改良型卤代醇环氧酶的制作方法

专利名称：：改良型卤代醇环氧酶的制作方法
技术领域：
：本发明涉及改良型囟代醇环氧酶及其制造方法等。
背景技术：
：卣代醇环氧酶也被称作卣代醇氢卣裂合酶、卣代醇脱卣酶(HalohydrinDehalogenase)或者卣代醇脱囟酶(HaloalcoholDehalogenase),其是具有将1,3-二卣代-2-丙醇转化成表闺代醇的活性和催化其逆反应的活性的酶(ECnumber:4.5丄-)。已知卣代醇环氧酶根据氨基酸序列的同源性等，大致被分为3组(组A、组B、组C)(非专利文献1:J.Bacteriology,183(17),5058隱5066,2001)。作为分类于组A的卤代醇环氧酶，可以举出来自^^奉状杆菌属(corynebacteriumsp.)N-1074株的HheA(非专利文献2:Biosci.Biotechnol.Biochem.，58(8)，1451-1457,1994)、来自节杆菌属(Arthrobactersp.)AD2林的HheAAD2(非专利文献1)、来自节杆菌属(Arthrobactersp.)PY1抹的Deh-PY1(非专利文献3:J.Health.Sci.,50(6)，605-612，2004)等。作为分类于组B的卣代醇环氧酶，可以举出来自棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)N-1074株的HheB(非专利文献2)、来自分枝杆菌属(Mycobacteriumsp.)GP1林的HheBGP1(非专利文献1)、来自节杆菌erithii(Arthrobactererithii)H10a抹的DehA(非专利文献4:Enz.Microbiol.Technol.,22,568-574，1998)等。作为分类于组C的囟代醇环氧酶，可以举出来自放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)DH094抹的HheC(专利文献1:特开平10-210981号公报)、来自放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1抹的HheC(非专利文献)、来自才艮癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的HalB(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgidb=protein&val=4960076#feature4960076)(非专利文献5:Thesis(1996)UniversityofWales,Cardiff,UnitedKingdom)等。作为各种医药品和生理活性物质的合成原料，表卣代醇是有用的物质。已知的是，例如，由(R)-表卣代醇的开环氰化所得到的(R)-(-)-4-卤代-3-羟基丁腈作为L-肉碱的合成原料是有用的(专利文献2:日本特开昭57-165352号公报)。对于至少一部分卣代醇环氧酶来说，除了具有上述将l，3-二卣代-2-丙醇转换为表离代醇的活性和催化其逆反应的活性以外，还了解到可催化如下反应，即，在氰化物的存在下使表卣代醇开环氰化来生成4-卣代-3-羟基丁腈，作为利用该反应的例子，已知有由1,3-二卣代-2-丙醇制造光学活性4-卣代-3-羟基丁腈的方法(专利文献3:日本特开平3-053889号公报，专利文献4:日本特开2001-25397号公报)以及由表卤代醇制造4-卤代-3-羟基丁基的方法(专利文献5:日本特开平3-053890号公报)。可是，从自然界中分离的微生物的每个菌体的面代醇环氧酶活性，从工业利用的角度来说，未必足够高。为了解决这个技术问题，有人尝试利用基因重组技术来提高每个转化体的卣代醇环氧酶活性。有文献例示出如下例子，例如，利用通过导入克隆有基因的各种表达质粒所得到的各种转化体，可以有效地制造光学活性4-卣代-3-羟基丁腈，所述基因为编码来自棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)N-1074林的卣代醇环氧酶HheB的基因(专利文献6:日本特开平4-278089号公报，专利文献7:日本特开平5-317066号公报以及专利文献8:日本特开2007-049932号公报)。就这些转化体而言，通过使菌体内保有多拷贝的卣代醇环氧酶基因，成功地大幅度提高每个转化体的卣代醇环氧酶活性。另一方面，由于近年的基因工程学技术的进步，使得有意识地制作变异体成为可能，所述变异体通过使酶蛋白质的1个以上的构成氨基酸缺失、或添加、插入1个以上的构成氨基酸或者用其他氨基酸取代1个以上的构成氨基酸来获得。已知这些变异体根据该变异的种类，与未导入变异的酶相比，其活性、稳定性、有机溶剂耐性、耐热性、耐酸性、耐碱性、底物特异性等性能得到提高。这些性能的提高，通过每单元活性的酶催化剂制造成本降低、酶催化剂的稳定化、反应工序的简化、反应收率的提高等，有时为利用酶反应的工业生产带来生产成本的大幅降低。因而，就多种酶而言，进行着提高各种性能的有用的改良酶的研制。就囟代醇环氧酶而言，也有人报道了使一个以上的构成氨基酸缺失，或添加、插入一个以上的构成氨基酸或者用其他氨基酸取代一个以上的构成氨基酸的变异体。例如，专利文献9(国际公开第2005/017141号小册子)6记载了来自放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1株的HheC的369种变异体以及来自棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheB的1种变异体。另夕卜，专利文献10(美国专利申请公开第2005/0272064号说明书)记载了来自放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1抹的HheC的570种变异体以及来自棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)N-1074林的HheB的1种变异体。此外，专利文献11(美国专利申请公开第2006/0099700号说明书)记载了来自放射形土;襄杆菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1抹的HheC的1422种变异体以及来自棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)N-1074林的HheB的1种变异体。对于这些变异体之中的几种变异体而言，显示出由乙基(R)-4-氯-3-羟基丁酸酯转换为乙基(S)-4-氰基-3-羟基丁酸酯的转换反应的活性得以提高。另夕卜，非专利文献6(J.Bacteriol.,183(17),5058-5066,2001)记载了来自放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1抹的HheC的变异体Serl32Ala、Serl32Cys、Tyrl45Phe、Argl49Lys、Argl49Glu以及Argl49Gln。非专利文献7(Enz.Microbiol.Technol.,30，251-258，2002)记载了来自放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1林的HheC的变异体C30A、C153S、C229A以及C153S/C229A,显示出变异体C30A以及C153S的稳定性相比于野生型卣代醇环氧酶得到了提高。非专利文献8(EMBOJ.，22(19),4933-4944，2003)记载了来自放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1抹的HheC的变异体Asp80Asn以及Asp80Ala。非专利文献9(Biochemistry,42(47),14057-14065,2003)记载了来自放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1株的HheC的变异体W139F、W192F、W238F以及W249F。非专利文献10(Biochemistry,44(17)，6609-6618，2005)记载了来自放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1抹的HheC的变异体N176A、N176D以及Y187F。这些都与来自放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1抹的面代醇环氧酶HheC的变异体相关。专利文献1:日本特开平10-210981号公报专利文献2:日本特开昭57-165352号公l艮专利文献3:日本特开平3-053889号公报专利文献4:日本特开2001-25397号公报专利文献5:日本特开平3-0538卯号公报专利文献6:日本特开平4-278089号公报专利文献7:日本特开平5-317066号公报专利文献8:日本特开2007-049932号公报专利文献9:国际公开第2005/017141号小册子专利文献10:美国专利申请公开第2005/0272064号说明书专利文献11:美国专利申请公开第2006/0099700号说明书非专利文献l:J.Bacteriol.，183(17)，5058-5066，2001非专利文献2:Biosci.Biotechnol.Biochem.,58(8),1451-1457,1994非专利文献3:J.Health.Sci.，50(6),605-612，2004非专利文献4:Enz.Microbiol.Technol.,22,568-574,1998非专利文献5:Thesis(1996)UniversityofWales,Cardiff,UnitedKingdom非专利文献6:J.Bacteriol.,183(17)，5058-5066，2001非专利文献7:Enz.Microbiol.Technol.30，251-258,2002非专利文献8:EMBOJ.，22(19),4933-4944，2003非专利文献9:Biochemistry,42(47),14057-14065,2003非专利文献10:Biochemistry,44(17),6609-6618,2005
发明内容发明要解决的课题工业利用面代醇环氧酶的情况下，被期望作为酶催化剂的更加高度化。例如，如上所述通过使转化体内的卣代醇环氧酶基因的高拷贝化，可以将每个转化体的卣代醇环氧酶活性提高到某个程度，但从经济性和实用性的角度考虑，期望活性进一步地提高。因而，期待着能带来每个转化体的卣代醇环氧酶活性提高的卤代醇环氧酶。另外，为了制造具有光学活性的4-卤代-3-羟基丁腈的情况下，通过已知的卤代醇环氧酶所制造的4-卤代-3-羟基丁腈的光学纯度未必足够高。因而，期待着提高了立体选择性的卤代醇环氧酶，其可生成光学纯度更高的4-卣代-3-羟基丁腈。另外，以1,3-二卤代-2-丙醇为起始原料，利用闺代醇环氧酶制造4-囟代-3-羟基丁腈的情况下，会产生因生成物(氯化物离子以及4-卣代-3-羟基丁腈)的阻碍而导致的反应速度的降低。因而，期待着难以受到生成物阻碍的囟代醇环氧酶。另外，为.了廉价地制造4-卣代-3-羟基丁腈，通常，优选增高反应体系内的底物和/或生成物(4-卣代-3-羟基丁腈)浓度来提高每个装置的生产率，但是，由已知的卣代醇环氧酶所得到的生成物积累浓度未必足够高。因而，期待着可以积累高浓度的生成物的卣代醇环氧酶。因此，本发明的目的在于提供一种可以解决这些技术问题的卣代醇环氧酶及其制造方法，并提供使用该酶的表面代醇或者4-卣代-3-羟基丁腈的制造方法。解决问题的手段本发明人等为了解决上述技术问题进行了深入的研究。结果发现，就野生型卣代醇环氧酶的氨基酸序列，尤其是分类于组B的野生型卣代醇环氧酶的氨基酸序列而言，通过将特定的氨基酸残基取代成其他氨基酸，可以制作出每个转化体的卣代醇环氧酶活性、立体选"^性、生成物阻碍耐性、生成物积累能力等属性得到提高的改良型卤代醇环氧酶，从而完成本发明。即，本发明如下。(1)一种改良型囟代醇环氧酶，其特征在于，其包含对野生型卣代醇环氧酶的氨基酸序列导入从以下的(A)(D)中选择的任一个或多个氨基酸变异而得到的氨基酸序列，其中，所述野生型卣代醇环氧酶的氨基酸序列包含以下的氨基I踏列I:S-al-a2-a3-a4-a5-a6-a7-a8-(x9画al0-all-al2隱Y-al3-al4-A-R画a15(序歹'J号74)(S表示丝氨酸残基，Y表示酪氨酸残基，A表示丙氨酸残基,R表示精氨酸残基，alal5分别独立地表示相同或不同的任意氨基酸残基)以及以下的氨基晚亭列II:L-卩16-R-L-卩17-卩18-卩19画卩20國E-卩21(序列号75)(L表示亮氨酸残基，R表示精氨酸残基，E表示谷氨酸残基，卩16-(321分别独立地表示相同或不同的任意氨基酸残基)，(A)比起始氨基酸残基(通常为甲硫氨酸残基)离C末端侧近一个残基的氨基酸残基被取代成其他氨基酸的氨基酸变异；(B)a14残基被取代成其他氨基酸的氨基酸变异；(C)a15残基被取代成其他氨基酸的氨基酸变异；9(D)(321残基被:取代成其他氨基酸的氨基酸变异。(2)—种改良型卣代醇环氧酶，其特征在于，其包含对野生型闺代醇环氧酶的氨基酸序列导入从以下的(E)(H)中选择的任一个或多个氨基酸变异的氨基酸序列，其中，所述野生型卣代醇环氧酶的氨基酸序列包含以下的氨基^列I:S-al-a2-a3-a4-a5-ct6-a7-a8-a9-alO-all画al2-Y-al3陽al4-A-R画a15(序歹11号74)(S表示丝氨酸残基，Y表示酪氨酸残基，A表示丙氨酸残基，R表示精氨酸残基，alal5分别独立地表示相同或不同的任意氨基酸残基)以及以下的氨基酸序列II:L-f316-R-L-卩17-(318-卩19-卩20-E-(321(序列号75)(L表示亮氨酸残基，R表示精氨酸残基，E表示谷氨酸残基，卩16-p21分别独立地表示相同或不同的任意氨基酸残基)，(E)比起始氨基酸残基(通常为曱硫氨酸残基)离C末端侧近一个残基的氨基酸残基被取代成赖氨酸或天冬酰胺的氨基酸变异；(F)a14残基被取代成丙氨酸、半胱氨酸或丝氨酸的氨基酸变异；(G)a15残基被取代成丙氨酸、丝氨酸或色氨酸的氨基酸变异；(H)(321残基被取代成谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或曱硫氨酸的氨基酸变异。就上述(1)和(2)所记载的改良型卣代醇环氧酶而言，作为野生型卤代醇环氧酶，可以举出例如分类于组B的酶。就上述(1)和(2)所记载的改良型卣代醇环氧酶而言，作为野生型卤代醇环氧酶，可以举出例如来自棒状杆菌(Corynebacterium)属细菌或分枝杆菌(Mycobacterium)属细菌的酶等。就上述(1)和(2)所记载的改良型卣代醇环氧酶而言，作为野生型卤代醇环氧酶的氨基酸序列，可以举出例如序列号1或序列号2所示的氨基酸序列等。作为上述(1)和(2)所记载的改良型卤代醇环氧酶，可以举出例如包含对野生型卣代醇环氧酶的氨基酸序列导入从以下的(i)~(iii)中选择的任一个或多个氨基酸变异而得到的氨基S交序列的酶等。(i)从除了比起始氨基酸残基离C末端侧近一个残基的氨基酸残基、a14残基、a15残基以及p21残基以外的氨基酸残基中选择的1个或数个氨基酸残基被取代成其他氨基酸的氨基酸变异；(ii)从除了比起始氨基酸残基离C末端侧近一个残基的氨基酸残基、氨基酸序列I所含的氨基酸残基以及氨基酸序列II所含的氨基酸残基以外的氨基酸残基中选择的1个或数个氨基酸残基发生缺失的氨基酸变异；(iii)在比起始氨基酸残基离C末端侧近两个以上残基的氨基酸残基构成的区域中的由氨基酸序列I和氨基酸序列II构成的区域以外的区域中，插入1个或数个任意氨基酸残基的氨基酸变异。(3)编码上述(1)或(2)所记载的改良型卣代醇环氧酶的基因。(4)含有上述(3)所记载的基因的重组载体。(5)将上述(4)所记载的重组载体导入宿主而得到的转化体或转导体。(6)培养上述(5)所记载的转化体或转导体所得到的培养物。(7)从上述(6)所记载的培养物中提取的改良型卣代醇环氧酶。(8)—种改良型卣代醇环氧酶的制造方法，其特征在于，培养上述(5)所记载的转化体或转导体，从得到的培养物中提取改良型卤代醇环氧酶。(9)一种表囟代醇的制造方法，其特征在于，通过使上述(1)、(2)或(7)所记载的改良型卣代醇环氧酶和/或上述(6)所记载的培养物与1,3-二卣代-2-丙醇接触，来生成表面代醇。(10)—种4-卣代-3-羟基丁腈的制造方法，其特征在于，通过使上述(l)、(2)或(7)所记载的改良型卣代醇环氧酶和/或上述(6)所记载的培养物在氰化物的存在下，与1,3-二卤代-2-丙醇或表卤代醇接触，来生成4-卤代-3-羟基丁腈。发明的效果根据本发明，可以得到每个转化体的卣代醇环氧酶活性、立体选择性、生成物阻碍耐性、生成物积累能力等提高了的改良型卤代醇环氧酶，同时，可以利用这些酶来高效地制造表卣代醇或4-卤代-3-羟基丁腈。图1是表示将来自表达野生型卤代醇环氧酶的转化体(JM109/pST111、iiJM109/pSTK001和JM109/pSTT001)以及表达改良型囟代醇环氧酶的转化体(JM109/pSTK002、JM109/pSTK003、JM109/pSTT002以及JM109/pSTT003)的粗酶液用SDS-PSGE进行分析的结果的图。具体实施例方式下面，对本发明的实施方式进行说明，但本实施方式是用于说明本发明的例示，并不是要将本发明仅限于该实施方式。只要本发明不脱离其要点，就可以以各种方式来实施。本说明书包含作为主张本申请优先权的基础的日本特愿2007-057854号说明书的全部内容。另外，本说明书中引用的全部的刊物，例如现有技术文献和公开公报、特许公报及其他专利文献，作为参考被纳入本说明书中。(I)卣代醇环氧酶活性在本发明中，所说的"卣代醇环氧酶活性"是指将1，3-二离代-2-丙醇转化为表卣代醇的活性和催化其逆反应的活性。1,3-二卣代-2-丙醇是用下述通式(1)表示的化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>(式中，X，和X2分别独立地表示相同或不同的卣原子。)作为卣原子，优选为氟、氯、溴、碘，特别优选为氯、溴。具体来讲，可以举出1，3-二氟-2-丙醇、1,3-二氯-2-丙醇(以下，有时称为"DCP，，)、1,3-二溴-2-丙醇、1，3-二碘-2-丙醇等，优选为1，3-二氯-2-丙醇、1，3-二溴-2-丙醇。表卣代醇是用下述通式(2)表示的化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>(式中，x表示卤原子)作为卣原子，优选为氟、氯、溴、碘，特别优选为氯、溴。具体来讲，可以举出表氟代醇、表氯代醇(以下，有时称为"EHC")、表溴代醇、表碘代醇等，特别优选为表氯代醇、表溴代醇。在本发明中，"卤代醇环氧酶活性"通过对每小时由1,3-二卤代-2-丙醇生成表卣代醇的生成量或氯化物离子生成量进行测定来求得。表卣代醇生成量可以通过例如液相色谱或气相色谱等进行定量。另外，氯化物离子生成量可以通过例如连续地或间断地添加碱溶液使得伴随着该氯化物离子的生成而降低的pH值保持在一定的值，由每小时所需要的碱量来方便地求出。有时将通过该方法算出的卣代醇环氧酶活性特别地称作"脱氯活性"。另外，也可以制作针对于改良型卣代醇环氧酶的抗体，通过免疫印迹或ELISA法等免疫学方法来算出。另外，假定囟代醇环氧酶活性与转化体内的表达量成正比的情况下，通过与囟代醇环氧酶活性已知的样品相比较，利用SDS-PAGE等分析手段也可以间接求得。只要是本领域技术人员使用公知的方法就可以进行SDS-PAGE。对于至少一部分卣代醇环氧酶来说，除了上述的"卣代醇环氧酶活性，，以外，还具有催化如下反应的活性，即，在氰化物的存在下，将表卣代醇开环氰化来生成4-卣代-3-羟基丁腈的反应。作为此时的氰化物，可以举出氰化氢、氰化钾(以下，有时称作"KCN")、氰化钠、氰酸或者丙酮氰醇等在添加于反应液中时生成氰离子(CN-)或氰化氬的化合物或其溶液等。另外，4-囟代-3-羟基丁腈是用下述通式(3)表示的化合物。(式中，x表示卤原子)作为卣原子，优选为氟、氯、溴、碘，特别优选为氯、溴。具体来讲，可以举出4-氟-3-羟基丁腈、4-氯-3-羟基丁腈(以下，有时称作"CHBN")、4-溴-3-羟基丁腈、4-碘-3-羟基丁腈等，优选为4-氯-3-羟基丁腈、4-溴-3-羟基丁腈。(II)卣代醇环氧酶(II-l)野生型囟代醇环氧酶本发明的改良型囟代醇环氧酶是通过在野生型卣代醇环氧酶(特別优选分类于组B的酶)中导入变异(氨基酸变异)来改良而得到的酶，其来源并无特别限制。这里，所说的"野生型卣代醇环氧酶"是指可以从自然界的生物分离的囟代醇环氧酶，就构成该酶的氨基酸序列而言，不存在有意或无意的氨基酸缺失或由其他氨基酸所导致的取代或者插入，意味着保持有来自天然的属性的卣^C醇环氧酶。此外，本发明中使用的野生型卣代醇环氧酶具有包含以下的氨基酸序列I(19氨基酸残基)以及以下的氨基酸序列II(IO氨基酸残基)的氨基酸序列，所述氨基酸序列I(19氨基酸残基)S-al画a2-a3-a4-a5-a6-a7-a8-a9-al0-all-al2-Y-al3-(xl4-A-R-a15(序列号74)(S表示丝氨酸残基，Y表示酪氨酸残基，A表示丙氨酸残基，R表示精氨酸残基，alal5分别独立地表示相同或不同的任意氨基酸残基)，所述氨基酸序列II(10氨基酸残基)L-卩16-R画L-卩17-pi8-(319-p20-E匿卩21(序列号75)(L表示亮氨酸残基，R表示精氨酸残基，E表示谷氨酰胺残基，|316-(321分别独立地表示相同或不同的任意氨基酸残基)。野生型卣代醇环氧酶是否是具有包含氨基酸序列I以及氨基酸序列II的氨基酸序列的酶，只要在公共的序列数据库，例如由美国生物工程学信息中心(NCBI;NationalCenterforBiotechnologyInformation)提供6勺GenBank凄史4居库(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgiCMD=search&DB=proterin)中，检索作为卣代醇环氧酶注册的酶，调查该酶的氨基酸序列中是否含有上述氨基酸序列I和氨基酸II即可。根据需要，可以使用基因信息解析用软件进行。另外，如果在公知文献中有对于野生型卣代醇环氧酶氨基酸序列的记载，也可以以其为参考。例如，通过以在J.Bacteriology,183(17),5058-5066,2001中记载的各种野生型囟代醇环氧酶氨基酸序列的比对信息为参考，可知是否含有氨基酸序列I和氨基酸序列II以及包含于整个氨基酸序列中的哪个位置上。氨基酸序列I中的丝氨酸残基、酪氨酸残基、精氨酸残基和丙氨酸残基，以及氨基酸序列II中的亮氨酸残基、精氨酸残基和谷氨酸残基，在已知的各种野生型卤代醇环氧酶的氨基酸序列中被高度地保存。已知野生型卣代醇环氧酶根据氨基酸序列的同源性等，被大致分成3个组14(组A，组B,组C)(J.Bacteriology,183(17),5058-5066,2001)。其中，作为本发明中使用的野生型卣代醇环氧酶，特别优选属于组B的酶。作为分类于组A的囟代醇环氧酶，可以举出来自棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)N-1074才朱的HheA(Biosci.Biotechnol.Biochem.，58(8)，1451-1457,1994)、来自节杆菌属(Arthrobactersp.)AD2抹的HheAA^(J.Bacteriology,183(17)，5058-5066,2001)以及来自节杆菌属(Arthrobactersp.)PYl抹的Deh-PYl(J.Health.Sci.，50(6)，605-612，2004)等。作为分类于组B的卣代醇环氧酶，可以举出来自棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)N-1074才朱^JHheB(Biosci.Biotechnol.Biochem.,58(8)，1451，1994)、来自分枝杆菌属(Mycobacteriumsp.)GP1抹的HheBGP1(J.Bacteriology,183(17),5058-5066，2001)、来自节杆菌erithii(Arthrobactererithii)HI0a抹的DehA(Enz.Microbiol.Technol.，22，568-574,1998)等。作为分类于组C的卣代醇环氧酶，可以举出来自放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)DH094抹的HheC(日本特开平10-210981号公报)、来自放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)ADl才朱的HheC(J.Bacteriology,183(17),5058-5066,2001)、来自根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的HalB(Thesis(1996)UniversityofWales,Cardiff,UnitedKingdom)等。这些囟代醇环氧酶之中，对于氨基酸序列已知的酶，在美国生物工程学信息中心(NCBI;NationalCenterforBiotechnologyInformation)提供的GenBank凄史才居库(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgiCMD=search&DB=proterin)中,通过以下的AccessionNo.来注册。"AccessionNo.BAA14361":来自棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheA的氨基断列"AccessionNo.AAK92100":来自节杆菌属(Arthrobactersp.)AD2抹的HheAAD2的氛基,列"AccessionNo.BAA14362，，来自棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheB的氨基i饼列"AccessionNo.AAK73175，，来自分枝杆菌属(Mycobacteriumsp.)GP1"AccessionNo.AAK92099":来自放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1林的HheC的氨基酸序列"AccessionNo.AAD34609":来自才艮癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ha旧的氨基酸序列对于在本发明中主要例示的来自棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的卣代醇环氧酶HheB而言，有人报道了如下内容，由于其基因(HheB)有2个起始密码子，因而存在2种卣代醇环氧酶，这两种酶的区别仅在于N末端附近的8个氨基酸残基的有无(Biosci.Biotechnol.Biochem.,58(8),1451-1457,1994)。在本发明中，将两者(上述2种囟代醇环氧酶)区别称呼时，将包含由最初的起始密码子翻译出来的氨基酸序列(序列号1)的HheB称作"HheB(lst)"，将包含由第2个起始密码子翻译出来的氨基酸序列(序列号2)称作"HheB(2nd)"，这些都是野生型卣代醇环氧酶。这里，就包含用序列号1表示的氨基酸序列的HheB(1st)而言，氨基酸序列I相当于包含第126号第144号的氨基酸残基的序列，氨基酸序列II相当于包含第198号第207号的氨基酸残基的序列。同样地，就包含用序列号2表示的氨基酸序列的HheB(2nd)而言，氨基酸序列I相当于包含第118号~第136号的氨基酸残基的序列，氨基酸序列II相当于包含第l卯号第199号的氨基酸残基的序列。另外，HheB(2nd)的氨基酸序列因受前述的两个起始密码子的影响，是包含缺失HheB(Ist)的氨基酸序列中的N末端附近的8个氨基酸残基(具体来讲，用序列号1表示的氨基酸序列中的第1号~第8号的氨基酸残基)的状态的氨基酸序列。在本说明书中，主要以来自棒状杆菌属(corynebacteriumsp.)N-1074林的野生型卣代醇环氧酶HheB为例进行说明，但如前所述，并不限定卣代醇环氧酶的由来，即使是HheB以外的卣代醇环氧酶，只要是具有包含前述氨基酸序列i和氨基酸序列n的氨基酸序列的酶，也可以应用同样的说明。另外，通过对本发明所示的变异的位置或变异的氨基酸种类或者碱基序列进行操作，也可以得到任一种改良型卣代醇环氧酶。在本发明中，说到"高同源性"时，是指例如60%以上的同源性，优选为75%以上的同源性，特别优选为90%以上的同源性。(II-2)改良型卣代醇环氧酶本发明中的"改良型卣代醇环氧酶"是包含如下的氨基酸序列的酶，所述氨基酸序列是主要利用基因重组技术，对野生型卣代醇环氧酶的氨基酸序列导入至少一个氨基酸取代变异而得到的氨基酸序列，是每个转化体的卣代醇环氧酶活性、立体选棒性、生成物阻碍耐性、生成物积累能力等得到提高的囟代醇环氧酶。本发明中的改良型卣代醇环氧酶包括每个转化体的卣代醇环氧酶活性比野生型囟代醇环氧酶高的酶。作为这里所说的每个转化体的卣代醇环氧酶活性的提高的本质的原因，可以A^因于氨基酸取代变异的任何原因，可以举出例如每个酶蛋白质的比活性自身的提高、活性型构象形成能力的提高、转化体内的表达量增加、转化体内的酶的稳定性提高、对底物耐性的提高、生成物阻碍感受性的降低等。所说的"每个转化体的卣代醇环氧酶活性"是指"每单位重量转化体干燥菌体的卣代醇环氧酶活性"，也称"菌体比活性"(本说明书中，有时将干燥菌体称作"DC")。另外，所说的"每个可溶性蛋白质的卣代醇环氧酶活性"是指"每单位重量可溶性蛋白质的卣代醇环氧酶活性"，也称作"蛋白质比活性"。此外，在本发明中，可以由一定量的转化体方便地得到一定量的可溶性蛋白质，"每个转化体的卣代醇环氧酶活性"("菌体比活性")与"每个可溶性蛋白质的卣代醇环氧酶活性"("蛋白质比活性")成正比。即，如果"每个可溶性蛋白质的囟代醇环氧酶活性，，("蛋白质比活性")高(如果低)，则"每个转化体的卣代醇环氧酶活性"("菌体比活性")高(低)。另外，在本发明中，所说的"液活性"是指每单位溶液量的卣代醇环氧酶活性。作为该溶液，可以举出含有能从培养生产卣代醇环氧酶的转化体而得到的"培养物"所得到的物质的溶液。具体来讲，可以举出培养液、培养液上清液、细胞或菌体悬浊液、细胞或菌体破碎液、粗酶液以及它们的处理物等。通过将"液活性"除以其溶液的菌浓度或者可溶性蛋白质浓度，可以算出"每个转化体的卣代醇环氧酶活性"("菌体比活性")或者"每个可溶性蛋白质的卣代醇环氧酶活性"("蛋白质比活性")。另外，本发明中所说的"活性回收率"是指以一定的操作前的活性17为100%,操作后回收的活性的相对比(％)。本发明的改良型卣代醇环氧酶中包含具有如下属性的酶，即，从底物l，3-二卣代-2-丙醇或者表卣代醇生成表卣代醇或4-面代-3-羟基丁腈的情况的该生成物的光学纯度比利用野生型卣代醇环氧酶从相同底物生成相同生成物的情况的该生成物的光学纯度高。即，包含对作为底物的1，3-二卣代-2-丙醇和/或表由代醇的立体选择性比野生型卣代醇环氧酶得到提高的酶。作为立体选择性提高的本质的原因，可以是起因于氨基酸取代变异的任何原因。在本发明中，所说的"光学活性"是指含有的一种镜像异构体多于另外的镜像异构体的物质的状态，或者仅由任一种镜像异构体构成的物质的状态。另外，所说的"光学纯度"大致等同于"镜像异构体过剩率(％ee)"，用下式定义。光学纯度—镜像异构体过剩率-100x([R]-[S])/([R]+[S])(%ee)这里，[R]和[S]表示试样中的镜像异构体的各自浓度。另外，本发明中，所说的"立体选择性"是指由底物生成生成物时，卣代醇环氧酶优先催化生成其中一种镜像异构体的反应的性质。另外，本发明的改良型囟代醇环氧酶包括生成物阻碍性提高的酶，即，包含对反应阻碍的耐性比野生型卣代醇环氧酶得到提高的酶，所述反应阻碍是由来自1，3-二卣代-2-丙醇或者表卣代醇的生成物即氯化物离子或4-卣代-3-羟基丁腈所引起的。作为生成物阻碍耐性提高的本质的原因，可以是起因于氨基酸取代变异的任何原因。另外，本发明的改良型卤代醇环氧酶包括生成物积累能力得到提高的酶，即，包含具有如下属性的酶，在由底物1,3-二卣代-2-丙醇或表卣代醇生成表卤代醇或4-卣代-3-羟基丁腈的情况下，可以使生成物高浓度生成并积累的属性。作为生成物积累能力提高的本质的原因，可以是起因于氨基酸取代变异的任何原因。就本发明的"改良型面代醇环氧酶"而言，具体来讲，包括这样的氨基酸序列，即，对前述的包含氨基Sl/f列I和氨基S拼列II的野生型卤代醇环氧酶的氨基酸序列导入选自以下的(A)(D)的任一个或多个氨基酸变异而得到的氨基*列。(A)比起始氨基酸残基离C末端侧近一个残基的氨基酸残基被取代成其他氨基酸的氨基酸变异；(B)a14残基被取代成其他氨基酸的氨基酸变异；(C)a15残基被取代成其他氨基酸的氨基酸变异；(D)|321残基被取代成其他氨基酸的氨基酸变异。.上述(A)中所说的"起始氨基酸残基"是指与基因(DNA或mRNA)中翻译起始密码子编码的野生型卣代醇环氧酶的氨基酸对应的氨基酸残基，即，是指翻译后的野生型卣代醇环氧酶的氨基酸序列中的N末端氨基酸残基(通常为甲硫氨酸残基)。上述(A)(D)的氨基酸变异，也可以通过将位于野生型卣代醇的氨基酸序列的最N末端侧的起始氨基酸残基(通常为曱硫氨酸残基)定义为第1号时，是从该起始氨基酸残基至C末端侧的第几号氨基酸残基的氨基酸变异的方式来指明。例如，在野生型卣代醇环氧酶为包^^序列号1所示的氨基酸序列的来自棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheB(1st)的情况下，(A)中的"比起始氨基酸残基离C末端侧近一个残基的氨基酸残基"、(B)中的"al4残基"、(C)中的"al5残基"和(D)中的"(321残基"分别相当于(A)第2号的氨基酸残基(丙氨酸残基)、(B)第141号的氨基酸残基(苏氨酸残基)、(C)第144号的氨基酸残基(苯丙氨酸残基)以及(D)第207号的氨基酸残基(天冬氨酸残基)。另外，在野生型卣代醇环氧酶为包括序列号2所示的氨基酸序列的来自棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)N-1074株的HheB(2nd)的情况下，(A)中的"比起始氨基酸残基离C末端侧近一个残基的氨基酸残基"、(B)中的"al4残基"、(C)中的"al5残基"和(D)中的"卩21残基"分别相当于(A)第2号的氨基酸残基(丙氨酸残基)、(B)第133号的氨基酸残基(苏氨酸残基)、(C)第136号的氨基酸残基(苯丙氨酸残基)以及(D)第199号的氨基酸残基(天冬氨酸残基)。但是，HheB(2nd)如前所述，不过是包含缺失了HheB(1st)的氨基S吏序列中的N末端附近的8个氨基酸残基的氨基酸序列的蛋白质，HheB(1st)和HheB(2nd)这两个氨基酸序列中的各氨基酸残基的绝对的作用实质上是相同的。作为本发明的"改良型卤代醇环氧酶"的优选的方式，可以举出例如包含导入了选自以下的(E)(H)的任一个或多个氨基酸变异而得到的氨基酸序列的酶。(E)比起始氨基酸残基(通常为曱硫氨酸残基)离C末端侧近一个残基的氨基酸残基被取代成作为其他氨基酸的赖氨酸或天冬酰胺的氨基酸变异；(F)氨基酸序列I中的a14残基被取代成作为其他氨基酸的丙氨酸、半胱氨酸或丝氨酸的氨基酸变异；(G)氨基酸序列I中的a15残基被取代成作为其他氨基酸的丙氨酸、丝氨酸或色氨酸的氨基酸变异；(H)氨基S交序列II中的(321残基被取代成作为其他氨基酸的谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或曱硫氨酸的氨基酸变异。这里，上述(E)(H)的氨基酸变异是对前述的(A)(D)的氨基酸酸"的具体例子的变异)。因此，与前述的(A)~(D)的情况相同，上述(E)中的"比起始氨基酸残基离C末端侧近一个残基的氨基酸残基"、(F)中的"al4残基"、(G)中的"al5残基，，和(H)中的"(321残基"，也可以分别通过将位于野生型卤代醇环氧酶的氨基酸序列的最N末端侧的起始氨基酸残基(通常为甲硫氨酸残基)定义为第1号时，是从该起始氨基酸残基至C末端侧的第几号氨基酸残基的氨基酸变异的方式来指明。即，例如在野生型卤代醇环氧酶为包含序列号1所示的氨基酸序列的来自棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheB(Ist)的情况下，上述(E)~(H)的氨基酸变异的方式可以如下指明。(E)第2号的氨基酸残基(丙氨酸残基)被取代成赖氨酸或天冬酰胺的氨基酸变异；(F)第141号的氨基酸残基(苏氨酸残基)被取代成丙氨酸、半胱氨酸或丝氨酸的氨基酸变异；(G)第144号的氨基酸残基(苯丙氨酸残基)被取代成丙氨酸、丝氨酸或色氨酸的氨基酸变异；(H)第207号的氨基酸残基(天冬氨酸残基)被取代成谷氨酰胺、谷氨20酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸的氨基酸变异。另夕卜，在野生型囟代醇环氧酶为包括序列号2所示的氨基酸序列的来自棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)N-1074林的HheB(2nd)的情况下，上述(E)~(H)的氨基酸变异的方式可以如下来指明。(E)第2号的氨基酸残基(丙氨酸残基)被取代成赖氨酸或天冬酰胺的氨基酸变异；(F)第133号的氨基酸残基(苏氨酸残基)被:取代成丙氨酸、半胱氨酸或丝氨酸的氨基酸变异；(G)第136号的氨基酸残基(苯丙氨酸残基)被取代成丙氨酸或丝氨酸的氨基酸变异；(H)第199号的氨基酸残基(天冬氨酸残基)被取代成谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、异亮氨酸或酪氨酸的氨基酸变异。作为本发明的"改良型卤代醇环氧酶"的更具体和优选的方式，在野生型面代醇环氧酶为具有序列号1所示的氨基酸序列的来自棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)N-1(H4林的HheB(Ist)的情况下，可以举出具有序列号315和7679所示的氨基酸序列的改良型卣代醇环氧酶。另外，在野生型面代醇环氧酶为包括序列号2所示的氨基酸序列的来自棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheB(2nd)的情况下，可以举出具有序列号1628和8083所示的氨基酸序列的改良型卣代醇环氧酶。以下，将序列号315和7679所示的氨基酸序列中的氨基酸变异(氨基酸取代)的方式示于表A中，将序列号16-28和8083所示的氨基S交序列中的氨基酸变异(氨基酸取代)的方式示于表B中。这里，表A中的"Ala2"、"Thrl41"、"Phel44"和"Asp207"的标记表示序列号1的氨基酸序列中的作为氨基酸取代的对象的氨基酸残基的位置和种类(3个字母标记)，例如，"Thrl41"意味着第141号的苏氨酸残基。另外，这些"Ala2"等下栏中的标记表示序列号3~15和76~79的各氨基酸序列的氨基酸取代后的氨基酸残基，例如，如果是序列号3的氨基酸序列，则由于在"Ala2"的下栏标记"Lys"，因此意味着是第2号的丙氨酸残基被取代成赖氨酸残基的氨基酸序列。这里，标记"-"意味着没有氨基酸取代。此外，将编码氨基酸取代后的各氨基酸序列的碱基序列(后述)的序列号一并标记于表的最右栏。以上的表A中的标记的说明同样也适用于表B中。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>[表B]<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>本发明的改良型囟代醇环氧酶只要是包含具有一个以上选自上述(A)(D),优选为(E)(H)的氨基酸变异的氨基酸序列的酶即可。因而，本发明的改良型卣代醇环氧酶中也包括具有如下氨基酸序列的酶，所述氨基酸序列将多个上述(A)(H)的特征(即，(A)~(H)的氨基酸变异)以组合的方式来具有。另外，本发明中的改良型卣代醇环氧酶的范围中也包含如下的改良型卤代醇环氧酶，该酶在维持着上述(A)~(H)的氨基酸变异的方式的同时，进一步包括对作为改良型卣代醇环氧酶基础的野生型卣代醇环氧酶的氨基酸序列导入选自以下(i)~(iii)的任一个或多个氨基酸变异而得到的氨基酸序列。(i)从除了比起始氨基酸残基离C末端侧近一个残基的氨基酸残基、氨基酸序列I中的a14残基、氨基酸序列中的a15残基以及氨基酸序列中的卩21残基以外的氨基酸残基中选择的1个或数个氨基酸残基被取代成其他氨基酸的氨基酸变异；(ii)从除了比起始氨基酸残基离C末端侧近一个残基的氨基酸残基、氨基酸序列I所含的氨基酸残基以及氨基酸序列II所含的氨基酸残基以外的氨基酸残基中选择的1个或数个氨基酸残基发生缺失的氨基酸变异；(iii)在比起始氨基酸残基离C末端侧近两个以上残基的氨基酸残基构成的区域中的由氨基酸序列I和氨基酸序列II构成的区域以外的区域中，插入l个或数个任意氨基酸残基的氨基酸变异。就上述(i)~(iii)的方式而言，所说的"1个或多个"是指例如1个~10左右，优选1个5个。在本发明中，有时用3个字母或1个字母标记来表示氨基酸的种类。此外，有时在数字之前或之后配以3个字母或1个字母来标记，此时，表示氨基酸残基的位置和取代前后的氨基酸的种类。即，只要没有特别说明，数字表示，如上所述，将利用翻译起始密码子编码的氨基酸残基(通常，为曱硫氨酸)定义为第1号的情况下是第几号的氨基酸残基。另夕卜，数字之前表示的3个字母或1个字母表示氨基酸取代前的氨基酸的3个字母或1个字母标记，数字之后表示的3个或1个字母表示发生氨基酸取代情况下的取代后的氨基酸的3个或1个字母标记。例如，第207号的天冬氨酸残基有时标记成"Asp207"或"D207"，第207号的天冬氨酸残基被取代成组氨酸的情况下，有时标记成"Asp207His"或"D207H"。(III)卣代醇环氧酶基因(in-i)野生型卣代醇环氧酶基因对于野生型卣代醇环氧酶之中已知其基因序列(碱基序列)的酶而言，在通过美国生物工程学信息中心(NCBI;NationalCenterforBiotechnologyInformation)4是供^fGenBank凄史才居库(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgiCMD=search&DB=proterin)中，通过以下的AccessionNo.进行注册。24"AccessionNo.D90349":编码来自棒状杆菌属(corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheA的基因的碱基序列；"AccessionNo.AF397297，，编码来自节杆菌属(Arthrobactersp.)AD2抹的HheAAD2的基因的碱基序列；"AccessionNo.D90350":编码来自棒状杆菌属(corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheB的基因的碱基序列；"AccessionNo.AY044094":编码来自分枝杆菌属(Mycobacteriumsp.)GP1林的他eB(jp,的基因的石威基序列；"AccessionNo.AF397296，，编码来自放射形土i襄斥干菌(Agrobacteriummdiobacter)AD1株的HheC的基因的碱基序列；"AccessionNo.AF149769":编码来自根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ha旧的基因的碱基序列；在本发明中，将这些称作"野生型面代醇环氧酶基因"。这里，该"野生型卣代醇环氧酶基因"中的"野生型"这个词是与"囟代醇环氧酶"有关的词，意味着卣代醇环氧酶的氨基酸序列是"野生型"。构成本发明的"野生型卤代醇环氧酶基因"的碱基序列只要是编码能在转化体宿主中利用的密码子的序列即可，未必限于来源生物基因组DNA上所编码的野生型卣代醇基因的碱基序列。将编码(II-l)野生型卣代醇环氧酶中描述的HheB(1st)的野生型囟代醇环氧酶基因称作HheB(1st),将编码HheB(2nd)的基因称作HheB(2nd)。HheB(1st)的碱基序列由序列号29表示，HheB(2nd)的碱基序列由序列号30表示。作为取得已知石咸基序列的野生型卣代醇环氧酶基因的方法，可以举出如下方法，即，由来源生物制备基因组DNA,以已知的野生型卣代醇环氧酶基因序列信息为基础来设计引物，使用该引物用PCR法将编码卤代醇环氧酶的基因进行扩增。作为来源生物，可以举出例如N-1074抹，该抹以保藏号"FERMBP-2643",在昭和63年11月10日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1-1-1中央第6(以下，在本说明书中相同))。另夕卜，也可以以公知的基因序列信息为基础，利用组合有合成寡聚DNA的PCR法(assemblyPCR)等，化学合成野生型卣代醇环氧酶基因的全长。例如，将野生型卣代醇环氧酶基因分割成几个区域(例如，50个碱基左右)，设计并合成多个在两端具有与相邻的区域重叠碱基(例如，20个碱基左右)的寡核苷酸。可以通过用PCR法使该寡核苷酸互相退火，来扩增野生型卣代醇环氧酶基因。另外，根据需要，也可以变更野生型卣代醇环氧酶基因的密码子。作为变更密码子的手段，可以使用例如MolecularCloning,ALabroatoryManual2nded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)、CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(1987-1997)等记载的利用部位特异变异诱导法或部位特异突变诱导法的变异导入用试剂盒(例如，QuickChangeTMSite-DirectedMutagenesisKit(stratagene公司制造)、GeneTailorTMSite-DirectedMutagenesisSystem(invitrogen公司制造)、TaKaRaSite-DirectedMutagenesisSystem(Mutan-K、Mutan-SuperExpressKm等宝生物公司制造)等来进行。此外，如上所述，进行组合有合成寡聚DNA的PCR法(assemblyPCR)时，也可以通过^f吏用变更密码子的引物来变更密码子。(III-2)改良型卣代醇环氧酶基因所说的本发明的改良型卣代醇环氧酶基因是指编码(II-2)中所述的改良型离代醇环氧酶酶蛋白的基因。所说的本发明的改良型卣代醇环氧酶基因是编码具有如下氨基^列的改良型囟代醇环氧酶的基因，所述氨基S臾序列例如是对包含序列号1或序列号2所示的氨基酸序列的野生型卤代醇环氧酶导入选自所述(II-2)的(A)~(D)的任一个或多个氨基酸变异而得到的序列，更优选为编码具有导入选自所述(II-2)的(E)~(H)的任一个或多个氨基酸变异而得到的氨基S^f列的改良型卣代醇环氧酶的基因。构成野生型卣代醇环氧酶基因和上述氨基酸变异导入后的氨基酸残基的碱基序列，只要是编码可在转化体宿主中利用的密码子的碱基序列即可，未必限于来源生物基因组DNA上所编码的野生型卣代醇环氧酶基因的碱基序列。对前述(II-l)的野生型卣代醇环氧酶中叙述的HheB(1st)进行编码的野生型面代醇环氧酶基因即HheB(lst)、以及编码HheB(2nd)的野生型卣代醇环氧酶基因即HheB(2nd),也都可以用作野生型卣代醇环氧酶基因，该野生型卣代醇环氧酶作为用于得到改良型囟代醇环氧酶基因的基础。作为本发明中的"改良型卤代醇环氧酶基因"26的更具体也是优选的方式，在野生型卣代醇环氧酶为具有序列号1所示的氨基酸序列的来自棒状杆菌属(corynebacteriumsp.)N-1074林的HheB(1st)的情况下，可以举出具有序列号31~43以及8487所示的碱基序列的改良型卣代醇环氧酶基因。另外，在野生型囟代醇环氧酶为具有序列号2所示的氨基酸序列的来自棒状杆菌属(corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheB(2nd)的情况下，可以举出具有序列号44~56以及88~91所示的碱基序列的改良型卣代醇环氧酶基因。本发明的改良型面代醇环氧酶基因只要是编码导入有1个以上选自前述的(II-2)的(A)~(H)的氨基酸变异的改良型卣代醇环氧酶的氨基酸序列的基因即可，因而，也包括编码将多个前述(II-2)的(A)(H)的特征(即(A)(H)的氨基酸变异)以组合方式来具有的改良型卣代醇环氧酶的氨基酸序列的基因。另夕卜，本发明中的改良型卣代醇环氧酶基因的范围中也包含编码如下的改良型卣代醇环氧酶的氨基酸序列的基因，该酶在维持着前述(II-2)的(A)(H)的氨基酸取代的方式的同时，进一步在作为改良型卤代醇环氧酶基础的野生型卣代醇环氧酶的氨基酸序列导入选自前述(II-2)的(i)~(iii)的任一个氨基酸变异。进而，作为本发明的改良型卣代醇环氧酶基因，也包括具有与编码改良型卣代醇环氧酶的氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的DNA，所述改良型卤代醇环氧酶导入有选自前述(II-2)的(A)~(H)的任一个或多个氨基酸变异；在严格条件下杂交的DNA。这样的DNA可通过如下方法获得，例如，以包含对导入有选自上述(A)(H)的任一个或多个氨基酸变异的氨基S吏序列进行编码的碱基序列的改良型卣代醇环氧酶基因DNA或其互补序列或者它们的片段作为探针，通过菌落杂交、噬斑杂交、DNA印记法等公知的杂交法来获得cDNA文库以及基因组文库。文库可以利用由^^知的方法制作的文库，也可以利用市售的cDNA文库以及基因组文库。所说的"严格的条件"是指杂交后的洗涤时的条件，即，盐浓度为3002000mM、温度为4075。C的条件，优选为盐浓度600900mM、温度为65。C的条件。可以举出例如2xSSC且50。C等的条件。如果是本领域技术人员，除了这样的緩冲液的盐浓度、温度等条件以外，还可以加入其他的探针浓度、探针的长度、反应时间等诸条件，来设定出用于得到具有与编码改良型卣代醇环氧酶的氨基酸序列相互补的碱基序列的DNA和在严格条件下杂交的DNA的条件，所述改良型囟代醇环氧酶导入有选自前述(II-2)的(A)~(H)的任一个或多个氨基酸变异。对于杂交法的详细步骤，可以参照MolecularCloning,ALaboratoryManual2nded.(ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))等。作为杂交的DNA，可以举出包含以下碱基序列的DNA或者其部分片段，所述碱基序列相对于编码导入有选自前述(n-2)的(A)(H)的任一个或多个氨基酸变异而得到的氨基S吏序列的碱基序列至少具有40%以上、优选60%、更优选90%以上的同源性。在本发明中，制备改良型卣代醇环氧酶基因的方法可以是导入变异的已知的任一种方法，通常，可以用公知的方法来进行。例如，可以举出以野生型卣代醇环氧酶基因为基础，利用市售的试剂盒来产生部位特异性取代的方法，或者选择性地开裂基因DNA,接着除去或添加所选择的寡聚核苦酸并进行连接的方法等。这些部位特异变异诱导法记载于"MolecularCloning,ALabroatoiyManual2nded.，，(ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))、"CurrentProtocolsinMolecularBiology"(JohnWiley&Sons(1987-1997))、Kunkel,Proc.Natl.Sci.USA,82:488-492(1985)、KramerandFritzMethod.Enzymol.，154:350-367(1987)、Kunkel，Method.Enzymol.,85:2763-2766(1988)等。近年，可以使用利用了基于Kunkel法或Gappedduplex的部位特异的突变诱导法的变异导入用试剂盒来进行，所述试剂盒例如有QuickChangeTMSite-DirectedMutagenesisKit(stratagene公司制造)、GeneTailorTMSite-DirectedMutagenesisSystem(invitrogen公司制造)、TaKaRaSite-DirectedMutagenesisSystem(Mutan-K、Mutan-SuperExpressKm等宝生物株式会社制造)等。另夕卜，作为目的的变异导入位置存在于对象基因序列中容易消化、连接的限制性内切酶部位的附近的情况下，通过使用导入了目的变异的引物(合成寡聚DNA)进行PCR，可以容易地得到导入了目的变异的基因DNA片段。此外，也可以用组合有合成寡聚DNA的PCR法(assemblyPCR)进行延伸来得到合成基因。另外，通过使其与羟胺、亚硝酸等作为变异源的药剂进行接触、作用的方法、利用紫外线照射诱导变异的方法、使用PCR(聚合酶链式反应)随机导入变异的方法等随机变异导入法，也可以由野生型卣代醇环氧酶基因得到改良型卣代醇环氧酶基因。(IV)重组载体、转化体(IV-1)重组载体为了使通过上述方法得到的本发明的改良型囟代醇环氧酶基因在宿主中表达，可以在基因的上游插入转录启动子，在下游插入终止子，从而构建表达盒，将该盒插入表达载体。或者，在该改良型卣代醇环氧酶基因的表达载体中已经存在转录启动子和终止子的情况下，可以不构建表达盒，只要利用载体中的启动子和终止子在其间插入该变异基因即可。为了在载体中插入该改良型卣代醇环氧酶基因，可以利用使用限制性内切酶的方法、使用拓朴异构酶的方法等。另外，如果在插入时有必要的话，也可以添加适当的接头。在本发明中，也可以在进行改良型卣代醇环氧酶基因的制备操作的同时，进行这样的重组操作。即，可以使用具有取代成编码其他氨基酸的碱基序列的碱基序列的引物，以克隆有野生型闺代醇环氧酶基因的重组载体为模板，进行PCR，将得到的扩增产物组入载体中。启动子的种类只要是能在宿主中适当地表达的启动子就没有特别限制，例如，作为可在大肠杆菌宿主中利用的启动子，可以举出色氨酸操纵子的trp启动子、乳糖操纵子的lac启动子、来自入噬菌体的PL启动子以及PR启动子等，也可以利用被改变、设计成tac启动子、trc启动子这样的序列。作为可在枯草菌宿主中利用的启动子，可以举出葡糖酸合成酶启动子(gnt)、碱性蛋白酶启动子(apr)、中性蛋白酶启动子(npr)、a-淀粉酶(amy)等。作为可在红球菌属细菌宿主中利用的启动子，可以举出表达载体pSJ034中所含有的来自灰暗诺卡氏菌诺卡氏菌(Rhodococcuserythropolis)SK92-B1林的腈水解酶表达调节基因所涉及的启动子。pSJ034是在红球菌(Rhodococcus)属细菌中表达腈水合酶的质粒，可以用日本特开平10-337185号公报所示的方法由pSJ023来制作。pSJ023作为转化体ATCC12674/pSJ023(保藏号"FERMBP-6232")的形态，于平成9年3月4日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1-1-1中央第6)。29终止子未必是必要的，其种类并不特别限定，可以举出例如p因子非依赖性终止子，例如有脂蛋白终止子、trp操纵子终止子、miB终止子等。另外，作为对于翻译成氨基酸重要的》成基序列，已知有SD序列和Kozak序列等核糖体结合序列，可以将这些序列插入变异基因的上游。将原核生物用作宿主时，可通过PCR法等添加SD序列，将真核细胞用作宿主时，可通过PCR法等添加Kozak序列。作为SD序列，可以举出来自大肠杆菌或者来自枯草杆菌的序列等，但只要是在大肠杆菌或枯草杆菌等理想的宿主内起作用的序列即可，并无特别限制。例如，可以通过DNA合成来制作共有序列并进行利用，所述共有序列是与16S核糖体RNA的3，末端区域相互补的序列为4个碱基以上相连续的碱基的序列。通常，载体中包含用于筛选作为目的的转化体的因子(选择标记)。作为选择标记，可以举出耐药性基因或营养要求性互补基因、同化性赋予基因等，可以根据目的或宿主进行选择。例如，作为在大肠杆菌中用作选择标记的耐药性基因，可以举出抗氨爷西林基因、卡那霉素基因、二氢叶酸还原酶基因、抗新霉素基因等。本发明中使用的载体，只要是保持上述变异基因的载体即可，并无特别限制，可以使用适于各宿主的载体。作为载体，可以举出例如质粒DNA、噬菌体DNA、逆转座子DNA、人工染色体DNA等。例如，以大肠杆菌作为宿主的情况下，可以使用具有可在大肠杆菌内自我复制的区域的pTrc99A(CentraalbureauvoorSchimmelcultures(CBS)、荷兰；http:〃www.cbs.knaw.n1/)、pUC19(宝生物，日本)、pKK233-2(CentraalbureauvoorSchimmelcultures(CBS)、荷兰；http:〃www.cbs.knaw.n1/)、pET-12(Novagen公司，德国)、pET-26b(Novagen公司，德国)等。另外，也可以根据需要，使用改变了这些载体的物质。另外，也可以使用表达效率高的表达载体，例如具有trc启动子、lac操纵子的表达载体pTrc99A或者pKK233-2等。含有上述改良型囟代醇环氧酶基因的重组载体，被包含在本发明的范围内。作为含有改良型卣代醇环氧酶基因的重组载体的具体例子，可以举出例如本发明中例示的pSTK002、pSTK003、pSTT002、pSTT003、pSTT002-T133A、pSTT002-T136C、pSTT002-T133S、pSTT002-F136A、pSTT002-F136S、pSTT002-F136W、pSTT002-D199Q、pSTT002-D199E、pSTT002-D199H、pSTT002-D199S、pSTT002-D199T、pSTT002-D199Y、pSTT002-D199L、pSTT002-D199M、pSTT002-D199I等。(IV-1)转化体通过将本发明的重组载体对宿主进行形质转换或形质导入，制作转化体或转导体(以下，将它们统称为"转化体")。该转化体也被包含于本发明的范围内。在本发明中使用的宿主，只要在导入上述重组载体后，能够表达目的改良型卤代醇环氧酶，就没有特別限制。作为宿主，可以举出例如大肠杆菌、枯草杆菌、红球菌属细菌等细菌、酵母(Pichia,Saccharomyces)、曲霉菌(Aspergillus)、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等。以细菌作为宿主的情况下，在本发明中，可以优选使用大肠杆菌、红球菌属细菌作为宿主。作为大肠杆菌，可以举出例如大肠杆菌K12林和B林、或者来自它们的野生林的派生林即JM109株、XL1-Blue株、C600林等。特别是，将上述乳糖操纵子的lac启动子及其派生启动子用作表达启动子的情况下，如果使用具有lacI阻遏物基因的宿主，则表达就是诱导型(用IPTG等诱导)，如果使用没有lacl阻遏物基因的宿主，则表达就是构成型，因此，可以利用适应需要的宿主。这些菌林可以从美国标准菌种收藏所(ATCC)等容易地获得。作为枯草杆菌，可以举出例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等。作为红球菌(Rhodococcus)属细菌，可以举出例如紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)ATCC999抹、ATCC12674抹、ATCC17895株、ATCC15998抹、ATCC33275抹、ATCC184、ATCC4001林、ATCC4273株、ATCC4276抹、ATCC9356林、ATCC12483抹、ATCC14341抹、ATCC14347株、ATCC14350抹、ATCC15905抹、ATCC15998抹、ATCC17041林、ATCC19149株、ATCC19150林、ATCC21243林、ATCC29670株、ATCC29672抹、ATCC29675抹、ATCC33258抹、ATCC13808抹、ATCC17043抹、ATCC1卯67林、ATCC21999抹、ATCC21291抹、ATCC21785株、ATCC21924抹、IF014894林、IF03338林、NCIMB11215抹、NCIMB11216抹、JCM3202株、紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)Jl林(保藏号"FERMBP-1478")、球状红球菌(Rhodococcusgloberulus)IF014531抹、藤黄红球菌(Rhodococcusluteus)JCM6162抹、JCM6164株、灰暗诺卡氏菌诺卡氏菌(Rhodococcuserythropolis)IF012538抹、IFO12320抹、马红球菌(Rhodococcus叫ui)IFO3730抹、JCM1313抹。优选的举出紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)Jl林(保藏号"FERMBP-1478")。上述ATCC株可以从美国标准菌种收藏所获得，IFO林可以从独立行政法人制品评价技术基础机构生物科技本部生物遗传资源部门(NBRC)获得，JCM抹可以从独立行政法人理化学研究所生物资源中心微生物材料开发室获得，FERM抹可以从独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心获得。作为向细菌导入重组载体的方法，只要是向细菌中导入DNA的方法就没有特别限制。可以举出例如使用4丐离子的方法、电穿孔法等。以酵母作为宿主的情况下，可以-使用例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂歹直酵母(Schizosaccharomycespombe)、巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)等。作为向酵母导入重组载体的方法，只要是向酵母中导入DNA的方法就没有特别限制，可以举出例如电穿孔法、原生质球法、醋酸锂法等。以动物细胞为宿主的情况下，可以使用猴细胞COS-7、Vero、CHO细胞、小鼠细胞、大鼠GH3、人FL细胞等。作为向动物细胞中导入重组载体的方法，可以举出例如电穿孔法、磷酸钧法、脂质转染法等。以昆虫细胞为宿主的情况下，可以使用Sf9细胞、Sf21细胞等。作为向昆虫细胞中导入重组载体的方法，可以使用例如磷酸钙法、脂质转染法、电穿孔法等。以植物细胞为宿主的情况下，可以举出烟草BY-2细胞等，但并不限于这些。作为向植物细胞中导入重组载体的方法，可以使用例如土壤杆菌法、基因枪法、PEG法、电穿孔法等。上述通过含有改良型卣代醇环氧酶基因的重组载体所得到的转化体被包含于本发明的范围内。作为通过含有改良型卤代醇环氧酶基因的重组载体所得到的转化体的具体例子，可以举出例如本发明中所例示的JM109/pSTK002、JM109/pSTK003、JM109/pSTT002、JM109/pSTT003、JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-T133C、JM109/pSTT002-T133S、JM109/pSTT002-F136A、JM109/pSTT002-F136S、JM109/pSTT002-F136W、JM109/pSTT002-D199Q、JM109/pSTT002-D199E、JM109/pSTT002-D199H、JM109/pSTT002画D199S、JM109/pSTT002-D199T、JM109/pSTT002-D199Y、JM109/pSTT002曙D199L、JM109/pSTT002-D199M、JM109/pSTT002-D199I等。(V.)改良型卣代醇环氧酶的制造方法在本发明中，改良型卣代醇环氧酶可以是培养上述转化体得到的培养物自身或者从培养物中提取来制造。在本发明中，所说的"培养物，，是指包括培养液、培养液上清液、细胞或菌体、细胞或菌体悬浊液、细胞或菌体破碎液、粗酶液及它们的处理物等通过培养生产改良型离代醇环氧酶的转化体所得到的物质以及源于它们的物质中的任一种。培养本发明的转化体而得到的培养物也包括在本发明的范围内。培养本发明的转化体的方法，可以按照宿主的培养中所使用的通常的方法来进行。目的改良型卣代醇环氧酶在上述培养物中的任一种中被积累。本发明的培养转化体的培养基，只要是含有宿主能够同化的碳源、氮源、无机盐类等，可有效地培养转化体的培养基即可，可以使用天然培养基、合成培养基中的任一种。作为碳源，可以举出葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、棉子糖、淀粉等碳水化合物、醋酸、丙酸等有机酸、乙醇、丙醇等醇类。作为氮源，可以举出氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐或其他的含氮化合物。另外，可以使用蛋白胨、酵母粉、肉膏、玉米浆、各种氨基酸等。作为无机物，可以举出亚磷酸钾、磷酸钾、磷酸锰、硫酸锰、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、碳酸钙等。另外，根据需要，为了防止培养中产生发泡，也可以添加消泡剂。另外，根据需要，也可以适当地添加维他命。培养中，根据需要，可以向培养基中添加氨节西林或四环素等抗生素。培养过程中，为了防止载体和目的基因的脱落，可以以施加选择压的状态来培养。即，在选择标记为耐药性基因的情况下，可以向培养基中添加与^目应的药剂，在选择标记为营养要求性互补基因的情况下，可以从培养基中除去与之相应的营养因子。另外，在选择标记为同化性赋予基因的情况下，可以根据需要添加与^目应的同化因子作为唯一的因子。例如，在培养用含有耐氨苄基因的载体进行形质转换的大肠杆菌的情况下，在培养中，可以根据需要向培养基中添加氨节西林。化体的情况下，可以根据需要在培养基中添加诱导剂。例如，培养用具有可由异丙基-P-D-硫代半乳糖香(IPTG)来诱导的启动子的表达载体进行形质转换的转化体时，可以在培养基中添加IPTG等。另外，培养用具有可由吲哚乙酸(IAA)来诱导的trp启动子的表达载体进行形质转换的转化体时，可以在培养基中添加IAA等。转化体的培养条件，只要是不妨碍目的改良型卣代醇环氧酶的生产率和宿主的繁育的条件即可，并无特别限制，通常，培养温度为10。C45。C，优选为10°C~40°C,更优选为15°C~40°C,进一步优选为20°C~37°C，根据需要，可以在培养过程中变更温度。培养温度为5~120小时，优选为5~100小时，进一步优选为10~100小时，更优选为15~80小时左右。使用无机或有机酸、碱溶液等来进行pH的调节，如果是大肠杆菌则通常调节为6~9。作为培养方法，可以举出固体培养、静置培养、振荡培养、通气搅拌培养等。特别是培养大肠杆菌转化体的情况下，优选通过振荡培养或通气搅拌培养(发酵罐)在好氧的条件下进行培养，此时，也可以用通常的固体培养法进行培养，但如果可能的话，优选采用液体培养法进行培养。作为培养所用的培养基，优选使用如下培养基，其是在例如酵母粉、胰蛋白胨、多聚蛋白胨、玉米浆、大豆或小麦麸的浸出液等1种以上氮源中添加氯化钠、亚磷酸钾、磷酸钾、硫酸镁、氯化镁、氯化铁、硫酸铁或硫酸锰等无机盐类的l种以上，进一步根据需要适当地添加糖质原料、维他命等而得到的培养基。培养基的初始pH值最好调节至7~9。另外，培养在5。C40。C进行5100小时，优选在10°C~37。C进行5100小时。优选通过通气搅拌深部培养、振荡培养、静置培养、流加培养等来实施。尤其是，以工业规模来生产改良型卣代醇环氧酶的情况下，可以利用通气搅拌培养。此外，作为通气搅拌培养的操作方式并无限制，可以选用分糸匕培养(batchculture)、半分糸匕培养(fed-batchculture,semi-batchculture)以及连续培养(continuousculture)中的任一种方式来进行。尤其是，在想通过高浓度培养来提高每个装置、每小时、每笔费用或每次操作的生产率的情况下，可以进行半分批式培养。在半分批式培养中使用的流加(fed)培养基成分，可以使用与初批(batch)培养基成分的组成相同的培养基，也可以变更组成，但优选培养基成分的浓度高于初批培养基的浓度。流加培养基的体积并无特别限制，通常，可以添加初始培养基的1/2以下的体积。作为添加流加培养基的方法(feedingmode),可以举出例如定流流加法(constant)、指凄t流力口法(exponential)、阶IS:增力口流力口法(stepwiseincrease)、比增歹直速度4空制;克力口法(specificgrowth-ratecontrol)、pH,争il力口';去(pH陽stat)、DO,争力充力口'法(DO-stat)、葡萄糖浓度控制流加法(glucoseconcentrationcontrol)、醋酸浓度监观'K危力口法(acetateconcentrationmonitoring)、才莫浙月3申经电i各;克力口法(fuzzyneuralnetwork)等(TrendsinBiotechnology(1996),14，98-105)，但只要能得到所希望的卣代醇环氧酶活性即可，并无特别限制。实施半分批式培养时的培养结束时期，没有必要限定于流化培养基的投入结束后，可以根据需要继续培养，在每个转化体的卣代醇环氧酶活性达到最高点时结束培养。作为对以动物细胞为宿主所得到的转化体进行培养的培养基，可以举出通常使用的RPMI1640培养基、DMEM培养基或者在这些培养基中添加有小牛血清等的培养基等。通常在存在5。/。C02的条件下，在37。C培养1~30天。在培养过程中，可以根据需要，在培养基中添加卡那霉素和盘尼西林等抗生素。在转化(转导)体为植物细胞或植物组织的情况下，可通过使用通常的植物培养用培养基，例如MS基本培养基、LS基本培养基等来进行培养。培养方法可以釆用通常的固体培养法、液体培养法中的任一种。在转化体为植物细胞或植物组织的情况下，可通过使用通常的植物培养用培养基，例如MS基本培养基、LS基本培养基等来进行培养。培养方法可以采用通常的固体培养法、液体培养法中的任一种。在上述培养条件下培养时，可以使本发明的改良型卣代醇环氧酶积累于上述培养物中，即，积累于培养液、培养液上清液、细胞、菌体或者细胞或者菌体的破碎物的至少一种。培养后，在改良型卣代醇环氧酶生产于菌体内或者细胞内的情况下，可以直接将菌体或者细胞用作物质生产的催化剂，或者，也可以通过破碎菌体或者细胞，来提取目的改良型卣代醇环氧酶。任何一种情况，如果有必要的话，可以通过离心分离或者膜过滤等固液分离操作来进行培养基的除去和洗涤。离心分离只要能够提供使菌体或者细胞沉降的离心力即可，并无特别限制，可以利用圆筒形和分离^1型等。作为离心力，可以以例如500G20000G左右进行。另外，可用于本工序的膜过滤，只要是能够实现作为目的的固液分离即可，可以是微滤(MF)膜、超滤'(UF)膜中的任一种，通常，优选使用微滤(MF)膜。就微滤而言，例如，如果基于流动方向，可以分类成死端或4晉流(切向流)方式，如果基于压力的施加方式，可以分类成重力式、加压式、真空式、离心力式等，如果基于操作方式，可以分类成分批式和连续式等，但只要能够进行固液分离操作即可，可以利用其中的任一种。作为MF膜的材质，可以大致分为高分子膜、陶瓷膜、金属膜以及它们的复合型，只要不使改良型卤代醇环氧酶活性和固液分离操作时的该活性回收率降低，就没有特别限制，但特别优选高分子膜，例如聚砜、聚醚砜、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚烯烃、聚乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯腈、混合纤维素酯、铜氨法再生纤维素酯、聚酰亚胺、尼龙、特氟龙(注册商标)等。作为膜的孔径，只要能够捕捉菌体或细胞，实现浓缩操作即可，通常可以使用0.10.5pm左右的膜。由上述离心分离和膜过滤所进行的固液分离操作时，可以添加水或者根据需要添加緩沖液、等渗液进行稀释洗涤。就使用的緩沖液而言，只要是不使改良型卣代醇环氧酶活性和固液分离操作时的该活性回收率降低的緩冲液即可，并无特别限制，例如，盐浓度最好是5-500mM,优选为5~150mM左右，pH最好是59左右。作为緩冲液成分，可以举出例如三羟曱基氨基曱烷(Tris)磷酸钠盐或钾盐、柠檬酸盐、醋酸盐等。具体来讲，可以举出例如20mMTris-硫酸緩冲液(pH8)、20mM磷酸钠緩沖液(pH7)等。另外，作为等渗液，可以举出例如0.7~0.9%氯化钠溶液等。此外，如果有能够稳定改良型卤代醇环氧酶的物质等，则可以添加它们。进行上述的培养基除去和洗涤后，可以将菌体或细胞再度悬浮于水或者根据需要悬浮于緩冲液、等渗液中，可以制备菌体或细胞悬浮液。菌体或细胞悬浊液也可以直接用作物质生产中的催化剂，也可根据需要在进行处理后使用。作为处理方法，例如，在由上述培养得到的培养物中加入表面活性剂，使得终浓度达到0.01%~10%,最好在卤代醇环氧酶不失活的温度下进行搅拌。表面活性剂的终浓度优选为0.05%~1%,特别优选为0.1%0.5°/。。处理温度优选为0。C40。C,特别优选为4。C20。C。处理时间只要在可确认菌体处理的效果的时间内即可，优选为15分钟24小时，特别优选为30分钟2小时。作为表面活性，可以使用阴离子表面活性剂、阳离子表面活性或非离子表面活性剂。作为阴离子表面活性剂，可以使用十二烷基硫酸钠等。作为阳离子表面活性剂，可以使用千索氯铵等。作为非离子表面活性剂，可以使用曲通X100等。用表面活性剂进行处理的菌，可以用緩冲液洗涤来使用，也可以不洗涤而直接使用。另外，也可以不进行上述培养基的除去和洗涤操作，而直接进行菌体或细胞的表面活性剂等的处理。另外，菌体或细胞也可以固定化来使用。具体来讲，可以举出例如将培养后的细胞或菌体用丙烯酰胺等凝胶包含而得到的物质、负载于氧化铝、氧化硅、沸石、硅藻土等无机载体而得到的物质等。另一方面，通过破碎菌体或细胞，也可以提取目的改良型卣代醇环氧酶。作为菌体或细胞的破碎方法，可以举出超声波处理、由弗氏压碎器或匀浆器所进行的高压处理、由珠磨机所进行的磨碎处理、由冲击波破碎装置所进行的冲撞处理、使用溶菌酶、纤维素酶、果胶酶等的酶处理、冻结溶解处理、低渗液处理、由噬菌体所进行的溶菌诱导处理等，可以单独使用任一种方法或者根据需要组合利用。以工业的规模进行菌体或细胞的破碎的情况下，考虑到操作性、回收率、成本等，优选主要利用高压处理或磨碎处理、冲突处理，也可以根据情况在物理破碎操作中组合酶处理等。就各破碎处理方法而言，只要是由菌体或细胞得到的改良型面代醇环氧酶回收率足够高的方法，则操作条件就没有特别限制。所说的足够高的改良型卤代醇环氧酶回收率，例如优选为85%以上，更优选为90%以上，进一步优选为95%，最优选为99%以上。利用珠磨机进行磨碎处理的情况下，就使用的微珠而言，可以通过例如将密度2.56.0g/cm3、尺寸0.11.0mm的微珠通常填充8085。/o左右，进行破碎，作为运转方式，也可以采用分批式、连续式中的任一种。菌体或细胞浓度也没有特别限制，例如，如果是细菌的话，最好是6~12%左右，如果是酵母的话，最好是14~18%左右。进行高压处理的情况下，就处理压力而言，只要来自菌体或细胞的改良型卣代醇环氧酶回收率足够高即可，并无特别限制，例如，可以在40150MPa左右的压力下进行破碎。菌体或细胞浓度也没有特别限制，例如，可以是20%以下左右。也可以根据需要，通过将装置串联地配置，或者使用多级结构的装置，进行多级处理，提高破碎和操作效率。通常，由于每lOMPa的处理压力会产生2~3。C的温度上升，因此优选根据需要进行冷却处理。冲撞处理情况下，例如，可以预先利用喷雾急速冻结处理(冻结速度例如每分钟数千摄氏度)等将被破碎菌体或细胞浆液制成冻结微粒(例如，50fim以下)，通过高速(例如约300m/s)的输送气体使其冲撞于冲撞板，从而破碎菌体或细胞。上述菌体或细胞破^5f处理的结果为，在因细胞内的核酸流出而使得处理液的粘度上升，操作困难的情况下，或者对于后续的残渣分离工序下的活性回收率提高有效果的情况下，可以根据需要通过核酸除去或核酸分解，期待处理液的粘度降低或残渣分离工序下的活性回收率的提高。作为除去或分解细胞破碎液中的核酸的方法，只要是不使改良型囟代醇环氧酶活性或该活性回收率降低，并且能够除去或分解核酸的方法即可，可以是任一种方法，可举出如生物化学实验讲座5巻200~201页中所记载的方法通过在细胞破碎液中添加鱼精蛋白硫酸或者链霉素来沉淀核酸的方法；用核酸分解酶来分解核酸的方法；使用葡聚糖-聚乙二醇进行液液分离的方法等。另外，有时进一步追加物理破碎处理也是有效的。这些方法中，尤其是想既避免繁杂的工序又迅速分解核酸的情况下，也可以釆用用核酸分解酶来分解核酸的方法。就用于核酸分解酶处理的核酸分解酶而言，只要是至少作用于脱氧核糖核酸(DNA),具有核酸分解反应催化能力，降低DNA聚合度的酶即可，可以是任何酶，也可以利用本来就存在于该转化体细胞内的核酸分解酶，但也可以另外添加外因性的核酸分解酶。作为另外添加的核酸分解酶，可以举出来自牛脾脏的DNaseI(和光纯药，曰本)、来自猪脾脏的DNaseII(和光纯药，日本)、来自粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)的核酸分解酶Benzonase(注册商标)核酸酶(Nuclease)(宝生物，曰本)、来自金黄葡萄球菌的核酸酶(NucleasefromStaphylococcusaureus)(和光纯药，日本)等。添加的酶量，因酶的种类和单位数(U)的定义而不同，如果是本领域技术人员则可以适当地设定。根据需要，可以在该酶溶液中添加核酸分解酶所要求的镁等辅助因子。处理温度根据使用的核酸分解酶而不同，但只要是来自常温生物种类的核酸分解酶，则通常设定于2040。C的温度即可。在需要从得到的破碎液中除去菌体或细胞破碎残渣的情况下，可以通过例如离心分离或过滤(死端方式或4晉流方式)等来除去。离心分离操作可以如前所述地进行。在菌体或细胞破碎残渣孩i小，且难以容易地沉降的情况下，可以根据需要使用凝集剂来提高残渣沉淀效率。就有机高分子凝集剂而言，如果基于离子性，则可以举出阳离子系凝集剂、阴离子系凝集剂、两性系凝集剂、非离子系凝集剂，如果基于成分，则可以举出丙烯酸系、聚乙烯亚胺、缩合系聚阳离子(聚胺)、二甲基二烯丙基氯化铵、壳聚糖等，就本发明中使用的凝集剂而言，只要是不使改良型闺代醇环氧酶活性或该活性回收率降低，并且能够提高残渣分离效率的凝集剂，就可以是任一种凝集剂。作为构成丙烯酸系凝集剂成分的丙烯酸系水溶性单体，可以举出例如丙烯酰胺、丙烯酸钠、丙烯酰胺2-曱基-丙烷磺酸钠、二甲基氨乙基-曱基丙烯酸酯、甲基丙烯酰氧基乙基-三曱基氯化铵、曱基丙烯酰氧基乙基-节基二曱基-氯化铵、二甲基氨乙基-丙烯酸酯、丙烯酰氧基乙基-三曱基氯化铵、二曱基氨基丙基-丙烯酰胺、丙烯酰胺丙基-三曱基氯化铵、聚氯脒等，可以举出这些单体的均聚物、由多种组合所形成的共聚物或者高分子改性物作为丙烯酸系凝集剂。作为极具代表性的阳离子系高分子凝集剂，可以举出聚氨基烷基曱基丙烯酸酯类、聚氨基烷基曱基丙烯酸酯和丙烯酰胺的共聚物类、聚丙烯酰胺的曼尼希改性物类、聚二曱基二烯丙基铵盐类、聚乙烯基咪唑啉类、聚丙烯酰胺类、胺系缩聚物类等，多数商品已经在市场上销售。作为其主要商品，可以举出例如Sanpoly-K-601,K-602(主成分聚胺，三共化成)、KuriflockLC-599(主成分聚胺和聚酰胺，栗田工业)、HymolockM-166，M-566,M-966,(主成分丙烯酰胺改性物，协立有机工业)、Uniflocker-UF-301,UF-304，UF-305，(主成分聚丙烯酰胺，尤尼吉可)、UF-330,UF-340，(主成分氨基曱基丙烯酸酯，尤尼吉可)、UF-505(主成分二氰胺(dicyanoamine),尤尼吉可)、RyuflocC-110(主成分聚胺，大日本油墨化学)、PuriflocC-31(主成分聚胺，陶氏化学)。另夕卜，也可以举出Dia-Nitrix公司(曰本)制造的K-400系列、KM-200系列、KM-1200系列、KAM-200系列、KD-200系列、KP-000系列、KP-100系列、KP-200系列、KP-300系列、KP-500系列、KP-1200系列、KA-000系列、KA-200系列、KA-300系列、KA-400系列、KA-600系列、KA-700系列、KA-800系列等。这些凝集剂可以单独使用或者将2种以上并用来使用。就本发明中使用的凝集剂而言，只要是不使改良型卤代醇环氧酶活性或该活性回收率降低，并且可提高残渣分离效率提高的凝集剂，就可以是上述任一种凝集剂，具体来讲,可以举出例如Dia-Nitrix公司(日本)制造的K-403B、K-408、K-415等。作为凝集剂的添加量，才艮据凝集剂的种类、菌体或石皮^淬液的液状而有所不同，例如，破碎后的微生物干燥重量％浓度的1/200-1/5的浓度，优选为1/100~1/10浓度。作为添加方法，例如将凝集剂预先溶解于水中后，添加于菌体或细胞破碎液，静置或搅拌至少5分钟24小时即可，优逸静置或搅拌30分钟10小时左右。作为此时的温度，优选例如为0。C60。C,特别优选为0。C50。C,进一步优选为0。C40。C。另外，在需要调节pH的情况下，也可以适当地添加成无机盐终浓度为5~200mM,进行緩冲液化，根据需要，还可以添加使改良型卣代醇环氧酶稳定的物质。利用过滤进行残渣分离时，如果能实现目的的残渣分离，就可以使用微滤(MF)膜、超滤(UF)膜中的任一种膜，通常，优选使用微滤(MF)膜。微滤膜如前所述，只要是能够进行残渣分离操作的膜，就可以利用任一种膜。作为膜的孔径，只要是可捕捉菌体或细胞残渣，并且在滤液侧回收改良型卣代醇环氧酶活性的孔径即可，例如，可以使用0.1-0.5iim左右的膜。此外，如果使用过滤助剂、根据需要的凝集剂的话，也可以使用孔径0，5pm以上的膜或者滤纸。作为过滤助剂，可以举出硅藻土、纤维素粉末、活性炭等。凝集剂如上所述。除去残渣之后所得到的上清液，是细胞提取液可溶性级分，可以作为含有改良型卣代醇环氧酶的粗酶溶液。然后，根据需要，通过使用在蛋白质的分离纯化中使用的通常的生物化学方法，可以从所述培养物中分离纯化卤代醇环氧酶，其中所述生物化学方法包括例如硫酸铵沉淀、各种色谱(例如凝胶过滤色i普(例如Sephadex色谱柱)、离子交换色谱(例如DEAE-Toyopearl)、亲和色谱、疏水色镨(例如butylToyopearl)、阴离子色谱(例如MonoQ色谱柱)等)、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳等，这些方法可以单独使用或者适当地组合使用。在本发明的转化体是基因重组体，并且，担心由于转化体在制造工序中向环境中泄露、混入制品中或者使用后的处理等而可能引起二次微生物污染的情况下，可以根据需要进行灭活处理。作为灭活方法，只要是不使改良型卤代醇环氧酶活性或该活性回收率降低，并且可灭活转化体的方法，就可以是任何方法，例如可以单独或者组合利用热处理、菌体破碎处理、药剂处理等方法。例如，通过在菌体破碎处理之前或之后进行药剂处理，可以进行灭活。作为所使用的药剂，根据转化体的宿主种类而异，可以举出例如千索氯铵、氯化十六烷吡啶、甲基硬脂酰氯、十六烷基三甲基氯化铵等阳离子表面活性剂、盐酸烷基二氨基乙基甘氨酸等两性离子表面活性剂等。另外，也可以举出乙醇等醇类、2-巯基乙醇等硫醇类、乙二胺等胺类、半胱氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸等氨基酸类等。就药剂的浓度而言，只要是不降低改良型卤代醇环氧酶活性或该活性回收率，并且可以灭活的浓度即可，例如，优选为微生物干燥重量％浓度的1/1001/2的浓度，更优选为1/101/5浓度左右。处理温度为050。C,优选为04(TC。另夕卜，pH为5~9左右，优选为68左右。另一方面，在改良型卣代醇环氧酶生产于菌体外或细胞外的情况下，直接使用培养液，或者通过上述的离心分离或过滤等来除去菌体或细胞。然后，根据需要，通过利用硫酸铵沉淀进行萃取等，来从所述培养物中提取改良型卤代醇环氧酶，进一步根据需要，将透析、各种色谱(凝胶过滤、离子交换色谱、亲和色i普等)单独或适当组合来使用，从而也可以进行纯化。在转化体为植物细胞或植物组织的情况下，通过使用纤维二糖酶、果胶酶等酶的细胞溶解处理、超声波破碎处理、磨碎处理等来破坏细胞。然后，如果需要的话，通过使用在蛋白质的分离纯化中使用的通常的生物化学方法，可以从所述培养物中分离纯化卣代醇环氧酶，其中所述生物化学方法包括例如^5克酸铵沉淀、各种色谱(例如凝胶过滤色谱(例如Sephadex色谱柱)、离子交换色i普(例如DEAE-Toyopearl)、亲和色"i普、疏水色i普(例如butylToyopearl)、阴离子色谱(例如MonoQ色谱柱)等)、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳等，这些方法可以单独使用或者适当地组合使用。分离的卣代醇环氧酶与上述细胞或菌体同样地，可以保持于适当的载体上，作为固定化酶来使用。按以上方法得到的培养物和改良型卣代醇环氧酶，被包含于本发明的范围内。得到的培养物和改良型卣代醇环氧酶的生产收率，可以通过测定(I)记载的卣代醇环氧酶活性，算出每个培养装置、—每个培养液、每单位菌体(转化体)湿重量或干燥重量、每单位酶液中蛋白质重量等的活性来求出。另夕卜，在本发明中，也可以从上述改良型卤代醇环氧酶基因或含有改良型卣代醇基因的重组载体中提取改良型鹵代醇环氧酶。即，在本发明中，可以完全不使用生细胞而采用无细胞蛋白质合成体系，来产生改良型卣代醇环氧酶。所说的无细胞蛋白质合成体系，是使用细胞提取液在试管等人工容器内合成蛋白质的体系。在本发明中使用的无细胞蛋白质合成体系中，也包含以DNA为模板来合成RNA的无细胞转录体系。此时，与上述宿主对应的生物相当于下述的细胞提取液的来源生物。这里，上述细胞提取液可以使用来自真核细胞或来自原核细胞的提取液，例如可以使用小麦胚芽、大肠杆菌等的提取液。这些细胞提取液可以是浓缩的也可以是未浓缩的。细胞提取液可以通过例如超滤、透析、聚乙二醇(PEG)沉淀等来得到。此外，在本发明中，无细胞蛋白质合成也可以使用市售的试剂盒来进行。作为这样的试剂盒，可以举出例如试剂盒PROTEIOS(东洋纺)、TNTTMSystem(promega)、合成装置的PG-MateTM(东洋纺)、RTS(roche-diagnostics)等。如上述那样通过无细胞蛋白质合成而得到的改良型卣代醇环氧酶，可以如前所述选择适当的色谱来进行纯化。(VI)表囟代醇和4-卣代-3-羟基丁腈的制造方法如上述方法制造的改良型面代醇环氧酶可以作为酶催化剂来用于物质生产。即，可以供于以下的(VI-1)(VI-3)所示的反应。(VI-1)1，3-二卣代-2-丙醇向表卣代醇的转换本转换反应可以通过使1,3-二卣代-2-丙醇与上述的改良型卤代醇环氧酶和/或由上述培养所得到的培养物相接触来进行。作为底物的1,3-二卣代-2-丙醇是用前述通式(1)表示的化合物。作为卤原子，优选为氟、氯、溴、碘，特别优选为氯、溴。具体来讲，可以举出1,3-二氟-2-丙醇、1，3-二氯-2-丙醇、1,3-二溴-2-丙醇、1,3-二碘-2-丙醇等，优选为1，3-二氯-2-丙醇、1,3-二溴-2-丙醇。转换反应液中的底物浓度优选为0.01-15(W/V)%。从酶稳定性的观点出发，底物浓度在该范围内时是理想的，特别优选为0.0110%。底物可以一次性添加于反应液中或者分次添加。从积累性的观点出发，优选通过分次添加而使底物浓度恒定。作为反应液的溶剂，优选酶活性的最适值pH4~10的附近的水或緩冲液。作为缓冲液，优选例如由磷酸、硼酸、柠檬酸、戊二酸、苹果酸、丙二酸、邻苯二曱酸、琥珀酸或醋酸等的盐等构成的緩沖液、Tris緩冲液或者good緩沖液等。反应温度优选为5~50°C,反应pH值优选为4~10的范围。反应温度更优选为10~40°C。反应pH更优选为pH6~9。反应时间才艮据底物等的浓度、菌体浓度或者其他的反应条件等进行适当地选择，优选设定成在1-120小时内结束的条件。另外，在本反应中，通过乂人反应体系内除去伴随着反应的进行所生成的氯离子，可以进一步提高光学浓度。优选通过添加硝酸银等来除去该氯离子。在反应液中生成、积累的表卣代醇可以釆用公知的方法来提取和纯化。例如，用醋酸乙酯等溶剂进行萃取，在減压下除去溶剂，从而可以得到表面代醇的浆液。另外，可以通过在减压下蒸馏这些浆液来进一步纯化。(VI-2)1，3-二卣代-2-丙醇向4-卣代-3-羟基丁腈的转换本转换反应可以通过使1,3-二囟代-2-丙醇与上述改良型卣代醇环氧酶和/或由上述的培养所得到的培养物接触来进行。作为底物的1,3-二卣代-2-丙醇是用前述通式(1)表示的化合物，优选为1，3-二氯-2-丙醇、1,3-二溴-2-丙醇。另外，作为氰化物，可以使用氰化氢、氰化钾、氰化钠、氰酸或丙酮氰醇等在添加于反应液中时生成氰离子(CN-)或氰化氢的化合物或其溶液。反应液中的底物浓度从酶稳定性的观点出发，优选为0.01~15(W/V)%,特别优选为0.0110%。另夕卜，氰化物的使用量从酶稳定性的观点出发，优选为底物的1~3倍量(摩尔)。反应条件可以与上述(VI-1)相同。反应液中生成、积累的4-卣代-3-羟基丁腈可以使用公知的方法来提取和纯化。例如，可以通过使用离心分离等方法从反应液除去菌体后，用醋酸乙酯等溶剂进行萃取，减压下除去溶剂，可以得到4-卤代-3-羟基丁腈的浆液。另外，也可通过减压下蒸馏这些浆液来进一步纯化。(VI-3)表卣代醇向4-卣代-3-羟基丁腈的转换本转换反应通过使表面代醇与上述改良型卣代醇环氧酶和/或由上述培养所得到的培养物相接触来进行。作为底物的表囟代醇是用前述通式(2)表示的化合物。作为囟原子，优选为氟、氯、溴、碘，特別优选为氯、溴。具体来讲，可以举出表氟代醇、表氯代醇、表溴代醇、表硪代醇等，特别优选为表氯代醇、表溴代醇。另外，氰化物可以使用氰化氩、氰化钾、氰化钠、氰酸或丙酮氰醇等添加于反应也中时生成氰离子(CN-)或者氰化氬的化合物或其溶液。反应条件、提取和纯化方法可以与上述(VI-2)相同。以下，利用实施例来对本发明进行更具体地说明。但是，本发明并不因这些实施例而受到任何限制。实施例1比起始氨基酸残基离C末端侧近一个残基的氨基酸残基被取代成其他氨基酸的改良型卣代醇环氧酶的获得及其评价(1)表达改良型囟代醇环氧酶的转化体的制作(表达载体pKK233-2)按以下所述制作出表达改良型卣代醇环氧酶的表达质粒(表达载体pKK233-2)以及含有该表达质粒的表达改良型卣代醇环氧酶的转化体，所述改良型卣代醇环氧酶是，来自棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的野生型卣代醇环氧酶即HheB(2nd)中，由翻译起始密码子编码的氨基酸残基的下游的1个氨基酸残基(第2个氨基酸残基)分别被取代成赖氨酸和天冬酰胺的酶。首先，通过PCR扩增卣代醇环氧酶基因HheB(2nd)。PCR反应液的组成(总量50ial)如下表所示，制备出3个系列(3个系列的不同在于正义引物各不相同)。44<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>用作引物的寡聚核苷酸的序列如下所示。DH-08:GGCCATGGCTAACGGAAGACTGGCAGGC(序列号57:由28个核苷酸构成，该序列中具有限制性内切酶Ncol识别部位(CCATGG)和卤代醇环氧酶基因HheB(2nd)的翻译起始密码子以后的序列，与第2个氨基酸对应的密码子是GCT编码丙氨酸)由33个核苷酸构成，该序列中具有限制性内切酶BspHI识别部位(TCATGA)和卣代醇环氧酶基因HheB(2nd)的翻译起始密码子以后的序列，与第2个氨基酸对应的密码子是AAA编码赖氨酸)由33个核苷酸构成，该序列中具有限制性内切酶BspHI识别部位(TCATGA)和卣代醇环氧酶基因HheB(2nd)的翻译起始密码子以后的序列，与第2个氨基酸对应的密码子是AAC编码天冬酰胺)DH画07:CGCCTGCAGGCTACAACGACGACGAGCGCCTG(序列号60:由32个核苷酸构成，该序列中具有限制性内切酶Sse8387I兼PstI识别部位(CCTGCAGG)以及卣代醇环氧酶.基因HheB(2nd)终止密码子下游区域)另外，用作模板的pSTlll记载于日本特公平5-317066公报，由含有pSTlll的重组载体所得到的大肠杆菌转化体JM109/pST111以保藏号"FERMBP-10922",在平成3年3月1日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>利用GFXPCRDNAbandGelBand纯化试剂盒(GE保健生物科学)分别对进行了热处理的3个系列的PCR反应液进行纯化，然后，对系列1的PCR扩增产物用限制性内切酶NcoI和PstI进行双酶切消化，对系列2和系列3的PCR扩增产物用限制性内切酶BspHI和PstI进行双酶切消化。用琼脂糖凝胶电泳分离各消化产物后，用QIAquickGelExtraction试剂盒(QIAGEN)对含有卣代醇环氧酶基因全长的带(约0.8kb)进行纯化。另一方面，将作为pKK233-2(CentraalbureauvoorSchimmelcultures(CBS),荷兰；http://www.cbs.knaw.nl/)的衍生物的，可通过WO2006/41226号小册子记载的方法来制备的表达载体pKK233-2(+Sse)用限制性内切酶NcoI和PstI消化后，通过苯酚萃取、氯仿萃取、乙醇沉淀(MolecularCloning,ALaboratoryManual,2nded.(ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))来纯化。将其与含有上述囟代醇环氧酶基因全长的3种PCR扩增产物分别混合后，向该混合液添加溶液I(SolutionI)(DNALigation试剂盒ver.2(宝生物)，制作出连接混合物。通过将该混合物在16。C孵育12小时，从而使PCR扩增产物和表达载体pKK233-2(+Sse)结合。将200jil预先制备好的大肠杆菌JM109林感受态细胞(将大肠杆菌JM109抹接种于lml的LB培养基(1%蛋白胨，0.5%酵母粉，0.5%NaCl)中，在37°C好氧预培养5小时，然后将预培养液0.4ml加入SOB培养基40ml(2%蛋白胨，0.5%酵母粉，10mMNaCl，2.5mMKCl，lmMMgS04，lmMMgCl2)，在18°C培养20小时，将得到的培养物通过离心分离(3700xg，10分钟，4。C)进行集菌后，加入13ml冷TF溶液(20mMPIPES-KOH(pH6.0),200mMKC1,10mMCaCl2，40mMMnCl2)，在0。C放置10分钟，再次离心分离(3700xg,10分钟，4°C)来除去上清液，将得到的大肠杆菌菌体悬浮于冷TF溶液3.2ml,加入0.22ml的二曱基亚砜，在0。C放置10分钟，然后，使用液氮来保存于-80°C),加入IOjxI的上述连接产物中，在0。C放置30分钟。接着，对该感受态细胞在42。C给予30秒钟的热激处理，在0。C冷却2小时。然后，添加lml的SOC培养基(20mM葡萄糖，2%蛋白胨，0,5%酵母粉，lOmMNaCl,2.5mMKC1,lmMMgS04，lmMMgCl2),在37。C振荡培养1小时。将培养后的培养液以各自200|il的量，涂布于LBAmp琼脂培养基(氨千100mg/L,含有1.5%琼脂的LB培养基)，在37。C培养1夜。将在琼脂培养基上生长的多个转化体菌落，用1.5ml的LBAmp培养基(含有100mg/L氨苄的LB培养基)在37。C培养1夜。将得到的培养液分别集菌后，采用FlexiPrep(GE保健生物科学)回收重组质粒。使用毛细管DNA测序仪CEQ2000(贝克曼库尔特)，按照附加的操作手册，对被克隆于3种质粒中的PCR扩增产物的碱基序列进行解析，确认在PCR反应中没有产生错误变异。将克隆有来自系列1的PCR扩增产物的DNA片段的质粒命名为pSTKOOl，将克隆有来自系列2的PCR扩增产物的DNA片段的质粒命名为pSTK002，将克隆有来自系列3的PCR扩增产物的DNA片段的质粒命名为pSTK003，另夕卜，将含有这些质粒的大肠杆菌JM109抹转化体分别命名为JM109/pSTK001、JM109/pSTK002和JM109/pSTK003。下述各质粒的特征如下。pSTK001:对第2氨基酸残基为丙氨酸残基的野生型卣代醇环氧酶HheB(2nd)进行编码的野生型闺代醇环氧酶基因被克隆于表达载体pKK233-2上；pSTK002:对第2氨基酸残基(丙氨酸残基)被取代为赖氨酸的改良型卣代醇环氧酶HheB(2nd)进行编码的改良型卣代醇环氧酶基因被克隆于表达载体pKK233-2上；pSTK003:对第2氨基酸残基(丙氨酸残基)被取代为天冬酰胺的改良型卣代醇环氧酶HheB(2nd)进行编码的改良型卣代醇环氧酶基因被克隆于表达载体pKK233-2上。(2)表达改良型卣代醇环氧酶的转化体的制作(表达载体pTrc99A)制作出表达改良型卣代醇环氧酶的表达质粒(表达载体pTrc99A)以及含有该表达质粒的表达改良型卣代醇环氧酶的转化体，所述改良型卣代醇环氧酶是，在来自棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的野生型卣代醇环氧酶即HheB(2nd)中，比起始氨基酸残基离C末端侧近1个残基(第2个氨基酸残基)分别被取代成赖氨酸和天冬酰胺的酶。就制作而言，使用pTrc99A来代替在实施例1(1)中使用的表达载体pkk233-2，其他与实施例1(1)同样地进行。将克隆有来自系列1的PCR扩增物的DNA片段的质粒命名为pSTTOOl,将克隆有来自系列2的PCR扩增物的DNA片段的质粒命名为pSTT002,将克隆有来自系列3的PCR扩增物的DNA片^:的质粒命名为pSTT003,另外，将含有这些质粒的大肠杆菌JM109抹转化体分别命名为JM109/pSTT001、JM109/pSTT002和JM109/pSTT003。上述各质粒的特征如下。pSTT001:对第2个氨基酸残基为丙氨酸残基的野生型卣代醇环氧酶HheB(2nd)进行编码的野生型卤代醇环氧酶基因被克隆在表达载体pTrc99A上。pSTT002:对第2个氨基S爽残基(丙氨酸残基)被取代成赖氨酸的改良型卤代醇环氧酶HheB(2nd)进行编码的改良型卣代醇环氧酶基因被克隆在表达载体pTrc99A上。pSTT003:对第2个氨基酸残基(丙氨酸残基)被取代成天冬酰胺的改良型卤代醇环氧酶HheB(2nd)进行编码的改良型卣代醇环氧酶基因被克隆在表达载体pTrc99A上。(3)表达改良型卣代醇环氧酶的转化体的评价对于在实施例1(1)和(2)中制作的6株转化体(JM109/pSTK001、JM109/pSTK002、JM109/pSTK003、JM109/pSTT001、JM109/pSTT002、JM109/pSTT003)和日本特公平5-317066号公l艮记载的JM109/pST111共计7抹，按如下方式进行IPTG(异丙基-l-硫代-D-p-D-半乳糖苷)的评价。在各沃色曼氏试验管中分注lml的LBAmp培养基，在各试验管中分别接种二次评价选拔林6株以及JM109/pST111的菌落。在37。C、210rpm的条件下，培养约8培养基(500ml容积的三角烧瓶中的100ml)，在37。C、210rpm的条件下，培养24小时。通过离心分离(3700xg,IO分钟，4°C)从得到的培养液中回收各菌体，用20mMTris-硫酸緩冲液(pH8.0)进行洗涤后，悬浮于相同緩冲液中使得菌浓度为12.5gDC/L。使用超声波破碎机VP-15S(taitec，日本)，在输出控制4、DUTYCYCLE40%、PULS、TIMER=B模式10s的条件下，对得到的lml的菌体悬浊液进行冰浴，同时进行3分钟破碎。将破碎的菌体悬浊液供于离心分离(23000xg,5分钟，4°C)，采用上清液作为粗酶液。用20mMTris-硫酸緩冲液(pH8.0)对得到的粗酶液进行稀释，使得各破碎前的(在菌体悬法液时刻的)菌体浓度达到6.25gDC/L。将稀释了的来自各转化体的粗酶液与等量的聚丙烯酰胺凝胶电泳用样品緩冲液(0.1MTris-HCl(pH6.8)，4%w/vSDS，12。/。v/v卩巯基乙醇，20。/。v/v甘油，微量溴酚蓝)进行混合，煮沸5分钟来进行变性处理。制作出10%聚丙烯酰胺凝胶，每1道供应5|il的变性处理完的样品，进行电泳分析(图1)。作为30kDa强的带分别观察到卣代醇环氧酶(图1中的箭头)。与来自表达野生型卤代醇环氧酶HheB(l"的JM109/pST111的粗酶液比较，确认出来自表达相同野生型面代醇环氧酶HheB(2nd)的JM109/pSTK001的粗酶液和来自JM109/pSTT001的粗酶液的表达量增加(认49为这是因为表达载体的不同所引起的)。另一方面，与来自JM109/pSTK001的粗酶液和来自JM109/pSTT001的粗酶液相比较，来自表达第2个氨基酸残基被取代成天冬酰胺的改良型卣代醇环氧酶HheB(2nd)的JM109/pSTK003的粗酶液和来自JM109/pSTT003的粗酶液的表达量分别进一步增加，另外，来自表达第2个氨基酸残基被取代成赖氨酸的改良型卣代醇环氧酶HheB(2nd)的JM109/pSTK002的粗酶液和来自JM109/pSTT002的粗酶液的表达量分别进一步大幅增加。接着，使用上述粗酶液，通过以下方法测定卣代醇环氧酶活性(脱氯活性)。制备100ml的活性测定用反应液(50mMDCP,50mMTris-硫酸(pH8)),将温度调节为20°C。向该反应液中添加稀释好的来自各转化体的粗酶液，开始反应。使用pH自动控制器，用0.01当量的氢氧化钠水溶液，来调节伴随着因卣代醇环氧酶活性所导致的氯化物离子的游离的pH的降低，使得pH保持在8。在10分钟的反应期间内，由为了将pH保持在8而投入的0.01当量的氬氧化钠水溶液的量，来算出氯化物离子生成量，算出卣代醇环氧酶活性(脱氯活性)(U)。1U的定义为相当于在上述条件下每分钟由DCP脱离l)imol氯化物离子的酶量，通过用在活性测定中使用的各粗酶液的活性和该活性除以在活性测定中使用的各粗酶液的液量，来算出各粗酶溶液的液活性。此外，假设通过上述超声波处理使得菌体被完全破碎，通过用该液活性除以破碎前的(菌体悬浊液时刻的)菌浓度，算出菌体比活性。将对于各转化体的菌体比活性的结果示于表1中。与表达野生型卤代醇环氧酶HheB(2nd)的JM109/pSTK001和JM109/pSTT001相比较，表达第2个氨基酸残基被取代成天冬酰胺的改良型卤代醇环氧酶HheB(2nd)的JM109/pSTK003和JM109/pSTT003的各自的菌体比活性提高至大约12倍和大约5倍，此外，表达第2个氨基酸残基被取代成赖氨酸的改良型卤代醇环氧酶HheB(2nd)的JM109/pSTK002和JM109/pSTT002的各自的菌体比活性提高至大约25倍和大约17倍。即，就比起始氨基酸残基离C末端侧近一个残基的氨基酸残基(用序列号2表示的氨基酸序列的第2个氨基酸残基)被取代成其他氨基酸的表达改良型卣代醇环氧酶的转化体而言，每个转化体的卣代醇环氧酶活性比野生型卣代醇环氧酶高。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>*JM109/pSTK002和JM109/pSTK003以JM109/pSTK001的菌体比活性为1来分別算出相对值，JM109/pSTT002和JM109/pSTT003以JM109/pSTT001的菌体比活性为1来分别算出相对值。实施例2由随机变异所得到的改良型卣代醇环氧酶的筛选(1)面代醇环氧酶变异体文库的制作为了获得更有用的改良型卣代醇环氧酶，制作通过错配诱导PCR导入了随机变异的卣代醇环氧酶基因变异体文库，进行来自该文库的改良型卣代醇环氧酶及其基因的筛选。将在实施例1(2)制作的pSTT002用作模板，如下所示，进行由错误诱导PCR所得到卣代醇环氧酶基因变异体文库的制作。制备lOO^il的以下表的组成的PCR反应液。<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>用作引物的Trc-03的序列如下所示。Trc-03:GGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCC(序列号61:由25个核苷酸构成，与pTrc99A的多克隆位点的下游区域对应)将制备好的lOO(il的PCR反应液以每管lOpl分注于10个PCR反应用管中，然后，分别将其供于以下的热循环中。[表d]<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>将进行了热循环处理的IO管PCR反应液混合，与实施例1(2)同样地，进行PCR反应液的纯化和限制性内切酶消化(由NcoI和PstI进行双酶切消化)以及来自凝胶的纯化、表达载体pTrc99A的限制性内切酶消化(由Nco1和PstI进行双酶切消化)以及纯化、连接反应以及形质转换。将培养皿上生长的菌落制成卣代醇环氧酶基因变异体文库。(2)改良型卣代醇环氧酶的筛选(一次评价)使用在实施例2(1)中制作的卣代醇环氧酶基因变异体文库，按如下方式进行改良型卣代醇环氧酶的筛选(一次评价)。将含有终浓度为lmM的IPTG的LBAmp培养基分注于96孔板(深孔)，每个孔分注500|il,在各孔中接种卣代醇环氧酶基因变异体文库的菌落。对96孔中的12个孔，接种用作评价对照的JM109/pSTT002菌落。在37。C、800rpm的条件下，培养大约16小时，然后，将得到的培养液中的20|il分注于盖板式96孔板中。使用离心分离机(佐久间制作所50A-IVD)以及转子(佐久间制作所HM-2HLS),将盖板式96孔板供于离心分离(3000rpm,5分钟，4°C)。除去培养液上清液后，将评价用反应液1(400mMDCP,800mM(R)-CHBN,0.025%溴曱酚紫(BCP),50mMTris-硫酸(pH8))40|il添加于各孔中。悬浮后，在室温下静置，随时间的变化来观察反应液所呈的颜色变化(伴随着由卣代醇环氧酶活性所导致的氯化物离子的生成，pH值降低，由此，BCP的颜色从紫色变化为黄色)，选出比作为对照的JM109/pSTT002显著更早发现变色的抹。对大约20000林的菌落进行该一次评价，选出77抹。(3)改良型卣代醇环氧酶的筛选(二次评价)对于实施2(2)中选出的一次评价选拔抹77才朱，按如下方式进行二次评价。对于一次评价选拔林77抹，与实施例2(2)同样地，进行利用96孔板(深孔)的培养后，将得到的各培养液样品((20^1，15(^1,lO)il，5fi1)x2)分注于盖板式96孔板中。使用离心分离机(佐久间制作所50A-IVD)以及转子(佐久间制作所HM-2HLS)，将盖板式96孔板供于离心分离(3000rpm,5分钟，4°C)。除去培养液上清液后，对于各培养液沉淀(菌体)，即实施例2(2)记载的评价用反应液1和评价用反应液2(400mMDCP，0.025%溴曱酚紫(BCP),50mMTris-硫酸(pH8))40|il添加于各孔中。悬浮后，在室温下静置，随时间的变化来观察反应液所呈的颜色变化，选择在添加有评价用反应液1的体系中比作为对照的JM109/pSTT002显著更早地发现变色的林，以及针对于各林的添加有评价用反应液1体系中的呈色速度和添加有评价用反应液2体系中的呈色速度之差少的林。对于一次评价选拔林77抹进行该二次评价，选出20株。(4)二次评价选拔林的卣代醇环氧酶基因变异的确认对于在实施例2(3)中选出的二次评价选拔林20林，解析各抹所具有的卣代醇环氧酶基因的变异。使用FlexiPrep(GE保健生物科学)从实施例2(3)中得到的各抹培养液回收质粒，使用毛细管DNA测序仪CEQ2000(贝克曼库尔特)，按照附加的操作手册，解析各质粒中的卣代醇环氧酶基因的碱基序列。将其结果示于表2中。<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>(*)任一抹的卣代醇环氧酶都是第2个氨基酸残基被取代成赖氨酸。另外，氨基酸变异的位置表示Hheb(2nd)(序列号2)中的位置。确认出在进行解析的20抹之中，12抹(#1007,#1009,#1014,#1019，#1023，#1024,#1034,#1037，#1038,#1066,#1068,#1072)表达了具有氨基S吏取代变异F136S的卤代醇环氧酶，2抹(#1002,#1005)表达了具有氨基S吏取代变异T133A的鹵代醇环氧酶，2抹(#1020,#1055)表达了具有氨基酸取代变异V75A的卣代醇环氧酶，1抹(#1018)表达了具有氨基酸取代变异D199H的卣代醇环氧酶，1林(#1029)表达了具有氨基酸取代变异V25I的卣代醇环氧酶，1抹(#1057)表达了具有氨基酸取代变异H57R和87F的卣代醇环氧酶。各转化体、它们所表达的囟代醇环氧酶以及编码其的卣代醇环氧酶基因如表2所示命名。(5)改良型卣代醇环氧酶的筛选(三次评价)对于在实施例2(3)中选拔的，在实施例2(4)中确认出其卣代醇环氧酶基因变异的6株(JM109/pSTT002-V25I,JM109/pSTT002-H57R+Y87F，JM109/pSTT002-V75A，JM109/pSTT002隱T133A，JM109/pSTT002-F136S以及JM109/pSTT002-D199H)和作为对照的JM109/pSTT002共计7林，按如下方式进行三次评价。在各沃色曼氏试验管中分注lml的LBAmp培养基，在各试验管中分别接种二次评价选拔林6林以及JM109/pSTT002的菌落。在37°C、210rpm的条件下，培养约8小时后，将得到的各培养液lOOfil接种于含有终浓度为lmM的IPTG的LBAmp培养基(500ml容积的三角烧瓶中的100ml),在37。C、210rpm的条件下，培养16小时。通过离心分离(3700xg，IO分钟，4'C)从得到的各培养液100ml中回收各菌体，用20mMTris-硫酸緩冲液(pH8.0)进行洗涤后，悬浮于相同緩冲液中使得菌浓度为12.5gDC/L。使用得到的菌体悬浊液，通过使用在实施例1(3)记载的方法中反应液的DCP浓度为400mM的反应液的方法，以及使用在实施例1(3)记载的方法中反应液的DCP浓度为400mM并且添加(R)-CHBN至终浓度800mM的反应液的方法，分别测定在不存在(R)-CHBN的条件下和存在(R)-CHBN的条件下的卣代醇环氧酶活性(脱氯活性)。将1U定义为相当于在上述个条件下每分钟由DCP脱离l)imol氯化物离子的酶量，通过用活性测定中使用的各菌体悬浮液的活性，除以该活性测定中所使用的各菌体悬浮液的液量，来算出各菌体悬浮液的液活性。进一步，通过用该液活性除以菌浓度，算出各林的菌体比活性。将其结果示于表3中。[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>对于JM109/pSTT002-H57R+Y87F、JM109/pSTT002-V75A、JM109/pSTT002-F136S以及JM109/pSTT002-D199H,确认出不存在(R)-CHBN下的菌体比活性高于JM109/pSTT002的菌体比活性。另外，对于JM109/pSTT002-H57R+Y87F、JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-F136S以及JM109/pSTT002-D199H，确认出存在(R)-CHBN下的菌体比活性高于JM109/pSTT002的菌体比活性。即，确认出这些转化体所表达的卣代醇环氧酶是在不存在(R)-CHBN下或存在(R)-CHBN下的带来每个转化体的卣代醇环氧酶活性提高的改良型卣代醇环氧酶。实施例3由部位特异性的随机变异所得到的改良型卣代醇环氧酶的筛选(1)部位特异性的随机变异体文库的制作在实施例2(5)中检测出的改良型卣代醇环氧酶之中，作为为每个转化体带来卣代醇环氧酶活性提高效果的氨基酸变异位点，发现了卣代醇环氧酶Hheb(2nd)(序列号2)的第133号的苏氨酸残基(T133)、第136号的苯丙氨酸残基(F136)以及第199号的天冬氨酸残基(D199)。使这些位点的氨基酸随机变异，尝试获得更有效的改良型卣代醇环氧酶。作为使T133、F136和D199变异成20个必需氨基酸的随机引物，制作出以下的引物。MDH-14:CGCTGGCCTACAGCNNNGCGCGTTTCGCT(序列号62:由29个核苷酸构成，对卣代醇环氧酶HheB(Ist)(序列号1)的第141号的氨基酸或者HheB(2nd)的第133号(序列号2)的氨基酸进行编v吗的密码子为随机碱基(NNN;N是腺噤呤、胸腺嘧咬、鸟噤呤或胞嘧咬中的任一种)的正义引物)MDH画15:AGCGAAACGCGCNNNGCTGTAGGCCAGCG(序列号63:由29个核苷酸构成，具有MDH-14的互补序列的反义引物)MDH-16:CAGCACGGCGCGTNNNGCTCAGCGCGGGT(序列号64:由29个核苷酸构成，对卣代醇环氧酶HheB(Ist')(序列号1)的第144号的氨基酸或者HheB(2nd)(序列号2)的第136号的氨基酸进行编码的密码子为随机碱基(NNN;N是腺噤呤、胸腺嘧啶、鸟。票呤或胞嘧啶中的任一种)的正义引物)MDH-17:ACCCGCGCTGAGCNNNACGCGCCGTGCTG(序列号65:由29个核苷酸构成，具有MDH-16的互补序列的反义引物)MDH-18:CGACTGCCCGAGAGNNNGCGCTGCTCGCG(序列号66:由29个氨基酸构成，对卣代醇环氧酶HheB(Ist)(序列号1)的第207号的氨基酸或者HheB(2nd)(序列号2)的第199号的氨基酸进行编码的密码子为随机碱基(NNN;N是腺噪呤、胸腺嘧啶、鸟噤呤或胞嘧啶中的任一种)的正义引物)MDH画19:CGCGAGCAGCGCNNNCTCTCGGGCAGTCG(序列号67:由29个核苷酸构成，具有MDH-18的互补序列的反义引物)使用上述引物和模板pSTT002，通过QuickChageSite-DirectedMutagenesis试剂盒(STRATAGENE公司)进行部位特异性的变异导入。反应液组成(总量50^1)如下表所述(系列1以获得T133随机变异体为目的，系列2以获得F136随机变异体为目的，系列3以获得D199随机变异体为目的)。[表e]<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>各系列中使用的引物的组合如下所示。系列1:正义引物MDH-14，反义引物MDH-15系列2:正义引物MDH-16,反义引物MDH-17系列3:正义引物MDH-17,反义引物MDH-18对于上述组成的各反应液，进行下表的热循环。[表q<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>按照附加的操作手册，在进行了热循环处理的各反应液中添加的DpnI,在37。C孵育1小时。使用DpnI处理液，与实施例2(1)同样地进行形质转换。将出现在培养i上的菌落制成卣代醇环氧酶基因部位特异的(T133，F136,D199)变异体文库。(2)来自部位特异的随机变异体的改良型卣代醇环氧酶的筛选由在实施例3(1)中制作的卣代醇环氧酶基因部位特异的(T133,F136,D199)变异体文库，进行更有用的改良型卣代醇环氧酶的筛选。将含有终浓度为lmM的IPTG的LBAmp培养基分注于96孔板(深孔)，每个孔分注500fil，对于实施例3(1)制作的卣代醇环氧酶基因部位特异的(T133,F136,D199)变异体文库的各系列，将200个菌落接种于各孔中。与作为评价的对照所使用的JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-F136S、JM109/pSTT002-D199H以及JM109/pSTT002—并进行接种。在37°C、800rpm的条件下培养约16小时，然后，将得到的培养液中的20pl分注于盖板式96孔板中。使用离心分离机(佐久间制作所50A-IVD)以及转子(佐久间制作所HM-2HLS),将盖板式96孔板供于离心分离(3000rpm,5分钟，4°C)。除去培养液上清液后，将实施例2(2)记载的评价用反应液1和评价用反应液3(200mM(S)-CHBN,0.025%溴曱酚紫(BCP)，50mMTris-硫酸(pH8))40pl添加于各孔中。悬浮后，在室温下静置，随时间的变化来观察反应液所呈的颜色变化，选出在添加有评价用反应液1的体系中比作为对照的JM109/pSTT002显著更早发现变色的株、在添加有评价用反应液3的体系中比作为对照的JM109/pSTT002显著更早发现变色的株以及各抹的评价用反应液1添加系中的呈色速度和评价用反应液3添加系中的呈色速度的比例与作为对照的JM109/pSTT002的该比例不同的林。对各系列200菌落进行该评价，从系列1'(T133随机变异体文库)选出7林，从系列2(F136随机变异体文库)选出7株，从系列3(D199随机变异体文库)选出194^。(3)部位特异的随机变异文库选拔林的卣代醇环氧酶基因变异确认对于来自在实施例3(2)中选拔的系列1(T133随机变异体文库)的7抹、来自系列2(F136随机变异体文库)的7抹、来自系列3(D199随机变异体文库)的19林共计33林，对各林所具有的面代醇环氧酶基因的变异进行59解析。使用FlexiPrep(GE保健生物科学)从在实施例3(2)中得到的各林培养液回收质粒，使用毛细管DNA测序仪CEQ2000(贝克曼库尔特)，按照附加的操作手册，对各质粒中的卣代醇环氧酶基因的碱基序列进行解析。将其结果示于表4中。[表4]系列转化体氨基酸取代变异(*1)密码子变异转化体命名(*2)1T133-l,T133-2,T133-3，T133-4,T133-7T133CACG-TGT扁09/pSTT002-T133CT133画5T133AACG-GCT~~—----—T133-6T133SACG-TCTJM109/pSTT002-T133S2F136-l，F136-6F136STTC-AGTF136曙3，F136-4，F136國5TTC画TCAF136-2F136ATTC-GCGJM109/pSTT002-T133AF136-7F136WTTC-GCGJM109/pSTT002-T133W3D199-1，D199曙2，D199-3,D199-4,D199-5D199HGAC-CACD199-7,D199-8，D199-12D199EGAC画GAGJM109/pSTT002画D199ED199-11GAC-GAAD199-9D199QGAC-CAA.ivno(〕ps'n'()02-卜)199(、)D199-6,D199-10D199YGAC-TATJM109/pSTT002-D199YD199-9-5D199RGAC-CGC腿09/pSTT002-D199RD199-6-2D199TGAC-ACTJM109/pSTT002-D199TD199-4-3GAC-ACCD199-6-4D199SGAC-TCCJM109/pSTT002-D199SD199-13D199LGAC-CTGJM109/pSTT002-D199LD199-14D199MGAC-ATGJM109/pSTT002-D199MD199-15D199IGAC-ATCJM109/pSTT002-D199I*1任一抹的卣代醇环氧酶都是第2号氨基酸残基都被置换成赖氨酸。另外，表示氨基酸残基的位置的数字是表示HheB(2nd)(序列号2)的氨基^列中的氨基酸残基的位置的数字。*2作为氨基酸取代变异体，对于已经在实施例2或者本表中取得的变异体，不重新命名。60考虑到作为氨基酸取代变异的方式与已经取得的酶的重复，将进行了解析的33株所表达的卣代醇环氧酶以及对其进行编码的卣代醇环氧酶基因如表2所示命名。实施例4由改良型卣代醇环氧酶所进行的(R)-CHBN合成反应(1)改良型卣代醇环氧酶粗酶液的制备为了调查通过在实施例2和实施例3中获得的改良型卣代醇环氧酶所合成的(R)-CHBN的光学纯度，首先，由表达各改良型卣代醇环氧酶的转化体来制备粗酶液。对于表达改良型卣代醇环氧酶的15林的转化体抹(JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-T136C、JM109/pSTT002画T133S、JM109/pSTT002國F136A、JM109/pSTT002-F136S、JM109/pSTT002-F136W、JM109/pSTT002-D199Q、JM109/pSTT002-D199E、JM109/pSTT002-D199H、JM109/pSTT002-D199S、JM109/pSTT002-D199T、JM109/pSTT002-D199M、JM109/pSTT002-D199L、JM109/pSTT002-D199I、JM109/pSTT002-D199Y)以及作为对照的JM109/pSTT002的合计16林，按如下方式进行三次评价。在各沃色曼氏试验管中分注lml的LBAmp培养基，在各试验管中分别接种二次评价选拔林15抹以及JM109/pST002的菌落。在37。C、210rpm的条件下，培养约8小时后，将得到的各培养液100^1接种于含有终浓度为lmM的IPTG的LBAmp培养基(500ml容积的三角烧瓶中的100ml)，在37。C、210rpm的条件下，培养16小时。通过离心分离(3700xg,IO分钟，4。C)从得到的各培养液100ml中回收各菌体，用20mMTris-硫酸緩冲液(pH8.0)进行洗涤后，悬浮于相同緩冲液中使得菌浓度为12.5gDC/L。使用超声波破碎机VP-15S(taitec，日本)，在输出控制4、DUTYCYCLE40%、PULS、TIMER=B模式10s的条件下，对得到的3ml的菌体悬浊液进行冰浴，同时进行10分钟破碎。将破碎的菌体悬浊液供于离心分离(23000xg，5分钟，4°C),提取上清液作为粗酶液。对于得到的各粗酶液，通过使用在实施例1(3)记载的方法中反应液的DCP浓度为400mM的反应液的方法，分别测定卤代醇环氧酶活性(脱氯活性)。将1U定义为相当于在上述个条件下每分钟由DCP脱离ljLimol氯化物离子的酶量，通过用活性测定中使用的各菌体悬浮液的活性，除以该活性测61定中所使用的各菌体悬浮液的液量，来算出各菌体悬浮液的液活性。(2)分析方法在后述的通过改良型卤代醇环氧酶合成(R)-CHBN的合成反应中实施的反应液中的DCP、ECH以及CHBN浓度分析以及生成CHBN的光学纯度分析4姿如下方式进4亍。<反应液中的DCP、ECH以及CHBN浓度分析>反应液中的DCP、ECH以及CHBN浓度分析通过逆相HPLC来进行。逆相HPLC分析条件示于下表中。[表g]<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>将反应终止液1OOpl利用上表记载的流动相400(il稀释混合之后，按照上表记载的分析条件进行分析。预先使用浓度已知的DCP、ECH以及CHBN溶液制作标准曲线，使用该标准曲线来求得反应液中的DCP、ECH以及CHBN浓度。<生成CHBN的光学纯度分析>生成CHBN的光学纯度分析，在将CHBN酯化后，通过正相HPLC进行。将正相HPLC分析条件示于下表。[表h]<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>加入与约400|il的反应终止液等量的二异丙基醚(以下，有时称作IPE)来进行萃取。取出IPE层，加入少量的无水硫酸钠进行搅拌。取出100plIPE,添加10pl的(R)-a-曱氧基-a-(三氟曱基)苯基乙酰氯(以下，有时称作(R)-MTPA)以及40ili1的吡啶。在室温下反应一夜，然后，添加IPE,制成约400^1。加入400^1的1当量的盐酸，进行2次萃取，然后，向提耳又的IPE层中加入400|Lil的饱和碳酸氢钠水溶液，进行2次萃取。向提取的IPE层中加入少量的无水硫酸钠进行搅拌，然后，通过吸气器使IPE层挥发。通过上表记载的流动相使残存物悬浮后，利用上述记载的分析条件进行分析。由(R)-CHBN-(R)-MTPA酯和(S)-CHBN-(S)-MTPA酯的区域面积比算出各浓度，以本说明书中说明的要领(前述)算出CHBN的光学纯度。(3)通过改良型卣代醇环氧酶进行(R)-CHBN的合成使用在实施例4(1)中制备的来自各改良型囟代醇环氧酶表达转化体的粗酶液，在氰化钾的存在下，进行由DCP合成CHBN的反应。反应液基本组成^(口下表戶斤示,反应才示度(reactionscale)是2ml。<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>反应在2(TC进行3小时。反应结束后，通过实施例4(2)记载的分析条件，对反应液中的DCP、ECH以及CHBN浓度和CHBN的光学纯度进行分析。<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>在使用来自表达野生型面代醇环氧酶的转化体林JM109/pSTT002的粗酶液的反应中，CHBN只积累77mM，与此相对，在使用来自表达改良型卤代醇环氧酶的各转化体4朱的粗酶液的反应中，积累了87149mM的CHBN。因而，显示出这些改良型卣代醇环氧酶能够比野生型囟代醇环氧酶积累高浓度的生成物。另外，使用来自表达野生型卣代醇环氧酶的转化体株JM109/pSTT002的粗酶液来合成的(R)-(:1忖的光学纯度是91.6°/化6,与此相对，使用来自表达改良型卣代醇环氧酶的转化体才朱(JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-T133C、JM109/pSTT002-D199Q、JM109/pSTT002-D199E、JM109/pSTT002-D199H、JM109/pSTT002-D199S、JM109/pSTT002-D199T、JM109/pSTT002-D199L、JM109/pSTT002-D199M、JM109/pSTT002-D199I以及JM109/pSTT002-D199Y)的粗酶液来合成的(R)-CHBN的光学纯度是93.l%ee~97.8%ee,确认出通过这些改良型卣代醇环氧酶合成的(R)-CHBN与通过野生型囟代醇环氧酶合成的(R)-CHBN相比，光学纯度高。因而，认为这些改良型卤代醇环氧酶对于DCP和/或中间体ECH的立体选择性提高。实施例5氯化物离子存在下的改良型卣代醇环氧酶活性的确认氯化物离子是通过囟代醇环氧酶由1,3-二卣代-2-丙醇和氰化物来合成4-卣代-3-羟基丁腈时的生成物，可以阻碍利用囟代醇环氧酶所进行的该合成反应。对在高浓度氯化物离子存在下的野生型卣代醇环氧酶和改良型商代醇环氧酶的卣代醇环氧酶活性进行调查、比较。使用实施例4中制备的来自表达野生型面代醇环氧酶的转化体4朱JM109/pSTT002的粗酶液和来自表达改良型卤代醇环氧酶的转化体林JM109/pSTT002-D199H的粗酶液，通过使用在实施例1(3)记载的方法中反应液的DCP浓度为400mM的反应液的方法，以及使用在实施例1(3)记载的方法中反应液的DCP浓度为400mM并且添加氯化钠至终浓度100mM或200mM的反应液的方法，测定在不存在氯化钠的条件下(OmM)以及存在氯化钠的条件下(100mM和200mM)的卣代醇环氧酶活性(脱氯活性)，以来自各转化体的粗酶液在不存在氯化钠的条件下(OmM)的该活性为100%，算出相对活性值。将其结果示于表6中。来自粗酶液的转化体反应液中的氯化钠浓度[mM]0100200JM109/pSTT002-D199H100%91%78%JM109/pSTT002100%44%德65来自表达野生型囟代醇环氧酶的转化体林JM109/pSTT002的粗酶液的卣代醇环氧酶活性，在存在1OOmM和200mM的氯化物离子的条件下，分别降低至44%和40%,与此相对，来自表达改良型卣代醇环氧酶的转化体抹JM109/pSTT002-D199H的粗酶液的卣代醇环氧酶活性，在存在100mM和200mM的氯化物离子的条件下，分別显示出91%和78%的残存活性。因而，确认出该改良型卣代醇环氧酶与野生型卣代醇环氧酶相比，相对于氯化物离子所引起的反应阻碍的耐性得到提高。实施例6表达改良型由代醇环氧酶的转化体(红球菌属细菌宿主)的制作及其评价(1)表达改良型卣代醇环氧酶的转化体(红球菌属细菌宿主)的制作制作表达改良型卣代醇环氧酶的转化体(红球菌属细菌宿主)，对该转化体进行评价。首先，以日本特开2007-49932号记载的表达质粒pJHB057为模板，制作出分别导入有如下变异的改良型卣代醇环氧酶表达质粒，所述变异为卣代醇环氧酶HheB(Ist)(序列号1)的第141号的苏氨酸残基变为丙氨酸的取代变异(T141A)，第144号的苯丙氨酸残基变为丝氨酸的取代变异(F144S)以及第207号的天冬氨酸残基变为组氨酸的取代变异(D207H)。作为在变异导入中所使用的引物，制作以下引物。MDH-05:CGCTGGCCTACAGCGCGGCGCGTTTCGCT(序列号68:由29个核苷酸构成，对卣代醇环氧酶HheB(Ist)的第141号的氨基酸进行编码的密码子为GCG(编码丙氨酸)的正义引物)MDH-06:AGCGAAACGCGCCGCGCTGTAGGCCAGCG(序列号69:由29个核苦酸构成，具有MDH-05的互补序列的反义引物)MDH-07:CAGCACGGCGCGTTCCGCTCAGCGCGGGT(序列号70:由29个核苷酸构成，对卤代醇环氧酶HheB(Ist)的第144号的氨基酸进行编码的密码子为TCC(编码丝氨酸)的正义引物)MDH-08:ACCCGCGCTGAGCGGAACGCGCCGTGCTG(序歹寸号71:由29个核苷酸构成，具有MDH-07的互补序列的反义引物)MDH-09:CGACTGCCCGAGAGCACGCGCTGCTCGCG(序列号72:由29个核苷酸构成，对卤代醇环氧酶他eB(Ist)的第207号的氨基酸进行编码的密码子为CAC(编码组氨酸)的正义引物)MDH-10:CGCGAGCAGCGCGTGCTCTCGGGCAGTCG(序列号73:由29个核香酸构成，具有MDH-09的互补序列的反义引物)4吏用上述引物和冲莫才反pJHB057，通过QuickChangeSite-DirectedMutagenesis试剂盒(STRATAGEN公司)进行部位特异的变异导入。反应液组成(总量50^1)如下表所示(系列1以获得T141A变异体为目的，系列2以获得F144S变异体为目的，系列3以获得D207H变异体为目的)。<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>各系列中使用的引物的组合如下所示。系列1:正义引物MDH-05,反义引物MDH-06系列2:正义引物MDH-07,反义？1物MDH-08系列3:正义引物MDH-09,反义引物MDH-IO对于上述组成的各反应液，进行下表的热循环。<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>Jl/pJHB057画D207H。(2)表达改良型卣代醇环氧酶的转化体(红球菌属细菌宿主)的评价在实施例6中得到的3种转化体(Jl/pJHB057-T141A、Jl/pJHB057-F144S以及Jl/pJHB057-D207H)的评价按照如下方式进行。将该3抹转化体以及作为对照的Jl/pJHB057的共计4抹，分别接种于100ml的GGPK培养基(1.5%葡萄糖，1%谷氨酸钠，0.1%酵母粉，0.05%K2HPO4,0.05%KH2P04,0.05%MgS(V7H2O,卡那霉素50[ig/ml,pH7.2),在30。C振荡培养72小时。通过离心分离(3700xg,IO分钟，4°C)从得到的各培养液100ml中回收各菌体，用20mMTris-硫酸緩冲液(pH8.0)进行洗涤后，悬浮于相同緩冲液中使得菌浓度为12.5gDC/L。使用超声波破碎机VP-15S(taitec,日本)，在输出控制4、DUTYCYCLE40%、PULS、TIMER=B模式10s的条件下，对得到的3ml的菌体悬浊液进行冰浴，同时进行10分钟破碎。将破碎的菌体悬浊液供于离心分离(23000xg,5分钟，4°C),提取上清液作为粗酶液。对于得到的各粗酶液，通过使用在实施例1(3)记载的方法中反应液的DCP浓度为400mM的反应液的方法，分别测定卣代醇环氧酶活性(脱氯活性)。将1U定义为相当于在上述个条件下每分钟由DCP脱离l|imol氯化物离子的酶量，通过用活性测定中使用的各菌体悬浮液的活性，除以该活性测定中所使用的各菌体悬浮液的液量，来算出各菌体悬浮液的液活性。进一步，通过用该液活性除以蛋白质浓度，来算出各株的每单位蛋白质的比活性。蛋白质浓度使用Bio-Rad蛋白质分析仪(Bio-Rad)来测定。将其结果示于表7中。<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>分别导入有如下变异的改良型卣代醇环氧酶，是即使在以红球菌属细菌为宿主的情况下，也能为每个转化体带来卣代醇环氧酶活性提高的改良型卣代醇环氧酶，所述变异为HheB(Ist)(序列号1)的第141号的苏氨酸残基变为丙氨酸的取代变异(T141A),第144号的苯丙氨酸残基变为丝氨酸的取代变异(F144S)以及第207号的天冬氨酸残基变为组氨酸的取代变异(D207H)。序列表自由文字序列号328:变异肽序列号3156:变异DNA序列号5161:合成DNA序列号62:合成DNA序列号62:n表示a、c、g或t(存在位置1517)序列号63:合成DNA序列号63:n表示a、c、g或t(存在位置13~15)序列号64:合成DNA序列号64:n表示a、c、g或t(存在位置14-16)序列号65:合成DNA序列号65:n表示a、c、g或t(存在位置1416)序列号66:合成DNA序列号66:n表示a、c、g或t(存在位置15~17)序列号67:合成DNA序列号67:n表示a、c、g或t(存在位置13~15)序列号6873:合成DNA序列号74:Xaa表示任意的氨基酸残基(存在位置213、15、16、19)序列号75:Xaa表示任意的氨基酸残基(存在位置2、58、10)序列号7683:变异肽序列号8491:变异DNA权利要求1.一种改良型卤代醇环氧酶，其特征在于，其包含对野生型卤代醇环氧酶的氨基酸序列导入从以下的(A)～(D)中选择的任一个或多个氨基酸变异而得到的氨基酸序列，所述野生型卤代醇环氧酶的氨基酸序列包含以下的氨基酸序列IS-α1-α2-α3-α4-α5-α6-α7-α8-α9-α10-α11-α12-Y-α13-α14-A-R-α15(序列号74)，其中，S表示丝氨酸残基，Y表示酪氨酸残基，A表示丙氨酸残基，R表示精氨酸残基，α1～α15分别独立地表示相同或不同的任意氨基酸残基，以及以下的氨基酸序列IIL-β16-R-L-β17-β18-β19-β20-E-β21(序列号75)，其中，L表示亮氨酸残基，R表示精氨酸残基，E表示谷氨酸残基，β16-β21分别独立地表示相同或不同的任意氨基酸残基，(A)比起始氨基酸残基离C末端侧近一个残基的氨基酸残基被取代成其他氨基酸的氨基酸变异；(B)α14残基被取代成其他氨基酸的氨基酸变异；(C)α15残基被取代成其他氨基酸的氨基酸变异；(D)β21残基被取代成其他氨基酸的氨基酸变异。2.—种改良型卣代醇环氧酶，其特征在于，其包含对野生型卣代醇环氧酶的氨基酸序列导入从以下的(E)(H)中选择的任一个或多个氨基酸变异而得到的氨基酸序列，所述野生型卣代醇环氧酶的氨基S吏序列包含以下的氨基酸序列I:S-al陽a2-a3-a4-a5画a6-a7-a8-a9画al0-all-al2陽Y-al3-al4-A-R-a15(序歹'J号74),其中，S表示丝氨酸残基，Y表示酪氨酸残基，A表示丙氨酸残基，R表示精氨酸残基，alal5分别独立地表示相同或不同的任意氨基酸残基，以及以下的氨基酸序列II:L-卩16-R-L-卩17-卩18-卩19-卩20-E-卩21(序列号75),其中，L表示亮氨酸残基，R表示精氨酸残基，E表示谷氨酸残基，pi6-(321分别独立地表示相同或不同的任意氨基酸残基，(E)比起始氨基酸残基离C末端侧近一个残基的氨基酸残基被取代成赖氨酸或天冬酰胺的氨基酸变异；(F)al4残基被取代成丙氨酸、半胱氨酸或丝氨酸的氨基酸变异；(G)al5残基被取代成丙氨酸、丝氨酸或色氨酸的氨基酸变异；(H)(321残基被取代成谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或曱硫氨酸的氨基酸变异。3.根据权利要求1或2所记载的改良型囟代醇环氧酶，其中，所述野生型卣代醇环氧酶是分类于组B的酶。4.根据权利要求1~3的任一项所记载的改良型卣代醇环氧酶，其中，所述野生型卣代醇环氧酶是来自棒状杆菌(Corynebacterium)属细菌或分枝杆菌(Mycobacterium)属纟田菌的酶。5.才艮据权利要求1~3的任一项所记载的改良型卣代醇环氧酶，其中，所述野生型卣代醇环氧酶的氨基酸序列是序列号1或序列号2所示的氨基酸序列。6.根据权利要求1~5的任一项所记载的改良型离代醇环氧酶，其包含对所述野生型卣代醇环氧酶的氨基酸序列导入从以下的(i)(iii)中选择的任一个或多个氨基酸变异而得到的氨基酸序列，其中，(i)从除了比起始氨基酸残基离C末端侧近一个残基的氨基酸残基、a14残基、a15残基以及P21残基以外的氨基酸残基中选择的1个或数个氨基酸残基被取代成其他氨基酸的氨基酸变异；(ii)从除了比起始氨基酸残基离C末端侧近一个残基的氨基酸残基、氨基酸序列I所含的氨基酸残基以及氨基酸序列II所含的氨基酸残基以外的氨基酸残基中选择的1个或数个氨基酸残基发生缺失的氨基酸变异；(iii)在比起始氨基酸残基离C末端侧近两个以上残基的氨基酸残基构成的区域中的由氨基酸序列I和氨基酸序列II构成的区域以外的区域中，插入l个或数个任意氨基酸残基的氨基酸变异。7.编码权利要求16的任一项所记载的改良型卣代醇环氧酶的基因。8.含有权利要求7所记载的基因的重组载体。9.将权利要求8所记载的重组载体导入宿主而得到的转化体或转导体。10.培养权利要求9所记载的转化体或转导体而得到的培养物。11.从权利要求IO所记载的培养物中提取的改良型囟代醇环氧酶。12.—种改良型卣代醇环氧酶的制造方法，其特征在于，培养权利要求9所记载的转化体或转导体，从得到的培养物中提取改良型卣代醇环氧酶。13.—种表卣代醇的制造方法，其特征在于，通过使权利要求1~6和11的任一项所记载的改良型囟代醇环氧酶和/或^L利要求10所记载的培养物与1，3-二卣代-2-丙醇接触，来生成表卣代醇。14.一种4-面代-3-羟基丁腈的制造方法，其特征在于，在氰化物的存在下，使权利要求1~6和11的任一项所记载的改良型卤代醇环氧酶和/或权利要求10所记载的培养物与1，3-二卣代-2-丙醇或表卣代醇接触，从而生成4-卣代-3-羟基丁腈。全文摘要本发明提供一种工业上有用的改良型卤代醇环氧酶、其制造方法以及使用该酶制造表卤代醇或4-卤代-3-羟基丁腈的制造方法。本发明的改良型卤代醇环氧酶是包含对野生型卤代醇环氧酶的氨基酸序列导入特定的氨基酸取代变异而得到的氨基酸序列的酶，其中，所述野生型卤代醇环氧酶的氨基酸序列包括规定的氨基酸序列I和氨基酸序列II。文档编号C12N15/60GK101636497SQ20088000699公开日2010年1月27日申请日期2008年3月7日优先权日2007年3月7日发明者佐藤荣治,汤不二夫,泷川优弥,渡边文昭,秋山卓理申请人:三菱丽阳株式会社