抗毒素不稳定化技术的制作方法

专利名称：抗毒素不稳定化技术的制作方法
抗毒素不稳定化技术 要求优先权
本申请要求2007年7月12号提交的美国临时申请号60/959, 399 的优先权，该临时申请所公开的内容通过引用将其全部并入本文。
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基酸序列的序列表。所附序列表没出超出在提交的国际申请中公开的 内容。计算机可读形式中记录的信息与与其相关的书面形式的序列表 相同。
背景技术：
细菌通常配置有所谓毒素-抗毒素(TA)或"自杀"基因系统，其 被认为在生长调节、细胞死亡和应激条件下的休眠中发挥重要作用， 在正常的生长条件下，毒素与从相同操纵子编码的其同源抗毒素形成 稳定的复合物(TA "复合物，，)，从而毒素丧失作用于其细胞靶标的 能力。然而，在应激条件下，不稳定的抗毒素随着胞质内游离毒素的 伴随释放而被迅速降解，所述游离毒素随后将其毒性作用施加在特定 的细胞乾标上。
存在于细菌基因组上的毒素或自杀基因的数量变化很大；大肠杆 菌(^sc力eWc力/a co//) —般包含6个独立的TA操纵子，每一个编码 一对抗毒素及其同源毒素，而结核分枝杆菌01//co6acter/咖 rw6ercf7/oir/;y)包含大约40个这样的操纵子。至今已经测序的所有治 病细菌基因组实际上包含1个或更多个TA操纵子，除了与宿主细胞专 性生长的细菌例如衣原体和支原体以外。在大肠杆菌的6个TA操纵子 中，3个已经被很好的表征；ReIE是一个核糖体相关因子，其刺激核糖体内切核糖核酸酶活性，MazF和ChpBK以序列特异性内切核糖核酸 酶(所谓mRNA interferase (MIase))发挥作用。已经证明MazF当被 诱导时，在ACA序列处切割细胞mRNA从而有效抑制细胞蛋白质合成及 因此的细胞生长。MazF与其抗毒素MazE形成稳定的复合物，并且已 经测定了 MazF-MazE复合物的X射线结构。因为TA复合物对细胞没有 毒性，所以其在大肠杆菌中得以很好的表达并很容易以非常高的产率 纯化。最近，ReIE-ReIB和YoeB-YefM复合物的X射线结构也已经被 测定，揭示了毒素和抗毒素如何在TA复合物中相互作用。
大多数细菌在其基因组内包含一定数量的毒素或"自杀"基因。 重要的是，从这些基因产生的毒素既不旨在杀死其定居处的其他细菌， 也不杀死感染过程中的动物细胞。相反，它们在细胞内产生并对本身 有毒性。在该新领域中的最新进展已经提供了关于这些毒素在细菌生 理学、多重抗药性的持续、致病性、生物膜形成和进化中作用的许多 迷人的观点。现在很明显的是，对这些毒素的研究在感染性疾病和医 疗科学中有非常重要的意义。因为这些毒素中的大多数与操纵子中的 其同源抗毒素共转录(因此称为毒素-抗毒素或TA操纵子)，并且它 们在正常生长条件下的细胞内形成稳定的复合物，这些毒素的毒性作 用一般不产生作用(Bayles， 2003; Engelberg—Kulka et al. ， 2004; Hayes, 2003; Rice and Baytes, 2003 )。然而，因为抗毒素的稳定 性比其同源毒素的稳定性低的多，所以引起细胞损害或生长抑制的任 何应激条件都影响细胞中毒素和抗毒素之间的平衡，导致细胞中毒素 的释放。尽管存在很大的争议，但最合理的是认为从TA操纵子编码的 这些毒素取决于应激条件的性质而以2种不同方式发挥功能。1种是 通过抑制特定的细胞功能例如DNA复制和蛋白质合成来调节生长速 率。在广泛的应激条件下，毒素的量超过抗毒素，细胞生长可能完全 被停滞。TA毒素在生长调节中的这种作用似乎是其主要功能。然而， 其第2种作用是自杀性的，即杀死其自己的宿主细胞。在特定的条 下，TA毒素可以发挥作用以消除被高度损害的细胞(例如DNA损害或 噬菌体感染)以维持健康的群落。TA操纵子也经常出现在质粒中，其在杀死细胞分裂后丟失质粒的细胞方面发挥作用；是一种称为分离后 杀死(post-segregational killing )。因此，TA毒素主要是抑制细 菌的，而不是杀细菌的(Gerdes et al.， 2005 )，但在特定条件下， 细胞可以达到无法恢复的地步而导致细胞死亡(Amitai et al.，
2004 )。最近，Engelberg-Kulka认为大肠杆菌毒素MazF不是细胞死 亡的执行者，而是激活下游系统的调控者(Engelberg-Kulka et al.，
2005 )。
因为已知毒素的过表达对细胞生长是高毒性的，所以共表达其抗 毒素对于毒素的纯化是重要的。用于从其TA复合物纯化毒素蛋白质的 常规方案使用His标签亲和柱层析，其后通过变性和复性步骤以去除 抗毒素；这些步骤是十分冗长的。
因此，需要纯化毒素蛋白质的有效方法，在这种方法种不需要这 样的变性和复性步骤。
发明概述
本发明特定实施方式的目的是提供用于从其TA复合物纯化毒素 蛋白质的方法，该方法避免了之前常规方法中的变性和复性步骤。
在特定的实施方式中，本发明涉及用于从毒素-抗毒素复合物中的 抗毒素蛋白质分离毒素蛋白质的方法，该方法包括将不稳定化序列插 入所述毒素-抗毒素复合物中；和将所述毒素-抗毒素复合物暴露于一 定条件以刺激毒素和抗毒素共表达，其中所述不稳定化序列引起在共 表达期间抗毒素从毒素分离。
在其他实施方式中，本发明涉及用于从毒素-抗毒素复合物中的抗 毒素蛋白质分离毒素蛋白质的方法，该方法包括将不稳定化序列插入 所述毒素-抗毒素复合物的抗毒素蛋白质中；和将所述毒素-抗毒素复 合物暴露于一定条件以刺激毒素和抗毒素共表达，其中所述不稳定化 序列引起在共表达期间抗毒素从毒素分离。
在其他实施方式中，本发明涉及用于纯化毒素-抗毒素复合物中的 毒素蛋白质的方法，该方法包括将不稳定化序列插入毒素-抗毒素复合物的抗毒素蛋白质中；将所述毒素-抗毒素复合物暴露于一定条件以刺 激毒素和抗毒素共表达，其中所述不稳定化序列引起在共表达期间抗 毒素从毒素分离；和将所述分离的抗毒素与合适的蛋白酶接触，其中
所述蛋白酶消化所述分离的抗毒素，从而纯化所述毒素。
在其他实施方式中，本发明涉及对毒素-抗毒素复合物不稳定化的
方法，该方法包括将不稳定化序列插入所述毒素-抗毒素复合物中。 在其他实施方式中，本发明涉及毒素-抗毒素共表达系统，该系统
包含编码毒素-抗毒素复合物的遗传材料，其中所述毒素-抗毒素复合
物包含凝血酶识别序列(SEQ ID NO. 3)。
在优选的实施方式中，所述不稳定化序列是能够被因子Xa、 TEV 蛋白酶或凝血酶切割的序列。在特定的优选实施方式中，所述不稳定 化序列是SEQ ID NO. 3所示的凝血酶识别序列。
附图简述


图1描绘了将凝血酶识别序列引入MazE抗毒素中。 图2描绘了通过凝血酶处理将残留MazE抗毒素从纯化的MazF样 品中去除。
图3描绘了本发明一个实施方式的图解模型。 图4描绘了纯化的MazF的内切核糖核酸酶活性。
发明详述
如上文所讨论的，包括人病原体在内的几乎所有细菌都包含毒素， 毒素在细胞中与其同源的抗毒素形成稳定的复合物(TA复合物)。以 这种模式，在正常生长条件下，毒素在细胞中不能实施其毒性作用。 因为已知毒素的过表达对细胞生长是高毒性的，所以共表达其抗毒素 对于毒素的纯化是重要的。本发明的发明人已经开发了用于纯化毒素 蛋白质的高效并简单的方法，其中避免了变性和复性步骤。
在特定的实施方式中，按照如下方式纯化毒素蛋白质通过将新 的氨基酸序列("不稳定化序列")引入所述抗毒素蛋白质中以对细胞中的TA复合物内的所述抗毒素不稳定化。所述不稳定化序列可以是 已知的序列，其可以被特定的蛋白酶例如因子Xa、 TEV蛋白酶和凝血 酶切割。因子Xa在氨基酸识别序列IEGR ( SEQ ID NO. 1 )处切割；TEV 蛋白酶在氨基酸识别序列ENLYFQG (SEQ ID NO. 2 )处切割；而凝血酶 在氨基酸识别序列LVPRGS (SEQ ID NO. 3)处切割.
如果抗毒素蛋白质的三维结构是已知的，可以将所述不稳定化序 列在例如环区域处插入。引入外源肽的结果是抗毒素将不稳定化， 从而在所述毒素和抗毒素在细胞中共表达期间将所述抗毒素从TA复 合物分离。因为已知许多抗毒素被固有的蛋白酶例如Lon和ClpAP所 消化，所以分离的抗毒素将很容易被这种蛋白酶在体内去除。通过这 种方式，能够纯化毒素蛋白质，而不去除抗毒素。
在特定的实施方式中，如果使用一步His标签层析将残留的抗毒 素与毒素共洗脱，那么可以使用特定的蛋白酶处理洗脱的毒素样品， 所述蛋白酶识别被引入到抗毒素中的特定序列。
本发明的方法可以广泛应用于来自任何细菌的任何TA复合物系 统，而允许大规模的毒素分离。所得到的纯化毒素可以不仅用于基础 科学，还可以作为治疗工具用于治疗人的癌症和其他疾病，例如用作 非常规抗生素。它们也可以用于多种工业目的。
实施例
使用MazE-MazF系统作为模型如下所述对本发明的方法进行示例 说明。
构建IPTG可诱导鹏Wiaz尸共表达系统，其中将凝血酶识别序列 LVPRGS (SEQ ID NO. 3 )引入P链S3和S4之间MazE上的环区域中， 代替位于位置38-"处的VDGK氨基酸序列(SEQ ID NO. 4 )(图1)。 将具有该质粒的细胞在存在IPTG下进行温育以过表达MazE和MazF 两者。将用His标签层析纯化的MazF样品在不存在生物素化的凝血酶 (Novagen)(泳道1 )、存在0. 01单位生物素化的凝血酶(泳道2 )、 0. 02单位生物素化的凝血酶(泳道3 ) 、 0. 04单位生物素化的凝血酶(泳道4)和0. 08单位生物素化的凝血酶(泳道5)情况下，在室温 温育过夜(参见图2)。将样品进行15% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
("SDS-PAGE"),其后进行考马斯亮蓝染色。在后续染色的SDS-PAGE 凝胶上不能检测到MazE。据假设抗毒素MazE可以在体内被内源蛋白 酶所消化。使用His标签层析，及其后对100mM磷酸钠(pH7.6)-300 mM NaCl-20。/。甘油-5 mM P巯基乙醇进行透析来纯化His标签的MazF 蛋白质。如图2所示，得到了高纯度的MazF蛋白质。尽管在SDS-PAGE 上的MazF条带下只检测到非常微弱的MazE条带(泳道1)，还是通 过凝血酶处理从纯化的MazF样品中成功去除了残留的MazE蛋白质(泳 道2-5)。通过消化从大肠杆菌细胞提取的总RNA证实了纯化的MazF 的内切核糖核酸酶活性。将用热苯方法从大肠杆菌细胞提取的总RNA 在不存在纯化的MazF蛋白质(泳道1)、存在0. 375 jig纯化的MazF 蛋白质(泳道2) 、 0.75 ng纯化的MazF蛋白质(泳道3 ) 、 1. 5 纯化的MazF蛋白质(泳道4 ) 、 3 ng纯化的MazF蛋白质(泳道5 ) 和6 jig纯化的MazF蛋白质(泳道6)情况下，在37。C温育10分钟
(参见图4)。将样品进行3. 5%丙烯酰胺凝胶电泳，其后进行溴化乙 锭染色。本发明该实施方式的图解模型显示在图3中。
权利要求
1.用于从毒素-抗毒素复合物中的抗毒素蛋白质分离毒素蛋白质的方法，包括a.将不稳定化序列插入所述毒素-抗毒素复合物中；和b.将所述毒素-抗毒素复合物暴露于一定条件以刺激毒素和抗毒素共表达，其中所述不稳定化序列引起在共表达期间所述抗毒素从所述毒素分离。
2. 权利要求1的方法，其中将所述不稳定化序列插入所述毒素-抗毒素复合物的抗毒素蛋白质中。
3. 权利要求1的方法，其中所述不稳定化序列是能够被因子Xa、 TEV蛋白酶或凝血酶切割的序列。
4. 权利要求1的方法，其中所述不稳定化序列是SEQ ID NO. 1所 示的因子Xa识别序列。
5. 权利要求1的方法，其中所述不稳定化序列是SEQ ID NO. 2所 示的TEV蛋白酶识别序列。
6. 权利要求1的方法，其中所述不稳定化序列是SEQ ID NO. 3所 示的凝血酶识别序列。
7. 权利要求2的方法，其中将所述不稳定化序列插入所述抗毒素 蛋白质的环区域中。
8. 用于纯化毒素-抗毒素复合物中的毒素蛋白质的方法，包括a.将不稳定化序列插入所述毒素-抗毒素复合物的抗毒素蛋白质中；b. 将所述毒素-抗毒素复合物暴露于一定条件以刺激毒素和抗毒素共表达，其中所述不稳定化序列引起在共表达期间所述抗毒素从所述毒素分离；和c. 将分离的抗毒素与合适的蛋白酶接触，其中所述蛋白酶消化所 述分离的抗毒素，从而纯化所述毒素。
9. 权利要求8的方法，其中所述不稳定化序列是能够被因子Xa、 TEV或凝血酶切割的序列。
10. 权利要求8的方法，其中所述不稳定化序列是SEQ ID NO. 1 所示的因子Xa识别序列。
11. 权利要求8的方法，其中所述不稳定化序列是SEQ ID NO. 2 所示的TEV蛋白酶识别序列。
12. 权利要求8的方法，其中所述不稳定化序列是SEQ ID NO. 3 所示的凝血酶识别序列。
13. 权利要求8的方法，其中将所述不稳定化序列插入所述抗毒素 蛋白质的环区域中。
14. 权利要求8的方法，其中在体内将所述蛋白酶与所述抗毒素接触。
15. 权利要求8的方法，其中在使用一步His标签层析与所述毒素 共洗脱后，将所述蛋白酶与所述抗毒素接触。
16. 对毒素-抗毒素复合物不稳定化的方法，包括将不稳定化序列插入所述毒素-抗毒素复合物中。
17. 权利要求16的方法，其中将所述不稳定化序列插入所述毒素-抗毒素复合物的所述抗毒素蛋白质中。
18. 权利要求16的方法，其中所述不稳定化序列是SEQ ID NO. 1 所示的因子Xa识别序列。
19. 权利要求16的方法，其中所述不稳定化序列是SEQ ID N0.2 所示的TEV蛋白酶识别序列。
20. 权利要求16的方法，其中所述不稳定化序列是SEQ ID NO. 3 所示的凝血酶识别序列。
21. 毒素-抗毒素共表达系统，包含编码毒素-抗毒素复合物的遗 传材料，其中所述毒素-抗毒素复合物包含SEQ ID NO. 3。
22. 权利要求21的毒素-抗毒素共表达系统，其中所述毒素-抗毒 素复合物包含MazF和MazE。
23. 权利要求22的毒素-抗毒素共表达系铳，其中SEQ ID NO. 3 位于P链S3和S4之间MazE的环区域中。
24. 权利要求21的毒素-抗毒素共表达系统，其中所述遗传材料是 质粒。
25. 用于从毒素-抗毒素复合物中的抗毒素蛋白质分离毒素蛋白质 的方法，包4舌a.将不稳定化序列插入所述毒素-抗毒素复合物的所述抗毒素蛋白质中；和b.将所述毒素-抗毒素复合物暴露于一定条件以刺激毒素和抗毒 素共表达，其中所述不稳定化序列引起在共表达期间所述抗毒素从所 述毒素分离。
全文摘要
本发明公开了用于纯化毒素蛋白质的方法，该方法避免了变性和复性步骤。
文档编号C12Q1/68GK101688253SQ200880024400
公开日2010年3月31日 申请日期2008年7月14日 优先权日2007年7月12日
发明者M·伊诺叶, 井上晃一 申请人:新泽西内科与牙科大学