Ace2多肽的制作方法

专利名称：：Ace2多肽的制作方法ACE2多肽本发明涉及重组蛋白质生产的领域。血管紧张素转化酶(ACE2)是肾素-血管紧张素系统的关键酶。它作为羧肽酶锚固于膜上，作为受体主要在肺细胞、肾细胞和心脏细胞以及内皮细胞上表达并裂解各种肽底物。知名的代表底物是血管紧张素-II(Angn)，其被裂解为血管紧张素l-7(Ang1-7);血管紧张素-I，其被裂解为血管紧张素l-9;同样地，还有即elin和缓激肽。AngII和Ang1-7是肾素_血管紧张素系统的拮抗剂。ACE2通过控制肽比例而决定性地负责血管厚度的调整以及内皮细胞的通透性并因此影响有机体的内环境稳定。ACE2的表达尤其受细胞因子调节并且在各种炎症中降低，这继而导致Angn(ACE2最重要的底物之一)的病理性增加。ACE2用于治疗急性肺病的两种形式ARDS或ALI，随这两种病在肺中出现下调的ACE2表达。对于该种治疗使用重组的可溶性人ACE2，其被全身性给予从而在最短的时间内供整个有机体使用，以便降低增加的AngII浓度并与此同时产生Ang1_7。这补偿了增加的AngII浓度的负性作用。为此，很希望拥有一种产物，其具有合适的药学特征相应地，其具有在有机体内良好的分布、药学上有意义的半衰期以及具有低免疫原性的适宜的物质。特别是该产物必须是有酶活性的、可良好溶解的以及在溶液中稳定的，并且可以以高纯度可重复地和经济地进行制备。Tipnis等人(JBiolChem.275(43)(2000):33238-43)描述了ACE2(在此文中还被称为ACEH)的分离和其cDNA的分离。通过在CH0细胞中进行生产获得了具有120kDa摩尔质量的糖基化的蛋白质单体。去糖基化后该蛋白质具有85kDa的质量。Donoghue(CircRes.87(5)(2000):1-9)描述了可溶性ACE2在CH0细胞中的表达，它没有完全被糖基化，并且表征为约90kDa的摩尔质量。此外，该文献还涉及各种ACE2序列的序列对比和抗ACE2抗体。W02004/023270A2涉及ACE2单体在昆虫细胞Sf9中表达后ACE2的结晶。在此情况下，该蛋白质的摩尔质量在质谱分析后给出89.6kDa。有效的酶替代疗法的治疗型转变需要这样的制备方法，其经济地和可重复地制备高纯度的药学上有效的产物。ACE2的可溶的、细胞外截段包含7个N-糖基化位点。非糖基化的ACE2是不溶的，倾向于聚集，是增强的免疫原并且具有縮短的半衰期。此外，它具有小的流体力学直径，其主要地不会负面地影响纯化。因此，本发明的目的是提供具有好的体内半衰期的高活性ACE2。该目的通过权利要求的具体内容来实现。本发明涉及重组ACE2多肽，其以二聚体存在。优选的是糖基化的重组ACE2多肽，其中ACE2多肽单体的糖基基团具有总计至少10、11、12、13、14、15或至少16个唾液酸残基，优选14个唾液酸残基，并且其中ACE2多肽以二聚体存在。同样地，本发明包含具有本文所述的糖基化的、摩尔加权平均的和进一步详细说明的ACE2单体。优选所述二聚体是同二聚体，其单体单位特别地具有相同的序列和糖基化。通常，所述单体单位是非共价结合的二聚体。单体可以通过变性步骤毫无困难地从二聚体获得。优选所有本文所述的糖基化不但涉及二聚体而且也涉及单体，包括二聚体复合物的一个或两个单体。特别优选所述二聚体包含两个锌离子。6"唾液酸残基"，特别地理解为N-乙酰神经氨酸类型(Neu5Ac)的残基，特别是在N-或O-糖基化。原则上，对于其半衰期从而其效应而言，治疗剂的稳定性是非常重要的标准。迄今为止，重组人ACE2仅鉴定为单体，并且在关于其功能、其晶体结构以及关于其与高特异性抑制剂相互作用的文献中也被描述为如此。因此，例如在参考Vickers等人(JBiolChem277(17)，2002:14838-14843)的情况下，Towler等人(JBiolChem279(17)，2004:17996-18007)描述了ACE2在昆虫细胞Sf9中的表达，其在作为最后纯化步骤的小心的大小排阻色谱法之后以单体获得。单体的摩尔质量为89.6kDa。商购可得的ACE2同样以单体形式存在(来自R&DSystems,编录号933-ZN,批号FIU035071)，其根据Tipnis等人(2000，同上)中的所述方法而制备，所不同的是，使用NSO代替CHO细胞作为表达系统。它被描述为单体，其不但在还原条件下而且在非还原条件下具有120kDa的摩尔重量。根据Donoghue等人(CircRes87，2000:el-e9)，ACE2单体在CHO细胞中表达，其分泌后显示90kDa的分子量。所有本文列出的文献和出版物通过弓|用而合并入本文。根据本发明，为了使根据本发明的治疗剂稳定，发展了一种方法，其仅导致稳定的ACE2二聚体，所述二聚体相比于ACE2单体不但具有生产技术上的而且具有药学上的优点。所述二聚体化带来下列的优点在生理溶液中更好的溶解度和生物利用率该二聚体显示高的溶解度和更长的体内半衰期和利用率。无聚集体形成该ACE2二聚体了形成稳定的复合物，而不会附加更多的ACE2分子以形成二聚体。减少的蛋白酶攻击因为单次蛋白质切割后，在此所有的可能性都表明C-末端部分在二聚体内部，该c-末端不被降解。增加的半衰期由于低免疫原性、更好的溶解度和降低的对蛋白水解的易感性，所述蛋白质的半衰期增加了。简单的蛋白质纯化ACE2二聚体的流体力学直径基于其结构和大于计算直径的突出的溶剂化外壳。因此，ACE2二聚体能够通过大小分离柱从来自蛋白质表达的常规杂质，例如血清白蛋白(67kDa)中出色地被分离。优选重组ACE2多肽在可能的N-糖基化位置的至少80%处被糖基化并且具有大于10%(总ACE2的质量％)或11%、12%、13%、14%，优选大于15%或16%、17%、18%、19%，特别地大于20%或21%、22%、23%、24%或25%的糖部分。发展了一种制备方法，其可重复地制备高纯度的且有酶活性的、高度复杂的糖基化ACE2。该产物表征为其高的糖部分(>20质量％)和复杂的、高度支化的、部分带负电荷的糖结构。这对产物的溶解度、生物利用率、酶活性以及药学性质产生积极作用。通过选择合适的表达构建体、合适的表达宿主、优化的筛选策略，通过针对细胞代谢经调整的培养基以及通过细致的伴随克隆分析和筛选，可以制备分泌所希望产物的细胞系。ACE2已经在昆虫细胞Sf9和小鼠细胞NS0中进行了表达。该物质主要在体外试验中使用。ACE2在CH0细胞中的瞬时表达也有结果。至今还没有产生具有方法适宜的生产率的细胞系。此外，还没有进行关于产物性质(特别是关于N-糖基化)的相应的克隆筛选。蛋白质的溶解度不仅由其氨基酸序列而且由其折叠以及由翻译后修饰所决定。主要是所负载的糖结构，其决定性地增加蛋白质的溶解度并影响其药学特征。因此，就EPO而言，可以表明，复杂的支化糖结构的存在积极影响这些蛋白质的半衰期。原则上，为了进行ACE2的重组表达，考虑各种表达系统，其中基于缺失的N-糖基化位点加工(Prozessierung)的原核生物宿主细胞不再进行测试。优选至少70%的糖基化的N-糖基化位点具有选自式1-8的相互独立的结构(式5)(式6)(式7)(式8)其中，GlcNAc图Fuc么M<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>优选所有可能的N-糖基化位点都被糖基化。优选至少80%，优选至少90%，特别地100%的糖基化的N-糖基化位点具有式1-8的结构。优选二聚体的ACE2单体单位具有至少90kDa，优选至少92kDa，尤其优选至少94kDa，特别是至少96kDa，特别优选至少98kDa，最优选至少100kDa、100.5kDa、101kDa、101.5kDa或者至少102kDa的分子量。绝对摩尔质量_即肽本身而没有水合物外壳_可以通过肽图谱来测定。更高的糖基化形式还可以具有至少103kDa、104kDa、105kDa、106kDa、107kDa或至少108kDa的摩尔质量。由另外的因素例如水合物外壳所影响的摩尔质量测定(例如在含水系统中的色谱法或凝胶电泳)还可以导致更高的结果。在进一步的实施方案中，二聚体的ACE2单体(式l)(式2)(式3)(式4)单位具有至少101kDa或至少102kDa，优选至少105kDa，尤其优选至少109kDa，特别是至少113kDa，特别优选至少117kDa，最优选至少119kDa的表观分子量，如通过凝胶电泳所测定的。在另一个实施方案中，单体的分子量(表观的或绝对的)最大为102kDa、103kDa、104kDa、108kDa、110kDa、112kDa、116kDa、120kDa、125kDa、130kDa、135kDa或140kDa。更高的分子量是由于可能的ACE2的修饰，例如PEG化。优选所述单体(其没有形成二聚体)具有至少82kDa，优选至少86kDa，尤其优选至少90kDa，特别是至少94kDa，特别优选至少98kDa，最优选至少101kDa或者最大102kDa、103kDa、104kDa、108kDa、110kDa或最大112kDa的分子量。这些分子量可以例如根据肽图谱方法进行测定。优选ACE2多肽不具有跨膜结构域。因此，它是可溶性的ACE2。在这种情况下，特别优选的实施方案包含ACE2-多肽，其多肽链由其中的氨基酸18-740或具有酶活性的片段组成。另外的多肽由SEQIDNO:1的氨基酸18-615组成。虽然对于大多数的治疗性应用人的ACE2(SEQIDNO:1)是优选的，但是也可以使用其他哺乳动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、猪、灵长类或牛的ACE2。ACE2是在所有哺乳动物中普遍存在的酶，具有在不同物种中相同的底物Ang11。因此原则上，它也是在异种生物中可使用的。因此，可以与ACE2的来源(例如人、小鼠、大鼠、仓鼠、猪、灵长类或牛)无关地用根据本发明的蛋白质进行治疗。然而，在优选的实施方案中，ACE2的来源和被治疗的生物是相同的。优选与SEQIDNO:1的Ser740(例如，C-末端)相应的ACE2多肽的丝氨酸(或c-末端氨基酸)被O-糖基化。优选至少70%，优选至少80%，特别是至少90%，最优选100%的糖基化的N-糖基化位点具有唾液酸，优选相应于SEQIDN0:1的N-糖基化位点的Asn53、Asn90、Asn103、Asn322、Asn432、Asn546、Asn690被唾液酸化。在特别的实施方案中，与SEQIDNO:1的Asn53相应的天门冬酰胺被唾液酸化一次、两次、三次或四次。在ACE2制剂中，优选至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的这些氨基酸被唾液酸化一次、两次、三次或四次。在特别的实施方案中，与SEQIDNO:1的Asn90相应的天门冬酰胺被唾液酸化一次、两次、三次或四次。在ACE2制剂中，优选至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的这些氨基酸被唾液酸化一次、两次、三次或四次。在特别的实施方案中，与SEQIDNO:1的Asnl03相应的天门冬酰胺被唾液酸化一次、两次、三次或四次。在ACE2制剂中，优选至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的这些氨基酸被唾液酸化一次、两次、三次或四次。在特别的实施方案中，与SEQIDNO:1的Asn322相应的天门冬酰胺被唾液酸化一次、两次、三次或四次。在ACE2制剂中，优选至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的这些氨基酸被唾液酸化一次、两次、三次或四次。在特别的实施方案中，与SEQIDNO:1的Asn432相应的天门冬酰胺被唾液酸化一次、两次、三次或四次。在ACE2制剂中，优选至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的这些氨基酸被唾液酸化一次、两次、三次或四次。9在特别的实施方案中，与SEQIDNO:1的Asn546相应的天门冬酰胺被唾液酸化一次、两次、三次或四次。在ACE2制剂中，优选至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的这些氨基酸被唾液酸化一次、两次、三次或四次。在特别的实施方案中，与SEQIDNO:1的Asn690相应的天门冬酰胺被唾液酸化一次、两次、三次或四次。在ACE2制剂中，优选至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的这些氨基酸被唾液酸化一次、两次、三次或四次。在特别的实施方案中，与SEQIDNO:1的Ser740相应的丝氨酸被唾液酸化一次、两次、三次或四次。在ACE2制剂中，优选至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的这些氨基酸被唾液酸化一次、两次、三次或四次。优选至少30%，优选至少40%，特别是至少55%，最优选至少70%的糖基化的N-糖基化位点具有至少两个唾液酸。在ACE2制剂中，优选至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的这些氨基酸如此被唾液酸化。优选与SEQIDNO:1的Asn53相应的天门冬酰胺被N_糖基化，优选用根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。优选与SEQIDNO:1的Asn90相应的天门冬酰胺被N_糖基化，优选用根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。优选与SEQIDNO:1的Asnl03相应的天门冬酰胺被N_糖基化，优选用根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。优选与SEQIDNO:1的Asn322相应的天门冬酰胺被N_糖基化，优选用根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。优选与SEQIDNO:1的Asn432相应的天门冬酰胺被N_糖基化，优选用根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。优选与SEQIDNO:1的Asn546相应的天门冬酰胺被N_糖基化，优选用根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。优选与SEQIDNO:1的Asn690相应的天门冬酰胺被N_糖基化，优选用根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。在另一个方面，本发明涉及重组ACE2多肽的制备，所述重组ACE2多肽包含如本文所定义的多肽(ACE2单体或二聚体或者二聚体的单体单位)，其中具有表观分子量(如通过凝胶电泳测定的)低于100kDa或低于101kDa，优选低于104kDa，特别优选低于108kDa，特别是低于112kDa，尤其优选低于117kDa，最优选低于119kDa的ACE2多肽部分以低于20%，优选低于10%，尤其优选低于5%，最优选低于1%，特别是约0%，以及所有上述的组合而存在。例如，低于100kD的ACE2多肽可以以0%存在，低于100kDa的ACE2多肽可以以低于20%存在。所述部分与所有所涉及的ACE2形式有关并对此例如通过非变性凝胶电泳进行在此类似地，可以使用绝对摩尔质量作为摩尔质量范围，所述绝对摩尔质量可以通过肽图谱进行测定。因此，优选具有表观分子量(如通过凝胶电泳测定的)低于86kDa或低于89kDa，优选低于92kDa，特别优选低于94kDa，特别是低于97kDa，尤其优选低于100kDa，最优选低于101kDa的ACE2多肽部分以低于20%，优选低于10%，尤其优选低于5%，最优选低于1%，特别是约0%，以及所有上述的组合而存在。例如，低于86kD的ACE2多肽可以以0%存在，低于97kDa的ACE2多肽可以以低于20%存在。优选具有跨膜结构域的ACE2多肽部分以低于20%，优选低于10%，尤其优选低于5%，最优选低于1%，特别是约0%存在。优选ACE2多聚体部分以低于20%，优选低于10%，特别优选低于5%，最优选低于1%，特别是约0%存在。"ACE2多聚体"理解为具有3个或更多个ACE2多肽的复合物。在一个ACE2二聚体制剂中，此外优选ACE2单体部分以低于20%，优选低于10%，尤其优选低于5%，最优选低于1%，特别是约0%存在。在一个ACE2单体制剂中，此外优选ACE2二聚体部分以低于20%，优选低于10%，尤其优选低于5%，最优选低于1%，特别是约0%存在。优选ACE2分子的ACE2二聚体部分总计至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或至少99%。在进一步的实施方案中，为此组合地或独立地，ACE2分子的ACE2单体部分可以为至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或至少99%。优选具有相应于SEQIDN0:1的Asn53的N_糖基化天门冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，优选大于70%，尤其优选大于80%，特别优选大于90%，最优选大于99%，特别地100%，并优选地具有根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。优选具有相应于SEQIDNO:1的Asn90的N_糖基化天门冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，优选大于70%，尤其优选大于80%，特别优选大于90%，最优选大于99%，特别地100%，并优选地具有根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。优选具有相应于SEQIDNO:1的Asnl03的N_糖基化天门冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，优选大于70%，尤其优选大于80%，特别优选大于90%，最优选大于99%，特别地100%，并优选地具有根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。优选具有相应于SEQIDNO:1的Asn322的N-糖基化天门冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，优选大于70%，尤其优选大于80%，特别优选大于90%，最优选大于99%，特别地100%，并优选地具有根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。优选具有相应于SEQIDNO:1的Asn432的N_糖基化天门冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，优选大于70%，尤其优选大于80%，特别优选大于90%，最优选大于99%，特别地100%，并优选地具有根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。优选具有相应于SEQIDNO:1的Asn546的N_糖基化天门冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，优选大于70%，尤其优选大于80%，特别优选大于90%，最优选大于99%，特别地100%，并优选地具有根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。优选具有相应于SEQIDNO:1的Asn690的N_糖基化天门冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，优选大于70%，尤其优选大于80%，特别优选大于90%，最优选大于99%，特别地100%，并优选地具有根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。优选具有相应于SEQIDNO:1的Ser740的0_糖基化的丝氨酸的ACE2多肽部分大于60%，优选大于70%，尤其优选大于80%，特别优选大于90%，最优选大于99%，特别地100%，基于Angl-7(血管紧张素l-7)转化物，优选ACE2多肽或制剂的催化活性kkat为至少4/s，优选至少5/s，尤其优选至少6/s，特别优选至少7/s，最优选至少7.6/s。Ang1_7由ACE2从AngII(血管紧张素II)形成。该转化物可以如实施例中描述的那样以简单的方法进行测定。该转化物或ACE2的催化活性还可以从其他分析数据进行外推。所述活性可以例如如W02008/046125A中描述的那样进行测量。在另一个方面，本发明涉及用于制备重组ACE2多肽或重组ACE2的制剂的方法，其包含这样的步骤将编码ACE2的多核苷酸，优选编码没有跨膜结构域的ACE2的多核苷酸，引入真核细胞中；表达ACE2多肽并收集经表达的ACE2，尤其是以二聚体形式的。然后，可以选择这样的细胞，其产生如本文所描述的、尤其是具有高分子量的根据本发明的ACE2多肽。优选将所述编码ACE2的多核苷酸设计在载体上。优选选择具有标记(优选DHFR)的ACE2表达。优选所述标记位于载体上。优选所述载体具有用于被表达的ACE2mRNA的IRES(或对此编码的)。优选所述真核细胞是CH0细胞。本发明还涉及通过如此方法获得的重组ACE2多肽或重组ACE2多肽的制剂。在另一个方面，本发明提供了稳定的、用编码ACE2的多核苷酸转染的真核细胞系(或细胞)，优选地CHO细胞系(或细胞)，其表达特别是如上文定义的ACE2。可以根据如上文指出的所希望的性质，例如从具有分子量至少102kDa的单体单位产生二聚体，来选择所述细胞系。所述细胞优选地具有至少10pg/细胞/天，优选至少15pg/细胞/天，尤其优选至少20pg/细胞/天的ACE2生产率。优选ACE2的表达在足够的Zn2+离子存在下进行。优选使用至少0.5微摩尔，尤其直至5微摩尔的Zn2+，尤其是发酵可以在2.5-3.5微摩尔Zn2+的情况下进行。例如，表达细胞的培养基中的Zn2+浓度可以是至少0.5iiM、0.75iiM、1.0iiM、1.25iiM、1.5iiM、1.75iiM、2.0iiM、2.25iiM或至少2.5iiM或3.0iiM。优选其他操作步骤同样在Zn2+离子存在下进行。在另一个方面，本发明涉及根据本发明的ACE2产物的药物的或药学制剂。尤其是用于治疗或预防高血压、心功能不全(例如，充血性、急性或慢性心功能不全)、心肌梗死或动脉硬化、肾病或肾功能不全、多囊肾病(Zystennieren)(多囊肾病，PKD)或肺病(例如慢性阻塞性肺病)、肺炎、哮喘、慢性支气管炎、肺气肿、囊性纤维化、间质性肺病、肺循环低压(pulmonaleHypertonie)、肺栓塞、肺结节病、结核病、肺水肿、ALI、ARDS或肺癌。ACE2的通常治疗适应征在例如WO2004/000367A中提及，其也适合于根据本发明的ACE2产物。根据本发明，可以提供包含ACE2蛋白质的药学组合物或药物。这样的组合物可以包含相同的药学上适宜的盐、额外的缓冲液、张度组分(Tonizitatskomponenten)或药学上适宜的载体。药学载体物质用于所述组合物的更好的相容性并允许所述活性物质更好的溶解度以及更好的生物利用率。对此的实例是乳化剂、增稠剂、氧化还原组分、淀粉、醇溶液、聚乙二醇或脂质。适宜的药学载体的选择极其依赖于施用的方法。对于口服施用可以使用液体或固体的载体，对于注射则必需是液态的最终组合物。优选根据本发明的ACE2组合物包含缓冲液物质或张度物质。借助于缓冲液可以调节药物的pH值至生理条件，此外可以减弱或缓冲pH波动。对此的实例是磷酸盐缓冲液。张度物质用于调节渗透性并且可以包含离子物质，例如无机盐(例如，NaCl或KC1)，或非离子物质(例如，甘氨酸或碳水化合物)。12优选根据本发明使用的组合物或药物适合用于全身性、局部地、口服或鼻内施用或以吸入施用。本发明的组合物的这些施用方式使快速和简单的摄取成为可能。如果确定了ACE2组合物用于口服施用，则优选考虑耐胃液的配制剂或者胶囊剂。为了进行口服施用，可以例如将固体或液体的药物直接或者经溶解或经稀释地摄入。根据本发明使用的药物优选地适合用于静脉内、动脉内、肌内、血管内、腹膜内或皮下施用。因此，适合于例如注射或输液。血管系统(Blutbahn)的直接施用具有优点，即药物的活性物质分布于整个机体并迅速到达靶组织。通过下面的附图和实施例进一步阐明而非限制本发明。附图图1:ACE2表达和筛选盒图2:制备克隆历史的ACE2特异的蛋白质印迹分析图3:ACE2单体的SDS-PAGE分析图4:克隆选择图5:LC-MS糖基化分析图6:ACE2的制备型大小分离图7:ACE2在3个物种中的药物代谢动力学图8:用于Angl-7禾PAngII定量的校准曲线。在WatersC18BondapakRP，2.lx300mm，10iim，125人柱上借助于RP-HPLC在所引用的浓度范围内分离肽。图9:N-末端肽的MS/MS-谱。注Q和K具有相同的质量。图10:ACE2序列和N-糖基化预测图11:糖基化位点103(A)、位点432(B)、位点546(C)、位点690(D)、位点90(E)的经解谱的谱图。图12:C-末端0-糖基化肽的谱图。结构归类应当探试性地进行分类。图13:LC-MS释放的聚糖图14:ACE2二聚体结构的测定，借助于非变性PAGE(左侧，蛋白质条带借助于银染进行可视化)和SEC(右侧，ZorbaxG-450柱上，在220mM磷酸钠存在下，在pH7.0下10%乙腈中进行分离，该色谱在214nm处进行)。图15:ACE2二聚体的大小排阻色谱法的色谱(滞留8.55分钟，8.93分钟)。标准甲状腺球蛋白(670kDa，7.43分钟)、y-球蛋白(158kDa)、卵白蛋白(43kDa，10.08分钟)、肌球蛋白(17kDa，11.08分钟)、维生素B_12(l.3kDa，12.71分钟)。图16:来自皮质(A)、脑(B)和ACE2-二聚体表达克隆(C)的细胞提取物的ACE2特异的蛋白质印迹分析。在D中，加载了纯的ACE2二聚体。图17:ACE2单体形式的分析型SEC-HPLC色谱。运行条件柱ZorbaxGF250，缓冲液220mMNa2HP04+10%CH3CN，pH8.0在lml/分钟情况下。图18:ACE2二聚体(A)和ACE2单体(B)的PAGE分析，蛋白质借助于银染(a)和ACE2特异的蛋白质印迹(b)进行检测。图19:ACE2单体相比于ACE2二聚体的酶活性的确定。在恒定的荧光标记底物香豆素-APK-DNP的初始浓度和四种不同的酶浓度下进行，并对比各个荧光曲线。图20:ACE2二聚体形式给药(2.5mg/kg，蓝色柱)或ACE2单体形式给药(2.5mg/kg，灰色柱)24和48小时后所测量的ACE2血清活性。实施例实施例1:高度糖基化的ACE二聚体的表达在表达载体中克隆人ACE2序列(SEQIDNO:1)的可溶性片段，在所述表达载体中首先插入可扩增的选择标记DHFR，以便导致增加的ACE2基因表达。为此在编码ACE2和DHFR的基因之间引入衰减性IRES，其使得在同一mRNA上的ACE2和DHFR的双顺反子读码成为可能。在图1中图解说明了ACE2表达盒和筛选盒。这两个蛋白质在同一启动子调控下表达之后，可以通过使用拮抗剂MTX进行DHFR筛选针对性地提高ACE2的表达。通过这些策略可能获得特别稳定的表达细胞系，其提供高产率的恒定质量的产物。还可能在细胞系中获得合理的产物滴度，其可能对于某些目标蛋白质的重组表达是较不适宜的。将该载体转化入CH0dhfr细胞并在持续增加的MTX压力下扩增ACE2基因的拷贝数。经过多轮筛选和亚克隆，借助于细胞内FACS分析和蛋白质化学以及酶学分析根据最佳产物性质来筛选最好的产物。为了选择最适合的克隆，首先考虑特定的酶活性(其用3种不同的底物的测定)、产物同质性、细胞生产率以及糖复杂性。在图2中，显示了单个克隆的相续的培养上清液的总结性重现的蛋白质印迹，其被用于建立生产细胞系。单个克隆的产物性质区别于从右到左增加的表达产物的糖部分，其通过明显的质量增加而可辨认。这些通过高度糖基化的克隆的特定筛选而实现。最终，具有最高分子量表达产物的克隆(克隆5B9)被用于建立生产细胞系(1B4)。决定继续进行6个克隆，其表达高酶活性的和复杂的N-糖基化ACE2。当可溶性ACE2具有83kDa的分子量时，选择这样的克隆，其在变性SDS-PAGE中表现为范围直至120kDa的分子量(取决于其糖结构)。图3显示了通过本生产方法制备的ACE2(泳道B)，对比于在NS0中制备的标准ACE2(泳道A)。当根据本发明的ACE2多肽(此处作为单体进行分析)是同质的、高度糖基化的，并且因此表现为约120kDa的单一条带时，参考物质条带显示83kDa至120kDa，这暗示非常异质的糖基化。将初始克隆移置于无蛋白质的生长培养基(Polym皿)中。这种商购可得的培养基是化学物质确定的、无血清、没有动物蛋白质并且在CHO中就糖蛋白的重组表达进行了优化。发酵在2.5-3.5yMZn2+下进行。在培养基中维持所有6个克隆并且就其生产方法适宜性进行检查。特别是记录生长速率以及研究关于产物进程和代谢物的上清液(图4)。再次精确分析表达产物以及克隆。所有的克隆都表达高活性的ACE2并且具有20-30pg/细胞/天的生产率。此外，还分析糖结构和其异质性。最终选择克隆1B4。它在整个生产进程中具有同质的糖结构。在所有7个N-糖基化位点进行了糖基化，其中这些糖基化具有至少一个具有末端唾液酸的二-天线，有些甚至三天线的复杂的糖基化。基于这些克隆制备了主细胞库并进行了测试，以及建立了GMP适用的纯化方法和进而GMP生产方法。SEQIDN0:1(ACE2蛋白质序列，为了排出，由宿主细胞切除自体信号序列(加下划线)):MSSSSWLLLSLVAVTAAQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQST-PAHLLGD丽GRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMT-PFLLRNGANEGFHEAVGE頂SLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQAL-TIVGTLPFT预LEKWR丽VFKGEIPKDQ丽KK丽EMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLF-HVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGD-DIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVS由于ACE2的二聚体化，全部疏水蛋白质单位朝向复合体内部，其中带电荷的残基，例如N-联糖链朝外突出并且该结构溶解于同样带电荷的生理介质中。在Zn"存在下确认通过完整的N-糖基化ACE2的表达的所述二聚体化。在这种情况下，所述二聚体复合物由2个相同的亚基组成，其彼此静电结合并且在生理溶液中也不再分离。在这种情况下，能够分泌每个ACE2分子上各具14个强带电的唾液酸结构以及在二聚体中28个唾液酸结构的糖蛋白。每种情况下有2个Zn2+离子嵌入复合物中并稳定其结构。糖链的强带电使该分子溶解于生理水溶液并迫使所属的带电荷的蛋白质结构域朝向外面。这样来建立生产方法，使得终产物中仅存在ACE2二聚体。这些是可能的，由于在产生ACE2时存在足够的Zn2+离子(优选地使用1.5_5微摩尔Zn"，尤其是发酵可以在2.5-3.5uMZn2+下进行)并且后来进一步的处理步骤在Zn2+离子存在下来进行。纯化通过使用阴离子交换步骤、硫酸铵沉淀以及HIC步骤、阳离子交换步骤以及其他高溶解性阴离子交换步骤来进行。过程中的所有介质都是经磷酸盐缓冲的并含有氯化钠。最后的试样缓冲液是用于注射的生理甘氨酸溶液。实施例2:产物性质基于共价结合的糖结构，复杂的、高度糖基化的ACE2单体或二聚体的单体单位具有比其相应的氨基酸序列明显高的分子量。因此借助于肽图谱测得102kDa的摩尔质量，而非糖基化的ACE2只有83kDa。与此相应地，糖部分占约23%并且对于下文所描述的产物性质具有实质性意义。由于强烈的水合作用，相比于参照标准，在SDS-PAGE中约120kDa处显现单体单位(图3)。不表达天然的、膜结合的ACE2，而仅表达ACE2的可溶性部分。由于膜结构域的缺失而被完全糖基化。由于复杂的、高度糖基化的和因此带强负电的糖结构，ACE2具有相比于非糖基化的或未完全糖基化的ACE2而言明显高的溶解度。因此，可以毫无问题地制备直至15mg/ml、经生理学缓冲的蛋白质配制剂。除稳定的二聚体化之外，该产物在溶液中还进一步表现稳定并且经过较长贮存时间既不失去活性，也不倾向于降解或聚集。与此相反，去糖基化的ACE2在低浓度范围下就已经沉淀。其可借助于PNG酶F在制备型去糖基化起始物中显示。针对ACE2计算出的理论稳定指数为41.2，并且将该蛋白质归类为不稳定的，其中在该计算中，允许大于八的糖结构。然而，因为所述配制剂在溶液中表现稳定达数月之久，这明显归因于高的糖部分。此外，ACE2的更好的溶解导致这种配制剂仅由ACE2二聚体(或者在人工分离后仅从单体产生单体)组成，而非糖基化的ACE2倾向于多聚化和聚集。此外，由于高的带电糖链部分，所述ACE2制剂的流体力学直径、溶剂化外壳大大增加。这种情况可以用于通过大小分离柱进行ACE2的制备型纯化，其中，在此仅作为二聚体存在的蛋白质具有相比于计算出的83kDa而言约250kDa的表观分子量。制备型ACE2纯化的色谱反映在图6中。ACE2(第一幅图)用69分钟的滞留时间进行洗脱。这相应于在甲状腺球蛋白(第一幅图，在58分钟时，670kDa)和Y-球蛋白(第一幅图，在74分钟时，158kDa)之间的表观分子量。在该高分子量范围内在培养上清液中不具有杂质，从而可以以非常简单的分离步骤分离高纯度的产物。实施例3:产物的药学性质根据本发明的ACE2制剂作为稳定的、高纯度和浓縮的蛋白质溶液存在于生理缓冲中，并且可以不需进一步稳定化地存放和施用。例如，可以使用磷酸盐缓冲液。ACE2作为稳定的单体或二聚体在溶液中是稳定的，并且由于高的糖部分而不显示出聚集。此外，ACE2制剂具有完全的酶活性。由于其溶解度，ACE2可以以静脉内推注(Bolus)进行施用。出于同一原因，全身性地，生物利用率在给药后很快就得到保证。由于高的、强烈支化的和复杂的糖部分，ACE2只缓慢地降解。由此导致至少10.5小时长的半衰期，其是在各种物种，尤其是恒河猴(RhesusMakaken)中测得的。图7展示了在3种物种中静脉内给予的ACE2的所测得的半衰期。此外，高的唾液酸部分造成没有建立针对ACE2的中和性免疫应答。该免疫应答不但可能对于ACE2的外源施用产生不良后果，而且还可能中和自体的、细胞固有的ACE2。因此，所描述的ACE2配制剂连同全部所涉及的产物性质首次使得用rhACE2进行有效的治疗成为可能。实施例4:特定ACE2活性的测定通过测量AngII(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)的转化物来测定ACE2制剂的特定活性。在lOOiU的初始体积中以三次测定来进行全部测量。通过向在pH6.5下的50mMMES、300mMNaCl、10iiMZnCl2和0.01%Brij_30中的80iiMAngII溶液加入250ng/ml的ACE2启动酶促反应。小心地混合样品并在37。C下精确温育18分钟。通过加入100mMEDTA来终止酶促反应。为了进行分析，借助于RP-HPLC(WatersC18iiBond即ak，2.lx300mm，10iim，125人)在0.08%H3P04中的10至60%CH3CN线性梯度的使用下，流速为lml/分钟下分离该溶液20分钟。接着，辨认并对色谱图中的AngII和Ang1_7峰进行积分。按照各自在图8中所展示的校准曲线来求得肽浓度。接着，测定酶促转化物以及特定的酶活性。如前所述地测定ACE2产物的活性。在表1中展示了各自的峰积分(Peakintegration)结果以及计算出的酶数据。表l:酶数据和反应条件。给出了三次测定的平均值<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>ACE2制剂具有根据AngII转化物所测得的8.0±0.3/skkat和鉴于Ang1-7转化物的8.8±0.2/skkat的催化活性。这两个值很好地相符并且明显高于Vickers等人(JBiolChem.277(17)(2002):14838-43)的结果，其中公开了3.5/s的ACE2催化活性。反应条件是相同的。我们的制剂240%较高活性的原因可能是翻译后修饰和在此尤其是N-糖基化，其在Vickers所使用的物质中是明显较少的。所述物质在昆虫细胞中表达并具有相同的氨基酸序列，然而在明显较少的部分和支化程度上被糖基化。此外，还研究了R&DSystems的商购可得的ACE2制剂(目录编号933_ZN)，其同样具有明显较少的2.0±0.1/skkat的活性。根据本发明的制剂的一个重要的性质是特别高的酶活性，其主要通过翻译后修饰而成为可能。实施例5:重组ACE2的糖蛋白组的分析以两种不同的方法来分析经纯化的、CHO表达的ACE2样品首先，产生SDS-PAGE和S-烷基化后的胰蛋白酶肽并借助于LC-ESI-MS(和MS-MS)进行分析。发现了N-末端肽和多个内部肽。在具有聚糖结构的糖基化形式中发现了七个潜在N-糖基化位点中的五个，其主要包含具有岩藻糖和不同量的唾液酸的二天线聚糖。C-末端肽好像是O-糖基化的。其次，借助于碳-LC-ESI-MS来分析游离的、还原的N-聚糖。对于具有岩藻糖的二天线、二唾液酸聚糖可以显示，所述岩藻糖与核心a1，6-相结合且唾液酸是a2，3结合的。此外，除单糖基化或二糖基化的、二天线的聚糖发现有数量相当大的三天线寡糖。对糖基化ACE2质量的粗略估计得出101-102kDa，即由约17%的碳水化合物组成。借助于SDS-PAGE分离的hBChE的蛋白质水解消化对等份ACE2进行SDS-PAGE、脱色、脲基甲基化，用测序质量的胰蛋白酶进行消化并如所描述的那样从凝胶块中提取。将提取物在速度真空浓縮器(SpeedVac-Konzentrator)中进行干燥并在进行随后的LC-MS-分析前用含有0.1%甲酸的水进行重构。对于寡糖分析，用PNG酶F消化所述肽，并使用C18SPE-微柱(Spitzen)来纯化聚糖。胰蛋白酶肽和糖肽的MS分析质谱法分析如最近所描述的[Kolarich2006]，在Q-TOFUltimaGlobal(WatersMicromass)上进行，后者配备有标准电喷雾装置、C即-LC-系统(WatersMicromass)和10端口溶剂转换模土央(10-Port-L6SUngSmittel-Wechsel-Modul)(Rheodyne)。首先，使用水作为溶剂在AquasilC18_前柱(30x0.32mm，ThermoElectron)上捕捉样品。在溶剂转换前，首先以5X乙腈维持分析柱BiobasicC18-柱(100x0.18mm，ThermoElectron)，然后，施以具有2iU/分钟的流速的5至50%乙腈的线性梯度。所有洗脱剂均含有0.1%的甲酸。样品用MS-和MS-MS-方法进行分析。用MassLynx4.0SP4软件(WatersMicromass)进行数据分析。ACE2的游离N-聚糖的分析在多孔石墨化碳柱上分离经硼氢化物还原的聚糖并用质谱法进行检测。实施例6:糖基化分析在此测定了ACE2的肽序列、其分子量、全部糖基化位点的位置以及所结合的糖的结构。借助于胰蛋白酶消化、S-烷基化和LC-ESI-MS分析样品。糖基化产物的求得的蛋白质质量为102kDa，其中糖部分相当于总质量的23%。*在这种情况下，确认了N-末端肽以及全部序列内部肽的存在(参见序列信息)。所有7个推断的N-糖基化位点(位置53、90、103、322、432、546和690)确实都包含二天线、复杂的含唾液酸的岩藻糖基化的糖结构(图13)。C-末端肽被0-糖基化。通过碳-LC-ESI-MS根据其裂解和还原来测定这些糖链的结构。所有二天线结构各自都包含两个a2，3-结合的唾液酸和一个a1，6_结合的岩藻糖。还发现少量的三天线结构(图11)。所应用的筛选策略能够获得完全糖基化的和包含唾液酸的表达产物。方法样品制备ACE2借助于SDS-PAGE进行分离、脱色、烷基化并用胰蛋白酶进行消化。(Kolarich等人，Proteomics6(2006):3369-3380)。对凝胶提取物进行干燥并在进行LC-MS分析之前溶解于0.1%甲酸中。对于糖分析，用PNG酶F消化所述肽并经过C18SPE微柱进行纯化。MS分析所有质谱法分析借助于具有标准电喷雾装置和C即-LC系统(WatersMicromass)的Q-T0FUltimaGlobal(WatersMicromass)进行(Kolarich2006)。在AquasilC18前柱(30x0.32mm，ThermoElectron)上于水中富集样品。在乙月青梯度的使用下采用C18柱(100x0.18mm，ThermoElectron)作为分离柱。样品用MS和MSMS方法进行测量。游离的N-聚体的分析在多孔石墨柱上分离用硼氢化物还原的聚糖并表征其质量。实施例7:rhACE2的二聚体化根据实施例1制备的ACE2以二聚体获得，并且在该实施例中也是对此进行分析的，而不用分离二聚体。与变性的分析相反，通过天然处理保留了所获得的所述二聚体(图3)。取决于ACE2的二聚体化所有疏水蛋白质单位朝向复合体的内部，所述复合体中带电荷的残基，例如N-联糖链朝外突出并且该结构溶解于同样带电荷的生理介质中。在Zn"存在下确认通过完整的N-糖基化ACE2的表达的所述二聚体化。在这种情况下，所述二聚体复合物由2个相同的亚基组成，其彼此静电结合并且在生理溶液中也不再分离。在这种情况18下，能够分泌每个ACE2分子上各具14个强带电的唾液酸结构以及在二聚体中28个唾液酸结构的糖蛋白。每种情况下有2个Zn2+原子嵌入复合物中并稳定其结构。糖链的强带电使该分子溶解于生理水溶液并迫使所属的带电荷的蛋白质结构域朝向外面。这样来建立生产方法，使得终产物中仅存在ACE2二聚体。这些是可能的，由于在产生rACE2时存在足够的Zn2+离子(优选地使用1.5_5微摩尔Zn"，尤其是发酵可以在2.5-3.5uMZn2+下进行)并且后来进一步的处理步骤在Zn2+离子存在下来进行。在图14和15中，用不同的方法来检测ACE2复合物的二聚体化。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，在银染后检测到蛋白质是约250kDa大小的单一条带。用大小分离色谱法在ZorbaxG-450柱上，在220mM磷酸钠盐缓冲液中10X乙腈存在下于pH7.0，该产物同样在相应于约250kDa的分子量的滞留时间下显示单个峰。值得注意的是，在这两种情况下都仅能检测到二聚体化的蛋白质。既不能检测到单体结构，也不能检测到高分子聚集体。实施例8:ACE2二聚体-与膜固有ACE2的区别ACE2作为跨膜蛋白质在所有的高等物种中主要在肾脏、心脏、肺和肝的细胞上作为肾素_血管紧张素系统的重要酶被表达。膜锚固的ACE2在脂质双层膜中自然地被其他膜蛋白质环绕，所述其他蛋白质使ACE2稳定在激活的构象中，并且同样保护ACE2的细胞外结构域免于蛋白酶水解的降解。为了提高可溶性ACE2的药学性质和特别是可溶性蛋白质的活性和稳定性，选择仅导致稳定的ACE2二聚体结构的表达和生产策略。主要是蛋白质的C-末端结构域和翻译后修饰，它们决定性地负责二聚体化。为了突出ACE2二聚体结构的特点，用非变性PAGE和ACE2特异的蛋白质印迹来分析膜固有的ACE2的结构(图16)。在印迹A和B中加载细胞提取物(皮质和脑)以及在印迹C中加载根据实施例1产生的ACE2二聚体生产克隆的细胞提取物。在这种情况下，膜固有的产物具有相比于根据实施例l(C和D)表达产物而言明显较小的分子量，虽然前者只由细胞外部分组成。因此，这意味着膜固有的ACE2以单体存在。与此相反，表达产物由二聚体组成，所述二聚体赋予该产物药学上的优点。在印迹D中，分析了经纯化的终产物。它们仅还具有约240kDa分子量的单一条带。实施例9:改善的ACE2二聚体的药学性质APN01是生理性的ACE2蛋白质配制剂的名称，其仅由ACE2二聚体结构组成。在每种情况下，这两个ACE2单体形成非共价相互结合的复合体。如此来选择或设计分子生物学构造、表达细胞系、发酵方法、纯化和用于存放和应用的缓冲液，从而在终产物中仅出现稳定的ACE2二聚体。该二聚体既不聚集成更大的复合物也不在生理条件下分解为单体。在图15中，分析型SEC-HPLC色谱APN01，相比于大小分离标准(Bio-RADGF-Standard，蓝色曲线)。运行条件柱ZorbaxGF250，缓冲液220mMNa2HP04+10%CH3CN，pH8.O，在lml/分钟下。APN01以在8.6分钟时的单一峰的形式被洗脱，它鉴于滞留时间，位于甲状腺球蛋白(680kDa，滞留时间7.4分钟)和牛Y-球蛋白(158kDa，滞留时间8.9分钟)之间。该复合体的计算出的分子质量约为214kDa。这大约相应于每个102kDa的两个ACE2单位的预期分子量。出于对比的目的，在CHO细胞中制备ACE2单体作为参照物质，其同样用SEC-HPLC进行分析。在图17中展示了与此相关的色谱图。单体形式在9.0分钟的滞留时间被洗脱，相当于约110kDa的分子量。此外，用PAGE对比这两种产物(参见图18a)。而APN01(A)具有约240kDa分子量的蛋白质条带，在约100kDa显现单体形式(B)。借助于ACE2特异的蛋白质印迹来确定这两种产物的同一性，如在图18b中显而易见的那样。根据使用荧光标记的底物的活性测试所测，这两种产物显示出相同的特定的酶活性。如在图19中显而易见的。相同酶浓度的单体和二聚体形式具有相叠的曲线。为了对比这两种产物的药学性质，给Bl-6小鼠腹膜内以推注注射方式施用2.5mg/kg的这两种制剂并测量24和48小时后血清样品中的ACE2酶活性(参见图20)。如此来调整蛋白质浓度，从而使所有动物分别获得100i！1生理蛋白质溶液。每次，7个动物用APN01(ACE2-二聚体)和5个动物用ACE2单体进行处理。在给予ACE2之前，在血清样品中检测不到ACE2活性，然而在施用后，在所有情况下都测得全身性的ACE2活性。在应用后24小时，两个组明显地区别开来(t检验，P<0.001):在用ACE2二聚体处理的动物中，测得相当于0.9iig/mlACE2浓度的活性，而在获得ACE2单体的组中，仅发现0.2yg/ml的浓度的相应活性。48小时后，在获得ACE2同二聚体的组中发现还有0.2yg/ml的活性，而在获得单体的组中，不再能检测到全身性ACE2活性。这些数据表明了ACE2二聚体形式的非常明显的药学优点。20权利要求重组ACE2多肽，其以二聚体存在。2.根据权利要求1的重组ACE2多肽，其特征在于，它被糖基化，其中ACE2多肽单体的糖基基团具有总共至少14个唾液酸残基。3.根据权利要求2的重组ACE2多肽，其特征在于，可能的N-糖基化位点的至少80%被糖基化并且具有大于10%(质量％，相对于整个ACE2分子)，优选大于15%，特别地大于20%的糖部分。4.根据权利要求1、2或3的重组ACE2多肽，其特征在于，糖基化的N-糖基化位点的至少70%相互独立地选自式1-8的结构上人(式l)(式2)(式3)(式4)(式6)(式7)(式8)Fuc△Xyl&Neu5Ac5.根据权利要求1至4之一的重组ACE2多肽，其特征在于，所有可能的N-糖基化位点是都被糖基化的。6.根据权利要求1至5之一的重组ACE2多肽，其特征在于，至少80%，优选至少90%，特别地100%的糖基化的N-糖基化位点具有式1-8的结构。7.根据权利要求1至6之一的重组ACE2多肽，其特征在于，所述二聚体的ACE2单体单位具有至少90kDa，优选至少92kDa，尤其优选至少94kDa，特别是至少96kDa，特别优选至少98kDa，最优选至少101kDa的分子量。8.根据权利要求1至7之一的重组ACE2多肽，其特征在于，所述ACE2多肽不具有跨膜结构域，优选ACE2多肽链由SEQIDNO:1的氨基酸18-740或其酶活性片段组成。9.根据权利要求1至8之一的重组ACE2多肽，其特征在于，与SEQIDNO:1的Ser740相应的丝氨酸是0-糖基化的。10.根据权利要求1至9之一的重组ACE2多肽，其特征在于，至少70%，优选地至少80%，特别是至少90%，最优选100%的糖基化的N-糖基化位点具有唾液酸，优选与SEQIDNO:1的Asn53、Asn90、Asn103、Asn322、Asn432、Asn546、Asn690对应的N_糖基化位点被唾液酸化。11.根据权利要求1至10之一的重组ACE2多肽，其特征在于，至少30%，优选至少40%，特别是至少55%，最优选至少70%的糖基化的N-糖基化位点具有两个唾液酸。12.根据权利要求1至11之一的重组ACE2多肽，其特征在于，与SEQIDNO:l的Asn53相应的天门冬酰胺被N-糖基化，优选地具有如在权利要求4中定义的根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。13.根据权利要求1至12之一的重组ACE2多肽，其特征在于，与SEQIDN0:l的Asn90相应的天门冬酰胺被N-糖基化，优选地具有如在权利要求4中定义的根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。14.根据权利要求1至13之一的重组ACE2多肽，其特征在于，与SEQIDN0:l的Asn103相应的天门冬酰胺被N-糖基化，优选地具有如在权利要求4中定义的根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。15.根据权利要求1至14之一的重组ACE2多肽，其特征在于，与SEQIDN0:l的Asn322相应的天门冬酰胺被N-糖基化，优选地具有如在权利要求4中定义的根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。16.根据权利要求1至15之一的重组ACE2多肽，其特征在于，与SEQIDN0:l的Asn432相应的天门冬酰胺被N-糖基化，优选地具有如在权利要求4中定义的根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。17.根据权利要求1至16之一的重组ACE2多肽，其特征在于，与SEQIDN0:l的Asn546相应的天门冬酰胺被N-糖基化，优选地具有如在权利要求4中定义的根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。18.根据权利要求1至17之一的重组ACE2多肽，其特征在于，与SEQIDN0:l的Asn690相应的天门冬酰胺被N-糖基化，优选地具有如在权利要求4中定义的根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。19.重组ACE2多肽的制剂，其包含至少根据权利要求1至18之一的多肽，其特征在于，具有通过凝胶电泳所测得的低于100kDa，优选低于104kDa，特别优选低于108kDa，特别是低于112kDa，尤其优选低于117kDa，最优选低于119kDa的分子量的所述ACE2多肽部分以低于20%，优选低于10%，尤其优选低于5%，最优选低于1%，特别是0%存在。20.根据权利要求19的制剂，其特征在于，具有跨膜结构域的ACE2多肽部分以低于20%，优选低于10%，尤其优选低于5%，最优选低于1%，特别是0%存在。21.根据权利要求19或20的制剂，其特征在于，ACE2的多聚体部分以低于20%，优选低于10%，尤其优选低于5%，最优选低于1%，特别是0%存在。22.根据权利要求19至21之一的制剂，其特征在于，ACE2分子的ACE2二聚体部分为至少70%，优选至少80%，尤其优选至少90%，特别优选至少95%，最优选至少99%。23.根据权利要求19至22之一的制剂，其特征在于，具有相应于SEQIDN0:l的Asn53的N-糖基化天门冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，优选大于70%，尤其优选大于80%，特别优选大于90%，最优选大于99%，特别为100%，并优选地具有如在权利要求4中定义的根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。24.根据权利要求19至23之一的制剂，其特征在于，具有相应于SEQIDN0:l的Asn90的N-糖基化天门冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，优选大于70%，尤其优选大于80%，特别优选大于90%，最优地大于99%，特别是100%，并优选地具有如在权利要求4中定义的根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。25.根据权利要求19至24之一的制剂，其特征在于，具有相应于SEQIDN0:1的Asnl03的N-糖基化天门冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，优选大于70%，尤其优选大于80%，特别优选大于90%，最优选大于99%，特别是100%，并优选地具有如在权利要求4中定义的根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。26.根据权利要求19至25之一的制剂，其特征在于，具有相应于SEQIDN0:1的Asn322的N-糖基化天门冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，优选大于70%，尤其优选大于80%，特别优选大于90%，最优选大于99%，特别是100%，并优选地具有如在权利要求4中定义的根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。27.根据权利要求19至26之一的制剂，其特征在于，具有相应于SEQIDN0:1的Asn432的N-糖基化天门冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，优选大于70%，尤其优选大于80%，特别优选大于90%，最优选大于99%，特别是100%，并优选地具有如在权利要求4中定义的根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。28.根据权利要求19至27之一的制剂，其特征在于，具有相应于SEQIDNO:1的Asn546的N-糖基化天门冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，优选大于70%，尤其优选大于80%，特别优选大于90%，最优选大于99%，特别是100%，并优选地具有如在权利要求4中定义的根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。29.根据权利要求19至28之一的制剂，其特征在于，具有相应于SEQIDN0:1的Asn690的N-糖基化天门冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，优选大于70%，尤其优选大于80%，特别优选大于90%，最优选大于99%，特别是100%，并优选地具有如在权利要求4中定义的根据式1、2、3、4、5、6、7或8的结构的聚糖。30.根据权利要求19至29之一的制剂，其特征在于，具有相应于SEQIDNO:1的Ser740的0-糖基化丝氨酸的ACE2多肽部分大于60%，优选大于70%，尤其优选大于80%，特别优选大于90%，最优选大于99%，特别是100%。31.根据权利要求1至30之一的ACE2多肽或制剂，其具有基于从AngII(血管紧张素II)至Ang1_7(血管紧张素1-7)的转化的至少4/s，优选至少5/s，尤其优选至少6/s，特别优选至少7/s，最优选至少7.6/s的催化活性。32.用于制备优选地根据权利要求1至31之一的重组ACE2多肽或重组ACE2的制剂的方法，其包含这样的步骤将编码ACE2的多核苷酸，优选地没有跨膜结构域的编码ACE2的多核苷酸引入真核细胞中；表达ACE2多肽并收集经表达的ACE2，尤其是二聚体形式的，其中其中表达时优选Zn2+浓度至少为1.5微摩尔。33.根据权利要求32的方法，其特征在于，所述编码ACE2的多核苷酸设计在载体上。34.根据权利要求32或33的方法，其特征在于，所述ACE2表达用标记、优选DHFR进行筛选。35.根据权利要求34的方法，其特征在于，所述标记存在于载体上。36.根据权利要求35的方法，其特征在于，所述载体具有用于所表达的ACE2mRNA的IRES。37.根据权利要求32至36之一的方法，其特征在于，所述真核细胞是CH0细胞。38.重组ACE2多肽或重组ACE2多肽的制剂，其通过前述权利要求的方法而获得。39.稳定地用编码ACE2的多核苷酸转染的真核细胞系，优选CHO细胞系，表达根据权利要求1至31之一的ACE2。40.根据权利要求39的细胞，其具有至少10pg/细胞/天，优选至少15pg/细胞/天，尤其优选至少20pg/细胞/天的ACE2生产率。41.药物，其包含根据权利要求1至18之一、31或38的重组ACE2多肽或根据权利要求19至31之一或38的制剂。全文摘要本发明涉及重组ACE2多肽，其中所述ACE2多肽以二聚体存在。所述二聚体特别地由糖基化的单体形成并且被用于制备具有延长的半衰期的药学产品。文档编号C12N9/64GK101796183SQ200880100650公开日2010年8月4日申请日期2008年6月12日优先权日2007年6月12日发明者B·佩巴尔,B·瓦格内,E·扬奇克-哈瓦拉特,H·洛博内,M·舒斯特,R·维克,S·斯兰内申请人:阿派隆生物制剂股份公司