Cho细胞的制作方法

专利名称：：Cho细胞的制作方法CHO细胞本发明提供具有组成型活性促有丝分裂受体的CHO细胞。该细胞用于蛋白质表达。因此本发明属于哺乳动物细胞工程和蛋白质表达的领域。
背景技术：
：用于产生重组多肽的表达系统为本领域所熟知，并描述于例如Marino,M.H.，Biopharm.2(1989)18-33;Goeddel，D.V"等，MethodsEnzymol.185(1990)3-7;Wurm，F.，和Bernard,A.，Curr.Opin.Biotechnol.10(1999)156-159中。这种表达系统包含宿主细胞和合适的表达质粒。表达质粒的基本元件是例如大肠杆菌(E.coli)的原核质粒增殖单位，其包含复制起点和选择标记、真核选择标记和用于表达目的结构基因的一个或更多个表达盒，每一所述表达盒包含启动子、结构基因和包括多聚腺苦酸化信号的转录终止子。对于哺乳动物细胞中的瞬时表达，可选择哺乳动物的复制起点，如SV40Ori或OriP。作为启动子，可选择组成型或i秀导型启动子。为了优化转录，在5，非翻译区可包括Kozak序列。对于mRNA加工，尤其是mRNA剪接和转录终止，根据结构基因的组成(外显子/内含子组成)可包括mRNA剪接信号以及多聚腺苷酸化信号。优选在哺乳动物细胞，如CHO细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、HEK细胞、BHK细胞、PER.C6细胞等中产生用于药物应用的多肽。为了宿主细胞的发酵和目的多肽的表达，使用培养基。今天CHO细胞在实验室中小规模或在生产过程中大规模地广泛用于药物多肽的表达。由于其广泛的分布和用途，CHO细胞的特征和遗传背景是众所周知的。因此，管理机构批准CHO细胞用于产生应用于人的治5疗蛋白质。但是在培养基方面仍然具有许多条件。使用动物来源的组分，对人有害的物质，如病毒或朊病毒蛋白质污染的潜在危险亟待解决。除了高成本和下游加工问题，动物来源组分的另一问题是由于批与批的差异，因为天然产物使获得恒定产品数量和质量变得困难。为了克服这些条件，需要产品细胞系，其需要更少的动物来源组分用于其培养。Pak等已经报道了能够在完全确定成分的无蛋白质条件下自分泌生长的超级CHO细胞系(Pak，S.C.O.，等，Cytotechnology22(1996)139-146)。这是表达运铁蛋白和IGF-I的CHO-K1(ATCCCCL61)细胞系。Morris,A.E.，等(US2005/0170462)报道了通过调节IGF-I信号途径在细胞培养中产生重组蛋白质的方法。Belaus等用嵌合ErbB2v—E/IGF-I受体转染IL-3依赖性鼠类BaF/3细胞(Belaus，A.，等，J.Steroid.Biochem.Mol.Biol.85(2003)105-115)。发明简述本发明提供具有组成型活性促有丝分裂受体的CHO细胞，获得这种CHO细胞的方法，和用于在这种CHO细胞中重组产生异源多肽的方法。本发明的一个方面是CHO细胞，其表达组成型活性促有丝分裂受体。在一个实施方案中，所述CHO细胞是CHO-Kl细胞。在另一实施方案中，所述组成型活性促有丝分裂受体是ErbB2v—E/IGF-I受体。本发明的其它方面是CHO细胞系DSMACC2851。本发明的另一方面是用于获得具有组成型活性促有丝分裂受体的CHO细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤a)用第一种核酸转染CHO细胞，所述第一种核酸包含i)侧翼为两个loxP位点的编码选择标记的表达盒，ii)表达组成型活性促有丝分裂受体的表达盒，b)选择用所述第一种核酸转染的CHO细胞，c)用包含CRE重組酶表达盒的第二种核酸转染步骤b)中选择的CHO细胞，d)选择转染有所述第二种核酸的CHO细胞为具有组成型活性促有丝分裂受体的CHO细胞。在一个实施方案中，步骤b)的转染的CHO细胞具有组成型活性促有丝分裂受体。在另一实施方案中，在步骤d)中选择所述转染CHO细胞的第一种核酸包含的选择标记的缺失。在另一实施方案中，在步骤d)中选择的转染CHO细胞在根据第一种核酸的选择标记的选择剂存在下不生长。在其它实施方案中包含所述第一种核酸，其为用于表达运铁蛋白的额外表达盒。本发明的其它方面是用于在本发明CHO细胞中重组产生异源多肽的方法，在所述CHO细胞中表达組成型活性促有丝分裂受体。在一个实施方案中，转染CHO细胞的核酸包含编码异源多肽的表达盒。在一个实施方案中，所述异源多肽是人多肽。在另一实施方案中，所述异源多肽选自包含免疫球蛋白、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白片段或免疫球蛋白缀合物的多肽。发明详述本发明包含CHO细胞，其表达组成型活性促有丝分裂受体。例如在Ausubd，F.M.，等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,第I至III巻(1997),Wiley和Sons;Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)中描述了本领域技术人员已知的方法和技术，其用于实施本发明。如此处所用，术语"核酸"表示由各核苷酸组成的多聚物，即多核苦酸。它指天然发生的，或部分或完全非天然发生的核酸，其例如编码可重组产生的多肽。核酸可由分离的或通过化学手段合成的DNA片段构成。核酸可整合到另一核酸中，例如表达质粒或宿主细胞的基因组/染色体中。质粒包括穿梭和表达载体。通常，所述质粒还将包含原核增殖单位，其包含分别用于在细菌中载体复制和选择的复制起点(例如ColEl的复制起点)和选择标记(例如，青霉素或四环素抗性基因)。核酸同样通过其由各核苷酸组成的序列或由该核酸分子编码的氨基酸序列来表征。"表达盒"指核酸，其含有宿主细胞中至少含有的结构基因的表达和分泌所需的元件。"基因，，表示核酸，其为例如染色体或质粒上的区段，能够影响肽、多肽或蛋白质的表达。除了编码区，即结构基因，基因还包含其它功能元件，例如，信号序列、启动子、内含子和/或终止子。"结构基因"表示不含信号序列的基因区域，即编码区。术语"选择标记"表示核酸，其允许在相应"选择剂"的存在下特异性选择携带该核酸的细胞。重要的阳性选择标记是例如抗生素抗性基因。所述选择标记允许在相应选择剂的存在下选择转化有该选择标记的细胞；非转化细胞在这些选择性培养条件下不能够生长或存活。选择标记可以是阳性的、阴性的或双功能的。阳性选择标记允许选择携带所述标记的细胞，而阴性选择标记允许选择性消灭携带该标记的细胞。通常，选择标记将赋予对药物的抗性或补偿细胞中的代谢或分解代谢缺陷。可用于真核细胞的选择标记包括，例如氨基糖苷磷酸转移酶(APH)，如潮霉素磷酸转移酶(hyg)、新霉素和G418APH、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(tk)、谷氨酰氨合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(选择剂吲哚)、组氨醇脱氢酶(选择剂组氨醇D)的基因，和提供嘌呤霉素、博来霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin和霉酚酸抗性的基因。其它选择标记描述于例如WO92/08796和WO94/28143。"启动子，，指核酸，即多核苷酸序列，其控制有效连接的核酸的转录。启动子包括RNA聚合酶结合和转录起始的信号。所用启动子在宿主细胞的细胞类型中将是有功能的，设想在所述宿主细胞中表达有效连接的核酸。大量启动子，包括来自多种不同来源的组成型、诱导型和阻抑型启动子为本领域所熟知(并在数据库如GenBank中得以鉴定)。它们可获得为克隆的多核苷酸或在克隆的多核苷酸内(来自例如保藏中心，如ATCC及其它市售或个体来源)。"启动子"包含指导例如有效连接的结构基因转录的核苷酸序列。通常，启动子位于基因的5，非编码区或5'非翻译区(5，UTR)，靠近结构基因的转录起始位点。在转录起始中起作用的启动子内的序列元件特征通常在于共有核苷酸序列。这些序列元件包括RNA聚合酶结合位点、TATA序列、CAAT序列、分化特异性元件(DSE;McGehee，R.E.，等，Mol.Endocrinol.7(1993)551-560)、环腺苷酸效应元件(CRE)、血清效应元件(SRE;Treisman，R.,SeminarsinCancerBiol,1(1990)47-58)、糖皮质类固醇应答元件(GRE)，和用于其它转录因子如CRE/ATF(O'Reilly,M.A"等，J.Biol.Chem.267(1992)19938-19943)、AP2(Ye，J"等，J.Biol.Chem.269(1994)25728-25734)、SP1的结合位点、cAMP效应元件结合蛋白(CREB;Loeken,M.R"GeneExpr.3(1993)253-264)和八聚体因子(一般参阅，Watson等，编辑，MolecularBiologyoftheGene，第4版，TheBenjamin/CummingsPublishingCompany,Inc.1987，和Lemaigre，F.P.和Rousseau,G.G.，Biochem.J.303(1994)1-14)。如果启动子是诱导型启动子，那么转录速率响应诱导剂提高。相反，如果所述启动子是组成型启动子，那么转录速率不受诱导剂的调节。阻抑型启动子也是已知的。例如，c-fos启动子在生长激素结合到细胞表面其受体上后被特异性激活。可通过人工杂合启动子完成四环素(tet)调节的表达，所述启动子由例如CMV启动子后接两个Tet-操纵子位点组成。Tet-阻抑物结合两个Tet-操纵基因位点并阻断转录。加入诱导物四环素后，Tet-阻抑物从Tet-操纵基因位点上释放，转录继续进行(Gossen，M.和Bujard，H.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)5547-5551)。对于其它i秀导型启动子，包括金属硫蛋白和热激启动子，参阅例如Sambrook,等(上文)，和Gossen,M.，等，Curr.Opin.Biotech.5(1994)516-520。已经鉴定为强启动子用于高水平表达的真核启动子包括SV40早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-I启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复、中国仓鼠延伸因子la(CHEF-1，参阅例如US5,888,809)、人EF-la、泛素和人巨细胞病毒立9即早期启动子(CMVIE)。增强子(即，在启动子上作用增强转录的顺式作用DNA元件)在与启动子连接中起作用以提高单独用启动子获得的表达水平中是必须的，并可作为转录调节元件被包括在内。通常，含有启动子的多核苷酸区段也将包括增强子序列(例如，CMV或SV40)。"有效连接"指两种或更多种组分的并列，其中所述组分处于允许它们以其期望方式起作用的关系中。例如，如果启动子和/或增强子顺式起作用以控制或调节连接的编码序列的转录，那么启动子和/或增强子有效连接编码序列。通常，但不是必须的，"有效连接的"DNA序列是相邻的，并且需要时连接两个蛋白质编码区，如相邻并符合读框的分泌性前导序列/信号序列和多肽。然而，尽管有效连接的启动子通常位于编码序列的上游，但其不必与其相邻。增强子不必相邻。如果增强子增强编码序列的转录，那么该增强子有效连接编码区。有效连接的增强子可以位于编码序列的上游、中间或下游，和距离启动子相当远的位置。如果多聚腺苷酸化位点以转录继续进行通过编码区到达多聚腺苷酸化序列的方式定位在编码序列的下游末端，那么其有效连接编码序列。通过本领域已知的重组方法，例如使用PCR方法，和/或通过在便利的限制性酶切位点上连接来完成连接。如果不存在便利的限制性酶切位点，那么根据一般实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。如此处所用，术语"表达"指细胞内发生的转录和/或翻译。可在细胞中存在的相应mRNA量的基础上测定宿主细胞中期望产物的转录水平。例如，可通过PCR或通过Northern杂交对从所选核酸转录的mRNA进行定量(参阅Sambrook，等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))。可通过多种方法，例如通过ELISA，通过测定蛋白质的生物活性，或通过使用不依赖该活性的测定，如使用识别并结合所述蛋白质的抗体的Western印迹或放射免疫测定对由所选核酸编码的蛋白质进行定量(参阅Sambrook，等，1989，上文)。"宿主细胞"指向其中引入编码异源多肽的核酸的细胞。宿主细胞包括用于增殖核酸(例如质粒)的原核细胞，和用于表达核酸(例如结构基因)编码的多肽的真核细胞。通常，所迷真核细胞是哺乳动物细胞。"多肽"是通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物，其可以是天然产生的或合成的5低于约20个氨基酸残基的多肽可称作"肽"。包含两条或更多条氨基酸链或包含长度为100个氨基酸或更多个氨基酸的氨基酸链的多肽可称作"蛋白质"。"蛋白质"是包含一条或更多条氨基酸链的大分子，其中在一条链的情况下，该链具有100个氨基酸或更多个氨基酸的长度。多肽或蛋白质也可包含非肽组分，如碳水化合物基团。可通过产生所述蛋白质的细胞向蛋白质添加碳水化合物和其它非肽成分，并且其根据细胞类型而有所变化。蛋白质和多肽此处以其氨基酸主链结构定义；如添加碳水化合物基团通常不进行明确说明，但也存在。"异源DNA"或"异源多肽"指并非给定宿主细胞中天然存在的DNA分子或多肽，或DNA分子群或多肽群。对特定宿主细胞异源的DNA分子可含有来自宿主细胞种类的DNA(即内源DNA)，只要该宿主细胞来源DNA与非宿主细胞来源DNA(即外源DNA)组合。例如，认为含有编码多肽的非宿主DNA区段的DNA分子是异源DNA分子，所述非宿主DNA区段有效连接包含启动子的宿主DNA区段。相反，异源DNA分子可包含与外源启动子有效连接的内源结构基因。非宿主DNA分子编码的肽或多肽是"异源"肽或多肽。"克隆质粒"是核酸分子，如栽体、粘粒、噬菌粒或细菌人工染色体(BAC),其具有在宿主细胞中自主复制的能力。克隆质粒通常含有一个或少量限制性内切核酸酶识别位点，其例如允许在不丢失质粒基本生物功能的情况下以可确定的方式插入核酸，以及提供选择标记的核苷酸序列，所述选择标记适合用于鉴定和选择转化有克隆质粒的细胞。选择标记通常包括提供四环素、嘌呤霉素、潮霉素或氨节青霉素抗性的基因。"表达质粒"是编码待在宿主细胞中表达的多肽的核酸分子。通常，表达质粒包含例如大肠杆菌(E.coli)的原核质粒增殖单位，其包含复制起点和选择标记，真核选择标记，和用于表达目的核酸的一个或更多个表达盒，每一表达盒包含启动子、结构基因和包括多聚腺苷酸化信号的转录终止子。基因表达通常置于启动子的调节之下，并且这样的结构基因称为"有效连接"启动子。类似地，如果调节元件调节核心启动子的活性，那么调节元件和核心启动子有效连接。术语"免疫球蛋白"指基本上由免疫球蛋白基因编码的一种或更多种多肽组成的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区基因以及无数免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白可以多种形式存在，包括例如Fv、Fab和F(ab)2以及单链(scFv)或双抗体(例如Huston,J.S.，等，PNASUSA85(1988)5879-5883;Bird,R.E.，等，Science242(1988)423-426;—般而言，Hood,L.E.，等，Immunology,BenjaminN.Y"第2版(1984);和Hunkapiller，T.和Hood,L.E.，Nature323(1986)15-16)。免疫球蛋白通常包含两条所谓的轻链多肽(轻链)和两条所谓的重链多肽(重链)。每条重链和轻链多肽均含有可变域(可变区)(通常为多肽链的氨基末端部分)，其包含能够与抗原相互作用的结合区。每条重链和轻链多肽均包含恒定区(通常为羧基末端部分)。重链的恒定区介导抗体结合i)携带Fcy受体(FcyR)的细胞，如吞噬细胞，或ii)携带也称为Brambell受体的新生儿Fc受体(FcRn)的细胞。其也介导结合一些因子，包括经典的补体系统的因子，如组分(Clq)。免疫球蛋白轻链或重链的可变结构域依次包含不同的区段，即四个构架区(FR)和三个高变区(CDR)。"免疫球蛋白片段"表示包含结构域组中至少一个结构域的多肽，所述结构域组包含免疫球蛋白重链的可变结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域或免疫球蛋白轻链的可变结构域或Q结构域。也包含的是其衍生物和变体。此外，可存在其中一个或更多个氨基酸或氨基酸区缺失的可变结构域。"免疫球蛋白缀合物"表示通过肽键与其它多肽缀合的多肽，其包含免疫球蛋白重链或轻链的至少一个结构域。所述其它多肽是非免疫球蛋白肽，如激素、生长受体、抗融合肽等。"促有丝分裂受体"是这样的受体，其如果激活或灭活则正面或负面影12响细胞分裂，如细胞生长。术语"正面影响细胞分裂，，表示所述促有丝分裂受体促进细胞分裂。优选地，所述促有丝分裂受体是具有胞内磷酸化位点的跨膜受体。如果该磷酸化位点被磷酸化，那么所述受体激活细胞增殖。优选的促有丝分裂受体是嵌合ErbB2/IGF-I受体。术语"组成型活性"表示受体处于其活性形式，即不需要其它结合伴侣(如激活信号)而正面影响细胞分裂。这可例如通过在受体氨基酸序列中引入突变来完成。优选的组成型活性促有丝分裂受体是嵌合ErbB2v—e/IGF-I受体。胰岛素样生长因子I受体(IGF-IR，EC2.7.1.112，CD221抗原，也表示成IGF-IR)属于跨膜蛋白质酪氨酸激酶家族(LeRoith，D.，等，Endocrin.Rev.16(1995)143-163;Adams,T.E，，等，Cell.Mol.LifeSci.57(2000)1050-1093)。IGF-IR以高亲和力结合IGF-I,并在体内启动对该配体的生理学响应。IGF-IR也结合IGF-II，然而是以稍低的亲和力结合。例如通过结合IGF-I(在下文中通常也表示成效应子或配体)激活IGF-IR触发细胞信号级联放大，其可导致促有丝分裂效应或代谢效应(参阅例如Humbel，R.E.，Eur.J.Biochem.190(1990)445-462)。效应子结合IGF-IR导致酪氨酸激酶的激活。利用在生长因子受体中进行点突变，可以实现受体酪氨酸激酶的组成型活化，例如V664ENeu或V664QNeu(Bargmann,C.I"等，Cell45(1986)649-657)、V922EIGF-IR(Takahashi，K.,等，J.Biol,Chem.270(1995)19041-19045)、L301SCSF-1R或Y969FCSF-1R(Roussel，M.F.，Cell55(1988)979-988)、C332YFGFR陽2(Neilson，K.M,和Friesel，R.E.，J.Biol.Chem.270(1995)26037-26040)、V938DIR(Longo，N.，J.Biol，Chem.267(1992)12416-12419)、V560Gc-Kit或D814Vc-Kit(Furitsa，T.，等，J.Clin.Invest.92(1993)1736-1744)。例如IGF-IR中的V922E突变导致突变的IGF-IR组成型增强的酪氨酸激酶活性。表达V922EIGF-IR的CHO细胞显示了显著激活的葡萄糖摄取，但没有促进IGF-I缺失下的有丝分裂发生。例如通过胸苷摄取测定，或利用XTT的细胞增殖测定可以检测细胞的右&A劲促f泉胡在iHC，'rH"容dwn"13o。4tt"Ot2rk4827-4833)。为了成为组成型活性促有丝分裂受体，促有丝分裂受体的修饰位点可以例如位于跨膜区中。引入的修饰可导致胞内激酶结构域的构象变化，其导致所述结构域的组成型活化。该组成型活化提供了修饰受体的配体独立的激活。如果这种促有丝分裂受体是组成型活性，那么其为包含该受体的细胞提供提高的增殖能力。该增殖能力是在该组成型活性促有丝分裂受体的存在下，独立于未修饰受体的配体的存在，所述配体将通常激活促有丝分裂性质。在一个实施方案中，本发明的细胞在悬浮液中生长。在另一实施方案中是适合于在无血清培养基中生长的本发明细胞。提供组成型活性促有丝分裂受体的细胞的生长独立于受体的相应配体，即其甚至可在缺少生长促进配体下生长。组成型活性促有丝分裂受体具有胞外域、跨膜区、紧接跨膜区的酪氨酸激酶结构域和亲水胞内结构域。所述受体仍然具有结合其激活配体的性质。本发明的一个实施方案包含组成型活性促有丝分裂受体，其为包含在CHO细胞中表达的融合多肽，该融合多肽具有V659E突变的ErbB2受体的胞外及跨膜结构域(ErbB2受体的氨基酸(AA)1-682,对于人ErbB2受体参阅SEQIDNO:09)和IGF-I受体p亚基的胞质域(IGF-I受体的AA929-1337,对于人IGF-I受体参阅SEQIDNO:10)。术语"AA"用于"氨基酸位置"。如该申请中所用，术语"氨基酸"表示一组羧基a-氨基酸，其可直接由核酸编码或是前体形式。氨基酸组包含丙氨酸(三字母代码ala;—字母代码A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、曱硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp,W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。因此，本发明的一个方面是CHO细胞，其表达组成型活性促有丝分裂受体。在该方面的一个实施方案中是包含核酸的CHO细胞，所述核酸编码具有V659E突变的ErbB2受体的胞外及跨膜结构域(氨基酸(AA)1-682)和具有SEQIDNO:03中所示氨基酸序列的IGF-I受体p亚基的胞质域(AA929-1337)。在本发明的另一实施方案中是CHO细胞、CHO-K1细胞，或CHO-DHFR细胞(DSMZACC126)，或CHODG44细胞，优选CHO-K1细胞。本发明的第二个方面是细胞系CHO-K1ErbB2V>E/IGF-IDSMACC2851。本发明的另一方面是用于获得具有组成型活性促有丝分裂受体的本发明CHO细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤a)用第一种核酸转染CHO细胞，所述第一种核酸包含i)包含侧翼为两个loxP位点的编码选择标记的核酸的表达盒，所述1oxP位点一个位于表达盒的3，位置(下游)，一个位于5，位置(上游)，ii)任选地包含编码运铁蛋白的核酸的表达盒，iii)包含编码组成型活性促有丝分裂受体的核酸的表达盒。b)选择用所述第一种核酸转染的CHO细胞，c)用包含CRE重组酶表达盒的第二种核酸转染步骤b)中选择的CHO细胞，d)选择转染有所述第二种核酸的CHO细胞为具有组成型活性促有丝分裂受体的CHO细胞。在侈'J^口Ausubel，F.M.(编丰耳)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,第I至III巻(1997);Glover,N.D.，和Hames，B.D.,编辑，DNACloning:APracticalApproach,第I至II巻(198S)，OxfordUniversityPress;Freshney,R.I.(编辑)，AnimalCellCulture—apracticalapproach,IRLPressLimited(1986);Watson,J.D.，等，RecombinantDNA，第二版，CHSLPress(1992);Winnacker，E丄.，FromGenestoClones;N.Y.，VCHPublishers(1987);Celis，J"编辑，CellBiology,第二版，AcademicPress(1998);Freshney,R.I.，CultureofAnimalCells:AManualofBasic15Technique,第二版，AlanR.Liss，Inc.,N.Y.(1987)中描述了用于实施本发明的重要方法和技术。loxP-CRE重组酶系统是位点特异性重组系统，其中所述loxP位点定义了重组^f立点，并且所述CRE重组酶催化核酸的重组(Sternberg，N.和Hamilton,D,，J.Mol.Biol.150(1981)467-486;Abremski，K.和Hoess，R.E"Gene25(1983)49-58;Hoess，R.E.，和Abremski，K.，J.Mol.Biol.181(1985)351-362)。本发明该方面的一个实施方案中步骤b)的转染的CHO细胞表达组成型活性促有丝分裂受体。在优选的实施方案中包含组成型活性促有丝分裂受体，具有V659E突变的ErbB2受体的胞外及跨膜结构域(氨基酸(AA)1-682)和IGF-I受体p亚基的胞质域(AA929-1337)。在另一优选实施方案中是具有SEQIDNO:03的氨基酸序列的组成型活性促有丝分裂受体。本发明CHO细胞是具有组成型活性促有丝分裂受体的CHO细胞，并且在另一实施方案，步骤d)中选择转染CHO细胞在第一种核酸中包含的可选择标记的缺失。在另一实施方案中，步骤d)中选择的转染CHO细胞在第一种核酸的选择标记的选择剂存在下不生长，即第一种核酸为其提供抗性。目前已经惊奇地发现表达组成型活性嵌合ErbB2v—E/IGF-I促有丝分裂受体的本发明CHO-K1细胞具有改善的生长特性。在一个实施方案中，所述CHO细胞在培养中生长至至少5xl06细胞/ml的最大细胞密度。在优选的实施方案中，所述CHO细胞在培养中生长至至少8xl(^细胞/ml的最大细胞密度。在其它实施方案中，从60到70ml体积中大约2到3xl05细胞/ml的细胞密度开始8到12代内达到所述最大细胞密度。在另一实施方案中，所述CHO细胞的培养是补料分批培养。在一个实施方案中，所述CHO细胞达到的细胞密度超过至少5代，不低于如补料分批培养6代后达到的细胞密度的95%。在另一实施方案中，所述CHO细胞达到的细胞密度超过至少6代，不低于如补料分批培养6代后达到的细胞密度的75%。在其实施方案中，从60到70ml体积中大约2到3xl05细胞/ml的细胞密度开始6代培养后达到所述细胞密度。通过如实施例中报道的CASY测定细胞密度。本发明的第四方面是用于在本发明CHO细胞中重组产生异源多肽的方法，所述CHO细胞表达组成型活性促有丝分裂受体。在一个实施方案中，所述异源多肽是生物活性多肽。如此处所用，术语"生物活性多肽"指有机分子，例如生物大分子，如肽、蛋白质、糖蛋白、核蛋白、黏蛋白、脂蛋白、合成多肽或蛋白质，当在人工生物系统中施用或向人工生物系统中施用时(所述人工生物系统如使用细胞系和病毒的生物测定)或在体内向动物(其包括但不限于鸟类或哺乳动物，包括人)施用时，其引起生物学效应。该生物学效应可以是，但不限于酶抑制或激活、在结合位点或周围结合受体或配体、信号触发或信号调节。生物活性分子不限于例如免疫球蛋白、或激素、或细胞因子、或生长因子、或受体配体、或激动剂或拮抗剂、或细胞毒性剂、或抗病毒剂、或成像剂、或酶抑制剂、酶激活剂或酶活性调节剂，如别构物质。在一个实施方案中，所述异源多肽是免疫球蛋白、免疫球蛋白缀合物或抗融合肽。"抗融合肽，，是抑制于膜融合相关事件或膜融合事件本身的肽，其中包括抑制病毒因膜融合造成的对未感染细胞的感染。这些抗融合肽优选为线性肽。例如，它们可来自gp41胞外域，例如DP107、DP178。此类肽的实例可见于US5,464,933、US5，656，480、US6,013,263、US6，017，536、US6,020,459、US6,093,794，、US6,060,065、US6,258,782、US6,348,568、US6,479,055、US6，656，906、WO1996/19495、WO1996/40191、WO1999/59615、WO2000/69902和WO2005/067960。例如，此类肽的氨基,列包含US5,464,933的SEQIDNO:1到10;US5,656,480的SEQIDNO:1到15;US6,013,263的SEQIDNO:1到10和16到83;US6,017,536的SEQIDNO:1到10，20到83和139到149;US6,093,794的SEQIDNO:1到10，17到83和210到214;US6,060,065的SEQIDNO:1到10，16到83和210到211;US6,258,782的SEQIDNO:1286和1310;US6,348,568的SEQIDNO:1129、1278-1309、1311和1433;US6,479,055的SEQIDNO:1到10和210到238;US6，656，卯6的SEQIDNO:1到171、173到216、218》J219、222至'j228、231、233至'J366、372至)J398、400至'』456、458到498、500到570、572到620、622到651、653到736、739到785、787到811、813到815、816到823、825、827到863、865到875、877到883、885、887到890、892到981、986到999、1001到1003、1006到1018、1022到1024、1026到1028、1030到1032、1037到1076、1078到1079、1082到1117、1120到1176、1179到1213、1218到1223、1227到1237、1244到1245、1256到1268、1271到1275、1277、1345到1348、1350到1362、1364、1366、1368、1370、1372、1374到1376、1378到1379、1381到1385、1412到1417、1421到1426、1428到1430、1432、1439到1542、1670到1682、1684到1709、1712到1719、1721到1753、1755到1757;或WO2005/067960的SEQIDNO:5到95。在一个实施方案中，所述抗融合肽具有包含5到100个氨基酸，优选10到75个氨基酸，并更优选15到50个氨基酸的氨基酸序列。在另一实施方案中，所述异源多肽是免疫球蛋白，或免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白缀合物。本发明的该方面包含用于在本发明细胞中重组产生异源多肽的方法。用于重组产生的细胞包含第三个核酸，所述核酸包含用于表达异源多肽的表达盒。所述笫三个核酸例如在表达质粒上被引入了细胞，并且在适合于所述异源多肽表达的条件下培养细胞。因此，本发明另一方面是用于重组产生异源多肽的方法，其中所述方法包括以下步骤a)提供表达组成型活性嵌合ErbB2v—E/IGF-I促有丝分裂受体的CHO-K1细胞，b)用包含表达异源多肽的表达盒的核酸转染所述细胞，c)从所述细胞或培养基中回收所述异源多肽。在一个实施方案中，所迷异源多肽是免疫球蛋白，或免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白缀合物。免疫球蛋白分子分为五种不同类型IgA(免疫球蛋白A)、IgD、IgE、IgG和IgM。在这些中，IgG和IgE更频繁地用于药物应用和诊断应用。在这些类型中，免疫球蛋白其整体结构不同，但结构单元类似。所有免疫球蛋白由两条不同的多肽链轻链和重链组成。"免疫球蛋白片段"包含免疫球蛋白轻链或重链的羧基末端恒定结构域，例如其包含免疫球蛋白重链的至少CHl-、Ch2-、CH3-结构域和绞链区，和任选地免疫球蛋白轻链的Ch4-結枸域，或Qr结构域。所述片段来源的免疫球蛋白可以是天然发生的或合成的免疫球蛋白，或啮齿类动物免疫球蛋白，或人源化免疫球蛋白，或人免疫球蛋白。在本发明一个实施方案中，所述免疫球蛋白片段额外含有重链或轻链可变结构域或其变体的片段。在可变结构域片段中，氨基酸或区域缺失。在一个实施方案中，可变结构域的一到六个氨基酸缺失。在另一实施方案中，可变结构域的一到六个区域缺失。在其它实施方案中，可变结构域缺失。在一个实施方案中，免疫球蛋白片段中包含的可变结构域和恒定结构域是同一抗体上的或来自同一抗体，即属于同一抗体。对于表达，将编码异源多肽的核酸引入表达质粒中，所述表达质粒包含本发明CHO细胞中有效连接形式的异源多肽进行表达所有需要的元件。在一个实施方案中，CHO细胞包含编码异源多肽的核酸。在一个实施方案中，所述异源多肽是人多肽。在另一实施方案中，所述多肽选自免疫球蛋白，或免疫球蛋白重链，或免疫球蛋白轻链，或免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白缀合物。本发明的优选细胞系CHO-K1ErbB2V〉E/IGF-I根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约在2007年6月13日保藏在德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ)),保藏号为DSMACC2851。提供以下实施例、序列表和附图帮助理解本发明，其真正范围在所附权利要求中给出。应理解在不背离本发明精神的情况下可对所述方法进行19修改。附图描述图1质粒5519-pUC的质粒图。图2质粒4699-pUC-Hyg的质粒图。图3质粒pMC-CRE的质粒图。图4适合悬浮培养的CHO-K1在培养过程中的细胞密度，CHO-K1-5519-1B6-18B3和CHO-Kl-5519画lB6-17C5;X轴:天；Y轴:以106细胞/ml计的细胞密度；填充正方形适合悬浮生长的CHO-Kl，填充的圆形CHO-K1-5519-1B6-18B3，填充的三角形CHO誦Kl-55191B6-17C5。实施例通过从亲本CHO-Kl(W)细胞系开始的3个连续的完整最佳克隆选择活动产生本发明的CHO细胞系，所述亲本CHO-Kl(W)细胞系是适合在悬浮培养中生长的CHO-K1细胞系(ATCCCCL-61)。实施例1质粒5519-pUC的产生质粒5519-pUC提供用于组成型活性促有丝分裂受体(嵌合受体ErbB2v—E/IGF-IR)的表达盒、用于运铁蛋白表达的表达盒、和赋予嘌呤霉素抗性的选择标记的表达盒。详述来说，质粒5519-pUC包含以下元件-包含侧翼为两个loxP位点(SEQIDNO:Ol)的嘌呤霉素选择标记的核酸；在下文中将该核酸命名为puro-loxP。-用于质粒在大肠杆菌中复制和生长的pUC复制起点，-P-内酰胺酶基因(p-内酰胺酶基因)，-包含运铁蛋白结构基因、信号肽、SV40早期启动子和起点、和运铁蛋白可读框的cDNA序列的核酸(Yang，F.，等，Proc,Natl.Acad.Sci.USA81(1984)2752-6)(SEQIDNO:02),-包含SV40早期启动子和起点序列，和编码具有V659E突变的ErbB2受体的胞外及跨膜结构域(氨基酸(AA)1-682)和IGF-I受体卩亚基的胞质域(AA929-1337)的cDNA序列的核酸(Belaus，A.，等，J.Steroid.Biochem.Mol.Biol.85(2003)105-15)(SEQIDNO:03)。将该嵌合受体命名为ErbB2v—E/IGF-IR。将质粒5519-pUC的元件引入栽体4699-pUC-Hyg。质粒5519-pUC的注释质粒图示于图1。通过PCR扩增载体pcDNA3.1/Hygro(+)(Cat-No.:V870-20,InvitrogenCorp.,USA)从1731位核苷酸至5590位核苷酸的3860bp的DNA片段来获得载体4699-pUC-Hyg。通过含有Ascl、SgrAI、Ascl、Sbfl和BamHI限制性位点的PCR引物(正向引物ataatacctgcaggaaaaggccggccaaaggatccctgtggaatgtgtgtcagttagggtg(SEQIDNO:11);反向引物ttttttcctgcaggtattatcaccggtgttttggcgcgccaggtggcacttttcggggaaatgtg(SEQIDNO:04))引入额外的56bp的核酸片段，丢弃Sse38387I限制性位点之内产生的PCR产物，得到包含3916bp的环形质粒4699-pUC-Hyg。质粒4699-pUC-Hyg包含以下元件-包含潮霉素选择标记(hyg)的核酸，-用于质粒在大肠杆菌中复制和生长的pUC复制起点，-P-内酰胺酶基因。质粒4699-pUC-Hyg的注释质粒图示于图2。实施例2用质粒5519-pUC转染CHO-K1细胞为了获得具有组成型活性促有丝分裂受体的CHO细胞，CHO-K1细胞在无血清培养基中适应生长。从美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection(ATCCCCL-61))获得基本CHO画Kl细胞系。Kao，F.T.和Puck,T.T.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA60(1968)1275-81;和Puck,T.T.，等，J.Exp.Med.108(1958)945-56描述了该CHO-K1细胞系的衍生和产生。将经适应的细胞系命名为CHO-Kl(W)。该细胞系不包含外来DNA,例如通过转染方法整合的DNA，并且适合在合成的无动物组分的ProCH04培养基(CambrexCorp.,USA)中悬浮培养生长。该培养基添加有8mM谷氨酰胺(Gin)和lxHT(次黄嘌呤-胸苷)补充物并在下文中命名为ProCH04完全培养基。使用靠近氨千青霉素选择标记(基因)的单Sspl限制性位点在转染前将质粒5519-pUC线性化。利用具有2mm缺口的电穿孔杯，使用GenePulserXCell电穿孔设备(Bio-RadLaboratoriesGmbH,Germany)，用线性化的DNA电穿孑LCHO-Kl(W)细胞。使用的电穿孔脉冲为160V/15ms，该脉沖应用于在总体积为200pi的Dulbecco'sPBS中的20照质粒DNA和7.5xl06细胞(CatNo:D8537，Sigma画AldrichGmbH，Seelze，Germany)。随后将细胞在ProCH04完全培养基中重悬浮并且按5000细胞/孔接种至二十块96孔多孔板。24小时后将生长培养基更换为ProCH04完全选择培养基(添加有5jig/ml嘌呤霉素的ProCH04完全培养基)。实施例3细胞系CHO-K1-5519-1B6的产生实施例2的转染细胞在ProCH04完全选择培养基中培养2-4周。为了获得稳定转染的细胞克隆，进行两步选择步骤。a)第一选择步骤使用两种不同标准来挑取用于增殖的克隆视觉选择将视觉上明显可见的克隆转染至24孔多孔板上(非组织培养处理的；BectonDickinson,表面积2.0cm2)。细胞增殖试验根据生长参数进行WST-I细胞增殖试验(RocheDiagnosticsGmbH，Germany)用于额外克隆的选择。选择具有最高吸光度的克隆并转移至24孔多孔板。使用WST-I比色测定来确定细胞增殖和克隆活力。测定基于细胞代谢活力与积累的甲腾染料的增加量之间的正相关，所述染料通过线粒体脱氢酶切割WST-I试剂产生。为了测定，将细胞复制。将一等分试样按1:10分传至终体积100^中置于96孔多孔板的一个孔中。经24小时的培养时间之后，向各孔中加入10WST-I细胞增殖试剂。随后将细胞在37。C/5%C02额外温育2小时。使用Tecan读数器(Spectrafluorplus，TecanDeutschlandGmbH，Germany)以620nm参考波长在450nm处测定样品的吸光度。b)第二选择步骤为了进一步在24孔多孔板、6孔多孔板和最后的摇瓶形式中进行克隆选择，使用确定的接种策略。因此在各细胞培养容器中接种3xl()S细胞/ml并且使用CASY细胞计数器(SchSrfeSystems,Reutlingen，Germany)测定4和7-8天后细胞密度和活力。通过将200pl的细胞悬浮液与20pi胰蛋白酶在37。C温育30分钟来溶解细胞团。为了测定，将50或100^解离后的细胞悬浮液在10mlCASYton緩沖液(SchSrfeSystemsGmbH，Germany)中稀释并且使用CellCounter和Analyzer-SystemCASY(SchSrfeSystemGmbH,Germany)通过电脉沖面积分析一式三份地测定在其400pl中总的活细胞浓度。使用150nm毛细管的测定结果为大小分布曲线。将大小分布分为三类颗粒3.4-5jLim为细胞碎片；5-10nm为死亡细月包；10—30|tim为活细月包。鉴定并扩大在4天(指快速增殖)和7-8天后具有最高细胞密度的细胞克隆。示例性结果示于表l中。表1:在分批培养条件下125ml摇瓶中培养的CASY选择的示例性结果(总体积ProCH04完全培养基中62.5ml)。细胞克隆细胞数目/ml第4天细胞活力第4天细胞数目/ml第8天细胞活力第8天CHO-K1-5519-1B65.5x10699%8.8x10699%23<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>在第一轮克隆选择后选择具有最佳生长特性的混合有转染子的细胞克隆CHO-Kl-55191B6。实施例44i姿rumn/d，，t^t人AA讧>t;^h/vo。、niv^一i、i、量uuj^jwv/使用经流式细胞仪(FluorescenceActivatedCellSorting,FACS)的单细胞沉积步骤来产生细胞系CHO-Kl(PuDL)。在含4jig/ml噤呤霉素的ProCH04完全培养基中培养实施例3中选择的具有最佳生长特性的转染子混合的细胞克隆CHO-Kl-5519-lB6。收集处于对数生长期的lxl(^个细胞，将其通过流经40jLim滤器以去除细胞团(BDFalcon;cellstrainer,BDBiosciences,USA),离心沉淀(300xg，10分钟)并在5mlProCH04完全培养基中重悬浮以在培养基中不含选择剂的溶液的情况下获得浓度为l-2xl(^细胞/ml的溶液。使用FACSAria细胞分选仪(BDBiosciences,USA)，将单个细胞沉积到二十块96孔多孔板(U-shape，Cellstar，Greinerbio-one，Frickenhausen，Germany)的各孑L中，所述孔含有50pi细胞受限的ProCH04完全培养基及50pi不含选择剂的新鲜ProCH04完全培养基。在单个细胞沉积步骤后两天，加入100含8pg/ml嘌呤霉素的两倍浓缩的选择性ProCH04完全培养基。17天后将82个最先出现的亚克隆在24孔多孔板中扩增。为了在24孔多孔板、6孔多孔板及摇瓶中的进一步克隆选择，使用前文描述的确定的接种策略(见实施例3)。鉴定并扩大培养分别在4天和7-8天后具有最高细胞密度的细胞克隆。在ProCH04完全培养基中补料分批悬浮培养(125mlErlenmeyer瓶)中生长后其生长特性的基础上选择下文中表示为CHO-Kl(PuDL)的克隆CHO-Kl-5519-lB6-18B3。实施例5用CRE重组酶表达质粒瞬时转染CHO-Kl(PuDL)细胞系CRE重组酶表达质粒pMC-CRE的构建如Gu等描述(Gu，H.，等Cell73(1993)1155-1164)。它包含与启动子/增强子一起的CRE编码部分及来自pMClNeopA的pA区。对于注释的质粒图^瞽见图3。为了转染，使用GenePulserXCeIl电穿孔设备(Bio-RadLaboratoriesInc.,USA)按照生产商iJL明书用环形质粒DNA电穿孔实施例4的CHO-Kl(PuDL)细胞。混合两次转染产物并在37.5mlProCH04完全培养基中重悬浮，密度为4xl05细胞/ml。实施例6细胞系CHO-K1ErbB2V>E/IGF-I的选择在经流式细胞术的单个细胞沉积步骤之前，实施例5中的细胞在无选择剂的ProCH04完全培养基中培养7代(24天)。为了该选择，使用FACSAria细胞分选仪(BDBiosciences)来将单细胞沉积到二十块96孔多孔板(U-shape，Cellstar，GreinerBio-OneGmbH,Frickenhausen，Germany)的每一孔中，所述孔含50pi细胞受限的ProCH04完全培养基和50新鲜ProCH04完全培养基。在单个细胞沉积步骤后三天，加入100pi新鲜ProCH04完全培养基。培养15天后将最先出现的127个亚克隆扩大至24孔多孔板中。为了进一步的克隆筛选，使用前文描述的确定接种策略(实施例3)。9天后使用CASYCellCounter-System鉴定具有最高细胞密度的三十一个细胞克隆。在125mlProCH04完全培养基中的补料分批悬浮培养中生长后，根据其生长特征来选择克隆CHO-K1ErbB2V>E/IGF-I。克隆CHO-K1ErbB2V>E/IGF-I在2007年6月13日作为CHO-K1ErbB2V>E/IGF-I保藏在DSMZ，保藏号为DSMACC2851。此外，克隆CHO-K1ErbB2V>E/IGF-I的特征在于对选择标记噤呤霉素(5jug/ml)敏感，通过RT-PCR分析验证CHO-KlErbB2V〉E/IGF-I细胞中pac-mRNA转录物的缺失确证了这一点。细胞增殖试验4吏用如上文描述的WST-I比色测定来间接测定功能性核酸puro-loxP的成功去除。因此各亚克隆的细胞分别在不含或含有5|iig/ml嘌呤霉素的ProCH04完全培养基中重悬浮。各亚克隆的两种细胞悬浮液以3xl0"细胞/100pl的浓度一式三份接种在五块96孔多孔板中。在五天的时期内，每天向含5lug/inl或不含嘌呤霉素的一个一式三份组中加入10plWST-I细胞增殖试剂/孔。细胞在37。C/5%C02中温育2小时并使用Tecan读数器(Spectrafluorphis)以620nm的参考波长在450nm处测定吸光度。含嘌呤霉素的ProCH04完全培养基与不含嘌呤霉素的培养基中细胞增殖抑制的比较显示31个检测的亚克隆中有17个是噪呤霉素敏感的。用RT-PCR检测亚克隆中的嘌呤霉素N乙酰基转移酶mRNA分子为了检测所选亚克隆中的噤呤霉素N乙酰基转移酶mRNA,使用LightCyclerInstrument(RocheDiagnosticsGmbH,Germany)进行杂交探针RT-PCR试验。RNA分离4吏用RNeasymini试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)从在6孑L多孑L板中生长的细胞中分离总RNA。按照生产商的方案进行提取。随后使用TURBODNA-freeKit(AmbionInc.,Austin,TX，USA)按照生产商的方案去除痕量的污染DNA。通过在UVIKON9M分光光度计(KontronInstruments,Italy)中260nm及280nm处测定吸光度来测定RNA样品的量及RNA的纯度。使用实时RT-PCR用于检测pac-mRNA的杂交探针测定在LightCycler仪器上使用一步RT-PCRLightCyclerRNAHybprobe试剂盒(RocheDiagnosticsGmbH，Germany)按照生产商方案将各细胞克隆中分离的总RNA反转录并随后扩增。使用"二次导数最大值方法"来测定各样品的交叉点(Cp)。所用引物对为pacF5-AGCTGCAAGAACTCTTCCTCAC-3'(SEQIDNO:5)和pacR5TCAGGCACCGGGCTT-3'(SEQIDNO:6)，扩增pac-mRNA的45726bp片段。设计Hybprobe探针并在TIBMOLBIOL(Berlin,Germany)标记荧光素或LightCyclerRed640。所用的Hybprobes组为在3，末端用荧光素标记的pacFL:CCCGCCTTCCTGGAGACCTCC-FL(SEQIDNO:7)和在5，末端用LCRed640染料标记的pacLC:640-CGCCCCGCAACCTCCCCT-p(SEQIDNO:8)。用磷酸封闭pacLC寡核苷酸探针的游离3'羟基。为确保正确的产物扩增，在PCR之后用2%(w/w)琼脂糖凝胶电泳分离所有样品。反应混合物含RNAMasterHybprobe混合物、500nM(每种)的正向和反向引物(pacF和pacR)、200nM的每种探针(pacFL和pacLC)、3.25mMMn(OAc)2和100纳克总RNA的20pi总体积。RT-PCR条件如下RT在61。C，20分钟和95。C，2分钟，PCR在95。C,4秒、55。C,15秒和72。C，20秒进行45个循环。实施例7ErbB2v—E/IGF-IR蛋白质表达的检测蛋白质提取和免疫印迹使用含CompleteMiniProteaseInhibitor混合物(RocheDiagnosticsGmbH，Germany)的200jtilRIPA裂解和提取緩冲液(Pierce,Rockford，IL，USA)从实施例6中鉴定的在6孔多孔板上生长的细胞中获得总细胞裂解产物。通过离心去除不可溶碎片后，使用MicroBCAProteinAssayKit(PierceInc.,USA)按照生产商方案对蛋白质浓度进行定量。将10jig总细胞裂解产物与含十二烷基硫酸锂(LDS)的样品緩沖液和50mMDTT混合。将样品煮沸10分钟并随后在还原性条件下10%(w/w)NuPAGEBis画TRIS凝胶(InvitrogenInc.,USA)上进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。通过半干方法将印迹转移至硝酸纤维素膜上。在含5%(v/v)脱脂奶粉的TBS緩沖液(TRIS-BufferedSaline)中稀释抗血清。在含0.1%Tween20(v/v)的TBS緩冲液中进行以下洗涤步骤。使用缀合辣根过氧化物酶的绵羊抗兔抗血清(按1:5000稀释，RocheDiagnosticsGmbH，德国)利用增强化学发光底物(LUMI-LightplusWesternBlottingsubstrate,RocheDiagnosticsGmbH,德国)来检测各自的一级抗血清。使用以下一级抗体针对人GF-I受体p链的兔多克隆抗体(按1:1000稀释，sc-713;SantaCruzBiotechnologyInc.,美国)。FACS分析通过流式细胞仪来检测嵌合受体的表面表达。lxl(^个细胞与rhuMab2C4(Omnitarg,F.Hoffmann-LaRocheAG,BasleSwitzerland)或作为同种型对照的人IgG(1-4506，Sigma-AldrichGmbH，Germany)温育。用缀合藻红蛋白的山羊抗人F(ab')2(CaltagLaboratories,InvitrogenInc.,美国)对细胞进4亍染色并用FACScan(BectonDickinson,MountainView,CA，美国)来测定表达。实施例8使用CHO-K1ErbB2V>E/IGF-I细胞重组产生免疫球蛋白缀合物质粒p4928对于抗CCR5的抗体缀合物的表达和产生，将类似例如在WO2008/019817中报道的那些轻链和重链表达盒以顺时针方向置于单个表达载体中。表达栽体包括用于筛选的新霉素抗性基因。除重链和轻链表达盒之外，所述表达载体还包含以下元件-包含新霉素选择标记(neo)的核酸，-用于质粒在大肠杆菌中复制和生长的pUC复制起点，-P-内酰胺酶基因。通过稳定转染在ProCH04完全培养基中培养的CHO-K1ErbB2V>E/IGF-I细胞来产生重组免疫球蛋白缀合物。在转染前使用氨节青霉素选择标记(基因)内的单Pvul限制性位点将质粒p4928线性化。使用带有2mm凹口的电穿孔杯的GenePulserXCellTM(Bio-RadLaboratories)电穿孑L设备用线性化DNA电穿孑LCHO-K1ErbB2V>E/IGF-I细胞。所用电穿孔脉沖为160V/15ms，应用于总体积200jal的Dulbecco'sPBS中的20照质粒DNA和7.5><106细胞。将两个转染方法合并，重悬浮于37.5mlProCH04完全培养基中，密度为4x10s细胞/ml,并转移到CellStarT75Flask中。24小时后向培养基中加入700照/mlG418硫酸盐(Calbiochem，LaJoIla，CA，USA)。4天后，将细胞转移至摇瓶形式中并在通过流式细胞术进行单个细胞沉积步骤之前在含700fig/mlG418硫酸盐的ProCH04完全选择培养基中培养6代。为了该选择，使用FACSAria细胞分选仪来将单个细胞沉积到二十块96孔多孔板的每孔中，所述孔含50pl细胞受限的ProCH04完全培养基和50新鲜ProCH04完全培养基。在单个细胞沉积步骤两天后，加入100pl含两倍浓度1400pg/mlG418硫酸盐的新鲜ProCH04完全选择培养基。培养14天后，用体浓度。为了选择高产抗体产生细胞系，在24孔形式中扩繁后使用一步抗人IgGELISA再次检测IgGl抗体浓度。最佳克隆篩选实验得到细胞克隆CHO-K1ErbB2V>E/IGF-I4928-3H6,所述克隆经分析A蛋白HPLC分析具有>100pg/ml的生产力。细胞培养条件如下摇动分批培养，其具有总体积30ml的不含选择剂的ProCH04完全培养基和3xl05细胞/ml的起始接种细胞密度。在第10天收集含免疫球蛋白缀合物的细胞培养上清液并在4°C储存24小时直至定量。在还原条件下通过SDS-PAGE验证轻链和重链的完整性和分子量。例如在Meissner，P"等，Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203中给出了关于人免疫球蛋白重组表达的一般信息。用抗人IgGELISA对含表达重链的多肽进行定量通过一步夹层ELISA来测定细胞培养上清液中的免疫球蛋白浓度，所述ELISA使用作为捕获试剂并用于检测过氧化物酶缀合的抗人IgGF(ab，)2抗体片段的生物素化抗人IgGF(ab，)2片段。通过室温(RT)下振荡温育一小时，用稀释緩沖液(稀释緩沖液含0.5%(w/v)牛血清白蛋白的PBS緩冲液)中的2ng/ml生物素化山羊多克隆抗人IgGF(ab，)2抗体片段((F(ab，)2<h-Fcy>Bi;Dianova，Germany,CodeNo.109-066-098)捕获抗体(0.1ml/孔))包被链霉抗生物素蛋白包被的96孔板(RocheDiagnosticsGmbH,Germany)。随后，用多于0.3ml的洗涤緩沖液(洗涤緩冲液含1%(w/v)Tween20的PBS)洗涤平板三次。将含IgG免疫球蛋白缀合物的细胞培养上清液(样品)在稀释緩冲液中连续稀释(两倍)至浓度为2-10ng/ml，将其加入板中，并在RT下振荡温育一小时。使用稀释緩冲液中的纯化单克隆标准抗体(0-40ng/ml)来生成IgG蛋白质标准曲线。用0.3ml/孔洗涤緩沖液洗涤平板三次后，用山羊多克隆抗人F(ab，)2特异IgG的缀合过氧化物酶的F(ab，)2片段(F(ab，)2<h-Fcy>POD;Dianova，CodeNo.109-036-098)检测与人Fcgamma结合的复合体。用0，3ml/孔洗涤緩沖液洗涤平板三次后，将平板用ABTS(2，2，-连氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)过氧化物酶底物溶液(RocheMolecularBiochemicals，CodeNo.1684302，RocheDiagnosticsGmbH,Germany)显色。10分钟后在TecanSpectrafluorplus平板读数器(TecanDeutschlandGmbH，Germany)上4十对试剂空白(温育緩冲液+ABTS溶液)在405nm和490nm处测定吸光度。对于背景校正，按照公式I从405nm处的吸光度中减去4卯nm处的吸光度。所有样品至少以一式两份检测，并且将两次或三次的吸光度测定值进行平均。根据标准曲线计算样品中的IgG含量。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>通过与蛋白A琼脂糖的亲和结合对免疫球蛋白多肽进行定量用ProCH04完全培养基按l:3稀释2ml澄清的培养上清液。使用来自GEHealthcare的AktaExplorer900层析系统的分析A蛋白层析进行蛋白质浓度的定量。用2xPBS平衡填充有250piA蛋白SepharoseTMCL-4B(GEHealthcare,Munich,Germany)的柱子，用2xPBS和100mM磷酸盐緩冲液(pH5.0)洗涤并用100mM砩酸盐緩沖液(pH2.7)洗脱。使用0.5ml/分钟的流速及280iim处的UV检测。将在ProCH04完全培养基中稀释的纯化单克隆标准抗体用于产生蛋白质标准曲线。SDSPAGE/考马斯蓝染色用十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离表达和分泌的多肽并用考马斯蓝试剂进行染色。将含分泌多肽的培养液离心以去除细胞和细胞碎片。将澄清上清液的等分试样与1/4体积(v/v)的NuPAGE-LDS-Sample-Puffer(InvitrogenCorp.，USA)和1/10体积(v/v)的NuPAGE⑧画10xReducingAgent(InvitrogenCorp.,USA)混合。样品在70。C温育10分钟并随后用SDS-PAGE来分离蛋白质。按照生产商说明书4吏用NuPAGEPre-Cast凝胶系统。具体而言，10%NuPAGENovexBis-TRISPre-Cast凝胶(pH6.4)和NuPAGEMOPS电泳緩沖液与NuPAGEAntioxidant组合使用。在120V分离1小时后，将凝胶用考马斯蓝溶液(30。/。(v/v)甲醇；10%(v/v)乙酸；0.2%(w/v)考马斯亮蓝R-250Dye,Pierce,Rockford，IL，USA)轻摇染色1小时并在水中脱色过夜。实施例9培养中的细胞密度在125摇瓶添加有1xHT补充物、6mM谷氨酰胺和4照/ml嘌呤霉素的ProCH04培养基中以160rpm培养在实施例4中获得的细胞克隆CHO-K1-5519-1B6-18B3和CHO-Kl-5519-lB6-17C5。作为适应无血清悬浮培养的参照CHO-Kl，也在相同条件下培养，除了不使用噤呤霉素但加入50ng/mlIGF-1。在总体积62.5ml中以约2至3xl05细胞/ml的量接种培养物。对于细胞密度分析，每天从培养物中取0.5至1.0ml样品。通过将200细胞悬浮液与20pl胰蛋白酶温育30分钟来溶解细胞团块。对于测定，将50或100解离后的细胞悬浮液在10mlCASYton緩冲液(ScharfeSystemsGmbH,Germany)中稀释并且使用CellCounter和Analyzer-SystemCASY(ScharfeSystemGmbH,Germany)通过电脉沖面积分析一式三份测定其400pi中的总可见细胞浓度。结果示于表2和图4中。表2:以1(^细胞/ml计的细胞密度。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>权利要求1.CHO细胞，其特征在于所述CHO细胞表达组成型活性促有丝分裂受体。2.权利要求1的CHO细胞，其特征在于所述CHO细胞是CHO-K1细胞。3.权利要求1或2任何一项的CHO细胞，其特征在于所迷CHO细胞表达嵌合ErbB2/IGF-I受体。4.权利要求1或2任何一项的CHO细胞，其特征在于所述CHO细胞表达嵌合ErbB2v—E/IGF-I受体。5.权利要求4的CHO细胞，其特征在于所述细胞包含组成型活性促有丝分裂受体，其为包含具有V659E突变的SEQIDNO:09的氨基酸1-682和SEQIDNO:10的氨基酸929-1337的融合多肽。6.外又利要求4的CHO细胞，其特征在于所述细胞包含编码SEQIDNO:03的氨基酸序列的核酸。7.前述权利要求任何一项的CHO细胞，其特征在于所述细胞在悬浮液中生长。8.前述权利要求任何一项的CHO细胞，其特征在于所述细胞适应于在无血清培养基中生长。9.前述权利要求任何一项的CHO细胞，其特征在于所述CHO细胞在培养中生长至至少5xl(^个细胞/ml的最大细胞密度。10.权利要求9的CHO细胞，其特征在于所述CHO细胞在培养中生长至至少8xl(^个细胞/ml的最大细胞密度。11.权利要求9到10任何一项的CHO细胞，其特征在于在60到70ml的体积中从2xl()5到3xl()S个细胞/ml的细胞密度开始8到12代内达到所述最大细胞密度。12.权利要求9到10任何一项的CHO细胞，其特征在于所述CHO细胞的所述培养是补料分批培养。13.PTJ逸4入々'J^SC,4^'I工'I"J,的Llav^-w"Ci，穴^4^仁J厂^l±1U5W/ICi达到的细胞密度超过至少5代，不低于如补料分批培养6代后细胞密度的95%。14.外又利要求13的CHO细胞，其特征在于所述CHO细胞达到的细胞密度超过至少6代，不低于如补料分批培养6代后细胞密度的75%。15.4又利要求13到14任何一项的CHO细胞，其特征在于从60到70ml体积中2xl()S到3xl()S个细胞/ml的细胞密度开始达到6代培养后的所述细胞密度。16.细胞系DSMACC2851。17.用于获得具有组成型活性促有丝分裂受体的CHO细胞的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤a)用第一种核酸转染CHO细胞，所述第一种核酸包含i)侧翼为两个loxP位点的编码选择标记的表达盒，ii)用于表达组成型活性促有丝分裂受体的表达盒，b)选择转染有所述第一种核酸的CHO细胞，c)用包含CRE重组酶表达盒的第二种核酸转染步骤b)中选择的所述CHO细胞，d)选择转染有所述第二种核酸的CHO细胞作为具有组成型活性促有丝分裂受体的CHO细胞。18.权利要求17的方法，其特征在于步骤b)的所述转染的CHO细胞具有组成型活性促有丝分裂受体。19.权利要求18的方法，其特征在于所述组成型活性促有丝分裂受体具有SEQIDNO:03的氨基酸序列。20.权利要求17的方法，其特征在于在步骤d)中选择所述转染的CHO细胞的第一种核酸中包含的选择标记的缺失。21.权利要求17的方法，其特征在于步骤d)中选择的所述转染的CHO细胞在根据第一种核酸的选择标记的选择剂存在下不生长。22.权利要求17的方法，其特征在于第一种核酸包含用于表达运铁蛋白的表达盒。23.权利要求1到4任何一项的CHO细胞，其特征在于所述CHO细胞表达异源多肽。24.用于产生异源多肽的方法，其特征在于其包括以下步骤a)提供权利要求1的CHO细胞，b)用核酸转染所述CHO细胞，所述核酸包含i)包含编码所述异源多肽的核酸的第一个表达盒，H)编码选择标记的第二个表达盒，c)在适合于表达所述异源多肽的条件下培养所述转染的CHO细胞，d)从所述培养基或细胞中回收所述表达的异源多肽。25.权利要求24的方法，其特征在于用于转染CHO细胞的核酸包含编码异源多肽的表达盒。26.权利要求25的方法，其特载在于所述异源多肽选自免疫球蛋白、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白片度，或免疫球蛋白缀合物。全文摘要本发明包含表达组成型活性促有丝分裂受体的CHO细胞，获得这种CHO细胞的方法，和使用本发明CHO细胞表达异源多肽的方法。文档编号C12N5/10GK101688181SQ200880021935公开日2010年3月31日申请日期2008年6月25日优先权日2007年6月29日发明者E·科佩茨基,R·德兰格申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司