是分离的，或者是它们存在于其中的或将它们导入其中的细胞、组织、器官或生物体的一部分。可通过超过两个结合配偶体的结合而发生结合。通过"结合配偶体复合物"或"靶物-结合配偶体复合物"指以特定的可检测的方式彼此连接的两个或更多个结合配偶体(如上文所定义的)(诸如耙物与结合所述耙物的分子)的结合；如此，例如，配体与受体、抗体与抗原、酶与底物、抗体与抗独特型抗体、有配体的抗体与结合它的抗体的结合。术语"固体支持物"在用于本文时指可连接靶物及其候选结合配偶体和耙物-结合配偶体复合物的不溶性基质。固体支持物本质上通常是生物学的，诸如但不限于细胞、孢子、或病毒或噬菌体颗粒。术语"偶联物"、"经偶联的"和"偶联"指任何和所有形式的共价或非共价键，而且包括但不限于直接的遗传融合或化学融合、经由接头或交联剂的偶联、和非共价结合，例如使用亮氨酸拉链。术语"串联或多聚体装配物"、"串联装配物"和"多聚体装配物，，以最广义使用，指通过任何手段(包括偶联(如上文所定义的)或通过络合)而彼此结合的两个或更多个多肽片段，其中所述"片段"可以与天然多肽的一部分相同和/或可以是不存在于天然多肽靶物中的人工序列。"串联装配物"指两个片段的结合，而"多聚体装配物"指超过两个片段的结合。术语"融合/融合物"在本文中用于指一条多肽链中不同起源的氨基酸序对其末端之一的融合/融合物之外，术语"融合/融合物"明确涵盖内部的融合/融合物，即在多肽链内插入不同起源的序列。如本文中所使用的，术语"肽"、"多肽"和"蛋白质"均指通过共价"肽连接，，而连接的氨基酸一级序列。一般而言，肽由少许氨基酸组成，通常约2个至约50个氨基酸，并且短于蛋白质。术语"多肽"，如本文中所定义的，涵盖肽和蛋白质。在本发明的语境中，术语"抗体，，(Ab)以最广义使用，包括展现出对特定抗原的结合特异性的多肽以及缺乏抗原特异性的免疫球蛋白和其它抗体样分子。后一类多肽例如由淋巴系统以低水平生成，和由骨髓瘤以升高的水平生成。在本申请中，术语"抗体"明确涵盖但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段。"天然抗体"通常是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的，大约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过共价二硫键与重链相连，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有所变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在一端具有一个可变域(VH),接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(VL),另一端是一个恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链可变域与重链可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变域之间形成界面，Chothia等，J.Mol.Biol.186:651(1985);Novotny和Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:4592(1985)。关于抗体链的术语"可变的"用于指抗体链中在抗体间序列差异广泛且参与每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的部分。此变异性集中于轻链和重链可变域两者中称作高变区的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各包含四个FR(分别是FR1、FR2、FR3和FR4)，它们大多采取(3-片层构造，通过形成环状连接且在有些情况中形成P-片层结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md.(1991),第647-669页)。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞毒性中的参与。术语"高变区"在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基(即轻链可变域中的残基30-36(Ll)、46-55(L2)和86-96(L3)及重链可变区中的残基30-35(Hl)、47-58(H2)和93-101(H3);MacCallum等，JMolBiol.1996)。术语"框架区"指抗体可变区中存在于更趋异的CDR区之间的本领域公认部分。此类框架区通常称为框架l-4(FR1、FR2、FR3和FR4),并为在三维空间中保持重链或轻链抗体可变区中找到的三个CDR提供支架，使得CDR能形成抗原结合表面。抗体根据其重链恒定域的氨基酸序列可分为不同的类。有五大类抗体IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中一些可进一步分成亚类(同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称为a、5、e、y和P。来自任何脊推动物物种的抗体的"轻链"根据其恒定域的氨基酸序列可归入两种截然不同的型之一，称作卡帕(K)和拉姆达(X)。"抗体片段"包含全长抗体的一部分，一般是其抗原结合域或可变域。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab，、F(ab，)2、scFv、(scFv)2、dAb和互补决定区(CDR)片段、线性抗体、单链抗体分子、迷你抗体、双抗体、由抗体片段形成的多特异性抗体，及一般而言，至少含有免疫球蛋白中足以将特异性抗原结合赋予多肽的部分的多肽。术语"单克隆抗体"用于指由B细胞的单一克隆合成的抗体分子。修饰语"单克隆"指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。如此，单克隆抗体可通过最初由Kohler和Milstein，Nature256:495(1975);Eur.J.Immunol.6:511(1976)记载的杂交瘤方法来制备，可通过重组DNA技术来制备，或者还可从噬菌体或其它抗体文库分离。术语"多克隆抗体"用于指由B细胞群体合成的抗体分子群体。"单链Fv"或"sFv"抗体片段包含抗体的Vh和Vl域，其中这些域存在于一条多肽链中。一般而言，FV多肽在VH和VL域之间进一步包含多肽接头，使得sFv能够形成结合抗原的期望结构。关于sFv的综述参见Pliickthun，于ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113巻,Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，NewYork,第269-315页，1994。单链抗体披露于例如WO88/06630和WO92/01047。双抗体是二价的双特异性抗体，其中在一条多肽链上表达VH和Vj或，但使用过短的接头使得同一条链上的两个域之间不能配对，由此迫使域与另一条链的互补域配对，产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger，P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:64446448(1993);及Poljak,R.J.等，Structure2:11211123(1994))。术语"迷你抗体"用于指自我装配成80kDa的二价二聚体(scFv-CH3)2的scFv-CH3融合蛋白。术语"适体，，在本文中用于指以高特异性和亲和力结合蛋白质靶物的合成的核酸配体。已知适体是蛋白质功能的有力抑制剂。术语"亲和体"用于指工程化的、靶物特异性的非免疫球蛋白结合蛋白，其通常基于自葡萄球菌蛋白A衍生的Z域的三螺旋支架。58个氨基酸的Z域衍生自金黄色葡萄球菌0Sto;/2y/ococcwawww力蛋白A(SPA)中的5个同源域之一(B域)。SPA强烈地结合免疫球蛋白的Fc区，并且Z最初开发为稳定化的基因融合配偶体，用于通过^f吏用含有IgG的树脂来亲和纯化重组蛋白。SPA的B域和Fc片段之间的复合物的结构显示了结合表面由螺旋1和2上暴露的残基组成，而螺旋3不直接参与结合。亲和体通常选自组合文库，其中通常使螺旋l和2的Fc结合表面处的13个残基随机化。然后通过针对想要的靶物生物淘选噬菌体展示文库来鉴定靶蛋白的特异性结合物。在多种生物化学测定法和临床应用中，此类亲和体可作为免疫球蛋白的备选使用。dAb片段(Ward等，Nature341:544546(1989))由Vh域組成。可以将一个或多个CDR共价地或非共价地掺入分子中以使其成为"免疫粘附素"。免疫粘附素可掺入CDR作为更大多肽链的一部分，可共价地将CDR连接至另一多肽链，或可非共价地掺入CDR。CDR容许免疫粘附素特异性结合感兴趣的特定抗原。如本文中所使用的，术语"抗体结合区"指免疫球蛋白或抗体可变区中能够结合抗原的一个或多个部分。通常，抗体结合区是例如抗体轻链(VL)(或其可变区)、抗体重链(VH)(或其可变区)、重链Fd区、组合的抗体轻链和重链(或其可变区)，诸如Fab、F(ab，)2、单域、或单链抗体(scFv)、或全长抗体，例如IgG(例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgAl、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。术语"氨基酸"或"氨基酸残基"通常指具有其本领域公认的定义的氨基酸，诸如选自下组的氨基酸丙氨酸(Ala);精氨酸(Arg);天冬酰胺(Asn);天冬氨酸(Asp);半胱氨酸(Cys);谷氨酰胺(Gln);谷氨酸(Glu);甘氨酸(Gly);组氨酸(His);异亮氨酸(Ile);亮氨酸(Leu);赖氨酸(Lys);曱硫氨酸(Met);苯丙氨酸(Phe);脯氨酸(Pro);丝氨酸(Ser);苏氨酸(Thr);色氨酸(Trp);酪氨酸(Tyr);和缬氨酸(Val)，尽管在想要时可使用经修饰的、合成的、或罕见的氨基酸。如此，37CFR1.822(b)(4)中所列出的经修饰的和不常见的氨基酸明确包括在此定义之内，并且通过提及而明确收入本文。氨基酸可细分成多个亚组。如此，氨基酸可分组为具有非极性侧链(例如Ala、Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Val);带负电荷的侧链(例如Asp、Glu);带正电荷的侧链(例如Arg、His、Lys);或不带电荷的极性侧链(例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr)。氨基酸还可分组为小的氨基酸(Gly、Ala)、亲核性氨基酸(Ser、His、Thr、Cys)、疏水性氨基酸(Val、Leu、Ile、Met、Pro)、芳香族氨基酸(Phe、Tyr、Trp、Asp、Glu)、酰胺(Asp、Glu)和碱性氨基酸(Lys、Arg)。术语"多核苷酸"指核酸，诸如DNA分子和RNA分子及其类似物(例如使用核苦酸类似物或使用核酸化学所生成的DNA或RNA)。在想要时，多核苷酸可例如使用本领域公认的核酸化学以合成方法制备或使用例如聚合酶以酶法制备，并且若想要的话，可进行修饰。典型的修饰包括曱基化、生物素化及其它本领域^^知修饰。另外，核酸分子可以是单链的或双链的，并且若想要的话，可连接至可检测模块。除非另有说明，术语"诱变"指用于改变多核苷酸或多肽序列的任何本领域公认技术。优选的诱变类型包括易错PCR诱变、饱和诱变或其它定点诱变。术语"载体，，用于指能够在细胞中自主复制并可以可操作连接DNA区段(例如基因或多核苦酸)以引起所附着区段复制的rDNA分子。能够指导编码一种或多种多肽的基因表达的载体在本文中称为"表达载体"。术语"控制序列，，指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纟^因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号、和增强子。若一段核酸与另一段核酸序列处于功能性相互关系中，则它是"可操作连才妄的"。例长口，若前序列(presequence)或分泌前导(secretoryleader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein)，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的定位促进翻译，则它与编码序列可操作连接。一般而言，"可操作连接的，，意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接通过在方便的限制性位点处的连接来实现。若没有此类位点，则依照常规实践使用合成的寡核香酸游f接头或接头。百分比氨基酸序列同一性可使用序列比较程序NCBI-BLAST2(Altschul等，NucleicAcidsRes.25:3389-3402(1997))确定。NCBI-BLAST2序列比较程序可以从http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov下载，或者以其它方式从国家卫生研究所(NationalInstituteofHealth,Bethesda，MD)获得。NCBI-BLAST2使用几项搜索参数，其中所有搜索参数设成缺省值，包括例如未遮掩=是，链=全部，期望发生=10，最小低复杂性长度=15/5,多通过e值二0.01，多通过常数=25，最终缺口对比的降^氐=25,和评分矩阵-BLOSUM62。术语"亮氨酸拉链"用于指通常含有4-5个亮氨酸残基，作为保守域存在于数种蛋白质中的重复性七肽基序。亮氨酸拉链折叠为短的、平行的巻曲螺旋，并且认为负责包含它们所形成的域的蛋白质的寡聚化。术语"微阵列"指可杂交阵列元素，诸如多核苷酸探针在基底上的有序排列。短语"基因扩增"指在特定细胞或细胞系中形成基因或基因片段的多个拷贝的过程。所复制区域(一段扩增的DNA)常常称为"扩增子"。通常，所生成信使RNA(mRNA)的量即基因表达水平也按所表达特定基因生成的拷贝数的比例升高。B.详细描述用于实施本发明方法的技术在本领域中是公知的，并记载于标准实验室教科书中，包括例如Ausubel等，CurrentProtocolsofMolecularBiology,JohnWileyandSons(1997);MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版，J.Sambrook和D.W.Russell编，ColdSpringHarbor,NewYork,USA,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001;O'Brian等,AnalyticalChemistryofBacillusThuringiensis，Hickle和Fitch编,Am.Chem.Soc.,1990;Bacillusthuringiensis:biology,ecologyandsafety,T.R.Glare和M.O，Callaghan编，JohnWiley,2000;AntibodyPhageDisplay,MethodsandProtocols,HumanaPress,2001;及Antibodies,G.Subramanian编，KluwerAcademic,2004。例如，谈变可使用定点诱变进行(Kunkel等，Proc.Natl.Acad.SciUSA82:488-492(1985))。PCR扩增方法记载于美国专利No.4,683,192，4,683,202,4，800，159,和4,965，188，及数本教科书中，包括PCRTechnology:PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification,H.Erlich编，StocktonPress,NewYork(1989);及PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,Innis等编,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)。本发明涉及构象约束多肽靶物的物理上可选择的展示，诸如构象性表位文库。依照本发明，天然多肽的离散或随机片段的串联或多聚体装配物或模拟此类片段的序列的串联或多聚体装配物以可选择的方式展示，并用候选结合配偶体的文库筛选。由于它们的接近性和/或由于结构支持元件的存在，串联或多聚体装配物中所存在的、作为三维结构元件(诸如构象性表位)的一部分的片段会采取正确的构象约束三维结构，并重新创建所讨论的结构元件(诸如构象性表位)的本质特性。然后可以使用候选结合配偶体来筛选和鉴定构象约束结构。如此，可如下鉴定构象性表位，即用抗体文库筛选多肽片段的串联或多聚体装配物的可选择展示，并选择匹配的靶物-抗体集合。这样，可以针对所有蛋白质的所有可能构象性表位生成抗体。在一个更一般的方面，此方法适于平行选择构象约束多肽结构和结合配偶体，诸如抗体、支架、蛋白质、肽等。如此，本发明包括克隆可表达基因片段的串联或多聚体装配物，和针对候选结合配偶体的文库(诸如抗体文库)筛选所克隆的装配物集合。然后对匹配的靶物和结合配偶体(例如抗体)集合进行富集和分开，并可独立地对靶序列和结合(例如抗体)序列进行回收和测序。在第一步中，使用标准克隆方案序贯地将两种或更多种cDNA片段克隆入表达载体的两个或更多个克隆位点中。所述位点可以是由合成的接头(存在于能够呈现游离氨基或夢A基末端和约束环的支架上)分开的，或者在一些情况中，可以是彼此直接融合的。图l中显示了构象性片段呈现的两种代表性例子，并记载于实施例l中。在一个具体的实施方案中，参与串联或多聚体装配物的片段是彼此直接融合的，并通过表达编码融合多肽序列的核酸来生成。或者，编码序列可以由外来的可表达序列相连接，这导致其中串联或多聚体片段由外来序列相连接的多肽的表达。可表达序列包括如下肽接头，其具有足够的长度以提供柔性，并容许相连接的片段运动，使得它们能采取想要的构象，但是又足够短，以保持片段很接近地相连接，使得能诱导构象性变化。此类接头通常长约3个至约25个残基、或约5个至约20个残基、或约8个至约15个残基、或约10个至约15个残基，虽然也可以使用更长的接头，这取决于相连接的片段的性质。在另一个实施方案中，至少一个参与串联或多聚体装配物的片段是结构上受约束的，如此例如可以是螺;旋或P-片层结构，或一种或多种蛋白质家族的特征性基序，诸如螺旋束、三叶结构、跨膜螺旋或胞外环。如此，有可能将靶蛋白的单一线性或不连续序列呈现在替代支架上，使得所导入的序列采用最初蛋白质的部分或全部构象性元件。此方法的一个例子记载于实施例3中。在实施例3中例示的和图3和4中显示的促血小板生成素(TPO)和促红细胞生成素(EPO)之外，四螺旋结构(含有4束反向平行的螺旋束)是许多细胞因子的共同结构支架，诸如白介素，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL國4、IL-5、IL-6、IL-IO、IL-ll、IL-12、IL-15、IL画17、IL-18、IL-23及它们的相应家族成员，集落刺激因子(CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落剌激因子(GMCSF)，以及数种生长因子。来自一种细胞因子的参照四螺旋束可以作为结构支架用于呈现来自其它螺旋束蛋白质(诸如其它细胞因子)的表位。类似地，来自受体(诸如7次跨膜受体)的胞外环可以作为支架用于展示来自相同或不同蛋白质的表位。此方法能够对针对所有已知的四螺旋束蛋白质或以另一种定义明确的结构基序的存在为特征的蛋白质的抗体进行容易的和定向的抗体选择。或者，可以工程化改造这些支架以含有多个环、单个或多个螺旋替代、或者甚至来自任何数目靶蛋白的环和螺旋的组合。通过延伸，可以利用可溶性和单跨度蛋白质的其它保守结构元件来呈现和指导抗体对它们在关联超家族蛋白质内的关键元件的识别。如此，可以将多跨度G蛋白偶联受体的胞外域的部分嫁接至无关蛋白质支架，如实施例4中所例示的。可以在本发明的方法中4吏用的其它支架记载于Binz等，NatureBiotechnology23(10):1257-1268(2005)，在此通过提及而明确收录且完整内容。此类支架包括但不限于CTLA-4、tandamistat、纤连蛋白、新制癌菌素(neocarzinostatin)、CMB4-2、脂笼蛋白(lipocalin)、T细胞受体、蛋白A域蛋白Z、lm9、设计的AR蛋白、锌指、pVIII、鸟胰多肽、GCN4、WW域、Src同源性域3(SH3)、Src同源性域2(SH2)、PDZ域、TEM-1卩-内酰胺酶、GFP、硫氧还蛋白、葡萄球菌核酸酶、PHD指、Cl-2、BPTI、APPI、HPSTI、大肠杆菌素(ecotin)、LACI-D1、LDT-I、MTI-II、蝎毒素、昆虫防卫素A肽、EETI-II、Min-23、CBD、PBP、细胞色素8562、Ldl受体域A、y-晶体蛋白、泛蛋白、转铁蛋白、C型凝集素样域、Avimer(Avidia/Amgen)和微生物蛋白质(Amunix)。串联或多聚体片段可衍生自任何已知的多核苦酸来源，包括单一基因、分化的细胞、组织、器官或生物体。如此，例如来自特定基因的随机或想要针对想要的表位的抗体以及针对单个靶物的所有表位的抗体。此方法还提供了一种将所表达的基因转变成供抗体选择用的物理上重悬呈现的克隆集合的策略，消除了对克隆全长基因的需要。在另一个实施方案中，可以对微阵列或基因扩增研究的结果分析基因及其结构决定簇的差异表达(过表达或表达不足)。在微阵列技术的一个具体实施方案中，以密集阵列将经PCR扩增的cDNA克隆插入物应用至基底。优选的是，将至少10，000种核苷酸序列应用至基底。微阵列化的(microarrayed)基因(以每种10,000个元素(element)固定化于微芯片上的)适于在严格条件下杂交。可通过逆转录自感兴趣组织提取的RNA来掺入荧光核苷酸，从而生成荧光标记的cDNA探针。应用于芯片的经标记cDNA探针特异性地杂交至阵列上的每个DNA点。严格清洗以除去非特异性结合的探针之后，通过共焦激光显微镜检术或通过另一种检测方法(诸如CCD照相机)来扫描芯片。对每个阵列元素的杂交的定量容许评估相应的mRNA丰度。凭借双色荧光，将分开标记的、自两种RNA来源生成的cDNA4笨针成对杂交至阵列。如此，同时测定与每种指定基因对应的、来自两种来源的转录物的相对丰度。杂交的小型化规模为大量基因提供了表达样式的便利且快速的评估。已经显示了此类方法具有检测罕见转录物(其以每个细胞几个拷贝进行表达)和可再现地检测至少约两倍的表达水平差异所需要的灵敏性(Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(2):106-149(1996))。可通过商品化的设备遵循制造商的方案(诸如通过使用AffymetrixGenChip技术或Incyte的微阵列技术)来实施微阵列分析。用于大规模基因表达分析的微阵列方法的开发使系统性搜索多种肿瘤类型中的癌症分类和结果预测的分子标志成为可能。在鉴定出差异表达的决定簇(诸如相对于相同细胞类型的正常组织在患病组织(例如癌组织)中过表达或表达不足的决定簇)后，它们可进行再合成，例如通过肽合成的已知化学方法来实现。预期这种再合成方法将这些决定簇标准化，并产生具有巨大的组合可克隆成分深度的定向物理文库。从靶细胞中取得RNA或总DNA，并随后依照本发明筛选自此RNA或DNA表达的序列的串联或多聚体装配物能够鉴定来自靶组织、器官或生物体的所有表位。如此，例如，此实施方案容许鉴定针对来自干细胞、患病组织、活化的免疫细胞等的抗原决定簇的抗体。用于RNA和DNA提取的一般方法在本领域中是公知的，并披露于分子生物学的标准教科书中，包括Ausubel等,CurrentProtocolsofMolecularBiology,JohnWiley和Sons(1997)。用于从石蜡包埋组织(诸如癌症活组织检查样品)中提取RNA的方法披露于例如Rupp和Locker,LabInvest.56:A67(1987);及DeAndr6s等，BioTechniques18:42044(1995)中。具体地，可使用来自商业制造商(诸如Qiagen)的纯化试剂盒、緩沖液组和蛋白酶依照制造商的指示来分离RNA。例如，可使用QiagenRNeasy迷你柱自培养中的细胞分离总RNA。其它商品化RNA分离试剂盒包括MasterPureTM完全DNA和RNA纯化试剂盒(EPICENTRE⑧，Madison,WI)和石蜡块RNA分离试剂盒(Ambion，Inc.)。可使用RNAStat-60(Tel-测试)自组织样品分离总RNA。可通过例如氯化铯密度梯度离心来分离自肿瘤制备的RNA。克隆和表达载体在本领域中是公知的，而且是商品化的。载体构件一般包括但不限于以下一种或多种信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、及转录终止序列。适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞有原核生物、酵母、或高等真核生物(哺乳动物)细胞。合适的原核生物包括革兰氏阴性的或革兰氏阳性的生物体，例如埃希氏菌属(Esc/zeWc/z/a)(例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(五.co//))、肠杆菌属(五"&rakcfe"、欧文氏菌属(5rvWm'a)、克雷伯氏菌属(尺/e^/e〃a)、变形菌属(尸rafew力、沙门氏菌属(5Wwowe〃a)(例如鼠伤寒沙门氏菌(h/mowe〃a/y//2/附wn'wm))、沙雷氏菌属(5^raf&)(例如粘质沙雷氏菌OSerra"awa/rescara))、及志贺氏菌属(幼!'ge〃a)、以及芽孢杆菌属(5acz7/0(诸如枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(5.//c/7e"z/on7^)(例如1989年4月12日公布的DD266,710中所披露的地衣芽孢杆菌41P))、假单胞菌属(/^ewflfomowoy)(诸如铜绿假单胞菌(户aerag/"osa))、及链霉菌属(6^epto附少cey)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446),虽然其它菌抹诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X176(ATCC31，S!3"和大肠杆菌W3110(ATCC27,325)也是合适的。这些例子是例示性的而非限制性的。合适的酵母包4舌啤酒jf唐酵母或酉良酒酵母(6"acc/zflrawycascweWw'ae)或普通面包酵母。另外，许多其它属、种和菌抹是通常可获得的，而且在本文中是有用的，诸如粟酒裂殖糖酵母(&/2/20^^/7^0附>^&;70附6￡);克鲁维氏酵母属(《/w;/veramyce"宿主，诸如例如乳克鲁维氏酵母(尺./ac&)、脆壁克鲁维氏酵母(K/rag/to)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维氏酵母(尺.6w/gaWcw)(ATCC16,045)、威克曼氏克鲁维氏酵母(尺.w/cA:eraw")(ATCC24，178)、〖wa/"7(ATCC56,500)、果蝇克鲁维氏酵母(dmso//w7an/m)(ATCC36,906)、耐热克鲁维氏酵母(Awmoto/erara)、及马克斯克鲁维氏酵母(Imflr;a'朋w力；亚罗酵母属(l^roWa)(EP402,226);巴斯德毕赤氏酵母(尸/c/z/a/ayfw/力(EP183,070);，i丝酵母属(Ca"(i/(ia);瑞氏木霉(7Hc/o6fe7warees/a)(EP244,234);粗并造脉孢霉(A^wras/oracmysa);许旺氏酵母属(5b/z丽朋/o，c&s),诸如西方许旺氏酵母(5"c/7丽w"/omyc&socc/tie"/"//";及丝状真菌，诸如例如脉孢霉菌(AAewra^ora)、青霉属CPew'cz7/Zww)、弯颈霉属(7b/，oc/a&wm)和曲霉属(y^/e/^〃/w力宿主，诸如构巢曲霉(Aw'ofw/a"力和黑曲霉(Am'ger》无脊推动物多细胞生物体的例子包括植物和昆虫细胞，包括来自如下宿主的昆虫宿主细胞，诸如草地夜蛾0S^OGfc!p&ra/ragz;peWa)(毛虫)、埃及伊蚊(j^fes(蚊子)、白纟丈j尹蚊04etfesa/6opz'cfw"(蚊子)、黑腹果蝇(Dmsop/2z7awe/awogosfer)(果錄)、及家蚕(5om勿amon')。用于转染昆虫细胞的病毒抹包括例如苜蓿尺蠖G4wtogra;/zaca/z/owz'ca)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5林。还可利用棉花、玉米、马铃薯、大豆、牵牛花、番茄、及烟草的植物细胞培养物作为宿主。合适的哺乳动物宿主细胞系的例子包括但不限于经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7,ATCCCRL1651);为了在悬浮培养中生长而亚克隆的人胚肾系293(293细胞)(Graham等，J.GenVirol.36:59(1977));幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL10);中国仓鼠卵巢细胞ADHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980));小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod,23:243-251(1980));猴肾细胞(CVl,ATCCCCL70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宫颈癌细胞(HELA,ATCCCCL2);犬肾细胞(MDCK,ATCCCCL34);牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺细胞(W138,ATCCCCL75);人肝细胞(HepG2,HB8065);小鼠乳房肿瘤(MMT060562，ATCCCCL51);TRI细胞(Mather等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982));MRC5细胞；FS4细胞；及人肝瘤(hepatoma)系(HepG2)。可以在多种培养基中培养宿主细胞。商品化的培养基包括Ham氏FlO(Sigma)、极限必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、及Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)(Sigma)。另夕卜，Ham等，Meth.Enz.58:44(1979)和Bames等，Anal.Biochem.102:255(1980)中所记载的任何培养基可以用作宿主细胞的培养基。培养条件(诸如温度、pH等)就是那些先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的，而且包括在制造商的指导中或者通过其它途径对于普通技术人员会是显而易见的。在一个实施方案中，构成串联或多聚体装配物的所有片段是随机选择的。例如，可使用此方法来表达所有来自靶定群体的可表达表位。如较早所讨论的，用于展示异源蛋白质(包括抗体和其它多肽)的系统在本领域中是公知的。已经在编码抗体基因的丝状噬菌体表面上展示了抗体片段(Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol"222:381388(1992);McCafferty等，Nature348(6301):552554(1990);Griffiths等,EMBOJ"13(14):3245画3260(1994))。关于用于选择和筛选抗体文库的技术的综述，参见例如Hoogenboom，NatureBiotechnol.23(9):1105-1116(2005)。另夕卜，有本领域中已知的用于在大肠杆菌(Agterberg等，Gene88:37-45(1990);Charbit等,Gene70:181-189(1988);Francisco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:2713-2717(1992))和酵母诸如酿酒酵母(Boder和Wittrup，Nat.Biotechnol.15:553-557(1997);Kieke等，ProteinEng.10:1303-1310(1997))表面上展示异源蛋白质及其片段的系统。其它已知的展示技术包括核糖体或mRNA展示(Mattheakis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:9022-9026(1994);Hanes和Pluckthun，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4937—4942(1997))、DN樣示(Yonezawa等，Nucl.AcidRes.31(19):ell8(2003));微生物细胞展示诸如细菌展示(Georgiou等，NatureBiotech.15:29-34(1997))、哺乳动物细胞上的展示、孢子展示(Isticato等，J.Bacteriol.183:6294-6301(2001);Cheng等，Appl.Environ.Microbiol.71:3337-3341(2005)和2006年11月13日提交的共同悬而未决的临时申请流水号60/865，574)、病毒展示诸如逆转录病毒展示(Urban等，NucleicAcidsRes.33:e35(2005))、基于蛋白质-DNA连接的展示(Odegrip等，Proc.Acad.Natl.Sci.USA101:2806-2810(2004);Reiersen等，NucleicAcidsRes.33:elO(2005))和微珠(microbead)展示(Sepp等，FEBSLett.532:455-458(2002))。出于本发明的目的，多肽片段的串联或多聚体装配物(例如串联和/或多聚体抗原片段)可方便地使用孢子展示来进行展示，包括使用枯草芽孢杆菌孢子外壳成分(CorB)的表面展示系统和苏云金芽孢杆菌(份)孢子展示，如记载于Isticato等，J.Bacteriol.183:6294-6301(2001);Cheng等,Appl.Environ.Microbiol.71:3337-3341(2005);及2006年11月13日提交的共同悬而未决的临时申请流水号60/865,574的，在此通过提及明确收录它们的完整公开文本。孢子展示系统是基于将要展示的序列附着于外壳蛋白(诸如枯草芽孢杆菌孢子外壳蛋白)或附着于毒素-原毒素(诸如价原毒素序列)。孢子展示系统的优点在于非真核性质的同质颗粒表面和颗粒大小，预期提供理想的非反应性背景。另外，孢子的颗粒大小足以能够通过流式细胞术进行选择，所述流式细胞术基于相互作用而容许可选择克隆分离。通过影响孢子稳定性，有可能实施多种孢子形成后的化学的、酶的和/或环境的处理和修饰。如此，有可能使用三氟乙醇(TFE)用化学处理来稳定化结构性螺旋结构，若展示此类结构的话。另外，氧化压力处理(诸如用反应性氧种类(例如过氧化物)或反应性氮种类(例如亚硝酸)进行的处理)是可能的。还有可能将孢子展示多肽的限定的或天然的群体暴露于酶促处理，诸如蛋白水解暴露、其它酶促过程、磷酸化等。其它可能的处理包括但不限于通过过氧亚硝酸盐处理进行的亚硝基化，通过重组的、纯化的或血清蛋白酶处理进行的蛋白水解，照射，与已知的伴侣蛋白(诸如热休克蛋白(细菌的和哺乳动物的两者))一起共温育，用折叠蛋白(诸如蛋白质二硫化物异构酶、脯氨酰异构酶等)进行的处理，冻干，和防腐剂样处理(诸如用硫柳汞进行的处理)。这些处理可通过本领域中7>知的方法进行。最后，可将噬菌体展示的抗体克隆与携带关联抗原的各个孢子共同捕获至孔。这能够实现多重共分离和挽救抗原-抗体对。这也可类似地延伸至选择和挽救其它结合配偶体。简言之，在份孢子展示系统中，万源毒素序列可获自天然的价原毒素蛋白，可通过化学合成或重组DNA技术的方法生成，或通过本领域中已知的任何其它技术来生成。天然的价原毒素蛋白或其编码序列可分离自多种份亚种，诸如例如库尔斯塔克(kurstaki)亚种、松i蜀(dendrolimus)亚种、蜡螟(galleriae)亚种、杀虫(entomocidus)亚种、鲇择(aizawai)亚种、莫氏(morrisoni)亚种、多窝(tolworthi)亚种、阿莱(alesti)亚种或以色列(israelensis)亚种。如此，可通过本领域中已知的方法，使用合适的寡核苷酸引物和探针自合适的份亚种的染色体PCR扩增编码说原毒素片段的DNA。然后可通过已知技术纯化PCR产物，诸如例如通过使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)遵循制造商的指示来实现。适于克隆原毒素片段的重组宿主细胞包括原核生物、酵母或高等真核生物细胞。对于克隆和常规的质粒操作，优选的宿主是大肠杆菌。然后使用B源毒素序列在价孢子的表面上展示本发明的串联或多聚体装配物。如此，本发明还涉^Bf原毒素序列与此多肽序列串联或多聚体装配物的偶联物。本发明的串联或多聚体装配物与5源毒素序列的偶联可通过融合(优选在末端，诸如价原毒素序列的N或C端)来进行。或者，可使用合适的肽接头序列来制备偶联物。接头序列以如下距离分开所展示的装配物和A原毒素序列，所述距离足以确保每种序列能采取正确的构象(构象约束结构)，若所述序列中所存在的片段能够形成此结构的话。接头序列的长度可有所变化，并且一般在l个和约50个氨基酸之间，更通常地，长至约15个氨基酸，或长至约10个氨基酸，或长至约8个氨基酸，或长至约7个氨基酸，或长至约5个氛基酸，或长至约3个氨基酸。通过本领域中公知的方法将接头序列掺入偶联物中。为了促进所展示的分子的消除，接头可以包含作为酶(诸如蛋白酶)的底物的序列。如此，在一个具体的实施方案中，给定蛋白酶的天然底物可作为接头肽使用或包含在接头肽之中。例如，接头可以是或可以包含烟草蚀刻病毒(TEV)的底物位点(ENLYFOG)。或者，接头肽可不同于蛋白酶的天然底物，但可包含能被蛋白酶切割的序列。如此，已知的是，胰蛋白酶样蛋白酶在赖氨酸和精氨酸残基的羧基侧进行特异性切割，而胰凝乳蛋白酶样蛋白酶对酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基等处的切割是特异性的。原毒素序列与要展示的串联或多聚体装配物之间的连接可通过使用异二聚体基序来实现，其中形成二聚体的两个成分可以是结合配偶体，它们彼此共价结合，或者可经由非共价相互作用而结合。例如。共价结合可经由在结合配偶体的半胱氨酸之间形成二辟"建而发生。可打破二硫键，并释放所展示的装配物，这通过用破坏二硫键的还原剂(诸如例如二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、(3-巯基乙醇、膦、硼氢化钠等)进行的处理来实现。优选的是，使用含有硫醇基团的还原剂。可使用例如一对亮氨酸拉链肽来实现非共价的结合。亮氨酸拉链最初是在数种DNA结合蛋白中鉴定的(Landschulz等，Science240:1759,1988)。如此，亮氨酸拉链域是用于指这些蛋白质中所存在的，负责蛋白质二聚化的保守肽域的术语。亮氨酸拉链域包含重复性七肽重复，通常有4个或5个亮氨酸残基，散布有其它氨基酸。例如，亮氨酸拉链肽包括公知的c-Jun"亮氨酸拉链肽"RIARLEEKVKTLKAQNSELASTA画LREQVAQLKQKVMNY(SEQIDNO:l)和v-Fos"亮氨酸拉链肽"LTDTLQAETDQLEDKKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAY(SEQIDNO:2)。核癌基因fos和jun的产物包含优先形成异二聚体的亮氨酸拉链域(O，Shea等，Science245:646，1989;Turner和Tjian，Science243:1689，1989)。亮氨酸拉链肽的其它例子包括但不限于酵母转录因子GCN4、大鼠肝中找到的一种热稳定性DNA结合蛋白(C/EBP;Landschulz等，Science243:1681,1989)、鼠原癌基因c-myc的基因产物(Landschulz等，Science240:1759,1988)中找到的域。数种不同病毒(包括副粘病毒、冠状病毒、麻渗病毒和许多逆转录病毒)的促融合蛋白也拥有亮氨酸拉链域(Buckland和Wild,Nature338:547,1989;Britton，Nature353:394，1991;Delwat和Mosialos,AIDSResearchandHumanRetroviruses6:703，1990)。通常优选使用合成的(与天然存在的相比)亮氨酸拉链肽，因为合成的序列可设计成展现出改善的特性，诸如稳定性。为了生成本发明的融合物，可以将所扩增的所原毒素DNA片段克隆入合适质粒中，符合要展示的串联或多聚体装配物的装配物的编码序列的读码框，在合适的孢子形成特异性启动子的控制下。孢子形成特异性启动子可以但不必须获自与价原毒素片段起源相同的说亚种。可通过电穿孔将含有原毒素片段-异源多肽融合物的编码序列的质粒导入说中，基本上如Du等，Appl.Environ.Microbiol.71(6):3337-3341(2005)所记载的，遵循Macaluso和Mettus，J.Bacteriol.173:1353-1356(1991)的方法进行。靶价菌林的质粒转化后，将细胞培养于合适的培养基中以促进孢子形成。因此，份孢子会在其表面上展示存在于融合物中的异源肽或多肽。毒素展示的分子偶联物被说成是附着至孢子表面，然而，实际上毒素成分到达孢子外壳内部，因为参与本文偶联物的原毒素是孢子外壳的一部分，虽然它们不是外壳蛋白。可与在所有的孢子展示系统中使用类似的技术，包括附着于孢子外壳蛋白的展示，包括例如披露于美国专利申请公开文本No.20020150594;20030165538;20040180348;20040171065;及20040254364中的孢子展示系统。结合配偶体(诸如抗体)可有利地使用噬菌体展示来展示。在噬菌体展示中，将异源蛋白质(诸如单链抗体片段(scFv))连接至噬菌体颗粒的外壳蛋白，而表达它的DNA序列包装在噬菌体外壳之内。噬菌体展示方法的详情可见于例如McCafferty等，Nature348,552-553(1990))，该文献记载了从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因全集在体外生成人抗体和抗体片段。依照此技术，以符合读码框的方式将抗体V域基因克隆入丝状噬菌体(诸如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中，并作为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面上。由于丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能性特性的选择也导致对编码展现出那些特性的抗体的基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式实施；关于它们的综述，参见例如Johnson,KevinS.和Chiswell,DavidJ.,CurrentOpinioninStructuralBiology3,564-571(1993)。V基因区l殳的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson等，Nature352,624-628(1991)从自经免疫小鼠的脾衍生的V基因小型随机组合文库分离了一批不同的抗D恶唑酮抗体。可构建来自未免疫人供体的V基因全集，并且可分离针对一批不同抗原(包括自身抗原)的抗体，基本上遵循Marks等，J.Mol.Biol.222,581-597(1991)或Gri伍th等，EMBOJ.12,725-734(1993)所记载的技术进行。在天然的免疫应答中，抗体基因以高速率积累突变(体细胞高突变)。所导入的一些变化会赋予更高的亲和力，并且展示高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞优先在随后的抗原挑战期间复制和分化。此天然过程可通过采用称为"链改组"的技术来模拟(Marks等，Bio/Techno1.10,779-783(1992))。在此方法中，通过噬菌体的V域基因变体(全集)的全集序贯替换重链和轻链V区基因而得到改善。此技术容许生成具有在nM范围内的亲和力的抗体和抗体片段。用于制备非常大的噬菌体抗体全集的策略已经记载于Waterhouse等，Nucl.AcidsRes.21,2265-2266(1993)。图2中显示了孢子上展示的表位文库和抗体文库的噬菌体展示的同时选择。简言之，在第1步中，将孢子展示的构象性表位文库与噬菌粒抗体文库组合。通过离心来收集孢子，并洗去未结合的抗体噬菌体。接着，通过添加小鼠抗噬菌体抗体和顺磁性抗小鼠珠来除去未结合的孢子。将噬菌体-孢子复合物结合至磁性柱，然后对其进行清洗以除去未结合的孢子。这些步骤之后，可回收噬菌体-孢子复合物，可自孢子解离噬菌体，并可选择性扩增噬菌体和孢子。可根据需要重复上述步骤，通常再进行2次至4次。在第3步中，可将孢子分拣入各个微板孔中，例如通过添加小鼠抗噬菌体抗体和经可4企测标记(例如焚光)的抗小鼠抗体来实现。然后可扩增噬菌体，并增殖携带孢子展示序列的芽孢杆菌(例如苏云金芽孢杆菌)。构象性表位和抗体文库的同时选择也是有可能的，若每种使用相同的载体进行展示的话。图6中显示了用于同时选择构象性表位和抗体文库(均以噬菌体展示呈现的)的例示性方法。在第1步中，除去未结合的抗体噬菌体。首先，将由合适的标签(例如HA)标记的噬菌粒构象性表位文库与用不同的标签(例如FLAG)标记的噬菌粒抗体文库组合。通过亲和纯化来分离HA表位噬菌体和复合的抗体噬菌体，并洗去未结合的抗体噬菌体。接着，解离复合的噬菌体，并扩增表位和文库噬菌粒集合，例如使用大肠杆菌作为宿主来进行。在第2步中，除去未结合的表位噬菌体。首先，带有HA标签的噬菌粒构象性表位文库与带有FLAG标签的噬菌粒抗体文库再次组合，并通过亲和纯化来分离FLAG抗体噬菌体和复合的表位噬菌体。洗去未结合的表位噬菌体，解离复合的噬菌体，并扩增表位和文库噬菌粒集合，例如使用大肠杆菌宿主细胞来进行。虽然已经参照某些噬菌体和孢子展示系统例示了本发明，但是它不限于此。噬菌体和孢子展示系统仅是例示性的，并且其它展示(无论本文中是否明确提及)也适于实施本发明。在以下非限制性实施例中提供了本发明的进一步详情。实施例实施例l:串联装配的构象性cDNA片段(图1和图2)为了装配来自靶定群体的所有可表达表位，首先提供来自该靶定群体的所表达基因的集合。在本情况中，目标是自活化的淋巴细胞捕获所有可能的构象性表位，但是本文中所描述的方法同样适用于自任何来源捕获构象性表位。首先，通过将全血收集入BDVacutainerCP丁TM细胞制备管中来自三名个体分离外周血单个核细胞。接着，如下活化淋巴细胞，即将来自三个集合中的每个的le7细胞混合在一起，接着温育6小时。温育之后，通过Tri试剂(Sigma)自新鲜的或RNAlater稳定化的组织提取总RNA。随后，使用01igotex纯化(Qiagen)来将分离的供体总RNA进一步纯化成mRNA。接着，通过使用随机九聚物寡核苷酸和/或寡((1丁)1851物依照AccuScript逆转录酶(Stratagene)的方案来生成第一链cDNA合成。简言之，将AccuscriptRT緩沖液(Stratagene)中的100ngmRNA、0.5mMdNTP和300ng随机九聚物和/或500ng寡(dT),8引物于65。C温育5分钟，接着快速冷却至4。C。然后，添加10x逆转录酶反应緩冲液(Stratagene)、100mMDTT、AccuscriptRT和RNA酶阻断剂(RNAseBlock),并于42。C温育H、时，并通过于70。C加热15分钟来灭活逆转录酶。然后可使用标准克隆方案将这些cDNA片段序贯地克隆入表达载体的两个串联克隆位点中。串联位点或是由合成接头分开或是存在于能够呈现游离氨基或^^端和限制性环的支架上。(图l，类型I和类型II)。在本情况中，将这些所表达的串联片段以与苏云金芽孢杆菌原毒素的重组融合物的形式系至孢子表面。针对组合抗体文库筛选所得孢子展示集合以富集对活化的淋巴细胞构象性表位有反应性的克隆。为了筛选，将含有107-108个苏云金芽孢杆菌孢子的lml与10气10"个噬菌体混合，并将集合于室温温育2小时。此温育之后，通过离心来收获孢子集合和结合的抗体。离心除去所有未结合的噬菌体，得到未结合的孢子和孢子噬菌体复合物两者的集合。接着，如下正选择孢子-噬菌体复合物，即将混合物与小鼠单克隆抗噬菌体抗体和供磁性选择用的抗小鼠顺磁性纳米颗粒(Miltenyi)或供基于FACS的富集或分离用的经荧光偶联的抗小鼠抗体一起温育(图2)。然后将复合物用pH2.2甘氨酸处理10分钟，然后用2MTris中和。此酸洗脱之后，抗体-抗原相互作用受到不可逆的破坏，并且噬菌体能离开孢子，随着再次增殖和选择大肠杆菌和芽孢杆菌而扩增。或者，可挽救噬菌体和孢子编码DNA,并使用其它分子生物学技术(诸如PCR)进行扩增。3-5轮选择之后，预期抗体集合得到充分的富集以对活化的淋巴细胞进行进一步的测试或选择。为了证明特异性富集，将抗体克隆的个体或集合制备为可溶性抗体片段，并通过流式细胞术来测试其对活化的淋巴细胞群体进行染色的能力。具体地，于30。C在补充有50pg/ml氨千青霉素和100nMIPTG的2-YT中在大肠杆菌菌才朱HB2151中将200ml抗体克隆培养物培养过夜。此过夜生长之后，通过离心来收获细胞。为了分离在它们的周质中积累的抗体蛋白质，首先将细胞重悬于10mlBBS-10E(200mM硼酸、150mM氯化钠、和10mMEDTA)中。接着，添力口5mlBBS-10EL(200mM硼酸、150mM氯化钠、10mMEDTA和10mg/ml溶菌酶)，并于37。C将混合物放置在定轨摇床中达60-90分钟。此温育之后，通过离心从含有抗体的溶胞产物中除去细胞碎片。接着将此溶胞物与亲本孢子一起温育以检测对关联表位的结合。具体地，在终体积0.1ml中于室温用含有3。/。BSA的PBS封闭孢子达15分钟。向这些经封闭的孢子添加O.lml溶胞物，并将混合物于4。C温育1小时。接着，通过添加0.8mlPBS来进行清洗，然后通过离心来再次分离孢子。然后，使用小鼠单克隆抗His6抗体来检测抗体对孢子的结合，其通过于4。C温育30-60分钟来进行。另一次清洗之后，用合适的抗小鼠藻红蛋白焚光团偶联物来检测结合。可通过传统的蛋白质组学和分子生物学方法来鉴定任何特异性抗体的关联抗原。或者，可使用明确鉴定出的抗体来回收其含有构象性表位的关联孢子克隆。因为表位是在孢子携带的质粒上编码的，所以它能测序并用于自公众可获得的序列数据库鉴定亲本基因。.预期本实施例中所描述的方法为感兴趣的任何特定细胞群体或组织生成所有可能的抗原。因为这些片段是随机的，所以不仅能评估构象性表位，而且还能评估来自单种，甚至多种蛋白质的不连续表位。实施例2:单一基因构象性片段在生成针对指定抗原的抗体中，通常发现针对一种或多种免疫优势表位的体液应答。在许多情况中，想要的功能性抗体可能需要识别免疫优势较小的表位。在此情况中，通常设法用抗体封闭免疫优势表位，然后再次免疫或选择。然后的体液应答针对下一个最易接近的表位，其仍可能生成或不生成想要的抗体。因为新抗体发现的目标是生成针对功能性构象性表位的抗体，由此可见会表达这样的表位以进行选择。单一表位可能仅产生针对线性决定簇的应答，其中所得的抗体可能不识别天然蛋白质。为了提高生成针对此天然蛋白质的构象性抗体的可能性，此表位需要在一些关键结构元件的背景内进行表达以侵_接近天然蛋白质。因而，将想要的表位用合成方法装配成串联构建体的单一位点，然后用来自亲本蛋白质的片段补充第二位点。此第二片段起结构性构象催化剂的作用。在一个具体的实施方案中，用单一序列固定第一片段，然后将来自亲本蛋白质的随机片段插入第二位点中，然后将其用重组方法系至芽孢杆菌载体，诸如苏云金芽孢杆菌孢子外壳蛋白。接着，针对组合抗体文库来筛选此集合，如实施例l中所描述的。3-5轮双重选择之后，针对天然蛋白质来对此富集的抗体集合进行反选择。保留识别天然结构的结合抗体，扩增，并鉴定。预期构象催化提供一般性结构支持，其也可由相关结构替代物来提供。因此，作为第二位点的另一个选项，掺入单一基序或替代结构基序的集合以补充和"催化"构象性表位形成。在此实施例中，描述了单一表位的强制识别。然而，还可将片段随机化，使得所有可能表位的表达分开。在此情况中，可同时筛选针对单一蛋白质的所有可能表位，由此生成针对特定蛋白质的所有可能抗体解决方案。实施例3:可溶性超家族构象性抗原(图3和图4)有可能在替代支架上呈现靶蛋白质的单一线性或不连续序列，使得所导入的序列采取最初蛋白质的部分或全部构象性元件。在此实施例中，在促血小板生成素(Tpo)(—种四螺旋束细胞因子)与中和性抗体之间重新创建已知的靶物-抗体相互作用。抗Tpo抗体TNl识别来自Tpo的交换环。在将此环叠加在紧密相关的替代四螺旋束蛋白质(诸如促红细胞生成素(Epo))之上时，预期其拥有足够的结构构象，使得TN1抗体结合嵌合蛋白。具体地，构建两类Epo-Tpo环蛋白。第一种用来自Tpo的氨基酸57-61替代Epo中的氨基酸57-61。这对应于交换环。因为环的前后呈现可能是至关重要的，还制备另一种Epo-Tpo环蛋白，其额外含有来自Tpo的邻近螺旋序列。在此情况中，用来自Tpo的氨基酸53-68替代Epo中的氨基酸53-68。边界以Tpo和Epo两者中找到的保守序列限定，目的在于它们可能给交换环提供甚至更大的构象稳定性。因为TN1抗体的晶体结构已经显示了一些与B螺旋的轻微近程接触，还在Epo-Tpo突变体的背景中制备了上述两种Tpo环构建体，所述Epo-Tpo突变体含有相应的Tpo替代，即用来自Tpo的氨基酸l10-125替代Epo中的氨基酸l14-139以及用来自Tpo的氨基酸97-134替代Epo中的氨基酸102-148。以重组方式将上文所述Epo-Tpo环蛋白融合至芽孢杆菌原毒素孢子展示系统，并针对TN1抗体筛选孢子。预期这些构建体在单轮淘选中选择性结合和富集TN1抗体，超过无关阴性对照抗体。接着，我们经过3-5轮孢子淘选来针对组合抗体文库筛选富集最好的ETL蛋白。这完成之后，对所富集的抗体反选择对天然Tpo蛋白的结合。结果，鉴定出的任何抗Tpo抗体会是实际上的Tpo交换环结合物。因为许多已知的细胞因子和生长因子是具有高度可变环结构的四螺旋束蛋白质，可利用替代四螺旋束支架(诸如Epo)来展示来自已知的四螺旋束蛋白质的环的文库。此方法能够对针对所有已知的四螺旋束蛋白质的抗体进行容易的和定向的抗体选择。或者，可以工程化改造这些支架以含有多个环、单个或多个螺旋替代、或者甚至来自任何数目靶蛋白的环和螺旋的组合。通过延伸，可以利用可溶性和单跨度蛋白质的其它保守结构元件来呈现和指导抗体对它们在关联超家族蛋白质内的关键元件的识别。实施例4:多跨超家族构象性抗原——GPCR图l与实施例3类似，可以在替代支架上呈现靶蛋白的单一线性或不连续序列，使得所导入的序列部分或完全采用天然靶蛋白中找到的构象性元件。举例而言，将多跨度G蛋白偶联受体的胞外域的一部分嫁接至无关蛋白质支架。G蛋白的B1片段具有游离氨基端和近端环结构，它们分别可用来自CCR3的成熟氨基端和来自CCR3的第三胞外环替换。在先前的研究中，融合物以与全长CCR3受体类似的分级亲和力结合CCR3关联配体、嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)和突变体，虽然亲和力总体降低了1000倍(Datta，ProteinSciences巻12,页2482,ColdSpringHarborLaboratoryPress2003)。这些结果提示可;容性构建体可部分提供足够的构象性元件以模拟受体。对于对CCR3的质量对照结合，用可溶性或噬菌体展示的嗜酸细胞活化趋化因子测试B1嵌合物。具体地，用CCR3的氨基端(氨基酸1-34)和第三胞外环(氨基酸265-281)替代氨基端的两个氨基酸和插入G蛋白的B1域片段的环氨基酸18和19之间。接着，经过3-5轮富集，针对组合抗体文库筛选展示在孢子表面上的此构建体。然后针对过表达CCR3的工程化哺乳动物细胞系正选择所富集的集合。然后以重组方式表达所得的抗体克隆，纯化，然后对CCR3的结合或在嗜酸细胞活化趋化因子中和测定法中进行测试。作为第二个例子，将CCR2的氨基端和第三胞外环类似地展示于B1展示支架上，并测试对中和性抗CCR2抗体1D9的反应性。具体地，用CCR2的氨基端(氨基酸1-42)和第三胞外环(氨基酸269-285)替代氨基端的两个氨基酸和G蛋白的B1域片段的环氨基酸18和19之间。接着，经过3-5轮富集，针对组合抗体文库筛选展示在孢子表面上的此构建体。针对过表达CCR2的工程化哺乳动物细胞系正选择所富集的集合。纯化所得的克隆，并对CCR2的结合或在MCP-1中和测定法中进行测试。孢子-噬菌体筛选如实施例1中所描述的那样进行。重要的是，在这两个例子中，选择了第三胞外环，但是也可使用第一或者甚至第二胞外环代替。掺入超过一个胞外环或甚至来自这些环的近膜区的一部分可能是必需的或有利的，以便提供更多构象环境。可将类似的方法应用于具有结构基序的其它蛋白质，诸如所有的G蛋白偶联受体(GPCR)、离子通道、以及其它多5争度和其它可溶性或整合的多环蛋白质。实施例5:鉴定和生成构象性抗原的生物信息学方法先前的实施例描述了使用各个蛋白质或超家族以及随机集合的方法。重要的是，随机集合可能衍生自其呈现会由于相对表达水平而产生高度偏倚的所表达的cDNA，并且不限于蛋白质的类型或天然蛋白质上片段的易接近性。此外，在克隆随机片段中，最好的情况也只不过仅能控制取向，但不能正确阅读框架。因此，预期存在许多非生产性克隆，其在它们的氨基或羧基末端不形成正确的融合物。可经由生物信息学方法来解决这些方面中的一些。例如，代替如实施例l中所描述的自活化的淋巴细胞直接克隆所表达的基因片段，检查活化的淋巴细胞中的基因表达以找到具有改变的表达性状的感兴趣基因。作为初级滤器，我们可聚焦于那些胞外的感兴趣基因。接着，合成或挽救相应的cDNA,并克隆其片段，这与先前实施例中所描述的规程类似。结果，仅生成那些处于正确取向和框架以导致生产性融合物的片段。最终结果是筛选此集合仅产生针对胞外蛋白质的抗体。作为一个额外的生物信息学步骤，进一步检查先前所描述的感兴趣基因，并鉴定在这些蛋白质的外表面上找到的预测的溶剂化区域。然后可合成这些溶剂化区域，克隆入构象性支架中，并针对组合抗体文库进行筛选。此额外步骤仅生成蛋白质的预测的暴露区域的片段，使集合对易接近表位甚至更具生产性。任一合成方法的主要优点在于根据其它相关标准(诸如基因诱导水平或时间表达)而将基因标准化或者甚至产生定制偏倚的所得能力。此方法还可用于编码预测的胞内蛋白质的基因和分离作为胞内抗体使用的抗体。实施例6:筛选抗体抗原复合物(图5)抗体在其可变区中经由特异性相互作用而结合抗原。由于两种构件之任一或二者中的诱导契合，通常形成并维持稳定的结合。在抗体的情况中，已经显示了有配体的和没有配体的抗体在结构上是不同的。通过使用构象性表位呈现来开发此结构差异以筛选识别特性抗体-抗原复合物的抗体。在一个例子中，将抗体克隆入串联表达质粒的第一位点中，并将关联表位克隆入第二位点中。在极接近于抗体处放置抗原容许其起抗体的构象催化剂的作用。结果是适于复合物筛选的稳定的且系在一起的抗原-抗体复合物。另外，由于抗原结合诱导抗体中独特的构象变化，这种稳定的呈现容许有效鉴定有配体的特定抗独特型抗体。例如，抗c-myc抗体(9E10)可在柔性接头[(Gly4-Ser)3]的氨基端进行表达，并连接至c-myc肽表位，其以重组方式与芽孢杆菌原毒素系在一起。针对组合噬菌体抗体文库筛选所得孢子展示复合物以找到抗复合物抗体和抗有配体的抗独特型抗体。这些所得抗体之任一可用作具有9E10抗体的双特异性抗体的一条臂。组合此双特异性抗体与经胞外装饰的c-myc细胞会具有两种后果。第一种是c-myc与9E10臂的"定向的"反应。第二种预期的后果是"反式"反应，其中抗独特型臂结合9E10+c-myc蛋白复合物或另一个双特异性抗体分子的有配体的9E10臂。此"反式"反应是渐进的反应，其一直继续，直至在化学计量上耗尽所有的耙物。实际上，此"抗体链反应，，装饰和加强抗体的结合以向靶物靶向、投递和稳定化最大限度量的Fc。实施例7:噬菌体-噬菌体乾物-抗体选择(图6)在先前的实施例中，使用孢子来展示表位集合，而使用噬菌体来展示抗体选择。还有可能使用相同的展示系统来展示两种集合，若这两种集合在选择方面是物理上可区别的且在扩增方面是遗传上可区别的。在此实施例中，第l步是在具有不同抗生素抗性(用于表位文库的四环素抗性和用于抗体集合的氨千青霉素抗性)的质粒中表达集合。其次，给噬菌体外壳蛋白带上表位标签以在物理上彼此辨别离散的集合。为了这样做，以重组方式将独特的亲和标签融合至pVII外壳蛋白的氨基端。具体地，首先体。例如，可使用HA辅助噬菌体来生成表位文库噬菌粒集合，而使用FLAG辅助噬菌体来生成抗体噬菌粒文库集合。将106-107个表位文库噬菌粒与10、10"个抗体文库噬菌粒在lmlPBS+1%BSA中混合，并于室温温育2小时。接着，将经抗HA包被的蛋白A^K与混合物于4。C温育1小时。然后用PBS+0.05%丁评6611-20清洗珠子3-5次。最后，将珠子用pH2.2甘氨酸处理10分钟，然后用2MTris碱中和。此步骤不可逆地解离抗体-抗原复合物，并容许它们感染大肠杆菌，并在氨千青霉素或四环素选择下扩增。所扩增的集合含有整个表位文库和仅生产性的抗体结合物。下一选择步骤类似于先前的步骤，但是代替HA沉淀，进行抗FLAG沉淀。因此，此步骤除去所有未结合的表位文库成员，并仅加强生产性的表位-抗体集合。虽然此实施例引用抗体-抗原相互作用，预期相同的方法也对任何数目或种类的相互作用性噬菌体展示集合起作用。这些可以是针对其它抗体的抗体，或者甚至是针对受体或酶的肽。还有可能用单一免疫学独特辅助噬菌体实现类似的结果，若每轮都将标签适当地重建给正确的表位或抗体群体。这种免疫学独特差异可以工程化改造入辅助噬菌体外壳蛋白，或者可以天然存在于两种不同的噬菌体外壳蛋白之间。实施例8:构象表位和抗体文库的同时选择在上述实施例中，使用构象性表位文库集合来富集识别天然蛋白质或天然呈现靶物的抗体。然而，有可能用目前所述系统来进^f亍同时构象性靶物-抗体选择。此情况中的目标是保存特定靶物-抗体配对。这仅在靶物集合展示实质上和物理上不同于抗体展示集合时是有可能的，诸如例如在靶物与不溶性孢子颗粒结合而抗体融合至可溶性丝状噬菌体时。为了保存配对，首先将靶物集合与抗体集合混合。合适的温育期之后，通过离心来收集孢子靶物集合，并用合适的清洗来除去未结合的噬菌体。进行清洗步骤以除去未结合的噬菌体之后，将复合的集合与单克隆抗噬菌体抗体一起温育，然后与顺磁性抗小鼠珠组合以磁性正选择噬菌体结合的孢子。或者，可以用偶联有荧光团的抗小鼠抗体来检测噬菌体-孢子和抗噬菌体复合物，并可通过FACS克隆分选孢子个体。可以在合适的条件下个别地挽救配对的组合以可寻址地和独立地挽救噬菌体，并增殖芽孢杆菌孢子。虽然在上述说明书中，参照某些实施方案阐明了本发明，但它不限于此。确实，从上述说明书看，在那些本文中所显示和描述的之外，对本发明的各种修饰对于本领域的技术人员会变得显而易见，并落入所附权利要求书的范围内。在此通过提及而明确且完整地收录整篇说明书中所引用的所有参考文献及其中所引用的参考文献。权利要求1.一种物理上可选择的展示，其包含一种或多种天然或变异多肽的离散或随机片段的串联或多聚体装配物，或模拟所述片段的序列的串联或多聚体装配物，其中至少一些所述装配物形成构象约束多肽靶物，并且其中至少一些所述片段不同于抗体片段。2.权利要求l的展示，其是构象性表位文库。3.权利要求l的展示，其包含超过一种多肽的离散或随机片段的串联或多聚体装配物，或模拟所述片段的序列的串联或多聚体装配物。4.权利要求l的展示，其中至少一些所述串联或多聚体装配物包含两种或更多种来自相同多肽的不同部分的片段，或模拟所述片段的序列。5.权利要求l的展示，其中至少一些所述串联或多聚体装配物包含来自不同多肽的片段，或模拟所述片段的序列。6.权利要求l的展示，其中至少一些所述串联或多聚体装配物包含抗体或抗体片段和所述抗体或抗体片段的配体。7.权利要求l的展示，其中在所述串联或多聚体装配物中，至少一些所述片段或序列是彼此直接融合的。8.权利要求l的展示，其中在所述串联或多聚体装配物中，至少一些所述片段或序列是由外源连接序列偶联的。9.权利要求l的展示，其中在所述串联或多聚体装配物中，至少一些所述片段或序列由结构支持元件组成或包含结构支持元件。10.权利要求l的展示，其中至少一些所述构象约束多肽耙物是由于所述串联或多聚体装配物中所存在的所述片段或模拟序列的接近性而形成的。11.权利要求l的展示，其中至少一些所述构象约束多肽靶物是由于所述串联或多聚体装配物中所述结构支持元件的存在而形成的。12.权利要求ll的展示，其中所述结构支持元件是一种或多种蛋白质家族的特征性基序。13.权利要求ll的展示，其中所述结构支持元件选自下组螺旋束、卩-片层结构、三叶结构、跨膜螺旋、和胞外环。14.权利要求l的展示，其中所述构象约束多肽靶物包含受体序列。15.权利要求14的展示，其中所述受体序列包括受体的结构基序。16.权利要求l的展示，其选自下组体内和体外展示系统。17.权利要求16的展示系统，其选自下组病毒的、真核生物的、细菌的、核糖体、mRNA、和DNA^示系统。18.权利要求17的展示，其是噬菌体展示。19.权利要求17的展示，其中所述真核生物展示系统是哺乳动物或酵母展示。20.权利要求17的展示，其中所述细菌展示系统是细菌细胞或孢子展示。21.权利要求20的展示，其中所述细菌展示系统是枯草芽孢杆菌(B""7/wS由/fc)或苏云金芽孑包軒菌(5ac/〃WJf/2W7'"g/e"^)孑包子展示。22.权利要求ll的展示，其中所述细菌展示系统是苏云金芽孢杆菌孢子展示。23.—种筛选方法，包括(a)提供物理上可选择的展示，其包含一种或多种天然或变异多肽的离散或随机片段的串联或多聚体装配物，或模拟所述片段的序列的串联或多聚体装配物，其中至少一些所述装配物形成构象约束多肽靶物，并且其中至少一些所述片段不同于抗体片l殳；(b)使所述展示与候选结合配偶体的文库在如下条件下接触，其中彼此具有结合亲和力的构象约束多肽靶物和候选结合配偶体形成靶物-结合配偶体复合物；并(c)检测至少一些所形成的靶物-结合配偶体复合物。24.权利要求23的方法，其进一步包括步骤(d)鉴定参与至少一些所检测出的耙物-结合配偶体复合物形成的耙序列。25.权利要求24的方法，其中鉴定参与所有所检测出的靶物-结合配偶体复合物形成的靶序列。26.权利要求23的方法，其中所述展示包含超过一种多肽的离散或随机片段的串联或多聚体装配物，或模拟所述片段的序列的串联或多聚体装配物。27.权利要求23的方法，其中至少一些所述串联或多聚体装配物包含两种或更多种来自相同多肽的不同部分的序列，或模拟所述片段的序列。28.权利要求23的方法，其中至少一些所述串联或多聚体装配物包含来自不同多肽的片段，或模拟所述片段的序列。29.权利要求23的方法，其中至少一些所述串联或多聚体装配物包含抗体或抗体片段和所述抗体或抗体片段的配体。30.权利要求23的方法，其中在所述串联或多聚体装配物中，至少一些所述片段或序列是彼此直接融合的。31.权利要求23的方法，其中在所述串联或多聚体装配物中，至少一些所述片段或序列是由外源连接序列偶联的。32.权利要求23的方法，其中在所述串联或多聚体装配物中，所述两种或更多种序列中的至少一些由结构支持元件组成或包含结构支持元件。33.权利要求23的方法，其中至少一些所述构象约束多肽靶物是由于所述串联或多聚体装配物中所存在的所述片段或模拟序列的接近性而形成的。34.权利要求23的方法，其中至少一些所述构象约束多肽靶物是由于所述串联或多聚体装配物中所述结构支持元件的存在而形成的。35.权利要求34的方法，其中所述结构支持元件是一种或多种蛋白质家族的特征性基序。36.权利要求34的方法，其中所述结构支持元件选自下組螺旋束、|3-片层结构、三叶结构、跨膜螺旋、和胞外环。37.权利要求23的方法，其中所述候选结合配偶体是抗体或抗体片段。38.权利要求37的方法，其中所述抗体片段选自下组Fab、Fab，、F(ab，)2、dAb、scFv和(scFv)2片段、线性抗体、单链抗体分子、迷你抗体、双抗体、和由抗体片段形成的多特异性抗体。39.权利要求38的方法，其中所述抗体片段是scFv片段。40.权利要求37的方法,其中所述抗体或抗体片段是抗体文库的一部分。41.权利要求23的方法，其中所述候选结合蛋白是抗体模拟物。42.权利要求41的方法，其中所述抗体模拟物是亲和体或适体。43.权利要求23的方法，其中所述物理上可选择的展示是体内或体外展示系统。44.权利要求43的方法，其中所述物理上可选择的展示选自下组病毒的、真核生物的、细菌的、核糖体、mRNA、和DNM示系统。45.权利要求44的方法，其中所述展示系统是噬菌体展示。46.权利要求44的方法，其中所述真核生物展示系统是哺乳动物或酵母展示。47.权利要求44的方法，其中所述细菌展示系统是细菌细胞或孢子展示。48.权利要求47的方法，其中所述细菌展示系统是枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌孢子展示。49.权利要求40的方法，其中所述抗体文库是展示的。50.权利要求49的方法，其中所述抗体展示是体内或体外展示系统。51.权利要求49的方法，其中所述抗体展示选自下组病毒的、真核生物的和细菌的展示系统。52.权利要求51的方法，其中所述展示系统是噬菌体展示。53.权利要求51的方法，其中所述真核生物展示系统是哺乳动物或酵母展示。54.权利要求51的方法，其中所述细菌展示系统是细菌细胞或孢子展示。55.权利要求54的方法，其中所述细菌展示系统是枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌孢子展示。56.权利要求49的方法，其中所述抗体文库是噬菌体文库，而所述物理上可选择的展示是孢子展示或噬菌体展示。57.权利要求56的方法，其中所述孢子展示是苏云金芽孢杆菌孢子展示。58.权利要求23的方法，其中所述构象约束多肽靶物包含受体序列。59.权利要求58的方法，其中所述结合配偶体是所述受体的配体候选物。60.权利要求59的方法，其中所述受体序列包括所述受体的结构基序。61.权利要求38的方法，其中另外鉴定参与至少一些所述靶物-结合配偶体复合物形成的抗体或抗体片段序列。62.权利要求61的方法，其进一步包括在步骤(d)之前富集和分开参与至少一些所述耙物-结合配偶体复合物形成的耙序列和抗体序列的步骤。63.权利要求62的方法，其进一步包括在富集和分开之后且在步-骤(d)之前独立地回收参与至少一些所述靶物-结合配偶体复合物形成的靶序列和抗体序列的步骤。64.权利要求38的方法，其中参与至少一些所述靶物-结合配偶体复合物形成的把序列是构象性表位的一部分。65.—种方法，包括(a)提供物理上可选择的展示，其包含一种或多种天然或变异多肽的离散或随机片段的串联或多聚体装配物，或模拟所述片段的序列的串联或多聚体装配物，其中至少一些所述装配物形成构象性表位；(b)使所述展示与抗体文库在如下条件下接触，其中彼此具有结合亲和力的构象性表位和抗体文库成员形成构象性表位-抗体复合物；并(c)检测至少一些所形成的构象性表位-抗体复合物。66.权利要求65的方法，其进一步包括步骤(d)鉴定参与至少一些所检测出的构象性表位-抗体复合物形成的构象性表位和抗体序列。67.权利要求66的方法，其中检测所有所形成的构象性表位-抗体复合物。68.权利要求67的方法，其中鉴定参与所有所检测出的靶物-结合配偶体复合物形成的构象性表位序列。69.权利要求65的方法，其中所述展示包含超过一种多肽的离散或随机片段的串联或多聚体装配物，或模拟所述片段的序列的串联或多聚体装配物。70.权利要求65的方法，其中至少一些所述串联或多聚体装配物包含来自相同多肽的不同部分的片段，或模拟所述片段的序列。71.权利要求65的方法，其中至少一些所述串联或多聚体装配物包含来自不同多肽的片段，或模拟所述片段的序列。72.权利要求71的方法，其中至少一些所述串联或多聚体装配物包含抗体或抗体片段和所述抗体或抗体片段的配体。73.权利要求65的方法，其中在所述串联或多聚体装配物中，至少一些所述片段或序列是彼此直接融合的。74.权利要求65的方法，其中在所述串联或多聚体装配物中，至少一些所述片段或序列是由外源连接序列偶联的。75.权利要求65的方法，其中在所述串联或多聚体装配物中，至少一些所述片段或序列由结构支持元件组成或包含结构支持元件。76.权利要求65的方法，其中至少一些所述构象性表位是由于所述串联或多聚体装配物中所存在的所述片段或模拟序列的接近性而形成的。77.权利要求65的方法，其中至少一些所述构象性表位是由于所述串联或多聚体装配物中所述结构支持元件的存在而形成的。78.权利要求77的方法，其中所述结构支持元件是一种或多种蛋白质家族的特征性基序。79.权利要求77的方法，其中所述结构支持元件选自下组螺旋束、卩-片层结构、三叶结构、跨膜螺旋、和胞外环。80.权利要求65的方法，其中所述抗体文库包含抗体片段。81.权利要求80的方法，其中所述抗体片段选自下组Fab、Fab，、F(ab，)2、dAb、scFv、和(scFv)2片段、线性抗体、单链抗体分子、迷你抗体、双抗体、和由抗体片段形成的多特异性抗体。82.权利要求81的方法，其中所述抗体片段是scFv片段。83.权利要求65的方法，其中所述物理上可选择的展示是细菌细胞或孢子展示。84.权利要求83的方法，其中所述细菌展示系统是枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌孢子展示。85.权利要求65的方法，其中所述抗体文库是噬菌体文库，而所述物理上可选择的展示是孢子展示或噬菌体展示。86.权利要求85的方法，其中所述孢子展示是苏云金芽孢杆菌孢子展示。87.权利要求65的方法，其中所述构象性表位是通过基因片段的串联或多聚体装配物的表达而获得的。88.权利要求87的方法，其中所述基因片段起源自靶定的生物学有关来源。89.权利要求88的方法，其中所述靶定的生物学有关来源选自下组细胞、组织、器官和生物体。90.权利要求89的方法，其中所述靶定的生物学有关来源选自下组干细胞、活化的免疫细胞、患病的组织、器官和病理性生物体。91.权利要求88的方法，其中通过分析所靶定的生物学有关来源中的基因表达数据来鉴定至少一些所述基因片段。92.—种核酸分子，其包含由编码肽接头的核苷酸序列分开的编码抗体或抗体片段和所述抗体或抗体片段的配体的核苷*列。93.—种载体，其包含权利要求92的核酸分子。94.经权利要求93的载体转化的宿主细胞。95.权利要求94的宿主细胞，其是真核生物的或原核生物的宿主细胞。96.权利要求95的宿主细胞，其是细菌、哺乳动物或酵母细胞。97.权利要求95的宿主细胞，其是大肠杆菌细胞。全文摘要本发明涉及构象约束多肽序列的组合文库及其用途。具体地，本发明涉及构象性表位的组合文库及其用途。文档编号C12N15/10GK101622347SQ200880006994公开日2010年1月6日申请日期2008年1月11日优先权日2007年1月12日发明者劳伦斯·霍罗威茨,拉梅什·R·巴特申请人:航道生物技术有限责任公司