专利名称：专性异二聚体大范围核酸酶及其用途的制作方法
专性异二聚体大范围核酸酶及其用途
本发明涉及来自同二聚体LAGLIDADG内切核酸酶单体的专性异 二聚体大范围核酸酶(megamiclease),编码所述大范围核酸酶的载体， 所述载体修饰的细胞、动物或植物，以及所述大范围核酸酶和衍生产物 用于分子生物学、基因组工程和基因组治疗的用途。
大范围核酸酶定义为具有大的(12-45bp )切割位点的序列特异性内 切核酸酶，其可导致活细胞中特定基因座处的DNA双链断裂 (double-strand break, DSB ) ( Thierry和Dujon, Nucleic Acids Res., 1992， 20, 5625-5631 )。大范围核酸酶已经用于;培养细胞和植物中刺激 其耙序列附近的同源重组(Rouet等，Mol. Cell. Biol, 1994,14, 8096-106; Choulika等，Mol. Cell. Biol" 1995, 15, 1968-73; Donoho等，Mol. Cell. Biol, 1998, 18， 4070-8; Elliott等，Mol. Cell. Biol" 1998， 18, 93-101; Sargent等，Mol. Cell. Biol" 1997， 17, 267-77; Puchta等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93， 5055-60; Chiurazzi等，Plant Cell, 1996， 8， 2057-2066),这使得大范围核酸酶诱导的重组成为一种用于基因组工程 的有效且稳定的方法。
对大范围核酸酶诱导重组的利用长期以来受到天然大范围核酸酶 种类的限制，当前技术的主要限制是需要事先在目的基因座中引入大范围 核酸酶切割位点。因此，正在大皿研究构建切割所选乾标的重新设计的 大范围核酸酶。
这些蛋白质可用于切割天然的染色体序列，并开辟基因组工程的广 泛应用的新前景。例如，大范围核酸酶可用于在染色体中敲除内源基因 或敲入外源基因。其还可以用于基因矫正，并原则上用于矫正与单基因 疾病相关的突变。
近来，将Cys2-His2型锌指蛋白(ZFP )的锌指DNA结合结构域与 内切核酸酶的催化结构域进行融合以诱导以下多种细胞类型中的 重组哺乳动物培养细胞(包括人淋巴细胞)、植物和昆虫(Smith等， Nucleic Acids Res, 1999， 27, 674-81 ; Pabo等，Annu. Rev. Biochem， 2001，70, 313-40; Porteus和Baltimore, Science, 2003, 300, 763; Ur譜等， Nature, 2005, 435, 646-651; Bibikova等，Science, 2003, 300， 764; Durai 等，Nucleic Acids Res., 2005, 33, 5978-5990; Porteus M.H.， Mol. Ther" 2006,13,438-446)。 ZEP的结合特异性相对容易操纵，而且现在可得到 能结合许多(g/a)nn(g/a)nn(g/a)nn序列的一系列新型人工ZEP( Pabo等， 出处同前；Segal和Barbas, Curr. Opin. Biotechnol" 2001, 12, 632-7; Isalan等，Nat. Biotechnol.， 2001， 19, 656-60 )。然而，保留非常窄的特异 性是基因组工程应用的主要问题之一，目前不清楚ZFP是否能满足非 常严格的治疗应用需求。此外，这些融合蛋白已经在果蝇(Bibikova等， Science, 2003， 300， 764; Bibikova等，Genetics, 2002,161， 1169- 1175 )和 哺乳动物NIHT3细胞(Alwin等，Mol. Ther" 2005， 12， 610-617; Porteus M.H.和Baltimore D.， Science, 2003， 300,763; Porteus M.H.和Carroll D" Nat. Biotechnol.， 2005， 967-973 )中表现出了高毒性，这很可能是由于频 繁的位点外(off-site)切割而引起的基因毒性作用(Porteus, M.H., Mol. Ther" 2006， 13， 438-446 )。
在自然界中，大范围核酸酶基本上由归巢内切核酸酶(homing endonuclease， HE)代表，其为由可移动遗传元件编码的内切核酸酶家族， 其功能是在称作归巢的过程中启动DNA双链断裂(DSB)诱导的重组事 件(Chevalier和Stoddard, Nucleic Acids Res" 2001,29， 3757-74; Kostriken 等，Cell; 1983,35,167-74; Jacquier和Dujon， Cell, 1985， 41, 383-94 )。在细 菌、真核生物和古细菌(archea) ( Chevalier和Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001， 29， 3757-74 )中已经鉴定了数百种HE;然而在选定的基因中 发现HE切割位点的可能性非常低。
由于它们的生物功能和其在效率和特异性方面优异的切割特性，HE 提供了产生用于基因组工程的新内切核酸酶的理想骨架。
过去十年中已积累了 LAGLIDADG家族(四个HE家族中最大的 一个)的相对充分表征的资料(Chevalier和Stoddard, Nucleic Acids Res.， 2001， 29， 3757-74)。 LAGLIDADG指的是整个所述家族中唯一的 实际上保守的序列，以一个或两个(常常更多)拷贝存在于所述蛋白质 中。具有单个基序的蛋白质(例如I-CwI)形成同二聚体并且切割回文 DNA序列或假回文DNA序列，而较大的双基序蛋白质(例如PI-S"I) 是单体并且切割非回文靼标。已经将9种不同的LAGLIDADG蛋白进行结晶，其显示出非常显著的核心结构保守性，这与在一级序列水平上
缺少相似性形成了对照(Chevalier等，Nat. Struct. Biol" 2001, 8， 312-316; Jurica等，Mol. Cell., 1998, 2, 469-476; Chevalier等，J. Mol. Biol" 2003， 329, 253-269; Moure等，J. Mol. Biol" 2003, 334, 685-695; Moure等，Nat. Struct. Biol" 2002, 9, 764-770; Ichiyanagi等,J. Mol. Biol" 2000, 300， 889-901; Gimble等，J. Biol. Chem., 1998， 273, 30524-30529; Bolduc等，Genes Dev. 2003, 17, 2875-2888; Silva等，J. Mol. Biol" 1999, 286, 1123-1136; Nakayama等，J. Mol. Biol" Epub 29 s印tembre 2006, Spiegel等，Structure, 2006， 14, 869-880 )。
在此核心结构(
图1)中，由两个单体或双LAGLIDADG蛋白中的两 个结构域组成的两个特征性ct即a即a折叠以双重对称方式彼此面对。DNA 结合取决于每个结构域的4个p链，其折叠成反向平行的P-片层，并在DNA 螺旋的大沟上形成鞍。对于与其天然靶标相结合的I-Oel结构进行的分析 显示，在每个单体中，八个残基(Y33、 Q38、 N30、 K28、 Q26、 Q44、 R68和R70)与乾标DNA的士3、 4、 5、 6、 7、 9和10位的七个4^&建立 直接相互作用(Jurica等，Mol. Cell.， 1998， 2， 469-76 )。另外， 一些戎基与 若干威基建立由7JC介导的接触；例如S40、 K28和N30与+8和-8位的4 ^ 对建立接触(Chevalier等，J. Mol. Biol" 2003, 329， 253-269 )。
催化位点位于中央，由来自两个单体的螺旋形成。就在所述催化位 点上方，所述两种LAGLIDADG肽也在二聚化界面中起到至关重要的 作用。除了该核心结构以外，还可发现其它的结构域，例如PI-5^el(蛋 白质内含子)具有一个蛋白质剪切结构域和其它的DNA结合结构域 (Moure等，Nat. Struct. Biol" 2002， 9， 764-770; Pingoud等， Biochemistry, 1998， 37， 8233-8243 )。
大范围核酸酶家族内广泛的结构保守性鼓励人们对HE进行诱变和 构建发生大量修饰的嵌合及单链HE 。
通过将N端KDmol结构域与I-Od单体融合而产生功能性嵌合及单 ^A工HE (Epinat等，Nucleic Acids Res" 2003， 31, 2952-62; Chevalier等， Mol. Cell., 2002， 10， 895-卯5;PCT国际申请WO 03/078619和WO 2004/031346)已证明了 LAGLIDADG蛋白的可塑性不同的单体或核心 结构域可融合到单个蛋白质中，以获得切割新的(非回文)乾序列的新型大范围核酸酶。
此外，不同研究组还使用推理性方法来局部改变I-OeI (Seligman等, Nucleic Acids Res" 2002， 30， 3870-3879; Sussman等，J. Mol. Biol" 2004, 342, 31-41; Rosen等，Nucleic Acids Res" 2006， 34， 4791-4800; Arnould等， J. Mol. Biol.， 2006, 355， 443-458及PCT国际申请WO 2006/097853和WO 2006/097784; Smith等，Nucleic Acids Res.， 2006， 34， e149 )、 Mcel (Doyon 等，J. Am. Chem. Soc., 2006， 128， 2477-2484 )、 PI-SceI ( Gimble等，J. Mol. Biol" 2003, 334， 993-1008 )和I画MwI (Ashworth等，Nature, 2006， 441， 656-659 )的特异性。
近期工作表明，得到大量的识别多种耙标的经局部修饰的I-Od大 范围核酸酶变体、通过组合方法将所述变体组装以及得到具有所选特异 性的完全重新i殳计的突变体是可能的(Arnould等，J. Mol. Biol.， 2006, 355， 443誦458;PCT国际申请WO 2006/097853和WO 2006/097784; Smith等，Nucleic Acids Res.， 2006， 34, e149 )。
因此，通过联用半推理性方法和高通量筛选改造了几百种特异性改 变的I-Od衍生物
-诱变了 I-Oel的残基Q44、 R68和R70或者Q44、 R68、 D75和 177，通过筛选鉴定了土3至5位上特异性改变的DNA耙标(5NNN DNA 靶标)的变体组(PCT国际申请WO 2006/097784和WO 2006/097853; Arnould等，J. Mol. Biol" 2006, 355， 443-458; Smith等,Nucleic Acids Res., 2006， 34， e149 )。
-诱变了 I-O^I的残基K28、 N30和Q38; N30、 Y33和Q38或者 K28、 Y33、 Q38和S40,通过筛选鉴定了 ±8至10位特异性改变的DNA 靶标(10NNN DNA耙标)的变体组(Smith等，Nucleic Acids Res.， 2006， 34， e149 )。
I-Oel的残基28-40以及44-77显示形成两个可分离的功能性亚结 构域，其能结合归巢内切核酸酶半位点的不同部分(Smith等Nucleic Acids Res.， 2006, 34, e149 )。
在相同单体内组合中两个亚结构域的突变使得能够设计出新的嵌合分子(同二聚体)，其能切割含有通过各亚结构域结合的土3至5 位以及土8至10位的核苷酸的回文组合DNA靶序列(Smith等，Nucleic Acids Res.， 2006, 34， e149 )。
将两种不同的变体相组合并组装成能切割由融合各变体DNA乾序 列的不同的一半而得到的嵌合靶标的功能性异二聚化内切核酸酶 (Arnould等，出处同前;PCT国际申请WO 2006/097854 )。有趣的是， 新蛋白质保持了正确的折叠和稳定性、高活性以及窄特异性。
所述两个前述步骤的组合允许进行包括4种不同亚结构域的更大的 组合方法。可分别修饰不同的亚结构域，并将其组合成能切割来自目的 基因的靶标的一种大范围核酸酶变体(异二聚体或单链分子)。在第一 步中，将几对新的大范围核酸酶组合在切割来自希望切割的耙标的回文 靶标的新分子("半大范围核酸酶")中。然后，这种"半大范围核酸酶" 的组合可得到切割目的耙标的异二聚体种类。在Smith等的Nucleic Acids Res., 2006, 34, e149中已经描述了将4组突变组装成切割才莫型把序 列或来自人RAGl基因的序列的异二聚体内切核酸酶。
这些变体可用于切割天然染色体序列，并在包括基因治疗的几个领 域中开辟了具有新前景的道路。例如，大范围核酸酶诱导的重组可用于 矫正与单基因遗传病(例如SCID、 SCA或CFTR)相关的突变。该策 略具有避开与当前的随机插入回补转基因之策略相关的不均等性的优 势。
虽然I-S"I归巢内切核酸酶已表明毒性比ZEP的小(Alwin等，Mol. Ther" 2005, 12, 610-617; Porteus M.H.和Baltimore D., Science, 2003， 300， 763; Porteus M.H.和Carroll D.， Nat. BiotechnoL， 2005, 23， 967-973),这可能是由于其特异性较高，但是在非常高的剂量下I-S"I 仍可能有害(Gouble等，J. Gene Med" 2006， 8， 616-622 )。位点外切割 可通过形成蛋白质工程副产物而大大提高。迄今为止，大多数改造的内 切核酸酶(ZFN和HE)是异二聚体，包括两种分别改造的单体，每种 单体结合所述靶标的一半。通过两个单体在相同细胞中共表达而形成异
二聚体(Porteus H.M" Mol. Ther" 2006， 13， 438-446; Smith等，Nucleic acids Res.， 2006, 34, e1149 )。然而，由于识别不同的靶标实际上与两种同二聚体的形成相关
(Arnould等，J. Mol. Biol" 2006, 355， 443-458; Bibikova等，Genetics, 2002， 161， 1 169-1175)，所以单个同二聚体有时可导致非常高水平的毒 性(Bibikova等，Genetics, 2002， 161， 1169-1175; Beumer等，Genetics, 2006，172, 2391-403)。
因此，仍然限制单LAGLIDADG归巢内切核酸酶(例如I-Od)的 较广泛应用的因素的是下面这一事实蛋白质为同二聚体。虽然靶向两 种不同DNA序列的两种不同I-Oel变体的共表达导致形成识别杂交 DNA序列的功能性异二聚体，但是这仍然导致形成3种不同酶的混合 物，包括两种同二聚体(Arnould等，J. Mol. Biol" 2006, 355, 443-458; PCT国际申请WO 2006/097853和WO 2006/097784; Smith等，Nucleic Acids Res.， 2006， 34, e149 )。
该特异性丢失可仅通过抑制功能性同二聚体形成来解决。理论上， 此结果可通过将两种单体融合在单链分子中来实现(Epinat等，Nucleic Acids Res.， 2005, 33, 5978-59卯；国际申请WO 03/078619 )。然而，所述 单链分子并不一定减轻不同分子中aP(3a即a折叠的相互作用，尤其是在 连接物长并且具有柔性时，但是其应当至少促进相同分子的appa即a折 叠之间的相互作用。
专性异二聚体大范围核酸酶的制备提供了解决基因组工程应用中 主要的特异性和毒性问题的良好折叠的功能性蛋白质。
此外，单链分子的制备和二聚化界面的重新设计并不是排他性的策 略，并且它们可联合使用。
因此，本发明人重新设计了两种I-Oel大范围核酸酶单体之间的相 互作用表面(界面)以得到专性异二聚体。
所述同二聚体的大部分二聚化界面由以巻曲螺旋排列的两种a-螺 旋(两个单体中的Lys7至Glyl9)组成，这使得它们难于重新设计。 这些螺旋下面的氨基酸(Asp20及其前面的)与DNA接触，因此决定 内切核酸酶的活性(活性位点)和特异性(DNA识别)。这些功能单独 阻止了任意这些残基在设计过程中容易地修饰。因此，这使得减少功能
12性同二聚体形成的可能性很小。尽管如此，本发明人已鉴定了二聚体中 可在不妨碍其结合能力或其酶活性的情形下而被干扰和改变的包含在
界面中的4个相互作用位点。
在各位点中， 一个单体(A)中的两个残基(Z和Z，)与另一个单 体(B)中的对应残基(分别为Z，和Z)建立起有利的相互作用。为了 保持异二聚体中的此相互作用并同时减少功能性同二聚体的形成，在一
个单体中利用两个残基Z替换残基Z和Z，，而在另 一个单体中利用两 个残基Z，替换残基Z和Z，。因此， 一个单体的一个残基(例如单体(A) 中的Z)被功能上与Z，等同的残基替换，在另一个单体(B)中，Z，被
功能上与Z等同的残基替换。因此，AA和BB同二聚体相排斥，而AB 异二聚体的形成是有利的。
本身被改造以识别不同DNA序列的新单体允许形成功能性异二聚 体并防止同二聚体位点切割。此设计显著提高了改造出用于基因组工程 的高度特异性试剂的能力，并除去了将重新设计的大范围核酸酶用于基 因治疗和其它应用的道路上的最后障碍之一。对于需要将基因毒性降到
最低的治疗应用而言，此特异性增强可能使情况完全改观。
本发明涉及一种由第一单体和第二单体(A和B)组成的专性异二 聚体大范围核酸酶，所述单体来源于两种不同的同二聚化LAGLIDADG 内切核酸酶(母体单体)并且具有至少一对突变引入到所述母体单体中 使得各母体同二聚化LAGLIDADG内切核酸酶的两个单体之间产生分 子间相互作用的对应残基上，其中所述突变对中的第一突变在所述第一
单体中，所述突变对中的第二突变在所述第二单体中，所述突变对破坏 由各单体形成功能性同二聚体，而不防止能切割非回文杂合DNA靶标
的功能性异二聚体的形成，所述非回文杂合DNA靶标包含各母体同二 聚化内切核酸酶所切割的DNA靶标中不同的 一半。
每一母体单体具有二聚化界面中的至少两个残基Z和Z，，其与分别 来自同 一或另 一母体单体的残基Z，和Z相互作用(两对相互作用的ZZ， 残基)以形成两种同二聚体和一种异二聚体。才艮据本发明，所述二聚化 界面的两对相互作用的残基中之一相互交换，而得到分别具有两个残基 Z或Z，的单体A以及具有两个残基Z，或Z的单体B。结果，各自具有 两个残基Z或两个残基Z，的A和B单体相比于其母体对应部分较不容
13易同二聚体化，而异二聚体AB界面上两对相互作用的ZZ，残基的存在 则有利于AB异二聚体的形成。
定义
氨基酸指天然或合成氨基酸，包括前述氨基酸的对映体和立体异构体。
多肽序列中的氨基酸残基在本文中根据单字母代码命名，其中，例 如Q表示Gln或谷氨酰胺残基，R表示Arg或精氨酸残基，D表示Asp 或天冬氨酸残基。
酸性氨基酸指天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。
碱性氨基酸指赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)。
小氨基酸指甘氨酸(G)和丙氨酸(A)。
芳香族氨基酸指苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
核苷酸按如下命名使用单字母代码命名核苷的碱基a为腺嘌呤， t为胸腺嘧啶，c为胞嘧啶，g为鸟嘌呤。对于简并核苷酸而言，r表示 g或a(噤呤核香酸)，k表示g或t, s表示g或c， w表示a或t， m 表示a或c, y表示t或c (嘧咬核苷酸)，d表示g、 a或t, v表示g、 a或c， b表示g、 t或c, h表示a、 t或c， n表示g、 a、 t或c。
"大范围核酸酶"意指具有12-45 bp的双链DNA靶序列的内切核
"同二聚体LAGLIDADG归巢内切核酸酶"意指具有单个 LAGLIDADG基序并且切割回文DNA乾序列(例如或I-M^I 或其功能性变体)的野生型同二聚体LAGLIDADG归巢内切核酸酶。
"LAGLIDADG归巢内切核酸酶变体"或"变体"意指通过利用不 同的氨基酸替换LAGLIDADG归巢内切核酸酶序列的至少一个氨基酸 而得到的蛋白质。
"功能性变体"意指能切割DNA靶标(优选不被野生型LAGLIDADG归巢内切核酸酶切割的新的DNA把标)的LAGLIDADG 归巢内切核酸酶变体。例如，这些变体在与DNA靼序列相接触或者与 所述DNA靼标直接或间接相互作用的位置上具有氨基酸变异。
"具有新特异性的大范围核酸酶变体"意指具有与母体归巢内切核 酸酶不同的切割靶标模式的变体。等价且无差异地使用的术语"新特异 性"、"经修饰的特异性"、"新的切割特异性"、"新的底物特异性"指变 体针对DNA靶序列中核苷酸的特异性。
"I陽OgI"意指具有序列SWISSPROT P05725 (SEQ ID NO: l)或 pdb登录号lg9y (SEQ ID NO: 43)的野生型I-Oel。
"结构域"或"核心结构域"意指"LAGLIDADG归巢内切核酸酶 核心结构域",它是LAGLIDADG家族归巢内切核酸酶的特征性 0^N52a2P3p4a3折叠，对应于约一百个氨基酸残基的序列。所述结构域包 含折叠成反向平行P-片层的四条P链(&、 p2、 p3、卩4)，所迷P-片层与 DNA靶标的一半相互作用。该结构域能够与另一 LAGLIDADG归巢内 切核酸酶核心结构域(其与所述DNA耙标的另一半相互作用)结合， 形成能够切割所述DNA靶标的功能性内切核酸酶。例如，在二聚化归 巢内切核酸酶I-Oel (163个氨基酸)的情况下，LAGLIDADG归巢内 切核酸酶核心结构域对应于残基6至94。
-"亚结构域"意指LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域中的 区域，其与归巢内切核酸酶DNA靶标半位点的不同部分相互作用。
-"P-发夹"是指LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域反向平 行P-片层的两条连续(5-链(p^2或p3(34)，其通过环或转角相连。
-"DNA靶标"、"DNA耙序列"、"乾序列"、"耙位点"、"靶标"、"位 点"、"识别位点"、"识别序列"、"归巢识别位点"、"归巢位点"、"切割位 点"是指被LAGLIDADG归巢内切核酸酶识别并切割的20到24 bp的双链 回文、局部回文(假回文)或非回文的多核苷酸序列。这些术语是指内切 核酸酶要在其中诱导双链断裂(切割)的独特DNA定位，优选地为基因 组定位。所述DNA靶标通过双链多核香酸的一个链的5'至3，序列来定义。 例如，通过野生型切割的回文DNA乾序列被定义为定义为序列
155，- t.i2C.iia-|oa>9aL8a>7C-6g-5t4C-3g-2t>ia*|C+2g+3a+4C+5g+6t+7t+stf9"IOg+lia+l2 ( SEQ ID NO :2)。
"DNA靶标半位点"、"半切割位点"或"半位点"意指DNA靶 标中与各个LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域/单体结合的部
"嵌合DNA靼标"或"杂合DNA耙标"意指两个母体大范围核酸酶耙 序列中不同之一半的融合物。另外，所述靼标的至少一半可包含通过至 少两个独立的亚结构域结合的核普酸之组合(组合DNA耙标)。
-"载体"是指能够转运与之连接的另一核酸的核酸分子。
-"Mi"是指一条序列与另 一序列具有足够导致序列间发生同源重
组的同一性，更具体地具有至少95%的同一性，优选97%的同一性， 更优选99%的同一性。
_"^^"是指两条核酸分子或多肽之间的序列同一性。可通过比较
各序列中可为比较目的而排列的位置来测定同一性。当所比较序列中的 一个位置被相同的碱基占据时，则这些分子在该位置上是相同的。核酸 或氨基酸序列之间的相似性或同 一性程度是核酸序列间共有的位置上 相同或匹配的核苷酸数量的函数。可使用多种比对算法和/或程序计算 两条序列之间的同一性，包括FASTA或BLAST,它们可作为GCG序 列分冲斤包(University of Wisconsin, Madison, Wis.)的一部分获得，并可 以例如默认设置使用。
-"tfc"包括哺乳动物以及其它脊推动物(例如鸟类、鱼和爬行动物)。 本文使用的术语"哺乳动物，，是指任何这样的脊稚动物，包括单孔类、有袋 类和胎盘动物，它们对其幼仔哺乳，并且分娩活的幼仔(真哺乳亚纲 (eutharian)或胎盘哺乳动物)或者产卵(后兽亚纲(metatharian)或非胎盘 (nonplacental)哺乳动物)。哺乳动物物种的实例包括人和其他灵长类(例 如猴、猩猩)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)和反刍动物(例如牛、 猪、马)。
"遗传性疾病"指部分或全部、直接或间接由于一种或几种基因异 常而引起的任意疾病。所述异常可以是突变、插入或缺失。所述突变可 以是准时突变。所述异常可影响基因或其调节序列的编码序列。所述异常可影响基因组序列的结构或者所编码mRNA的结构或稳定性。所述 遗传性疾病可以是隐性或显性的。这样的遗传性疾病可包括但不限于嚢 性纤维化、亨廷顿舞蹈病、家族性高胆固醇血症(LDL受体缺陷)、嗜 肝母细胞瘤、威尔森氏病、先天性肝性卟啉症、肝脏代谢的遗传病、 Lesch-Nyhan综合征、镰刀形红细胞贫血病、地中海型贫血、着色性干 皮病、范可尼贫血、视网膜色素变性、共济失调性毛细血管扩张综合症、 Bloom综合征、视网膜母细胞瘤、杜氏肌营养不良以及Tay-Sachs病。
根据本发明，参照氨基酸序列SEQ ID NO: 1表示突变位置。 了解了 I-O^I结构中的突变位置(pdb登录号Ig9y)，本领域技术人员 利用众所周知的蛋白质结构分析软件(例如Pymol)可容易地推出另一 种同二聚体LAGLIDADG归巢内切核酸酶中的对应位置。例如，I-CVeI 中的K96位和E61位对应于中的R102位和Q64位。此外，对 于而言，两个功能性亚结构域位于26-40位和44-77位上，在 中则分别位于28-43位和47-83位。
根据所述专性异二聚体大范围核酸酶的一个优选实施方案，所述第 一单体和所述第二单体分别具有下述突变对中之一
a) 8位上的谷氨酸被碱性氨基酸替换(单体A)， 7位上的赖氨酸被酸 性氨基酸替换(单体B )，
b) 61位上的谷氨酸被碱性氨基酸替换(单体A), 96位上的赖氨酸被 酸性氨基酸替换(单体B )，
c) 97位上的亮氨酸被芳香族氨基酸替换(单体A)， 54位上的苯丙氨 酸被小氨基酸替换(单体B),以及
d) 137位上的天冬氨酸被碱性氨基酸替换(单体A )， 51位上的精氨酸 被酸性氨基酸替换(单体B ),
所述位置参照氨基酸序列SEQ ID NO: 1来表示。
根据所述专性异二聚体大范围核酸酶的一个更优选的实施方案，如 a)或b)中所定义，所述单体的8位或61位上的谷氨酸被碱性氨基酸 替换，该单体还包含其7位和96位上的赖氨酸残基中的至少一个被精氨酸替换。
根据所述专性异二聚体大范围核酸酶的另一个更优选的实施方案，
如c)中所定义的97位上的亮氨酸被芳香族氨基酸替换的单体还包含 54位上的苯丙氨酸被色氨酸替换。
根据所述专性异二聚体大范围核酸酶的另 一个更优选的实施方案， 如c)中所定义的54位上的苯丙氨酸被小氨基酸替换的单体还包含58 位上的亮氨酸或57位上的赖氨酸被甲硫氨酸替换。
根据所述专性异二聚体大范围核酸酶的另一个更优选的实施方案， 所述酸性氨基酸是谷氨酸。
根据所述专性异二聚体大范围核酸酶的另 一个更优选的实施方案， 所述碱性氨基酸是精氨酸。
根据所述专性异二聚体大范围核酸酶的另 一个更优选的实施方案， 所述芳香族氨基酸是苯丙氨酸。
根据所述专性异二聚体大范围核酸酶的另 一个更优选的实施方案， 所述小氨基酸是甘氨酸。
根据所述专性异二聚体大范围核酸酶的另 一个更优选的实施方案， 其由具有突变D137R的第 一单体(A )和具有突变R51D的第二单体(B ) 组成。
根据所述专性异二聚体大范围核酸酶的另一个更优选的实施方案， 其包含上文a)、 b)、 c)或d)中所定义的至少两对突变，所述突变对中之 一有利地如c)或d)中所述。优选地， 一个单体的7位和96位上的赖氨 酸残基被替换为酸性氨基酸，另一个单体的8位和61位上的谷氨酸残 基被替换为碱性氨基酸。
更优选地，所述专性异二聚体大范围核酸酶包含如上文a)、 b)和c) 中所定义的3对突变。所述专性异二聚体大范围核酸酶有利地由第一单 体(A)和第二单体(B)组成，所述第一单体(A)具有至少选自以下 的突变(i) E8R、 E8K或E8H, E61R、 E61K或E61H以及L97F、 L97W或L97Y; (ii) K7R、 E8R、 E61R、 K96R以及L97F，或者(iii) K7R、E8R、 F54W、 E61R、 K96R以及L97F;所述第二单体(B)具有至少 选自以下的突变(iv)K7E或K7D，F54G或F54A以及K96D或K96E; (v)K7E、 F54G、 L58M以及K96E，或者(vi) K7E、 F54G、 K57M以及 K96E。
根据本发明的专性异二聚体大范围核酸酶来源于野生型同二聚化 LAGLIDADG归巢内切核酸酶或其功能性变体。野生型同二聚化 LAGLIDADG归巢内切核酸酶的实例显示在Lucas等，Nucleic Acids Res,， 2001， 29， 960-969的表1中。野生型同二聚化LAGLIDADG归巢 内切核酸酶可有利地选自I-Oel、 I-0 I、 以及I-Qml，优选
单体A和B由于二聚化界面外部的一个或多个突变而与野生型单体 不同。该额外突变有利地在与DNA靶标半位点相互作用的氨基酸残基 的位置上。LAGLIDADG归巢内切核酸酶DNA相互作用残基是本领域 中众所周知的(Jurica等，Molecular Cell" 1998, 2, 469-476; Chevalier 等，J. Mol. Biol., 2003， 329， 253-269 )。突变的残基可直接或通过7K分子 与DNA骨架或核苷酸碱基相互作用。优选地，所述突变修饰大范围核 酸酶的切割特异性，并产生具有新的特异性的大范围核酸酶，其能切割 来自目的基因的DNA靶标。更优选地，所述突变是对应于位于I-CVrf 氨基酸序列的26-40位的第一功能性亚结构域中的一个或多个氨基酸的 替换，其改变对DNA把标中士8-10位核香酸的特异性，和/或所述突变 是对应于位于I-Od氨基酸序列的44-77位的第二功能性亚结构域中的 替换，其改变对DNA耙标中土3至5位核苷酸的特异性，如前文所述 (PCT国际申请WO 2006/097784 、 WO 2006/097853 、 WO 2007/060495 、 WO 2007/049156、 WO 2007/049095以及WO 2007/057781; Arnould等， J. Mol. Biol" 2006, 355, 443-458; Smith等，Nucleic Acids Res.， 2006, 34, e149)。所述替换有利地对应于I-Oel氨基酸序列的26、 28、 30、 32、 33、 38和/或40、 44、 68、 70、 75和/或77位。为了切割其中n.4是t 或者n+4是a的DNA靶标，所述变体在44位有利地是谷胺酰胺；为了 切割其中iu是a或者n+4是t的DNA靶标，所述变体在44位有利地是 丙氨酸(A)或天冬酰胺；为了切割其中n-9是g或者n+9是c的DNA 靶标，所述变体在38位有利地是精氨酸(R)或赖氨酸(K)。根据所述专性异二聚体大范围核酸酶的另 一个有利的实施方案，所
述单体A和B是不同的单体变体，优选在的26-40位和/ 或44-77位具有突变的变体；由这两个单体组成的专性异二聚体大范围 核酸酶AB能切割非回文DNA把标，其中所述DNA乾标的至少+3至 +5位、+8至+10位、-10至-8位以及-5至-3位上的核苷酸对应于目的 基因的DNA把标的+3至+5位、+8至+10位、-10至-8位以及-5至-3 位上的核苷酸。优选地，所述异二聚体的两个单体都在26-40位和/或 44-77位具有突变。更优选地，两个单体都在的26-40位和/或44-77 位具有不同的突变。
单体A和B在与DNA乾序列相互作用的其它位置上可包含一个或 多个突变。具体而言，其它替换可以在与磷酸骨架相接触的位置上引入， 例如在最后的C-末端环(137-143位；Prieto等，Nucleic Acids Res.， Epub 22 April 2007 )。优选地，所述残基涉及所述DNA切割位点的结合与切 割。更优选地，所述残基在的138、 139、 142或143位上。两个 残基可在一个结构域中突变，只要每个突变在选自138位和139位的残 基对以及142位和143位的残基对中的不同残基对中即可。所引入的突 变修饰最后一个C端环的氨基酸与位点的磷酸骨架之间的相互 作用。优选地，138位或139位上的残基被替换为疏水性氨基酸以避免 与DNA切割位点的磷酸骨架形成氢键。例如，138位上的残基4皮替换 为丙氨酸或者139位上的残基被替换为甲石克氨酸。142位或143位上的 残基有利地被替换为小氨基酸(例如甘氨酸)以降低这些氨基酸残基侧 链的大小。更优选地，最后一个C-端环中的替换改变了所述专性异二 聚体大范围核酸酶对位点的土l至2、 ±6至7和/或±11至12位的 核苷酸的特异性。
此外，单体A和B可包含改善所述专性异二聚体大范围核酸酶对目 的基因之DNA靶序列的结合和/或切割性质的一个或多个其它突变。突 变的其它残基可以在单体的整个序列上。突变的实例包括下述突变，参 照I-Crd氨基酸序列124V，R70S， 75位天冬氨酸的突变为不带电荷的 氨基酸，优选天冬酰胺(D75N)或缬氨酸(D75V)，以及在单体序列 的C端一半中的替换，优选在以下位置的替换80、 82、 85、 86、 87、 94、 96、 100、 103、 114、 115、 117、 125、 129、 131、 132、 147、 151、 153、 154、 155、 157、 159和160位。在所述专性异二聚体大范围核酸酶的另一个有利的实施方案中，所
述突变是原始氨基酸被替换为选自以下的氨基酸A、 D、 E、 G、 H、 K、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 Y、 C、 V、 L和W。
此外，可将一个或多个残基插入到单体的NH2端和/或COOH端。 例如，将甲硫氨酸残基引入到NH2端，将标签(表位或多聚组氨酸序列) 引入到NH2端和/或COOH端；所述标签可用于检测和/或纯^b所述异 二聚体。
本发明还涉及上文所述的专性异二聚体大范围核酸酶的单体A或B。
本发明还涉及一种单链大范围核酸酶(融合蛋白)，其包含通过肽 连接物(p印tidic linker)连接的上文所述的单体A和B。
本发明的主题还包括编码如上文所定义的专性异二聚体大范围核 酸酶的至少一个单体或其单链衍生物的多核苷酸片段。
本发明的主题还包括一种重组栽体，其包含如上文所定义的至少一 种多核苷酸片段。所述栽体可有利地包含两种不同的多核苷酸片段，所 述多核苷酸片段各自编码本发明的专性异二聚体大范围核酸酶的单体 之一》
可在本发明中使用的载体包括但不限于病毒载体、质粒、RNA载体， 或者线性或环形DNA或RNA分子，可由染色体、非染色体、半合成或 合成的核酸所组成。优选的栽体是能够自主复制与之连接的核酸的载体 (附加型载体)和/或表达与之连接的核酸的栽体(表达载体)。大量的 合适载体是本领域技术人员已知的，并可以商品获得。
病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(parvovirus)(例如腺 相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒如正粘病毒(orthomyxovirus)(例 如流感病毒)、杆状病毒(例如狂犬病毒和疱渗性口炎病毒(vesicular stomatitis virus))、 富，J粘病毒(paramyxovirus)(例如麻渗病毒和仙台病 毒(Sendai))、正链RNA病毒如小RNA病毒(picornavirus)和a病毒， 以及双链DNA病毒，其包括腺病毒、疱瘆病4 (例如1和2型单纯疱 渗病毒、EB病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如牛痘病毒、禽痘病毒
21和金丝雀痘病毒)。其他病毒包括例如诺瓦克病毒、披膜病毒(togavirus)、 黄病毒(flavivirus)、呼肠病毒(reoviruses)、乳多空病毒(papovavirus)、 嗜肝DNA病毒(hepadnavirus)和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括禽 白血病-肉瘤、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、 慢病毒、泡沫病毒(spumavims) (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology,第三版，B. N. Fields，等 编辑,Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)。
优选的载体包括慢病毒载体，尤其是自失活(self inactivacting)的慢病 毒载体。
栽体可包含选择标记，例如用于真核细胞培养的新霉素磷酸转移酶、 组氨醇脱氢酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素磷酸转移酶、单纯疱渗病毒胸苷 激酶、腺苷脱氨酶、谷氨酰胺合成酶和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶； 用于酿酒酵母(5". Orew:wV^)的TRP1;大肠杆菌CE". "/Z)中的四环素、利福 平或氨苄青霉素抗性。
优选地，所述栽体是表达载体，其中编码本发明专性异二聚体大范围 核酸酶/单链衍生物的序列置于适当的转录和翻译控制元件的控制下，以允 许产生或合成所述大范围核酸酶。因此，所述多核普酸包含在表达盒中。 更具体地，载体包含复制起点、与所述编码多核苷酸有效连接的启动子、 核糖体结合位点、RNA剪接位点(使用基因组DNA时)、多腺苷酸化位 点和转录终止位点。其还可包^^增强子。启动子的选择将取决于其中表达 多肽的细胞。优选地，编码所述专性异二聚体大范围核酸酶的各个单体的 两种多核普酸包含在一个栽体中，所述载体能够驱动两种多核苷酸同时表 达。合适的启动子包括组织特异性和/或i秀导型启动子。i秀导型启动子的实 例是由提高重金属水平诱导的真核金属硫蛋白(metaUothionine)启动子， 应答于异丙基-p-D-石危代半乳吡喃糖苷(IPTG)诱导的原核lacZ启动子，和 由提高温度诱导的真核热休克启动子。组织特异性启动子的实例是骨骼肌 肌酸激酶、前列腺特异性抗原(PSA)、 a-抗胰蛋白酶、人表面活性剂(SP)A 和B蛋白、P-gS^白和酸性乳清蛋白基因。
根据所述栽体的另一个有利的实施方案，其包括靶向DNA构建体， 所述靶向DNA构建体含有与目的基因组位点周围区域有同源性的序 列，所述目的基因组位点含有如上文所定义的杂合DNA靶序列。
22更优选地，所述乾向DNA构建体包含
a) 与含有目的基因组位点周围区域有同源性的序列，其中所述目的基 因组位点含有如上文所定义的杂合DNA靶序列，以及
b) 两侧是a)中序列的待引入序列。
优选4吏用至少50 bp、优选大于100 bp、更优选大于200 bp的同源序 列。事实上，共有的DNA同源性位于断裂位点上游和下游的两侧区域， 且待引入DNA序列应位于两臂之间。待引入序列包含外源目的基因或者 用于佳i因或其一部分失活或缺失的序列。
本发明还涉及经上文所定义多核苷酸或载体(优选表达载体)修饰 的原核或真核宿主细胞。
本发明还涉及特征在于其所有或部分细胞经上文所定义多核苷酸 或载体修饰的非人转基因动物或转基因植物。
本文所用的细胞指原核细胞(例如细菌细胞)或真核细胞(例如动 物细胞、植物细胞或酵母细胞)。
本发明的主题还包括上文所定义的专性异二聚体大范围核酸酶/单 链大范围核酸酶衍生物、 一种或两种多核苷酸(优选包含在表达载体 中)、细胞、转基因植物、非人转基因哺乳动物用于分子生物学、体内 或体外基因工程、以及体内或体外基因组工程中的非治疗目的的用途。
非治疗目的包括例如(i)用于蛋白质生产的包装细胞系中特异性基 因座的基因打靶；(ii)用于植林改善和代谢工程的谷类植物中特异性基 因座的基因打耙；(iii)用于除去基因修饰的谷类植物中的标志物的靶 向重组，(iv)用于除去基因修饰的微生物菌株中的标志物的靶向重组 (例如用于抗生素生产)。
根据所述用途的一个有利的实施方案，其用于诱导含有杂交DNA 乾序列之目的位点中的双链断裂，从而诱导DNA重组事件、DNA丢失 或细胞死亡。
根据本发明，所述双链断裂是用于修复特定序列、修饰特定序列、
23恢复功能性基因而替换突变基因，弱化或活化内源目的基因、将突变引 入到目的位点中、引入外源基因或其部分、失活或消灭内源基因或其部
分、使染色体臂易位或者使DNA不被修复并降解。
本发明的主题还涉及基因工程方法，其特征在于包括以下步骤使 包含上文所定义的杂合DNA靶标的栽体上的目的位点中的双链核酸断 裂，所述断裂通过使所述载体与上文所定义的专性异二聚体大范围核酸 酶/单链大范围核酸酶衍生物相接触而实现，从而诱导与另 一栽体进行 同源重组，所述另一载体与所述专性异二聚体大范围核酸酶的切割位点 周围的序列有同源性。
本发明的主题还涉及基因组工程方法，其特征在于包括以下步骤 1)使基因座处发生双链断裂，所述断裂通过使杂交DNA靶标与所述大 范围核酸酶相接触而实现，其中所述基因座含有上文所定义的至少一种 杂合DNA靶标和专性异二聚体大范围核酸酶/单链大范围核酸酶衍生 物；2)将所述断裂的基因组基因座维持在适于与靶向DNA构建体进行 同源重组的条件下，所述构建体包含待引入到所述基因座中的序列，其 两侧是与所靶向基因座有同源性的序列。
本发明的主题还涉及基因组工程方法，其特征在于包括以下步骤 1)使基因座处发生双链断裂，所述断裂通过使切割位点与上文所定义 的所述大范围核酸酶相接触而实现，其中所述基因座含有上文所定义的 至少一种杂合DNA靶标和专性异二聚体大范围核酸酶/单链大范围核酸 酶衍生物；2)将所述断裂的基因组基因座维持在适于与和所述切割位 点周围区域有同源性的染色体DNA进行同源重组的条件下。
本发明的主题还包括上文所定义的至少一种专性异二聚体大范围 核酸酶/单链大范围核酸酶衍生物、 一种或两种多核苷酸(优选包含在 表达载体中)在制备用于在有此需求的个体中预防、改善或治疗遗传性 疾病的药物中的用途，所述药物可以任意方式施用给所迷个体。
本发明的主题还包括在有此需求的个体中预防、改善或治疗遗传 性疾病的方法，所述方法至少包括以下步骤以任意方式将上文所定义 的组合物施用给所述个体。在该情况下，如上文所定义的专性异二聚体大范围核酸酶/单链大范
围核酸酶衍生物的使用至少包括以下步骤(a)在个体的体细胞组织中，在 包含所述大范围核酸酶的至少一个识别和切割位点的基因之目的位点处 诱导双链切割，和(b)向该个体中引入靶向DNA,其中所述耙向DNA包含 (l)与切割位点周围区域有同源性的DNA，和(2)在该靶向DNA与染色体 DNA之间发生重组时修复目的位点的DNA。在适于将靶向DNA引入目的 位点的M下将靶向DNA引入所述个体。
根据本发明，所述双链切割通过对个体施用所述大范围核酸酶而整 体(/" "to)诱导，或者通过将所述大范围核酸酶引入到取自个体的体细胞内 并在4务饰后放回所述个体内而进行离体诱导。
在所述用途的一个优选实施方案中，将所述大范围核酸酶与靶向 DNA构建体组合，所述靶向DNA构建体包含修复基因中突变的序列，其 两侧是与所述大范围核酸酶的基因组DNA切割位点周围的基因区域有同 源性的序列，如上文所述。所述修复突变的序列是具有正确序列的基因 片段或者是外显子敲入构建体。
就矫正基因而言，基因的切割发生在突变附近，优选在突变的500bp 范围内。靶向构建体包含基因片段，其含有基因组DNA切割位点两侧至 少200 bp的同源序列(最小修复基质)用于修复切割，并含有用于修复突 变的正确基因序列。因此，用于基因矫正的靶向构建体包含最小修复基质 或由其组成；其优选为200 pb到6000 pb，更优选为1000 pb到2000 pb。
为了恢复功能基因，基因的切割发生在突变的上游。优选所述突变 是该基因序列中第一个已知的突变，从而该基因中所有下游突变都可同时 被矫正。所述靶向构建体包含基因組DNA切割位点下游的外显子，它们 在框内融合(如同在cDNA中一样)，并在3，端具有多聚腺苷酸化位点以 终止转录。待引入序列(外显子l构建体)的两侧是切割位点周围的内 含子或外显子序列，从而允许所改造基因(外显子HLA^因)转录成为能 编码功能性蛋白质的mRNA。例如，外显子^JU^构建体的两侧是上游和下 游的序列。
本发明的主题还包括上文所定义的专性异二聚体大范围核酸酶/ 单链大范围核酸酶衍生物、 一种或两种多核苷酸(优选包含在表达载体 中)在制备用于在有此需求的个体中预防、改善或治疗由具有DNA中间体的传染原引起的疾病的药物中的用途，所述药物通过任意方式施用 给所述个体。
本发明的主题还包括在有此需求的个体中预防、改善或治疗由具
有DNA中间体的传染原引起的疾病的方法，所述方法至少包括以下步 骤通过任意方式将上文所定义的组合物施用给所述个体。
本发明的主题还包括上文所定义的专性异二聚体大范围核酸酶/ 单链大范围核酸酶衍生物、 一种或两种多核苷酸(优选包含在表达栽体 中)在体外用于抑制传染原的传播、灭活或消灭传染原的用途，或者用 于物品消毒的用途，其中所述传染原具有DNA中间体，存在于生物来 源产品或旨在用于生物用途的产品中。
本发明的主题还包括给产品或物质消毒以除去其中具有DNA中 间体之传染原的方法，所述方法至少包括以下步骤将生物来源产品、 旨在用于生物用途的产品或物品与上文所定义的组合物接触一定时间， 所述时间足以抑制所述传染原的传播、灭活或消灭所述传染原。
在一个具体的实施方案中，所述传染原是病毒。例如，所述病毒 是腺病毒(Adll, Ad21)、疱渗病毒(HSV; VZV; EBV; CMV; 6、 7 或8型疱渗病毒)、嗜肝DNA病毒(HBV)、乳头状多瘤空泡病毒(HPV)、 痘病毒或者逆转录病毒(HTLV、 HIV)。
本发明的主题还包括组合物，其特征在于至少包含上述专性异二聚 体大范围核酸酶、 一种或两种核苷酸(优选包含在表达载体中)，如上文 所述。
在所述组合物的一个优选实施方案中，其包含靶向DNA构建体，所 述构建体包含修复目的位点的序列，其两侧是与如上所述的靶标基因座有 同源性的序列。优选地，所述乾向DNA构建体被包含在重组载体中或被 包含在表达栽体中，所述载体包含编码所述大范围核酸酶的多核苷酸，如 本发明中所定义。
本发明的主题还包括产品，其至少含有大范围核酸酶或编码所述大 范围核酸酶的一种或两种表达栽体及上述包含乾向构建体的载体，所述产 品作为组合制剂同时、分别或依次使用，用于预防或治疗遗传性疾病。对治疗的目的而言，以治疗有效量施用所述大范围核酸酶和可药用 赋形剂。如果所施用的量是有生理意义的，则这样的组合被称作以"治疗有 效量"施用。如果一种药剂的存在导致接受者生理状况可检测的变化，则它 是有生理意义的。在本文中，如果一种药剂的存在导致目标疾病的一个或 多个症状的严重程度减轻以及对损伤或异常的基因组矫正，则它是有生理 意义的。
在本发明用途的一个实施方案中，所述大范围核酸酶基本上是非免 疫原性的，即不引发或几乎不引发不利的免疫应答。根据本发明，可使用 大量改善或消除这类有害免疫反应的方法。在一个优选的实施方案中，所
述大范围核酸酶基本不含N-甲醃基甲硫氨酸。避免不想要的免疫>^应的另 一种方法是将大范围核酸酶与聚乙二醇("PEG")或聚丙二醇("PPG")(优 选500到20,000道尔顿的平均分子量(MW))缀合。与PEG或PPG的缀 合(如Davis等(US 4,179,337)所述)例如可提供具有抗病毒活性的非免 疫原性生理活性水溶性内切核酸酶缀合物。Saifer等(US 5,006，333)中还描 述了使用聚乙二醇-聚丙二醇共聚物的类似方法。
大范围核酸酶可作为多肽或者作为编码所述多肽的多核苷酸构建体 /载体使用。通过本领域4支术人员众所周知的任何适用于特定细胞类型的便 利手段而在体外、离体或在体内将其(单独或者与至少一种合适的栽体或 运栽体组合和/或与靶向DNA组合)引入细胞中。 一旦ii^细胞内，所述 大范围核酸酶和包含靼标DNA和/或编码大范围核酸酶之核酸的栽体(如 果存在的话)被细胞从胞质输入或转移至核内的作用位点。
专性异二聚体大范围核酸酶/单链大范围核酸酶衍生物(多肽)可有 利地与下述物质结合脂质体、聚乙烯亚胺(PEI)、和/或膜易位肽(Bonetta， The Scientist, 2002, 16， 38; Ford等，Gene Ther" 2001, 8, 1-4 ; Wadia和 Dowdy, Curr. Opin. Biotechnol.， 2002,13, 52-56 );在后一种情况下，所述 大范围核酸酶的序列与膜易位肽的序列融合(融合蛋白)。
可通过大量方法(例如注射、直接才聂入、射弹轰击、脂质体、电穿 孔)将包含耙标DNA和/或编码大范围核酸酶之核酸的载体引入细胞中。 可使用表达载体在细胞中稳定或瞬时地表达大范围核酸酶。在真核细胞中 进行表达的才支术是本领域4支术人员'i^p的(见Current Protocols in Human Genetics:笫12章"Vectors For Gene Therapy" &第13章"Delivery Systems for Gene Therapy")。任选地，可优选;重组蛋白中#^入核定位信号以确保其在核内表达。
专性异二聚体大范围核酸酶/单链大范围核酸酶衍生物的用途以及 利用本发明的所述大范围核酸酶的方法还包括利用编码所述专性异二聚 体大范围核酸酶的多核苷酸、载体、细胞、转基因植物或非人转基因哺乳 动物，如上文所述。
根据本发明的用途和方法的另一个有利的实施方案，所迷专性异二 聚体大范围核酸酶/单链大范围核酸酶衍生物、多核苷酸、载体、细胞、转
基因植物或非人转基因哺乳动物与上文所定义的耙向DNA构建体相关联。 优选地，所述编码专性异二聚体大范围核酸酶/单链大范围核酸酶衍生物的 单体的栽体包含如上文所定义的靶向DNA构建体。
根据本领域中众所周知并且可以商购的标准位点定向突变法，本发 明的专性异二聚体大范围核酸酶来源于母体同二聚化LAGLIDADG内切 核酸酶的单体。根据众所周知的重叠PCR技术，通过扩增含有如上文所 述的每个突变位置的重叠片段可有利地制备它们。
这可以通过利用互补引物组来实现。例如以下三对SEQIDNO:3 与SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5与SEQ ID NO: 6、以及SEQ ID NO: 7 或SEQ ID NO: 35与SEQ ID NO: 8可用于扩增单体A的编码序列 (CDS)，以下三对SEQ ID NO: 9与SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11与 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 36与SEQ ID NO: 14可 用于扩增单体B的CDS。
或者，以下两对SEQ ID NO: 37与SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 40与SEQ ID NO: 42可用于扩增单体A的CDS,以下两对SEQ ID NO: 37与SEQ ID NO: 38、 SEQ ID NO: 39与SEQ ID NO: 40可用于扩增单 体B的CDS。
可通过改造能够切割目的基因组DNA乾序列之变体的方法来获得 母体同二聚化LAGLIDADG内切核酸酶的单体，如之前Smith等Nucleic Acids Res.， 2006， 34 e149中所述，所述方法至少包括以下步骤
(a) 构建第一系列I-Oel变体，其在LAGLIDADG核心结构域的第一功能 性亚结构域中含有至少一个替换，所述第一功能性亚结构域位于I-Od的 26到40位，
(b) 构建第二系列I-Orl变体，其在LAGLIDADG核心结构域的第二功能性亚结构域中具有至少一个替换，所述第二功能性亚结构域位于I-Orl的 44到77位，
(c) 从步骤(a)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-Orl位点的变 体，在所述位点中(i) I-Oel位点中-10到-8位的核苷酸三联体已被存在于 所述基因组靶标中-10到-8位的核苷酸三联体所替换，且(ii)+8到+10位的 核苦酸三联体已被存在于所述基因组乾标的-10到-8位的核苷酸三联体的 反向互补序列所替换，
(d) 从步骤(b)的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变体位点的变 体，在所述位点中(i) I-Orl位点中-5到-3位的核苷酸三联体已被存在于所 述基因组靶标中-5到-3位的核苷酸三联体所替换，且(ii) +3到+5位的核苷 酸三联体已被存在于所述基因组耙标中-5到-3位的核苷酸三联体的反向互 补序列所替换，
(e) 从步骤(a)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CVrI位点的变 体，在所述位点中(i) I-Orl位点中+8到+10位的核苷酸三联体已被存在于 所述基因组靶标中+8到+10位的核苷酸三联体所替换，且(ii) -10到-8位的 核苷酸三联体已被存在于所述基因组靶标中+8到+10位的核苷酸三联体的 反向互补序列所替换，
(f) 从步骤(b)的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变体位点的变 体，在所述位点中(i) I-Crel位点中+3到+5位的核苷酸三联体已被存在于 所述基因组靶标中+3到+5位的核苷酸三联体所替换，且(ii) -5到-3位的核 苷酸三联体已被存在于所述基因组乾标中+3到+5位的核苷酸三联体的反 向互补序列所替换，
(g) 将来自步骤(c)和步骤(d)的两个变体中26到40位及44到77位中的突变 在单个变体中组合，以获得切割下述序列的新的同二聚体I-Od变体，所 述序列中(i)-10到-8位的核苷酸三联体与存在于所述基因组靶标中-10到-8 位的核苷酸三联体相同，(ii) +8到+10位的核苷酸三联体与存在于所U 因组靶标中-10到-8位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(m) -5到-3 位的核苷酸三联体与存在于所述基因组靶标中-5到-3位的核苷酸三联体相 同，(iv) +3到+5位的核苷酸三联体与存在于所述基因组靶标中-5到-3位的 核苷酸三联体的反向互补序列相同，在单个变体中组合，以获得切割下述序列的新的同二聚体I-CVeI变体，所 述序列中(i)+3到+5位的核苷酸三联体与存在于所述基因组靶标中+3到+5 位的核苷酸三联体相同，(ii) -5到-3位的核苷酸三联体与存在于所述基因 组耙标中+3到+5位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(iii)该位 点中+8到+10位的核苷酸三联体已被存在于所述基因组靶标中+8到+10位 的核苷酸三联体所替换，和(iv) -10到-8位的核苷酸三联体与存在于所述基 因组耙标中+8到+10位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，
(i)将步骤(g)与步骤(h)中获得的变体相组合以形成异二聚体，以及
(j)选择和/或篩选来自步骤(i)的能够切割位于哺乳动物基因中的所述基因 组DNA靶标的异二聚体。
步骤(a)和(b)可包括引入其它突变以提高突变体的结合和/ 或切割性能，尤其是在与DNA靶序列接触或者与所述DNA靶标直接或 间接相互作用的其它位置上。这些步骤可通过制备组合文库来实施，如 PCT国际申请WO 2004/067736和Arnould等(J. Mol. Biol" 2006， 355, 443-458)中所述。
可通过4吏用体外或体内切割测定来进行步骤(c)、 (d)、 (e)、 (f)和/或(j) 中的选择和/或筛选，如PCT国际申请WO 2004/067736、 Epinat等(Nucldc Acids Res" 2003, 31， 2952-2962)、 Chames等(Nudeic Acids Res" 2005， 33, el78)和Arnould等(J. Mol. Biol., 2006， 355， 443-458)中所述。优选地，通 过重组介导的所述DNA双链断裂的修复在下述条件下在体内进行步骤 (c)、 (d)、 (e)、 (f)和/或(j)，在所述条件下，由所述变体产生的突变DNA 靶序列中的双链断裂导致阳性选择标志物或报告基因的激活或者阴性选 择标志物或报告基因的失活，如在PCT国际申请WO 2004/067736、Epinat 等(Nucleic Acids Res" 2003， 31， 2952-2962)、 Chames等(Nucleic Acids Res" 2005, 33, el78)和Arnould等(J. Mol. Biol" 2006,355, 443-458)中所述。
可根据公知的重叠PCR技术，通过扩增包含两个亚结构域中之每一 个的重叠片段来进行步骤(g)和(h)中的(分子内)突变组合。
另夕卜，步骤(g)和/或(h)可进一步包括在整个变体或部分变体(特别是 所述变体的C端一半(80到163位))上引入随机突变。可才艮据本领域公 知的并可以商品获得的标准突变方法，通it^变体池(po01 of variants)产生 随机突变文库来进行突变。
30步骤(i)中的(分子内)变体组合是通过共表达步骤(g)的一种 变体和步骤(h)的一种变体从而允许形成异二聚体来进行的。例如，可 通过编码所述变体的一种或两种重组表达载体修饰宿主细胞。然后在允许 表达所述变体的条件下培养所述细胞，从而在所述宿主细胞中形成异二聚 体，如先前在PCT国际申请WO 2006/097854和Arnould等(J. Mol. Biol., 2006, 355， 443- 458)中所述的。
在此情形下，将本发明中所定义的单体A的突变引入到步骤(j) 中得到的异二聚体的一个单体中，将本发明中所定义的单体B的突变引 入到所述异二聚体的另 一个单体中。
或者，可通过引入下述修饰由源自上述改造大范围核酸酶变体之 方法的方法获得本发明的专性异二聚体大范围核酸酶
-在两种类型的原始骨架蛋白(scaffold protein)上进行步骤(a)和 步骤(b):具有单体A的突变的第一I-CVd骨架和具有单体B的突 变的第二I-Od骨架，以及
-通过以下步骤进行步骤(c) - (f)的选择和/或筛选将具有上文所 述的单体A或B的突变的变体文库转化到表达含有相应突变(分别 来自单体B或A)的I-Oel突变体的宿主细胞中，以允许形成异二聚 体，利用其中I-CVd位点的一半在土3至5位或土8至10位被修饰而另 一半未被修饰的非回文DNA靶标选择功能性异二聚体变体。
通过将来自相同单体(A)或(B)的两种变体的突变组合在一个 单体中来进行步骤(g)和(h)。
通过将步骤(g)中所得的来自单体(A或B)之一的变体与步骤 (h)中所得的来自另一个单体的变体相组合来进行步骤(i)。
根据本领域众所周知的方法从本发明的专性异二聚体大范围核酸 酶得到能切割目的基因之DNA靶标的单链大范围核酸酶(Epinat等， Nucleic Acids Res.， 2003， 31, 2952-62; Chevalier等，Mol. Cell" 2002， 10, 895-905; Steuer等，Chembiochem" 2004， 5， 206-13; PCT国际申请WO 03/078619以及WO 2004/031346)。 一f壬意这些方法均可用于构建本发明 的单链大范围核酸酶。本领域技术人员可通过任何已知方法制备本发明中所定义的编码
单体A和B的多核苷酸序列。例如，它们由cDNA模板通过与特定引 物的聚合酶链反应进行扩增。优选地，选择所述cDNA的密码子以有利 于所述蛋白质在所期望的表达体系中表达。
可通过众所周知的重组DNA和基因工程技术得到含有所述多核 苷酸的重组载体并将其引入到宿主细胞中。
本发明的专性异二聚体大范围核酸酶是通过在适于上文所述的单 体A和B共表达的条件下，在利用一种或两种表达栽体修饰的转基因 动物/植物或宿主细胞中共表达所述单体来制得的，并通过任何合适的 方法从宿主细胞培养物或转基因动物/植物中回收所述专性异二聚体大 范围核酸酶。
本发明的单链大范围核酸酶是通过在适于融合蛋白表达的条件 下，在利用一种表达栽体修饰的转基因动物/植物或宿主细胞中，融合 含有上文所述的单体A和B的融合蛋白来制得的，并通过任何合适的 方法从宿主细胞培养物或转基因动物/植物中回收所述单链大范围核酸 酵。
本发明的主题还包括上文所述的至少一种专性异二聚体大范围核 酸酶/单链大范围核酸酶衍生物作为用于制备其它大范围核酸酶的骨架 的用途。例如，为了制备新的第三代归巢内切核酸酶，可在所述单体上 进行第三轮诱变和选择/筛选。
除非另有说明，否则本发明的实施将使用本领域内的细胞生物学、 细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学 的常规技术。这些技术在文献中有详尽解释。参阅，例如Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL， 2000, Wiley和son Inc， Library of Congress, USA); Molecular Cloning:实验室操作手册，第三版, (Sambrook等,2001， Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait编辑,1984); Mullis等美国专利号4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins编辑1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins编辑1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney， Alan R.Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B.Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the series,Methods In ENZYMOLOGY (主编J. Abelson和M. Simon, AcademicPress, Inc., New York),尤其是第154和155巻(Wu等编辑)以及第185巻，"Gene Expression Technology" (D. Goeddel编辑)；Gene Transfer VectorsFor Mammalian Cells (J. H. Miller和M. P. Calos编辑，1987， Cold SpringHarbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And MolecularBiology (Mayer和Walker编辑,Academic Press, London, 1987); HandbookOf Experimental Immunology,第I國IV巻(D. M. Weir和C. C. Blackwell编辑，1986);以及Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y" 1986)。
除了上述特征以外，本发明还包括在以下涉及说明以及附图中所体现的其他特征，其中参考举例说明本发明专性异二聚体大范围核酸酶的实施例，在附图中
图1描绘了大范围核酸酶I-CVe-I与其乾标DNA模板的复合物(PDB:1G9Y)结构的侧视图。(A)、 ( B )、 (C)详细展示了同二聚体上两个单体间的三个可修饰的相互作用团块(patch )。 (D)是所设计的异二聚化界面，显示出蛋白质中每个相关位置上的氨基酸变化。
图2图示说明高盐浓度对切割特异性的影响。将(A)QAN或(B)KTG蛋白与QAN同二聚体位点(GTT/AAC )、 KTG同二聚体DNA位点(CCT/AGG)或者杂合位点QAN/KTG位点(GTT/AGG) —起孵育，NaCl浓度为50-225 mM。箭头表示未切割的乾标DNA ( 3.2 kb )或两个消化所得条带(1.1和2.1 kb )。星号(* )标记仅含有DNA的对照泳道。1 kb和100 bp的梯带(FERMENTAS )分别用M和Ml标记。
图3举例说明来自I-Oel变体QAN和KTG的突变体的CDS,其是为制备所述专性异二聚体大范围核酸酶而设计的。下划线表示三种诱变寡核苷酸的序列。QAN-A1和KTG-A1突变体分别为寡核苷酸SEQ ID NO: 3、 35和5; QAN-A2和KTG-A2突变体分别为寡核苷酸SEQIDNO:3、 7和5; QAN-B3和KTG-B3突变体分别为寡核香酸SEQ ID NO: 9、 11和13; QAN-B4和KTG-B4突变体分别为寡核苷酸SEQ ID NO: 9、 11和36。图4图示说明了所设计的大范围核酸酶的表达和纯化。箭头指示靶蛋白质带。(A)野生型同二聚体和突变体单体。泳道M—示准大范围标志物(BIORAD ); l.纯化的QANwt; 2.纯化的KTGwt; 3.沉淀物QAN-A1;4.上清液QAN-A1; 5.纯化的QAN-A1; 6.沉淀物KTG-B3; 7.上清液KTG-B3; 8.纯化的KTG-B3; 9.沉淀物KTG-A2; 10.上清KTG-A2; 11.纯化的KTG-A2; 12.沉淀物QAN-B3; 13.上清液QAN-B3; 14.纯化的QAN-B3;15.沉淀物QAN-B4; 16.上清液QAN-B4; 17.纯化的QAN-B4。(B) KTG-A2/QAN-B3的共表达和纯化。泳道1.未诱导；2.诱导；3.沉淀物；4.上清液；5.透析之前纯化；6.透析之后纯化。(C)另外两种设计的共表达泳道l.可见两个条带，对应于异二聚体QAN-A1/KTG-B3;泳道2.仅一个条带可见，表明QAN-B4/KTG-A2不产生异二聚体。
图5图示说明单独表达的设计的大范围核酸酶单体变体在不同盐条件下的非特异性DNA切割和非切割。将大约3.75 nM的每种纯化蛋白质与含有QAN同二聚体位点(GTT/AAC)、 KTG同二聚体DNA位点(CCT/AGG)或杂合位点QAN/KTG位点(Q-K: GTT/AGG)的34 nM纯化质粒(利用Xwwl预先线性化) 一起孵育。NaCl浓度为(A) 50 mM或
(B) 225 mM。箭头表示未切割的乾标DNA ( 3.2kb )或两个消化所得条带(1.1和2.1 kb )。星号(* )标记仅含有DNA的对照泳道。lkb的梯带(FERMENTAS)用M进行标记。
图6图示说明不同的大范围核酸酶的分析性超速离心结果。当单独表达时，(A)野生型单体形成约400 kDa的同二聚体(KTG-wt;QAN-wt), (B)所设计的非同二聚化KTG-A2和QAN-B3形成聚集体。
(C) 共表达的KTG-A2和QAN-B3形成完美的异二聚体。(D)共表达的QAN-B4和KTG-A2也在一定程度上形成异二聚体，而QAN-A1和KTG-B3则不形成二聚体。
图7图示说明共表达的野生型(wt)和所设计的专性异二聚体KTG-A2-QAN-B3大范围核酸酶的特异性DNA切割。(A)将纯化蛋白与含有QAN同二聚体位点(GTT/AAC)、 KTG同二聚体DNA位点(CCT/AGG)或杂合位点QAN/KTG位点(Q-K: GTT/AGG)的3nM纯化
质粒(利用jv:附wi预先线性化) 一起孵育。因为不同的构建体具有不同
的反应最适条件，因此所述同二聚体以0.25 nM浓度使用(4 h, 37。C)，而异二聚体以0.50 fiM浓度使用(30分钟，37。C)。 NaCl浓度为225 mM。箭头表示未切割的靶标DNA (3.2kb)或两个消化所得条带(1.1和2.1kb)。 lkb的梯带(Fermentas)用M进行标记。(B)将各酶样品在时间进程试验中对其最佳DNA位点的相对活性进行比较，使用1 fiM蛋白质和6 nM纯化的质粒靼标。白色星号标记估计最接近50%切割率的样
品位置o
图8图示说明竟争分析，以测定当暴露于Q-K异二聚体DNA位点(3.1 kb PCR产物)和KTG同二聚体DNA位点(0.85 kb PCR产物)的等摩尔混合物时KTG-wt同二聚体和KTG-A2/QAN-B3异二聚体蛋白的相对特异性。各耙标DNA以5nM的最终浓度使用。不同的DNA靶标具有特征性大小并且给出特定性大小的切割产物。(A)显示KTG和KTG-A2/QAN-B3酶的相对特异性和非特异性切割的时间进程试验。最终蛋白质浓度=1HM。 (B)酶滴定分冲斤，以测定每一种酶对相应(cognate)和非相应DNA靶标位点实现50%切割时蛋白质浓度的差异。将等摩尔量的DNA靶标位点PCR产物(Q-K和KTG)相混合并与每种酶的系列稀释液一起孵育，如所述，孵育1小时。扫描凝胶并利用ImageJ和Kaleidagraph进行分析。
图9是人RAG1基因(GenBank登录号NC—000011)的示意图。框内是外显子序列，并且示出了外显子-内含子连#^。灰色框表示ORF。RAG1.10序列用其序列和位置表示。
图lO表示被I-Od或其一些衍生变体切割的22 bp DNA靶标(分别为SEQ ID NO: 58至65 )。 C 1221是I-Oel靶标。10GTT—P、 5CAG—P、10TGG— P和5GAG_P是回文耙标，其与C 1221不同之处》于框内的基序。RAGl.lO是RAGl乾标，RAGl.10.2和RAGl.10.3是回文乾标，其分别来自RAGl.lO的左侧部分和右侧部分。如图中所示，10GTT_P、5CAG—P、 10TGG—P和5GAG—P的框内基序存在于RAG 1.10乾标+ 。
图11表示大范围核酸酶I-Or-I与DNA结合的复合物(PDB: 1G9Y )之结构的底视图。A.显示出把标DNA模板的复合物的视图。B.示出了相同的视图但是省略了 DNA。对于每种单体而言，两个残基R51和D137以棒条(stick)表示，氢键以虚线表示。以虚线画出的圆團圏定了两条DNA链被切割的活性位点。
35图12图示说明了异二聚化组合突变体对RAG 1.10的切割。该图显 示了利用RAGl.lO、 RAG1.10.2和RAG1.10.3靶标对RAG 1.10.2和RAG 1.10.3切割酶的突变体组合进行的次级筛选。试验形式是2点x2点的形式。 形成左栏的两点是突变体，形成右栏的两点是对照，用于评价实^^质量。 I-S"I与I-5^el靼标在a和d中，I-S"I的低活性形式在b中，空载体在c 中。
图13表示pCLS1088 (用于哺乳动物细胞中表达大范围核酸酶的质 粒)的图。
图14表示pCLS1058报告基因载体的图。利用杀稻瘟菌素和氨节西 林抗性基因标记报告基因载体。LacZ串联重M列具有800 bp的同源性， 并且通过1.3 kb的DNA分隔开。它们被EFl-a启动子和终止子序列所环 绕。把位点是利用Gateway方案(INVITROGEN)克隆的，导致CmR和ccdB 基因被所选的把位点所替换。
图15图示说明了通M CHO细胞中染色体外分析中监测到的同二 聚体和异二聚体针对3种RAG1.10乾标的活性。A.分别通过M2、 M2 K7E、 M2E8K和M3、 M3K7E、 M3 E8K同二聚体切割回文RAG 1.10.2 和RAG 1.10.3靶标。背景对应于利用空白表达载体转染细胞。在相同试 验中通过I-SceI切割S 1234KS^I靶标，显示为阳性对照。B.三种RAG 1.10异二聚体针对三种RAG1.10靶标的活性。对照与A中所述的那些相 同。
图16图示说明了来自M2和M3的突变体分别针对RAG 1.10.2和 RAG 1.10.3靶标的同二聚化活性。通过其所突变的位置设计双突变体例 如，M2 7,61代表M2K7EE61R。如图15A所示，背景对应于利用空白表 达载体转染细胞。在相同试验中通过I-X"I切割S 1234I-5"I靶标，显示 为阳性对照。
图17图示说明了在酵母中对通过共表达4种双突变M2突变体与4 种双突变M3突变体得到的16种异二聚体针对3种RAG1.10靶标进行筛 选。原始M2/M3异二聚体对这三种靶标的活性显示为对照。对于每个4 个点的酵母簇而言，左侧的两个点是实验结果，而右侧的两个点是用于评 价实验质量和有效性的各内部对照。红色椭圆表示4种专性异二聚体。图18图示说明了在CHO细胞中的染色体外分析中通过共表达4种 双突变M2突变体与4种双突变M3突变体得到的16种异二聚体针对3种 RAG1.10乾才示的活'性。
图19图示说明了在CHO细胞中的染色体外分析中M2/M3原始 RAGl.lO异二聚体和四种专性异二聚体OHl至OH4针对三种RAGl.lO 耙标的活性。阳性对照和阴性对照与图15种所述的那些相同。
图20图示说明了在酵母中两种单链分子SC1和SC2针对3种RAG 1.10耙标的筛选。SC1是M3-RM2-M2分子，SC2代表M3(K7E K96E)-RM2-M2(E8K E61R)分子。对于每4个点的酵母簇而言，左侧的 两个点是试验结果，而右侧的两个点是用于评价实验质量和有效性的各内 部对照。
实施例1:蛋白质设计
1) 材料和方法
利用自动蛋白质设计算法FoldX( 2.6.4版本X Guerois等，J. Mol. Biol" 2002， 320,369-387; Schymkowitz等,Nucleic Acids Res, 2005, 33， W382-388; Schymkowitz等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2005， 102， 10147-10152 )设计不同的异二聚体。将与DNA复合的大范围核 酸酶物的晶体结构(PDB号lg9y.pdb; Chevalier等，Nat. Struct. Biol., 2001, 8， 312-316 )用作设计模板。会先利用FoldX的〈RepairPDB〉命令 优化结构，以解除任意范德华力障碍。然后将各目的位置突变成丙氨酸， 利用〈BuildModel〉命令分别生成所有模型(异二聚体和同二聚体等)。 最后，通过〈AnalyseComplex〉命令分析所述复合物的各模型以计算不 同的相互作用能量。
2) 结果
利用在2.05A的分辨率(PDB:lg9y)下测定的与其相应DNA靶 序列结合的同二聚体的X射线结构(Chevalier等，Nat. Struct. Biol., 2001， 8， 312-316 )来设计I-Orf的异二聚化界面。目的是促进异 二聚化并且同时防止同二聚体的形成或者至少使得它们热力学不稳定。同二聚体的大部分二聚化界面由两个a-螺旋组成(两个单体中的 Lys7至Gly19)，其以巻曲螺旋排列，这使得它们不适合重新设计。这 些螺旋下方的氨基酸(Asp20及之后)与DNA接触，因此决定内切核 酸酶的活性(活性位点)和特异性(DNA识别)。仅这些功能就〗吏得任 意这些残基都无法在设计过程中被修饰。因此，这使得进行异二聚化的 可能性很小。仔细地分析了结构之后，鉴定了参与界面中相互作用的三 个区域，其可在二聚体中被干扰和改变而不妨碍其结合能力或酶活性 (图1)。
其中之一是两个螺旋上方的区域(图1A)，其中一个单体中的Lys7 和Glu8与另一个单体中的对应残基建立有利的静电相互作用。为了保 持异二聚体中的该相互作用并同时减少单体形成，将这些残基在一个单 体(下文称为单体A)中替换为两个精氨酸，另一个单体(下文称为单 体B)中替换为两个谷氨酸。这样AA和BB同二聚体将发生小的静电 排斥，而AB异二聚体的形成将是静电上更有利的。
第二部分是按照产生同二聚体的小的静电不平衡(相对于异二聚 体)的同样思路来选择的，但是其被置于所述巻曲螺旋的每一侧；由各 单体的Lys96和Glu61形成带电荷残基的双簇(double cluster )(图IB )。 为加强所述第一突变位点的静电作用，将所述第二位点在单体A中突变 为两个精氨酸，在单体B中突变为两个谷氨酸，这样，在各单体中形成 带电荷的三角形(A中呈正电，B中呈负电)。
第三个目的区域是两个螺旋中部的周围，其参与相互作用表面并 且主要由疏水相互作用和氬键组成，形成一种微核(minicore)。由于H 键网络相当复杂并且一路朝活性部位延伸，所以决定仅仅干扰由一个单 体的残基Tyr12、 Phel6、 Val45、 Trp53、 Phe54、 Leu55和Leu58以及 另一个单体的残基Leu97形成的疏水部分(所述残基Leu97像帽子一 样起到关闭所述疏水性袋的作用)(图1C)。重新设计这两个袋以便在 不干扰所述异二聚体中疏7jC相互作用(即不产生腔和空间障碍)的情形 下引入强的范德华力障碍。为此，将大残基引入到单体A中(分别为 54位的Phe或Trp以及97位的Phe),将小残基引入到单体B中(分 别为Gly和Leu)。可在97位引入甘氨酸到以使得给突变 色氨酸的54 位更多空间。结果，AA同二聚体形成巨大的空间位阻，阻碍了其形成，BB同二聚体含有大的腔，使其不稳定。反之，AB异二聚体的微核将被 这些相容的氨基酸有效填充。最终，在单体B中Leu 58突变成甲硫氨 酸，以防止由于小侧链的引入而在所述异二聚体中形成任何腔。注意利 用甲硫氨酸替换Lys 57将是解决相同问题的另 一种方法。
因此，设计了两种类型的单体A即Al和A2 (取决于54位上氨 基酸的性质，分别为Phe或Trp)以及4种类型的对应单体B即B3至 B6。与B3不同，B4通过97位的甘氨酸发生突变以适应单体A2的Trp 突变(图1D)。与B3和B4不同，B5和B6分别通过甲硫氨酸替换Lys57， 而Leu58未突变。利用FoldX测试了不同的突变以模拟所有的同二聚 体(A1:A1、 A2:A2、 B3:B3、 B4:B4、 B5:B5以及B6:B6)和异二聚体 (A1:B3、 A2:B3、 A2:B4、 Al :B5、 A2:B5以及A2:B6 )以及得到不同 的相互作用能量(表I)。
表I:利用FoldX计算的野生型或设计的同二聚体和异二聚体的相互作 用自由能
二聚体突变体和野生型 之间的互相作用 能量差异(kcal/mo1)
A1一B50,9"
A2一B30,9113
A2一B51,0488
A1一B31,2375
A2—B43,7899
A2一B63,9856
B3—B37,9921
B5一B58,9138
A1一A19,8489
A2一A212,0421
B4一B412,6754
B6_B613,1897
最后的构建体(A2:B4和A2_B6)与野生型同二聚体相比表现出 相互作用能量少量降低，但是仍然i著高于同二聚体。相反，A1:A1、 A2:A2、 B3:B3、 B4:B4、 B5:B5和B6:B6同二聚体均变得非常不稳定，
39因此预计这些物质仍然是单体。
实施例2:具有不同切割特异性的大范围核酸酶的改造以及切割条件的 优化
1)材料和方法
a) 大范围核酸酶的改造
如前文所述改造出具有改变的底物特异性的大范围核酸酶变体 (PCT国际申请WO 2004/067736、WO 2006/097784和WO 2006/097853; Epinat等,Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952-2962; Chames等,Nucleic Acids Res.， 2005, 33, el78; Ar羅ld等，J. Mol. Biol" 2006, 355, 443-458, 以及Smith等，Nucleic Acids Res" 2006, 34, e149 )。
b) 大范围核酸酶的制备和纯化
将携带pET (NOVAGEN) I-Oel突变体的新鲜BL21(DE3) (STRATAGENE)转化体在摇床上于37。C下在5ml Luria液体培养基 (LB加上30 ng/ml卡那霉素)中培养过夜。将该预培养物扩增至更大的 培养物(1:200 )。在OD6。。为06-0.8时，将培养瓶在水上放置15分钟以 抑制生长。通过在16'C下加入IPTG(最终浓度为ImM) 18小时诱导表 达，通过离心(15分钟，16,000 g)收集细胞。将沉淀物重悬于含有1 单位/pl脱氧核糖核酸酶I的30ml水冷裂解緩冲液(50mM Tris HCl， pH8; 200mMNaCl; 5mMMgCl2; 10%甘油；10mM咪唑)中，其后
在4。C下进行操作。立即将混悬物冷冻在液氮中，在4t:下于旋转平台
(60 rpm)上解冻16小时。利用ULTRA TURRAX T25 (JANKEL & KUNKEL, IKA-Labortechnik;在冰上进行3次，每次1分钟)对所述混 悬物进行匀浆，然后利用EmulsiFlex-C5匀浆器(AVESTIN)破碎5次， 每次500-1000 psi (磅/平方英寸)。在150,000 g下离心裂解物60分钟。 通过0.45pm滤器(MILLIPORE )过滤上清液。将2倍珠粒体积的250 mM NiS04加样到5 mlHi-Trap柱(AMERSHAM-PHARMACIA)上并 用3体积的结合緩冲液(50mMTrisHCl， pH 8; 300mM NaCl; ImM DTT; 20%甘油；10mM咪唑)进行沖洗。然后将上清液加样到所述柱 上并利用洗涤緩冲液(含有50 mM咪唑的回到其基线水平上。利用洗脱緩冲液(0.3M咪唑)洗脱蛋白质。收集 蛋白质峰并立即加载到透析膜(分子量截留-3.5kDa, SPECTRA)中， 置于2升透4斤緩冲液(50 mM Tris HC1， pH 8; 200 mM NaCl; 1 mM DTT; lmM EDTA; 50%甘油)中在4匸下透析至少12小时。将纯化 的蛋白质分成等份试样并快速冷冻在液氮中，贮存于-80t:。
c) DNA消化分析
如前文所述并进行一些改变来测定靶序列的切割(Epinat等， Nucleic Acids Res" 2003， 31, 2952-2962 ):将共表达的纯化酶在新鲜的透 析緩冲液中稀释至1 ng/pl(在分别纯化所设计的单体的情形下，加入每 种单体1.5吗，将它们各自稀释至0.5吗/^1)。将酶贮存于-80"C。利用 3.75 jiM酶、含有适当靶序列的34 nM的纯化的3.2 kb质粒(利用 X挑;il预先线性化)以及浓度为50至300 mM的NaCl，在20 pl最终反 应体积中制备反应混合物。将消化混合物在37X:下于水浴中孵育60分
钟，然后与2.5^体积的终止緩冲液进行混合，所述緩冲液修改自Wang 等，Nucleic Acids Res., 1997， 25， 3767-3776 (5 ml甘油；2mlEDTA， 0.5 M; 0.5mlSDS， 20%; 0.5 ml蛋白酶K, 20 mg/ml; 2.5 ml溴酚蓝(1% w/v), pH 8)。将样品在37X:下再孵育30分钟，然后将每种样品的一半 在1%琼脂糖凝胶上显影。
2)结果
利用之前得到的两种识别不同DNA序列的大范围核酸酶(PCT 国际申请WO 2006/097853; Arnould等，J. Mol. Biol" 2006， 355， 443-458)变体来验证特异性异二聚体的正确设计。这两种酶已通过筛 选在44位、68位和70位具有随机变异的I-Od文库而得到，其中64 种回文把标是由I-Oel切割的22bp回文耙标的土3、 ±4和±5位的替换 得到的。
这些变体均具有Asp75突变成Asn的突变，其降低了由碱性残基 Arg68和Arg70的替换所引起的能量应力(energetic strain );这些精氨酸 通常满足埋藏在结构中的Asp75的氢受体电位。 一种具有突变 Q"K、 R68T和R70G的大范围核酸4 (以"KTG"表示)识别DNA靶标 的_5、 -4和-3位的威基cct。具有突变Q44Q、 R68A和R70N的另 一种大范围核酸酶(称为"QAN")识别DNA靶标的-5、 -4和-3位的4^gtt。 在全部实施例中，靶标DNA序列以6碱基密码表示，其中第一个3g 对应于把序列的-5、 -4和-3位，另一个3^5^对应于同一DNA链上的+3、 +4和+5位；所述两个三联体以斜线(/)分开。因此KTG酶的靶标是 cct/agg, QAN酶的耙标是gtt/aac,异二聚体QAN-KTG的混合DNA靶标 记为gtt/鄉。
对于WT大范围核酸酶I-Orl而言，据才艮道消化其靶标DNA的 理想条件是20 mM Tris-HCl (pH 8.0-9.0)与lOmM MgCl2(Wang等, Nucleic Acids Res., 1997, 25， 3767-3776),据报道NaCl离子强度大于25 mM以上时该酶被抑制。当利用这些条件以及KTG和QAN酶时，^见 察到了亚最佳特异性(图2)。实际上，在低离子强度(《50mMNaCl)下， 两种酶不仅消化其耙标DNA序列，而且还消化混合的DNA耙标。这提 示，仅一个单体与DNA强结合就足以进行消化。增强离子强度提高了 酶对其靶标的活性，而且还降低对混合模板的消化在约225mMNaCl 下观察到几乎完美的特异性和良好的活性。该行为可解释为离子强度降 低对DNA的亲和力(因此，如果仅一个单体在二聚体中建立特异性相 互作用时，则防止结合)同时还增加酶活性。作为这些试验的结果，选 择下述最佳緩冲液来消化大范围核酸酶设计物25 mM HEPES (pH 8), 5 %甘油，10 mM MgCl2以及225 mM NaCl。
实施例3:所设计的切割人工靶标之突变体的表达与表征
1)材料和方法
a)大范围核酸酶突变体的克隆
在多达6个氨基酸位置上对两种同二聚化大范围核酸酶KTG和 QAN (基于I-Oel大范围核酸酶骨架)各自进行突变以形成两种可相 容的异二聚化界面，记作KTG-A2和QAN-B3。利用Quickchange⑧试 剂盒(STRATAGENE， # 200518)，通过round-the world PCR引入突变。
利用3组互补引物引入KTG-A2突变(K7R、E8R、F54W、E61R、 K96R、 L97F):(i) A1_RR_F (SEQ ID NO: 3)和A1_RR_R (SEQ ID NO:4):
5， caa tac caa ata taa cag gcg gtt cct get gta cct ggc eg 3, (SEQ ID NO: 3)
5'cgg cca ggt aca gca gga acc gec tgt tat att tgg tat tg 3 ，(SEQ ID NO: 4);
(")A1—RF_F (SEQ ID NO: 5)和Al一RF一R (SEQ ID NO: el-s' tea act gca gec gtt tct gag att caa aca gaa aca ggc aaa cc 3， (SEQ ID NO: 5)5' ggt ttg cct gtt tct gtt tga ate tea gaa acg get gca gtt ga 3， (SEQ ID NO: 6);
(i") A2—WLR—F 3' (SEQ ID NO: 7)和A2_WLR_R (SEQ ID NO: 8):
5' cca gcg ccg ttg gtg get gga caa act agt gga tag aat tgg cgt tgg tta eg 3, (SEQ ID NO: 7)
5，cgt aac caa cgc caa ttc tat cca eta gtt tgt cca gec acc aac ggc get gg 3'(SEQ ID NO: 8).
利用3组互补引物引入QAN-B3突变(K7E、F54G、L58M、K96E):
(i) B3—EE_F (SEQ ID NO: 9)和B3_EE_R (SEQ ID NO: 10):
5， caa tac caa ata taa cga aga gtt cct get gta cct ggc eg 3， (SEQ ID NO: 9),和5' egg cca ggt aca gca gga act ctt cgt tat att tgg tat tg 3' (SEQ ID NO: 10);
(ii) B3一GME—F (SEQ ID NO: 11)和B3_GME—R (SEQ ID NO: 12):
5， cca gcg ccg ttg ggg tct gga caa aat ggt gga tga aat tgg cgt tgg tta eg 3, (SEQ ID NO: 11)5' cgt aac caa cgc caa ttt cat cca cca ttt tgt cca gac ccc aac ggc get gg 3, (SEQ ID NO: 12);
(iii) B3_EL_F (SEQ ID NO: 13)和B3JEL_R (SEQ ID NO: 14):
5， tea act gca gec gtt tct gga act gaa aca gaa aca ggc aaa cc 3， (SEQ ID NO: 13)和5' ggt ttg cct gtt tct gtt tea gtt cca gaa acg get gca gtt ga 3， (SEQ ID NO: 14).
根据制造商说明(STRATAGENE, Quikchange )将所述第一组引物用于PCR和转化。将大约300个转化体细菌菌落合并到2ml培养基中，通过小量制备(miniprep)回收质粒DNA。利用诱变引物，将该DNA用作第二轮以及其后第三轮PCR的模板。通过DNA测序验证5个三轮突变体。
值得一提的是上述引物对于具有改变的特异性的任意I-Crel突变体都是通用的，因为二聚体界面突变位于DNA识别区域之外。
43使用相似方法来进行异二聚体对(QAN-A1、 KTG-B3、 QAN-B4 )的替代性设计，将合适的突变引入到用于诱变PCR的寡核苷酸中(图3)。
b) 大范围核酸酶的制备与纯化
试验方法如实施例2中所述。
c) DNA消4匕测定
试验方法如实施例2中所述，其中DNA消化緩沖液由以下组成25 mM HEPES (pH 8)、 5 %甘油、10 mM MgCl2以及50 mM NaCl (低离子强度)或225 mM NaCl (高离子强度)。
d) 分析性离心
在离心试验中通过监测沉降性能来研究大范围核酸酶和突变体的寡聚状态。对于贮存在緩沖液(50 mM Tris-HCl pH 8.0、 225 mM NaCl、 1 mmEDTA、 1 mM DTT、 8%甘油)中的每个样品(0.52 mg/ml各单体或1.04mg/ml各WT同二聚体)使用1.04 mg纯蛋白质。
，在样品是在装配有四孔AN-60转子和双扇形铝中心件的BECKMAN Optima XL國A离心机中离心时(48000 rpm, 4t:)，通it^280nm处监测吸光度信号来收集沉降速度镨。通过Sedfit(Schuck， P.,Biophys" 2000, 78, 1606-1619)中实施的c方法以及UltraScan 7.1软件包(Demder.B.,2005, http:〃www.ultrascan.uthscsa,edu )来测定分子量分布。
根据Laue等(/w Jwfl/j^/cfl/ f7/^""cew^7y"wg""Vm /w必/oc/re附/s外
州"25,及"a/ S( d"y C7^w,'"o^， C"m6n'rfge) 乂〉开的数据执4亍UltraScan 7.1操作来进行緩冲液强度和粘度的校正。
根据Cohn E. J.和Edsall J. T. (/w /VW"Vis， J附/wo ^i"V/s flwd/V/;^/ey， /U57，及e/"/^/A 2Vew KwA:)的方法由蛋白质序列估计大
范围核酸酶和突变体的偏微比容(partial specific volume )。
2)结果通过对原始KTG和QAN酶表达载体进行定点诱变(STRATAGENE, QuikChange⑧试剂盒)，然后表达和纯化相应的蛋白质来得到所设计的突变体Al、 A2、 B3和B4(图4)。在突变体的不同组合中，选择QAN-A1、 KTG画B3、 KTG陽A2、 QAN-B3和QAN-B4突变体。设计这些突变体以覆盖所有设计的异二聚体相互作用A1:B3、A2:B3和A2:B4，得到异二聚体QAN-A1:KTG-B3、 KTG-A2:QAN-B3以及KTG-A2:QAN-B4。
而野生型KTG和QAN酶产生的大多数蛋白质在可溶级分中，但在所设计的酶情形下观察到了相反的结果大多数所表达的蛋白质以包涵体形式存在于沉淀中，仅一小部分可被纯化，并且即便这部分也被其它蛋白质污染(图4)。这是所设计的突变体在单独表达时不能同二聚化并因而变得不稳定的第 一个标志。
在4氐和高离子强度(50 mM或225 mM NaCl)下测试了纯化的Al、 A2、 B3和B4酶对3种DNA靶标的活性(图5)。在低盐浓度下，仅仅可检测到对QAN-A1 —些特异性DNA消化活性；观察不到其它酶的特异性切割。此外，在高离子强度下，当与酶一起孵育时，不能检测到所预期的两条DNA条带，尽管在一些情形下DNA的量下降。
当单独表达非同二聚化单体设计物时，这些结果被所得到的低产率和低质量的蛋白质所破坏；即使利用6升之大体积的细菌产生的蛋白质也不足(设计的单体为0.5-1.5 mg/ml;而野生型二聚化单体为30mg/ml )。
为了考察所纯化设计酶的寡聚状态，通过分析性超速离心测量了其大小特性(图6)。在单独表达的Al、 A2、 B3和B4蛋白质的情形下，观察到了所预期的单体酶的外观。然而，还检测到较高分子量的聚集体，包括三聚体和四聚体(图6B;仅显示了 KTG-A2和QAN-B3,但是利用其它设计物得到相似的结果)。因此，所设计的酶实际上不能同二聚化，这可能在纯化过程中已经影响到了其稳定性和聚集特性。
为了研究异二聚化的潜能，将等摩尔量的单独纯化的设计的酶(QAN國A1、 KTG-A2、 QAN國B3、 KTG國B3、 QAN-B4)以所有可能的组合进行混合。在KTG-A2/QAN-B3的情形下，观察到了对应于二聚体
45分子量的主要物质的外观，但是这不是所形成的唯一物质。对于所述对
QAN-A1/KTG-B3和KTG-A2/QAN-B4而言，观察到了分子质量在单体和二聚体之间的新峰的外观以及高分子量聚集体的减少。对于那些将不
产生异二聚体的组合而言，没有蛋白质行为的显著变化可观察到。大体上，这些结果表明，单独表达异二聚化单体不是有效的策略，因此在细菌细胞内进行了共表达测定。
实施例4:所设计的切割人工耙标之突变体的共表达与表征
1) 材料和方法
a) 所设计的单体的共表达
为了从QAN-B3单体中除去His标签，利用A^I/7VWI(NEWENGLAND BIOLABS)将其从母体质粒pCLS1214 (pET系列)上切下来。然后将该片段克隆到类似切割的pCDFDuetl质粒(NOVAGEN)中。利用该混合物转化TOP10超级感受态细胞(INVITROGEN)并在50ng/ml的链霉素-硫酸大观霉素中进行选择。通过DNA测序验证克隆。将BL21(DE3)超级感受态细胞与 10 ng各质粒(pCLS1211-KTG-A2 和pCDFDuetl-QAN-B3)进行共转化。通过在链霉素-硫酸大观霉素存在下培养所转化的克隆来选择双重转化体(double transformants )。
b) 大范围核酸酶的纯化
实验方法如实施例2中所述。
c) DNA消化分析
实验方法如实施例2中所述，其中DNA消化緩沖液由以下组成25mM HEPES (pH 8), 5 %甘油，10 mM MgCl2以及225 mM NaCl (高离子强度)。
d) 分析性离心
实验方法如实施例3中所述。
2) 结果实施例3中所示的结果提示，异二聚体设计物可能是功能性的，但是单体酶的表达导致强的聚集并因此得到部分失活的酶。为了避免该问题，将单体基因表达盒亚克隆到互补质粒中并且共转化到细菌细胞中，从而原始的pET系列质粒表达一个单体(具有His标签)，相容的pCDFDuet载体(INVITROGEN)表达配对的单体(无His标签)。双重抗生素选择保证各细胞均包含两种质粒。
所述共表达的KTG-A2/QAN-B3蛋白的表达分析显示出未产生包涵体，这提示之前的聚集问题已得到解决。所纯化的酶的SDS-page分析随后显示了 了具有大致相同量蛋白质的2条带，这提示我们异二聚体被纯化，而同二聚体未被纯化。质语直接证明了两种蛋白质和异二聚化复合物的存在。此外，所纯化的蛋白质的分析性超速离心给出了在所期望的二聚体分子量处的非常清晰的单一镨(图6C )。
利用纯化的共表达异二聚体设计物消化各DNA靶标，观察到异二聚体DNA靼标(gtt/agg)的清晰的特异性切割，几乎观察不到同二聚体靶标(cct/agg和gtt/aac;图7A)的特异性切割。尽管KTG-A2/QAN-B3异二聚体似乎表现出对杂合DNA靶标的特异性切割，但是其活性可能较小。为了排除这一点，我们比较了 QAN、 KTG和KTG-A2/QAN-B3在时间进程中的活性(图7B)。该实验表明，就对其底物的50%切割而言，利用相同的表观蛋白质浓度，KTG和异二聚体具有相似的活性，而QAN则需要4倍时间的孵育。
因此，所述蛋白质设计是成功的，这使得能特异性形成异二聚化I-Od酶变体，只要共表达了单体部分即可。
利用共表达的QAN-A1/KTG-B3蛋白质重复的相同实验显示了混合的结果在纯化后有2个条带，但一个条带的强度大于另一个条带的强度，具有对异二聚体的特异性切割，但是与KTG-A2/QAN-B3组合相比特异性
水平降低(图6D)。分析性离心显示形成了含有小比例聚集体的二聚体。
最后，第三个共表达組合KTG-A2/QAN-B4导致仅一个条带被纯化，并且通过分析性离心检测到单体(图6D)。因此，该设计不能成功地制备异二聚体，即使发生了共表达。很有趣的是，KTG國A2/QAN-B3 、 QAN-A1/KTG-B3 和 KTG-A2/QAN-B4之间的二聚体比例和活性与通过FoldX预测的能量相关 性极好(表I)。就所预期的通过计算机得到的能量而言，最佳 设计在体外形成最佳异二聚体。
实施例5:竟争试验
为了测量酶对同二聚体和异二聚体DNA位点的相对差别，进行了竟 争试验，其中所述酶同时接近等摩尔量的两种底物(图8)。选择 KTG-A2/QAN-B3异二聚体和KTG-wt用于这些试验，因为它们表现出了 针对其各自耙标的相似活性(图8B)。在时间进程实验中，KTG优先切割 其靼标，但是KTG-A2/QAN-B3靶标的相应位点被轻微消化(图8A )。与 ^M目反，KTG-A2-QAN-B3异二聚体优先切割Q-K异二聚体DNA，很少 切割KTG位点。
为了更直接地比较相对切割偏好，对两种DNA靶标的等摩尔混合物 进行酶滴定(图8B )。这使得能在竟争性条件下测定对相应靶标和非相应 乾标表现出50%切割率的表观浓度KTG-wt就相应靶标而言- 0.1 jiM; KTG-wt就非相应乾标而言=1.5 ^M; KTG-A2/QAN-B3就相应乾标而言 =0.3nM; KTG-A2/QAN-B3就非相应把标而言=3.2 nM。因此，就两种 酶而言，发现相应靶标和非相应乾标的50%切割率的酶浓度的差异为大约 10至15倍。
总之，这些结果表明，尽管两种母体构建体和突变体衍生物的特异
性不是绝对的，但是可设计活性与最佳wt母体相似并且对其异二聚体靶
标具有明确的切割优先选择性的专性异二聚体大范围核酸酶，而原始同二 聚体对其同二聚体靶标具有相反的优先选捧性。
实施例6:通过把向精氨酸51-天冬氨酸137相互作用制备RAG1.10专性 异二聚体
之前通过在酵母中共表达能切割来自回文RAG1.10的靶标 RAG1.10.2和RAG1.10.3的两种I-Oel突变体得到了能切割来自RAG1 基因之耙标(RAG1.10序列，图9 )的异二聚体(Smith等，Nucleic Acids Res.， 2006,34, el49;图10 )。但是，两种突变体的共表达导致溶液中存在3种分子类型两种同二聚体以及异二聚体。通过引入其它突变制备了 专性异二聚体，以在不影响异二聚体稳定性和切割性能的情形下防止形成 功能性同二聚体。因此，仅RAG1.10靶标将被切割。为得到该专性异二聚 体，选择了两个残基精氨酸51 (R51)和天冬氨酸137 (D137),其在两种 I-Orl单体之间产生分子间相互作用R51-D137。这两个残^Ji接近于活性 位点，并参与围绕所述活性位点的水分子壳的配位(图11)。通过例如在 RAG 1.10.2切割酶( 一种变体，其切割RAG 1.10.2靶标)上产生 R51D突变(精氨酸被天冬氨酸残基替换)以及在RAG 1.10.3切割酶上产 生互补的D137R突变，在异二聚体中仍然存在吸引性的D51-R137相互作 用，而在RAG 1.10.2同二聚体中存在排斥性的D51-D137相互作用，在 RAG 1.10.3同二聚体中也存在排斥性的R51-R137相互作用。推测这些排 斥性相互作用可使得同二聚体的形成失去稳定性和/或干扰催化机制。
如Smith等，Nucleic Acids Res" 2006, 34， e149中所述，之前得到了 具有序列KRSNQS/AYSDR (标出了 28、 30、 32、 33、 38、 40 / 44、 68、 70、 75、 77位的残基)的RAG 1.10.2切割酶(称为M2)以及具有序列 NNSSRR/YRSQV的一种RAG 1.10.3切割酶(称为M3)，对于每种突变体 引入R51D突变或D137R突变，以产生4种单突变体。
在本实施例和下述实施例中，通过直接重复重组测定法，在酵母或 哺乳动物细胞中测量本发明的专性异二聚体大范围核酸酶对目的非回文 耙标和所衍生的回文靶标(其被两种同二聚体所切割)的切割活性，如前 文所述(PCT国际申请WO 2004/067736和WO 2006/097853; Epinat等， Nucleic Acids Res., 2003, 31， 2952-2962; Chames等,Nucleic Acids Res., 2005， 33， e178以及Arnould等，J. Mol. Biol" 2006, 355， 443-458 )。才艮告基 因载体包含在干扰序列内的LacZ报告基因(同向重复)和DNA靶标序列 的两个截短的非功能性拷贝，其在酵母或哺乳动物表达载体中克隆。大范 围核酸酶的表达导致基因组嵌合DNA乾序列的切割。该切割诱导同向重 复之间进行同源重组，产生功能性LacZ基因，其表达可通过合适的方法 进行监测。
1)材料和方法
a) R51D和D137R突变的引入
49通过对RAGl.10.2和RAGl.10.3切割酶的DNA进行两次PCR反 应来引入各突变。
对于R51D突变而言，第 一 次PCR反应是利用引物 Gall OF 5'争gcaacmagtgctgacacatacagg-3， (SEQ ID NO: 37) 和 R51DRev 5Mttgtccagaaaccaacggtcctgggtcttttgagtcao3' (SEQ ID NO: 38)进行的，第二次反 应是利用引物R51DFor 5'-gtgactcaaaagacccaggaccgttggtttctggacaaao3， (SEQ ID NO: 39)和 Gall OR 5'-acaaccttgattggagacttgacc-3， (SEQ ID NO: 40).进行的。
为了引入 D137R 突变， 利用 引 物
D137RRev 5，-ggttttacgcgtcttagaacggttcagagctgcaatctg-3* (SEQ ID NO: 41) 和
Dl 37RFor S'-cagattgcagctctgaaccgtlctaagacgcgtaaaaco^ (SEQ ID NO: 42)通过相同的方法进
行。纯化所有的PCR片段并与前述的利用iVcol和线性化(对于 RAGl.10.2切割酶而言)的pCLS0542载体(见例如PCT国际申请WO 2006/097853的图5)或前述的利用7VgoMIV和"mill线性化(对于 RAGl.10.3切割酶而言)pCLS1107载体(见例如PCT国际申请WO 2007/093918的图14 ) 一起通过高效LiAc转化方案来转>[匕酒酵母 (S""/mra附j;6^s OMWwVie)菌林FYC2-6A (MATa、 trpl厶63、 leu2厶1 、 his3厶200)。然后通过在酵母体内同源重组产生I-Odt突变体的完整编 码序列。回收酵母DNA并用于转化DH5a大肠杆菌(Eco//)菌林。纯 化细菌DNA，通过测序来检查R51D或D137R的存在。
b)突变体共表达
利用在pCLS0542表达栽体中编码来自原始RAG1.10.2切割酶的 突变体之DNA和在pCLS1107表达栽体中编码来自原始RAG1.10.3切 割酶的突变体之DNA转化酵母菌林FYC2-6A。在-L Glu + G418培养 基上选择转化体。
c)在酵母中接合共表达大范围核酸酶的克隆并筛选
使用菌落网格(gridder) (QpixII, Genetix)进行^^。使用低网格密度 (约4个点/cm2)将突变体在尼龙滤膜覆盖的YPD平板上划成网格状。在 同一滤膜上进行第二次划网格的过程，从而印上第二层，所述第二层由针 对每个靶标的含有不同报告基因的酵母菌林组成。将膜置于富含固体琼脂YPD的培养基上，在30。C孵育一夜，以使其^。接着，将滤膜转移至 缺少亮氨酸和色氨酸且加入G418并含有半乳糖(1%)作为碳源的合成培养 基上，在37。C孵育五天，以选择带有表达栽体和靶标载体的二倍体，。5 天后，将滤膜置于在0.5M磷酸钠緩冲液(pH7.0)中的含0.02。/。X-Gal、 0.1%SDS、 6。/o二甲基曱酰胺(DMF)、 7mM卩-巯基乙醇、1%琼脂糖的固 体琼脂糖培养基中，在37。C孵育，以检测p-半乳糖苷酶活性。通过扫描分 析结果，并使用适当的软件进行定量。
2)结果
R51D RAG 1.10.2切割酶与D137R RAG 1.10.3切割酶的共表达导致 RAG 1.10乾标的有效切割，而未看到RAG 1.10.2和RAG 1.10.3靶标的切 割(图12)。这清楚地表明所述异二聚体对RAG 1.10靶标序列有活性，而 所述两种同二聚体不切割回文RAG 1.10.2和RAG 1.10.3靶标。这样的异 二聚体符合用于定义专性异二聚体的标准。D137R RAG 1.10.2切割酶与 R51D RAGl.10.3切割酶的共表ii^导致形成专性异二聚体，其对RAG 1.10靶标的活性小于先前的异二聚体。
为了比较此异二聚体与实施例1、 3和4中所述的异二聚体，如实施 例1所述计算了 R51D和D137突变体相互作用的自由能。如表II所示， 所述异二聚体(S1_S2)与野生型同二聚体非常相似，而突变体同二聚体 (SI—SI和S2_S2 )明显失去稳定性。
表II:野生型或设计的同二聚体和异二聚体的FoldX计算的相互作用自 由能突变体和野生型之间相互作用 能量差异 (kcal/mo，)
A1一B50,911
A2一B30，9"3
A2一B51,0488
A1一B31,2375
S1—S21,3827
A2一B43，78的
A2一B63,9856
S1—S15,9036
B3一B37,9921
B5一B58,9138
S2一S29,7611
A1一A19，8489
A2_A212,0421
B4一B412,6754
B6_B613,1897
* S1和S2分别代表R51D和D137R突变体
实施例7:通过靶标赖氨酸7-谷氨酸8相互作用来制备RAG1.10专性异 二聚体
在本实施例中，靶向发生在两个单体之间的赖氨酸7-谷氨酸8相 互作用。因此，将单突变K7E或E8K引入到实施例6的M2或M3突 变体中。然后将所得的突变体在CHO细胞中共表达，利用之前所述的 CHO细胞中的单链退火(SSA)染色体外测定来监测所述异二聚体和 所述两种同二聚体针对3种RAG1.10乾标的活性(PCT国际申请WO 2004/067736和WO 2006/097853; Epinat等，Nucleic Acids Res.， 2003， 31, 2952-2962; Chames等，Nucleic Acids Res.， 2005， 33, el78; Arnould等，J. Mol. Biol" 2006, 355， 443-458 )。
1)材料和方法
a) K7E和E8K突变的引入
已经将来自I-Oel的突变体M2和M3在哺乳动物表达载体中进 行了克隆。通过对所述M2和M3突变体的DNA进行两次重叠PCR反应来引入各突变。对于K7E突变而言，第一次PCR反应是利用引物
CMVFor (5'-cgcaaatgggcggtaggcgtg"3，； SEQIDNO: 44) 和
K7ERev (5'- gtacagcaggaactcttcgttatatttggtattgg-3,; SEQ ID NO: 45)进行的，第二次反应是 利 用 引 物 K7EFor (5'-aataccaaatataacgaagagttcctgctgtacc-3,; SEQ ID NO: 46) 和 V5epitopeRev (5,-cgtagaatcgagaccgaggagagg"3'; SEQ ID NO: 47)进;f于的。对两种pCR片
段进行凝胶纯化、混合并利用CMVFor和V5epitopeRev引物进行第三
次装配PCR。所得的PCR片段包含具有K7E突变之I-Od突变体的
开放阅读框。然后纯化PCR片段，利用限制性酶5WI和X6al消化并
连接到也通过Sflcl和JVT6fll进行了消化的pCLS1088中(图13 )。通过
测序(MILLEGEN)验证所得的克隆M2 K7E或M3 K7E。除了利用两种 引 物 E8KRev (5'-caggtaCagcaggaactttttgttatatttgg-3,; SEQ ID NO: 48) 和
E8KFor (5,- accaaatataacaaaaagttcctgctgtacctgg-3'; SEQ ID NO: 49)以夕卜,利用完全相同的 方案将E8K突变引入到M2和M3突变体中。
b) 在用于CHO细胞中染色体外测定的载体中克隆RAG1.10、 RAG 1.10.2和RAG1.10.3靶标
如下克隆目的靶标从PROLIGO定购寡核苷酸，其相应于两侧 为Gateway克隆序列的靶序列。利用Gateway方案(IN VITRO GEN ) 将由单链寡核苷酸的PCR扩增得到的双链靶标DNA克隆到CHO报告 基因载体(pCLS1058，图14)中。
c) CHO细胞中的染色体外检测
才艮据供应商(QIAGEN )的方案利用Polyfect转染试剂转染CHO 细胞。转染后72小时，除去培养基，加入150jiL裂解/解析緩冲液用于 p-半乳糖苷酶液体测定(通常，1升緩沖液包含100 ml裂解緩冲液
(Tris画HC110mMpH7.5， NaCl 150 mM， Triton X100 0.1 %, BSA0.1 mg/ml，蛋白酶抑制剂)、10mlMgl00X緩冲液(MgCl2l00mM，卩-巯基
乙醇35%)、 110 ml ONPG 8 mg/ml以及780 ml磷酸钠0.1 M pH7.5 )。 在37"C孵育后，于420nm处测量吸光度。整个过程在自动化Velocityll BioCel平台上进行。
2)结果利用之前所述的染色体外检测于CHO细胞中监测单突变体M2K7E或E8K以及M3 K7E或E8K对其各自的DNA靶标RAG 1.10.2和RAG 1.10.3的活性。如图15A所示，7位或8位突变的突变蛋白质的活性与原始蛋白质的相同。第二步，共表达M2和M3突变体以形成3种可能的异二聚体M2/M3、 M2 K7E/M3 E8K、 M2 E8K/M3 K7E。然后监测其对3种RAG1.10耙标的活性。图15B显示，当共表达7位或8位突变的M2或M3突变体时，可观察到同二聚化活性的降低，尤其是具有E8K突变的突变体。同时，在7位和8位具有突变的两种异二聚体与原始M2/M3异二聚体相比较而言保持相同的针对天然RAG1.10乾标的活性水平。两种异二聚体M2 K7E / M3 E8K和M2 E8K/M3 K7E不是严格的专性异二聚体，因为仍然可检测到同二聚化活性，甚至在蛋白质仅可形成的同二聚体时也未改变。然而，当蛋白质可形成同二聚体和异二聚体时，靶标K7-E8相互作用显著降低至少 一种同二聚化活性。因此，与功能性同二聚体形成相比较而言，这种突变非常有利于功能异二聚体形成。
实施例8:通过靶向赖氨酸7-谷氨酸8以及谷氨酸61-赖氨酸96相互作用来制备RAG1.10专性异二聚体
实施例7表明，来自具有单个K7E或E8K突变之M2和M3突变体的M2/M3异二聚体(M2K7E/M3E8K和M2E8K/M3K7E )保留了同二聚化活性。因此，通过靶向谷氨酸61-赖氨酸96相互作用(其出现在形成异二聚体的两个单体之间)将其它突变引入到M2或M3突变体中。对于每种M2或M3突变体而言，产生了 4种双突变体K7E E61R、E8KE61R、 K7EK96E和E8KK96E。然后在CHO细胞中监测8种双突变体的同二聚化活性。在第二个阶段，将4种M2双突变体与4种M3双突变体共表达，利用前述的酵母筛选分析和染色体外CHO测定来监测所得16种异二聚体针对3种RAG1.10靶标的活性。
1)材料和方法
a) E61R和K96E突变的引入
通过对在酵母表达栽体中克隆的来自M2或M3的突变体之DNA进行两次重叠PCR反应来引入各突变。对于E61R突变而言，第一次PCR 反 应 是 利 用 引 物
Gall OF (5'-GCAACTTTAGTGCTGACACATACAGG-3，； SEQ ID NO: 37 和
E61RRev (5'-gtaaccaacgccaatacgatccactagttlgtcc-3'; SEQ ID NO: 50)进;f于的，笫二次反应是
利用 引 物E6RFor(5，-gacaaactagtggatcgtattggcgttggttacg"3';SEQIDNO:51) 和
Gall0R (5'-ACAACCTTGATTGGAGACTTGACC-3'; SEQ ID NO: 40)进行的。为了引入
K96E 突变 ， 我们利用 引 物
K96ERev (5'-cctgtttctgtttcagttccagaaacggctgcag-3，； SEQ ID NO: 52) 和K96EFor (5'-ctgcagccgtttctggaactgaaacagaaacagg-3';; SEQ ID NO: 53)通过完全相同的方法
进行。纯化所有的PCR片段，并将其与具有iV"I和的pCLS0542线性化载体(对于来自M2的突变体而言)或具有7VgoMIV和的pCLS1107线性化载体(对于来自M3的突变体而言) 一起通过高效LiAc 转化方案用于转化酿酒酵母(5"flcc^ro附^ces cercWsifle)菌抹FYC2-6A(MATa、 trpl厶63、 leu2厶l、 his3厶200)。然后通过在酵母中体内同源重组产生突变体的完整编码序列。回收酵母DNA，用于转化DH5a大肠杆菌菌林。纯化细菌DNA，通过测序来检查E61R或K96E的存在。
b) 突变体共表达
利用在pCLS1107表达载体中编码来自M3的突变体之DNA转化在pCLS0542表达载体中编码来自M2的突变体的酵母菌株。在-L Glu +G418培养基上选择转化体。
c) 将M2或M3双突变体克隆到哺乳动物表达载体中
利 用 引 物
CCM2For (5 ， -aagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcltatcgaccatggpcaatacca
aatataacaaagagttcc-3,; SEQ [D NO: 54) 和CCMRev(5，- ctgctctagattagtcggccgccggggaggamctto3，； SEQ ID NO: 55>通过pcR扩增各
突变体ORF。利用限制酶5VicI和JVT^I消化PCR片段，然后将其连接到也通过5ViCI和消化的栽体pCLS1088中。通过测序(MilleGen)来检查所得的克隆。
2)结果
554种双突变M2或M3突变体的同二聚化活性显示在图16中，其表明该活性降低至几乎背景水平，携带突变K7E和K96E的突变体尤其如此。第二步，将来自M2的所有突变体与来自M3的所有突变体共表达。然后利用酵母筛选测定(图17)和染色体外CHO测定(图18)来监测所得异二聚体针对3种RAG1.10耙标的活性。图17显示，通过红色椭圆从16种可能的异二聚体中标出了在酵母中表现为专性异二聚体的4种异二聚体。它们对RAG1.10靶标具有强的切割活性，与M2/M3异二聚体的活性相等，而它们表现出几乎不可检测的同二聚化活性。为
了突出专性异二聚体的该概念，图18表明，双突变M2突变体仅在其与双突变M3突变体(具有互补突变)共表达时起作用。4种所得的专性异二聚体^皮称为OHl至OH4，分别为
OHl=M2 K7E E61R/ M3 E8K K96E
OH2=M2 E8K E61R/M3 K7E K96E
OH3=M2 K7E K96E/M3 E8K E61R
OH4-M2 E8K K96E/M3 K7E E61R
最后，图19表明，4种专性异二聚体OHl至OH4在CHO细胞中对RAG1.10靶标具有与原始M2/M3异二聚体相同的切割活性，而同二聚化活性则降低至几乎不可检测的水平。这些数据显示，可通过将K7E/E8K和E61R/K96E突变引入到来自的突变体中形成异二聚体而产生专性异二聚体。
实施例9: K7E/E8K和E61R/K96E突变在单链分子设计中的用途
为了进一步证实K7E/E8K和E61R/K96E突变改善大范围核酸酶特异性的用途，将这些突变引入到RAG单链构建体中。利用称为RM2的32个氨基酸的长连接物将M3突变体的C端连接到M2突变体的N端的6位残基上来改造出单链分子M3-RM2-M2。因为该分子表现出针对RAG1.10.2靶标的一些同二聚化活性，所以将突变K7E、 K96E引入到M3突变体中，并将突变E8K、 E61R引入到M2突变体中以产生单链分子M3(K7EK96E)-RM2-M2(E8KE61R)，其还称为SCJ3H。然后利用前述的酵母筛选测定法监测两种单链分子针对3种RAG1.10耙标的活性。
1) 材料和方法
卓遂为、子邦2謦
对在pCLS0542酵母表达载体中克隆的带有E8K和E61R突变的M2突变体进行PCR反应。所述PCR反应利用反向引物
CreCterSacI (5,- tagacgagctcctacggggaggatttcttcttctcgct-3'; SEQ ID NO: 56) 和正向引物
RM2 (5,-tatcggccggtggatctgataagtataatcaggctctgtctaaatacaaccaagcactgtccaagtacaatcaggccctgtctggtggaggcggttccaacaaagagttcctgctgtatcttgctggattt3' SEQ IDNO: 57).
纯化PCR片段并利用￡flgl和Sflcl进行消化并连接到所述酵母表达载体中以《吏也利用和5^1消化携带突变K7E和K96E的M3突变体。对克隆进行测序后，得到SC—OH单链分子。
2) 结果
图20中所示的两种单链分子M3-RM2-M2和SC—OH针对3种RAG1.10靶标的酵母筛选表明，引入K7E/E8K和E61R/K96E允许在不降低所述单M RAG1.10靶标的切割活性的情形下消除针对RAG1.10.2靶标的同二聚化活性。因此，可将实施例8中所述的突变引入到专性异二聚体设计物、单链分子中以在不影响其对目的DNA靶标之活性的情形下提高其特异性。
5权利要求
1.一种专性异二聚体大范围核酸酶，其由第一和第二单体组成，所述单体来自两种不同的同二聚化LAGLIDADG内切核酸酶单体(母体单体)，并且具有至少一对突变引入到所述母体单体中使得各母体同二聚化LAGLIDADG内切核酸酶的两个单体之间形成分子间相互作用的对应残基上，其中所述突变对中的第一突变在所述第一单体中，所述突变对中的第二突变在所述第二单体中，所述突变对破坏由各单体形成功能性同二聚体，而不阻止形成能切割非回文杂合DNA靶标的功能性异二聚体，所述非回文杂合DNA靶标包含被各自母体同二聚化内切核酸酶切割的DNA靶标中不同的一半。
2. 权利要求1的专性异二聚体大范围核酸酶，其中所述单体中的 第一单体和第二单体分别具有下述突变对中的至少一种a) 8位上的谷氨酸被碱性氨基酸替换，7位上的赖氨酸被酸性氨基 酸替换，b ) 61位上的谷氨酸被碱性氨基酸替换，96位上的赖氨酸被酸性氨 基酸替换，c) 97位上的亮氨酸被芳香族氨基酸替换，54位上的苯丙氨酸被小 氨基酸替换，以及d) 137位上的天冬氨酸被碱性氨基酸替换，51位上的精氨酸被酸 性氨基酸替换，所述位置参照I-CVd氨基酸序列SEQ ID NO: 1来表示。
3. 权利要求2的专性异二聚体大范围核酸酶，其中如a)或b)中 所述，所述单体的8位或61位上的谷氨酸被碱性氨基酸替换，7位和 96位上的赖氨酸残基中的至少一个被精氨酸替换。
4. 权利要求2的专性异二聚体大范围核酸酶，其中如c)中所述的 97位上的亮氨酸被芳香族氨基酸替换的单体还包含54位上的苯丙氨酸 被色氨酸替换。
5. 权利要求2的专性异二聚体大范围核酸酶，其中，如c)中所述的54位上的苯丙氨酸被小氨基酸替换的单体还包含58位上的亮氨酸或 57位上的赖氨酸被甲硫氨酸替换。
6. 权利要求2的专性异二聚体大范围核酸酶，其中所述酸性氨基 酸是谷氨酸。
7. 权利要求2或3的专性异二聚体大范围核酸酶，其中所述碱性氨 基酸是精氨酸。
8. 权利要求2或4的专性异二聚体大范围核酸酶，其中所述芳香族 氨基酸是苯丙氨酸。
9. 权利要求2或5的专性异二聚体大范围核酸酶，其中所述小氨基 酸是甘氨酸。
10. 权利要求1-9中任一项的专性异二聚体大范围核酸酶，其由至 少具有突变D137R的第一单体和至少具有突变R51D的第二单体组成。
11. 权利要求1-9中任一项的专性异二聚体大范围核酸酶，其包含 如权利要求2的a)、 b)、 c)或d)中所定义的至少两对突变。
12. 权利要求ll的专性异二聚体大范围核酸酶，其中一个单体的7 位和96位上的赖氨酸残基被酸性氨基酸替换，另一个单体的8位和61 位上的谷氨酸残基被碱性氨基酸替换。
13. 权利要求11或12的专性异二聚体大范围核酸酶，其包含如权 利要求2的a)、 b)和c)中所定义的3对突变。
14. 权利要求13的专性异二聚体大范围核酸酶，其由第一单体和第 二单体组成，所述第一单体至少具有突变K7R、 E8R、 E61R、 K96R和 L97F或者K7R、 E8R、 F54W、 E61R、 K96R和L97F，所述第二单体 至少具有突变K7E、 F54G、 L58M和K96E或者K7E、 F54G、 K57M 和K96E。
15. 权利要求1-14中任一项的专性异二聚体大范围核酸酶，其由两 种单体变体组成，其还包含I-Orl的26-40位以及44-77位的不 同突变。
16.权利要求15的专性异二聚体大范围核酸酶，其能切割来自目的基因组序列的非回文杂合DNA靶标，所述目的基因组序列对应于被各母体 同二聚化内切核酸酶切割的DNA靶标中不同的一半。
17. —种单链大范围核酸酶，其包含通过肽连接物连接的如权利要求 1-16中任一项所定义的专性异二聚体大范围核酸酶的第一单体和第二单 体。
18. 权利要求1-16中任一项的专性异二聚体大范围核酸酶的单体。
19. 一种多核苷酸片段，其编码权利要求18的单体或权利要求17的 单链大范围核酸酶。
20. —种重组载体，其包含权利要求19的至少一种多核苷酸片段。
21. —种包含两种多核苷酸片段的表达载体，所述多核苷酸片段各自 编码权利要求1-16中任一项的专性异二聚体大范围核酸酶的两个单体中 之一，所述片段可操纵地与允许产生所述两种单体的调节序列相连接。
22. —种包含多核苷酸片段的表达载体，所述多核苷酸片段编码权利 要求17的单链大范围核酸酶，并且所述片段可操纵地与允许产生所述单链 大范围核酸酶的调节序列相连接。
23. 权利要求21或权利要求22的载体，其包含耙向DNA构建体，所 述构建体含有与权利要求1或16中所定义的杂合DNA靶标序列的周围区 域有同源性的序列。
24. 权利要求23的载体，其中所述乾向DNA构建体包含a)与权利 要求1或16中所定义的杂合DNA靶标序列的周围区域有同源性的序列， 以及b)待引入的序列，其两侧为a)中的序列。
25. —种宿主细胞，其包含权利要求19或权利要求21中所定义的一 种或两种多核苷酸片段或者权利要求20-24中任一项的载体。
26. —种非人转基因动物，其包含权利要求19或权利要求21中所定 义的一种或两种多核苷酸片段。
27. —种转基因植物，其包含权利要求19或权利要求21中所定义的 一种或两种多核苷酸片段。
28. 权利要求1-16中任一项的至少一种专性异二聚体大范围核酸酶、 权利要求17的一种单链大范围核酸酶、权利要求19或权利要求21中所定 义的一种或两种多核苷酸片段、权利要求21-24中任一项的一种载体、权 利要求25的一种宿主细胞、权利要求27的一种转基因植物、权利要求26 的一种非人转基因哺乳动物用于分子生物学、体内或体外基因工程以及体 内或体内基因组工程的用途。
29. 权利要求28的用途，用于诱导目的位点中的双链核酸断裂，从而 诱导DNA重组事件、DNA丢失或细胞死亡，其中所述目的位点包含所述 专性异二聚体大范围核酸酶所切割的杂合DNA乾序列。
30. 权利要求28或权利要求29的用途，其中所述双链核酸断裂是为 了以下目的修复特定序列、修饰特定序列、恢复功能性基因而替换突 变基因、弱化或活化内源目的基因、将突变引入目的位点、引入外源基 因或其部分、失活或消灭内源基因或其部分、使染色体臂易位或使DNA 不被修复并降解。
31. 权利要求28-30中任一项的用途，其中所述专性异二聚体大范围 核酸酶、单链大范围核酸酶、多核苷酸、载体、细胞、转基因植物或非人 转基因哺乳动物与权利要求23或24中所定义的靶向DNA构建体相关联。
32. —种基因工程方法，其包括以下步骤通过使包含权利要求l或 权利要求16中所述的杂合DNA靶标的栽体与权利要求1-16中任一项的专 性异二聚体大范围核酸酶或权利要求17的单链大范围核酸酶相接触,使得 位于所述载体上的目的位点发生双链核酸断裂，从而诱导与另一载体进行 同源重组，所述另一载体与所述专性异二聚体大范围核酸酶的切割位点的 周围序列有同源性。
33. —种基因组工程方法，其包括以下步骤l)使权利要求l或权 利要求16中所述的杂合DNA靶标的基因组基因座处发生双链断裂，所 述断裂通过使所述DNA靶标与权利要求1-16中任一项的专性异二聚体 大范围核酸酶或权利要求17的单链大范围核酸酶相接触而实现；2)将 所述断裂的基因组基因座维持在适于与靶向DNA构建体进行同源重组 的条件下，所述构建体包含待引入到所述基因座中的序列，其两侧是与 所靶向基因座有同源性的序列。
34. —种基因组工程方法，其包括以下步骤1)使包含权利要求1 或权利要求16中所定义的至少一种杂合DNA靶标的基因组基因座处发 生双链断裂，所述断裂通过使所述杂合DNA靶标与权利要求1-16中任 一项的专性异二聚体大范围核酸酶或权利要求17的单链大范围核酸酶 相接触而实现；2)将所述断裂的基因组基因座维持在适于与染色体DNA 进行同源重组的条件下，所述染色体DNA与所靶向基因座周围区域有 同源性。
35， 一种组合物，其至少包含以下至少之一权利要求1-16中任一 项的至少一种专性异二聚体大范围核酸酶、权利要求17的一种单链大范围 核酸酶、权利要求19或权利要求21中所定义的一种或两种多核苷酸片段 或者权利要求21-24中任一项的一种载体。
36. 权利要求35的组合物，其还包含含有修复目的位点之序列的靶向 DNA构建体，所述目的位点的两侧为与所靶向基因座有同源性的序列。
37. 权利要求1-16中任一项的至少一种专性异二聚体大范围核酸酶、 权利要求17的一种单链大范围核酸酶、权利要求19或权利要求21中所定 义的一种或两种多核苷酸片段、权利要求21-24中任一项的一种载体在制 备用于在有此需求的个体中预防、改善或治疗遗传性疾病的药物中的用 途，所述药物以任意方式施用给所述个体。
38. 权利要求1-16中任一项的专性异二聚体大范围核酸酶、权利要求 17的单链大范围核酸酶、权利要求19或权利要求21中所定义的一种或两 种多核苷酸片段、权利要求21-24中任一项的载体在制备用于在有此需求 的个体中预防、改善或治疗疾病的药物中的用途，所述疾病由具有DNA 中间体的传染原所引起，所述药物以任意方式施用给所述个体。
39. 权利要求1-16中任一项的专性异二聚体大范围核酸酶、权利要求 17的单链大范围核酸酶、权利要求19或权利要求21中所定义的一种或两 种多核苷酸片段、权利要求21-24中任一项的载体用于体外抑制传染原的 传播、灭活或消灭传染原的用途，或者用于物品消毒的用途，其中所述 传染原具有DNA中间体，存在于生物来源产品或旨在用于生物用途的 产品中。
40. 权利要求38或39的用途，其中所述传染原是病毒。
全文摘要
本发明涉及一种专性异二聚体大范围核酸酶，其由第一和第二单体组成，所述单体来自两种不同的同二聚化LAGLIDADG内切核酸酶单体(母体单体)，并且具有至少一对突变引入到所述母体单体中使得各母体同二聚化LAGLIDADG内切核酸酶的两个单体之间形成分子间相互作用的对应残基上；本发明还涉及编码所述大范围核酸酶的载体；以所述载体修饰的动物或植物；以及所述大范围核酸酶及衍生产物用于分子生物学、基因组工程和基因组治疗的用途。
文档编号C12N15/52GK101678087SQ200880006978
公开日2010年3月24日 申请日期2008年1月31日 优先权日2007年2月1日
发明者埃曼努埃尔·法雅尔多桑切斯, 弗朗索瓦·斯特里谢, 西尔韦斯特·格里佐, 路易斯·塞拉诺普布尔, 马克·伊萨兰 申请人:赛莱克蒂斯公司