生长激素和相关激素的抑制剂,和其使用方法

专利名称：生长激素和相关激素的抑制剂,和其使用方法
技术领域：
本发明涉及新型生 长激素和相关激素的抑制剂，特别是催乳素，和其它在此描述的激素。本发明特别涉及抗体，抗体片断，和其修饰物，以及多聚寡核苷酸，如反义多聚寡核苷酸，干扰RNAs，和小干扰RNAs，和使用这些抑制剂抑制生长激素和/或相关激素的方法。特别方面，本发明涉及制备这些抑制剂，包括一种或多种这些抑制剂的组合物的方法，以及使用一种或多种抑制剂抑制细胞，特别是肿瘤细胞的方法，例如，抑制细胞增殖，细胞存活，或细胞运动性。本发明也包括使用一种或多种描述的组合物或抑制剂，进行诊断和监控的方法，特别是治疗肿瘤的方法。
背景技术：
人类生长激素(hGH)是生长，发育和性成熟过程中的关键因子，并且自其1944年被发现以来一直进行了深入研究(C.H.Li, H. M. Evans, Isolation of pituitary growthhormone, Science 99(1944) 183-184)。内分泌型hGH由垂体前叶分泌，并且直接作用于身体生长调节。通过与膜结合生长激素受体(GHR)的交互作用而达到调节效应(T.Zhu，E. L. Goh, R. Graichen, L. Ling, P. E. Lobie 等综述，Signal transducton via the growthhormonereceptor, Cell Signal 13 (2001)599-616 ；D.Le Roith, C.Bondy, S.Yakar,J. L. Liu, A. Butler, The somatomedin hypothesis :2001, Endocr, Rev. 22(2001)53-74)。作为最初机制，hGH通过刺激肝IGF-I分泌而促进生长(D. Le Roith, C. Bondy, S. Yakar,J.L. Liu,A. Butler,The somatomedin hypothesis :2001,Endocr. Rev. 22(2001)53-74)。然而，在生长过程中hGH也表现出许多非依赖于IGF-I的效应。hGH的垂体前叶分泌是由生长激素释放激素(GHRH)和人生长激素释放多肽引发的，并由生长激素抑制素(SS)负调节。然而，在体内的一些推理位点也有hGH的合成。这样，hGH具有内分泌水平活性，但也具有重要的促分泌和旁分泌活性(见，例如，D. Le Roith, C.Bondy, S.Yakar, J.L. Liu, Butler, Thesomatomedin hypothesis :2001,Endocr. Rev. 22 (2001) 53-74 ;N. Liu, H. C. Mertani, G. Norstedt, J. TornelI, P. E. Lobie,Mode ofthe autocrine/paracrine mechanism of growth hormone action, Exp. Cell.Res. 237(1997) 196-206 ；S. Harvey,K.L. Hull,Growthhormone. A paracrien growth factorEndocine (1997) 267-279)。hGH的推理性分泌已经定位于多位点，包括中枢神经系统中的分离神经元群体，乳腺上皮细胞，血管纤维原内皮细胞，胸腺上皮细胞，免疫系统细胞，包括巨噬细胞，B-细胞，T-细胞，和自然杀伤细胞(见，例如，N. Liu, H. C. Mertani, G. Norstedt,J. TornelljP. E. Lobie,Mode of the autocrine/paracrine mechanism of growthhormoneaction, Exp. Cell. Res. 237(1997) 196-206 ；S.Harvey, K. L. Hull, Growth hormone. Aparacrine growth factor Endocrine (1997) 267-279，和这里引述的文献)。GH属于一种激素 家族，其包括催乳素(PRL)和胎盘催乳素(PU，和较少被认知的多育曲菌素和多育曲菌素相关蛋白，其可由内皮细胞或临近细胞分泌(AM Corbacho等，Journal ofEndocrinology，2002，173，219-238)。多肽激素家族的经典成员，GH，PRL,和 PL，是由来源于共同基因的同源蛋白。所有脊椎动物的垂体前叶主要分泌PRL和GH，而PL仅在哺乳动物中存在，由胎盘分泌。这三种激素具有许多共同结构和生物特性。GH，PL JPPRL在mRNA和蛋白水平上的相似性已经被广泛研究(Nicoll CS,Mayer GL & Russell SM 1986Structural features ofprolactins and growth hormones that can be related totheirbiological properties. Endocrine Reviews 7169-203，Goffin V，Shiverick KT,Kelly PA & Martial JA 1996 Sequence-functionrelationships within the expandingfamily of prolactin， growthhormone， placental lactogen and related proteins inmammlas. Endocrine Reviews 17385-410 ；Kelly PA 1990 Growth hormoneand prolactin.In Hormones from Molecules to Disease， pp 190-217.Eds E-E Baulieu & PA Kelly.Paris ；Herman,Publishers inArts and Science.由于更少的毒性和更高的耐受性，针对阻断肿瘤生长的特殊途径已经作为一种新型药物研发选择策略。例如，多种直接针对EGFR和HER2受体的化合物已经进入临床研发，并且目前已经进入临床试验。作为一个特别例子，HerceptinEl已经作为一种人源化单克隆抗体以针对并阻断J1ER2的功能。此外，TykerbBL已经作为一种表皮生长因子受体(EGFR)和人类表皮生长因子受体2(HER-2)的双酪氨酸激酶抑制剂。新型抗-肿瘤药物仍具有持续需求。特别是，需要鉴定针对一种肿瘤细胞生长的特定基因和蛋白。本发明符合该需求和其它需求。

发明内容
本发明包括针对生长激素(GH)和相关激素的基因和对应基因产物的抑制药物，例如一种或多种人类生长激素基因簇成员，催乳素(PRL)基因，和/或多育曲菌素基因，和其对应基因产物(如多肽)。人类生长激素基因簇成员包括人类生长激素I (hGHl)基因，生长激素2(hHG2)基因，人类绒毛膜生长催乳激素I(CSHl)基因；以及人胎盘催乳激素(PL，例如，hPL-1，hPL-2，hPL-3))，人类绒毛膜生长催乳激素2(CSH2)基因，人类绒毛膜生长催乳相似激素(CSL)基因，人类绒毛膜生长催乳相似激素2 (CSL-2)基因，人类绒毛膜生长催乳相似激素3(CSL-3)基因，人类绒毛膜生长催乳相似激素4(CSL-4)基因，或其任何变体。人类生长激素基因簇成员的例子包括但不局限于下列描述的氨基酸序列，如GenBankAccession Nos. AAA72260, AAK69708, NP_001308, NP_002050, AAA98621, AAA39404,NP_851350，NP_072171，NP_066271，NP_072170，NP_001308，NP_072167，和 NP_072166。催乳素基因包括但不局限于催乳素基因，催乳素相关蛋白基因，或任何其变体。编码催乳素的基因实施例包括但不局限于下列描述的氨基酸序列，如GenBank Accession Nos. CCA38264,NP_000939, CCA25214, CCA25108, AAH88370, CCA23829,和 CCA38265。多育曲菌素基因包括但不局限于多育曲菌素基因，多育曲菌素相关蛋白基因，或其任何变体。编码多育曲菌素的基因实施例包括但不局限于下列描述的氨基酸序列，如GenBank Accession Nos. S48671。人类生长激素基因簇的基因产物包括类生长激素I (hGHl)，生长激素2 (hHG2)，人类绒毛膜生长催乳激素I (CSHl);以及人胎盘催乳激素(PL，例如，hPL-1，hPL-2，hPL-3))，人类绒毛膜生长催乳激素2 (CSH2)，人类绒毛膜生长 催乳相似激素(CSL)，人类绒毛膜生长催乳相似激素2 (CSL-2)，人类绒毛膜生长催乳相似激素3 (CSL-3)，人类绒毛膜生长催乳相似激素4(CSL-4)，或其任何变体。催乳素基因的基因产物包括但不局限于催乳素和催乳素相关蛋白。多育曲菌素基因广物包括但不局限于多育曲菌素和多育曲菌素相关蛋白。本发明中的生长激素抑制剂包括抗体，和多聚核苷酸，包括反义多聚核苷酸，干扰RNAs (iRNAs)，和小干扰 RNAs (siRNAs)。一方面，本发明包括直接针对GH和/或其相关激素，或其变体的抗体，和抗体片断，和其修饰物。本发明的抗体的特征为其具有特异结合hGH，催乳素，或多育曲菌素多肽，和/或其变体的能力，例如，hGHl，hGH2，hPRL或hPL。本发明的抗体特异结合的hGH，hPRL，和/或hPL多肽包括一个或多个构象和/或序列表位。HGH多肽或其变体上的构象和序列表位包括但不局限于表2中显不的构象表位,和表3中显不的序列表位。hPRL多肽上的构象表位包括但不局限于表5中显示的构象表位。本发明的抗体可以包括一种生长激素多肽，如hGH，hPRL和/或hPL的抗原决定簇，表I和表4描述了这些抗原决定簇。特定方面，本发明包括直接针对GH，和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL或hPL的多克隆或单克隆抗体，或抗体片断，和其修饰物。特定方面，抗体这届针对一种多肽，例如，SEQ ID Nos :1-26中的至少一种，合适地为SEQ ID Nos : 1_26中的一种，或其修饰序列。多方面，抗体直接针对天然多肽，任何源于此多肽的肽，任何这些多肽或肽的修饰物(例如，其初级结构基于激素的序列)，或模拟激素3D结构的任何多肽或肽。另一特定方面，本发明包括一种多克隆抗体，抗体片断，或其修饰物。更特别的方面，本发明包括一种单克隆抗体，抗体片断，或其修饰物。另一方面，本发明包括GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL或hPL的抑制多聚核苷酸，包括，例如，反义多聚核苷酸，iRNAs，和siRNAs。特定方面中，抑制剂是适用于抑制GH和/或相关激素的多肽。特定方面中，多肽包括至少一种SEQ ID NO :27-96中的核苷酸序列，或其修饰序列。更特别地，试剂从下列组中选择直接针对GH和/或其相关激素转录的反义核苷酸；适用于表达此类反义链的核苷酸；直接针对GH和/或其相关激素转录的iRNA ;和适用于表达此类iRNA的核苷酸。其它方面中，本发明包括一种直接针对GH和/或其相关激素转录的独立iRNA (例如，siRNA)，或适用于表达直接针对GH和/或其相关激素转录的iRNA的核酸。特定方面中，独立的iRNA包括任何一种从SEQ ID Nos :33-60或97-98中选择的序列，或其修饰序列。一些方面中，独立iRNA可以包括一条正义链和一条反义链，并形成双链形式。这些反义多聚核苷酸和iRNAs，特别是siRNAs，可以抑制GH和/或相关激素核酸和/或多肽产物的表达，例如，SEQ ID NO ;27-32，或其修饰序列。其它方面，本发明包括制备这些反义多聚核苷酸或iRNAs的表达载体，以及宿主细胞。本发明也以一种宿主细胞为特点，例如，一种包括至少一种表达载体的微生物宿主细胞。另一方面中，本发明包括抑制GH和/或相关激素基因和相关基因产物(例如，多肽)的方法，特别是hGH和/或其变体，hPRL或hPL，方法包括根据本发明，将GH和/或其相关激素与抗体，或抗体片断，或其修饰物反应。特定方面中，本方法用于减少GH和/或相关激素的活性或其表达水平。进一步的方面中，本发明包括抑制GH和/或相关激素基因和相关基因产物(例如，多肽)的方法，特别是hGH和/或其变体，hPRL或hPL，方法包括根据本发明，将GH和/或相关激素多聚核苷酸与多聚核苷酸移植物反应，如反义链，iRNA，或siRNA。特定方面中，本方法用于减少GH和/或相关激素的活性或其 表达水平。更进一步方面中，本发明包括抑制GH和/或相关激素的交互反应的方法，特别是hGH和/或其变体，hPRL或hPL，方法包括根据本发明，将所述的受体与抗体，或抗体片断，或其修饰物反应。额外方面中，本发明包括抑制细胞，特别是肿瘤细胞(例如，来源于乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌，和/或子宫内膜异位的上皮肿瘤细胞)的增殖，存活和/或运动的方法。特别地，本方法包括使用至少一种GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL或hPL的抑制剂，如此所述，包括将细胞与抑制剂接触。特定方面中，抑制剂是一种抗体，多抗体片断，或其修饰物。另一方面中，抑制剂是一种多聚核苷酸抑制剂，或其片断，或修饰物，如反义链，iRNA,或siRNA。相关方面中，本发明包括在需要的主体中治疗或预防一种失调，例如癌症(包括但不局限于乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌)，细胞增殖失调(包括但不局限于子宫内膜异位)和/或细胞存活失调的方法。方法包括将所述的细胞与人类生长激素和/或相关激素，或其变体的抑制剂反应。hGH抑制剂可以单独给药，或与第二种治疗化合物联合给药(同时或连续)，如化学治疗或抗-肿瘤药物。例如，对所述的主体使用有效剂量的一种或多种抑制剂，包括但不局限于抗体，抗体片断，或其修饰物，使得所述的细胞与所述的抑制剂接触。另一相关方面中，本发明包括在需要的主体中治疗或预防一种失调，例如癌症(包括但不局限于乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌)，细胞增殖失调(包括但不局限于子宫内膜异位)和/或细胞存活失调的方法。方法包括将所述的细胞与hGH和/或相关激素，或其变体的抑制剂反应。hGH抑制剂可以单独给药，或与第二种治疗化合物联合给药(同时或连续)，如化学治疗或抗-肿瘤药物。例如，对所述的主体使用有效剂量的一种或多种抑制剂，包括但不局限于多聚核苷酸抑制剂，例如反义链，iRNA，或siRNA。另一方面中，本发明包括检测样本中GH和/或相关激素存在或水平的方法，特别是hGH和/或其变体，hPRL或hPL，方法包括将所述样本与一种多种抗体，抗体片断，或其修饰物接触。特定方面中，样本为生物体液或组织。另一方面中，本发明包括检测样本中GH和/或相关激素存在或水平的方法，特别是hGH和/或其变体，hPRL或hPL，方法包括将所述样本与一种多种多聚核苷酸，片断，或其修饰物接触。特定方面中，样本为生物体液或组织。额外的方面中，本发明包括诊断或监控主体(例如人类)中的失调的方法，如癌症(包括但不局限于上皮细胞肿瘤，如乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌)，细胞增殖失调(包括但不局限于子宫内膜异位)和/或细胞存活失调的方法，方法包括将所述主体的样本与生长激素(GH)和相关激素激素和对应多肽产物抑制剂接触，特别是所述的人类生长激素(hGH)和其变体，并测定相对于对照样本，抗体结合所述样本的水平。与对照样本相比，抗体与所述样本结合水平的升高表明存在肿瘤，细胞增殖失调和/或细胞存活失调。特定方面中，主体的样本为生物体液或组织。特别方面中，本发明包括诊断 或监控主体(例如人类)中的失调的方法，如癌症(包括但不局限于上皮细胞肿瘤，如乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，和/或子宫内膜癌)，细胞增殖失调(包括但不局限于子宫内膜异位)和/或细胞存活失调的方法，方法包括将所述的至少一种抗体与主体中样本接触；并测定相对于对照样本,抗体结合所述样本的水平。与对照样本相比，抗体与所述样本结合水平的升高表明存在肿瘤，细胞增殖失调和/或细胞存活失调。另一特定方面中，本发明包括诊断或监控主体(例如人类)中的失调的方法，如癌症(包括但不局限于上皮细胞肿瘤，如乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，和/或子宫内膜癌)，细胞增殖失调(包括但不局限于子宫内膜异位)和/或细胞存活失调的方法，方法包括将所述的至少一种抗体与主体中样本接触；并测定相对于对照样本，抗体结合所述样本的水平。与对照样本相比，抗体与所述样本结合水平的升高表明存在肿瘤，细胞增殖失调和/或细胞存活失调。特定方面中，诊断或监控的方法包括比较测定样本中GH和/或相关激素相对于标准或基础的水平，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL。特定方面中，本发明的方法使用ELISA。可选的，或附加的，本方法使用一种或多种RIA，免疫沉淀，Westernblotting，免疫组化染色，亲和色谱，竞争结合试验，和凝集试验。另一方面中，本发明包括一种组合物，例如,一种药物组合物,其包括至少一种在此描述的抗体，或抗体片断，或其修饰物。特定方面中，组合物可以包括一种或多种药物可接受稀释物，载体，和/或赋形剂。另一方面中，本发明包括一种组合物,例如,一种药物组合物,其包括至少一种在此描述的多聚核苷酸，或片断，或其修饰物。特定方面中，组合物可以包括一种或多种药物可接受稀释物，载体，和/或赋形剂。进一步的方面中，本发明包括在药物生产中使用一种或多种在此描述的抗体，或抗体片断，或其修饰物，治疗一种主体失调，特别是癌症，乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌，细胞增殖失调。进一步的方面中，本发明包括在药物生产中使用一种或多种在此描述的多聚核苷酸，或抗体片断，或其修饰物，治疗一种主体失调，特别是癌症，乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌，细胞增殖失调。另一方面中，本发明包括在药物生产中使用一种或多种在此描述的抗体，或抗体片断，或其修饰物，用于分离或纯化GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL。另一方面中，本发明包括在药物生产中使用一种或多种在此描述的多聚核苷酸，或片断，或其修饰物，用于鉴定GH和/或相关激素多聚核苷酸(例如，基因或转录产物)，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL。进一步的方面中，本发明包括一种在主体中诊断，监控，或治疗一种失调的试剂盒，特别是癌症，乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌，细胞增殖失调。本试剂盒包括至少一种在此描述的抗体，或抗体片断，或其修饰物。进一步的方面中，本发明包括一种在主体中诊断，监控，或治疗一种失调的试剂盒，特别是癌症，乳腺癌，结肠癌，肺癌， 前列腺癌，子宫内膜癌，细胞增殖失调。本试剂盒包括至少一种在此描述的多聚核苷酸，或抗体片断，或其修饰物。特定方面中，试剂盒包括a)至少一种针对GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL的抑制剂(例如，多聚核苷酸或抗体)；和b)合适的，使用方法。另一特定方面中，本发明的方法可以进一步包括一种多多种对照样本，其包括已知水平的GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL，或其片断，或修饰物。另一方面中，试剂盒可以进一步包括从人类中分离的可溶性激素。另一方面中，根据在此描述的方法，试剂盒包括用于诊断，监控，或治疗一种失调，特别是癌症，乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌，细胞增殖失调的本发明的组合物。相关方面中，本发明也提供了使用GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL，或其片断，或修饰物，以制备试剂盒，用于诊断，监控，或治疗一种失调，特别是癌症，乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌，细胞增殖失调。多种方面中，本发明的方法使用体内或体外表达系统。另一方面中，本方法使用由重组，合成，或半-合成方法制备的多聚核苷酸或抗体，或由内源性方法(例如，自然产生成分)制备的多聚核苷酸或抗体。该应用说明中涉及或指示的部分，单元和特征，与任何或所有其它两种或多种所述的部分，单元和特征，可以单独的或联合的，广义地包含本发明，这里说明的特定总变量数具有本发明涉及领域中的等同物，通过单独的说明，该同等物在此合并。以下描述了本发明的其它方面。


被认为包括所有情况的本发明的这些和其它方面，将从以下描述，结合随附的图表，仅以示范例的方法获得显性说明图1A-1D :显示了 RL95-2子宫内膜癌细胞系中自分泌_hGH的表达能力和其对细胞发育能力的效应。使用PCDNA3载体对RL95-2细胞稳定转染hGH cDNA。(图lA)hGH mRNA和hGH受体的水平通过RT-PCR测定。(图1B)以ELISA测定载体分泌至培养基中的hGH和转染RL95-2细胞中的hGH cDNA。以MTT方法评估hGH表达能力对RL95-2细胞发育的效应，图IC表示10% FBS培养基，图ID表示血清减量培养基(0. 2% )条件。值< 0. 001，**p 值< 0. 05。图2A-2D :RL95_2人类子宫内膜癌细胞产生的自分泌-hGH增强了细胞增殖和细胞存活。(图2A) 10% FBS培养基中RL95-2-载体和RL95_2_hGH细胞的生长曲线。(图2B)以BrdU核苷酸插入显示的自分泌-hGH对细胞周期的效应，和(图2C) TUNEL方法的细胞凋亡效应，血清去除48小时后介导的细胞凋亡。(图2D)实时PCR显示的自分泌-hGH的表达对多种细胞周期调节物，抗-凋亡，促-凋亡，和致癌基因表达的效应。\值<0.001，(^值< 0. 05。图3A-3D :RL95_2人类子宫内膜癌细胞产生的自分泌_hGH增强不依赖支持物生长，集落形成，腔体空间填充，和腺泡形态干扰的结果。(图3A)悬浮培养基中RL95-2-载体和RL95-2-hGH-稳定细胞生长曲线，10% FBS培养基中悬浮培养群落的形态。(图3B) 10%FBS培养基中RL95-2-载体和RL95_2_hGH_稳定 细胞的软琼脂集落形成，150 X放大率下群落形态。(图3C) RL95-2-载体和RL95-2-hGH-稳定细胞的基质胶集落，干扰腺泡形态的全部集落数量的图示。以400X放大率拍摄集落照片。(图3D) 10% FBS培养基中RL95-2-载体和RL95-2-hGH-稳定细胞的集落形成。*p值< 0. 001，**p值< 0. 05。图4A-4D RL95-2人类子宫内膜癌细胞产生的自分泌_hGH刺激间叶细胞显形并增强细胞运动性和导致蔓延性表型。(图4A)以明视场400X放大率显微镜测定塑料培养板上10% FBS培养基培养的RL95-2-载体和RL95_2_hGH-稳定细胞形态。(图4B)伤口愈合试验，以100X放大率测定伤口面积。以Transwell chamber方法测定RL95-2-载体和RL95-2-hGH-稳定细胞的运动性(图4C)和侵染(图4D)。*p值< 0. 001，**p值< 0. 05。图5A-5C :显示AN3细胞系中自分泌-hGH的表达能力和其功能特征。(图5A)以RT-PCR测定hGH mRNA水平。(图5B) 10 % FBS培养基中AN3-载体和AN3_hGH_稳定细胞的生长曲线。(图5C) 10% FBS培养基中AN3-载体和AN3_hGH_稳定细胞的软琼脂集落形成，150X放大率下的集落形态。$值< 0. 001，、值< 0.05。图6A-6D :兔抗hGH血清对RL95-2细胞的效应。以MTT试验评估hGH-抗血清处理后的RL95-2细胞的生存能力。(图6A) 10FBS培养基；和(图6B)血清-缺乏(0. 2% )培养基；NRC =正常兔血清；48小时间隔内用抗体处理细胞两次，4天内进行测定。(图6C)以非-特异兔IgG hGH-抗血清处理后的细胞周期和凋亡基因标记物的表达情况。(图6D)WCASPASE-GLOTM 3/7检测试剂盒(Promege)进行3/7半胱氨酸蛋白酶活性评估中获得的hGH抗体浓度增加效应。图7 :不同细胞系中的hGH基因表达模式。以实时PCR评估不同细胞中的hGH基因表达特征。柱状表示hGH基因相对于MCF7 (ATCC)细胞系的表达情况。关键r2 = 0. 984 ；SF =无血清；HP =高传代次数；vec =载体。图8A-8D :GH 和相关激素的序列信息。(图 8A)hPRL，GHl, GH2, CSHl, CSH2, hCSLhCSL-2，hCSL-3，hCSL-4的CLUSTALW氨基酸序列。下划线表示信号肽序列。(图8B) hPRL，GHl，GH2，CSHl，CSH2，hCSL，hCSL-2，hCSL-3，hCSL-4 的氨基酸序列。(图 8C)GH1，GH2，CSHL，CSH2, CSHl，hPRL 的 CLUSTALW 核酸序列。(图 8D)GH1，GH2, CSHL, CSH2, CSHl，hPRL 的核酸序列。图9A-9C:siRNA造成的hGH mRNA的衰减可促使子宫内膜癌细胞的凋亡两种siRNA 结构(sihGH5 和 sihGH6(SEQ IDNO :97 和 SEQ ID NO :98))促进了 RL95-2 细胞的凋亡活性(以半胱氨酸蛋白酶3/7活性评估的凋亡)(图9A和9B);实时PCR定量分析显示sihGH5和sihGH6的使用可减少RL95-2细胞中的hGH基因的表达(图9C)。
具体实施例方式以下是本发明的描述，包括其带有常规术语的优选的实施方案。以下的”实施例”部分提供了支持本发明和特定实施例的试验数据，对本发明进了了进一步的说明。定义术语”抗体”(例如，” GH抗体”或类似术语)应当以最广泛的可能意义理解，并包括完整的单克隆抗体和多克隆抗体。并包括其片断和其它修饰物，只要其显示了期望的生物学活性。抗体包括免疫蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，例如，包括一种特异结合(免疫结合)抗原的抗原结合位点的分子。其包括，但不局限于，多克隆，单克隆,人工的,单链,Fe,Fab,Fab’，和Fab2片断,及 Fab表达文库。与任何IgG, IgM, IgA, IgE,和IgD几何相关的抗体，其分子重链相互不同。其包括子集，如IgGl，IgG2，和其它。轻链可以是kappa链或lambda链。这里所指的抗体包括所有集合,子集,和类型。也包括人工抗体，例如，特异针对超过一种来源的单克隆抗体或其片断，例如，一种鼠类或人类序列。进一步包括camel id抗体或nanobodies。应当理解每个”抗体”或任何类似术语的的引述,包括完整抗体，以及任何片断，和其任何修饰物。术语”抗原结合位点”或”抗原结合部位”指免疫球蛋白分子上的部分，或片断，或其修饰物，其参与抗原相互作用。抗原结合位点通常由重链(”H”)和轻链(”L”)的N-末端可变区域(”V”)氨基酸残基构成。重链和轻链V区中的三个高度分歧结构，称为”超变量区域”，插入至称为”侧翼区域”的更为保守的侧翼结构中。这样，术语”侧翼区域”或”FR”指自然发现于，或接近于免疫球蛋白超变区域中的氨基酸序列。任何抗体分子中，轻链中的三种超变量区域和重链区域的三种超变量区域在3维空间上相互作用形成抗原结合表面。抗原结合表面通常与被结合的抗原的三维表面互补，每个重链和轻链的三个超变区域称为”互补-决定区域”，或” CDRs”。根据可接受的定义指定每个区域中的氨基酸(见，例如，Kabat Sequence of Proteins of Immunological Interest,National Institutes ofHealth, Bethesda, MD, 1987 和 1991 ;及 Chthia & Lesk J. Mol. Biol. 196 :901-917,1987，Chothia 等。Nature 342:878-883,1989)。这里使用的”选择性”多聚核苷酸，包括带有删除，插入，或替换不同核苷的多聚核苷酸，其具有相同编码或功能相等。编码的多肽和抗体也可以是”选择性”的，并包括删除，插入，或替换的氨基酸，产生沉默改变并形成功能相等的序列。根据残基的极性，电荷，可溶性，疏水性，亲水性和/或两性特征，可以进行氨基酸的设定替换，只要至少保留一种生物活性(例如，细胞增殖，细胞存活，或细胞运动的刺激性)或免疫原性或免疫学活性。例如，阴离子氨基酸可以包括天门冬氨酸和谷氨酸；阳离子氨基酸可以包括赖氨酸和精氨酸；带有非离子极性基团并具有相似的亲水性的氨基酸包括亮氨酸，异亮氨酸，和缬氨酸，甘氨酸和丙胺酸。如图示，通过相关序列的阵列，可以获得关于替换和/或删除或添加的指南。
术语”癌”和”癌的”指哺乳动物中以异常的或不受控制的细胞增殖，细胞存活，和/或细胞运动为典型特征的生理性状况。癌症病理学可以与以下状况相关，例如，转移，干扰临近细胞的正常功能，以非正常水平释放细胞因子或其它分泌物，抑制或恶化炎症或免疫应答，肿瘤形成，癌前病变，恶性肿瘤，侵染远距离器官或组织，如淋巴结。特别是乳腺癌，其可以包括上皮细胞肿瘤，非上皮肿瘤，癌，例如，原位癌，以及入侵性乳腺癌。也包括直肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌，和子宫内膜异位，和其它情况。这里使用的术语”互补的”或”互补”，指在可行的盐浓度和温度条件下，多聚核苷酸通过碱基配对自然结合。对于序列A-G-T，互补序列为T-C-A，反向互补为A-C-T，反向序列为T-G-A。两条单链分子间的互补可以是部分的，其中仅有部分核苷酸结合，或其可以为两条单链分子间的完全互补。核酸链之间互补的程度对于核酸链杂交的效果和强度具有重要效应。对于扩增反应尤其重要，其依赖于核酸链间的结合以及iRNAs和PNAs的设计和使用。这里使用的术语”衍生”，指多聚核苷酸，或其多聚核苷酸互补物的化学修饰物。一些化学修饰包括，例如，以烷基，酰基，或氨基基团替换氢。优选的方面，多聚核苷酸衍生物编码的多肽或抗体保留自然分子的生物或免疫功能 。衍生多肽或抗体通过糖基化、聚乙二醇化，或任何相似的过程，保留原始序列的一种或多种生物学功能(例如，对于细胞增殖，细胞存活，或细胞运动的效应)或免疫学功能。当特指抗体时，术语”衍生物”包括，例如，杂交和重组抗体。抗体的杂交和重组形态包括，例如，人源化抗体，微型双功能抗体，三功能抗体，和单链抗体。这里使用的术语”表位”包括任何具有结合免疫球蛋白或相关分子能力的多肽或多肽决定簇，例如，一种scFv，或一种T细胞受体。表位决定簇通常包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸和/或唐链分子，并且通常具有特定的三维决定结构特征，以及特定的离子特征。表位包括两种主要类型，顺序表位(SEs)，其中抗体与以肽链连接的氨基酸残基连续片断相结合，以及构象表位(CEs)，其中抗体与非连续残基的折叠多肽链结合。构象表位也指自然表位。由抗原-抗体复合物的结晶结构分析可以获知，如果将被抗体识别，则残基必须在相互作用中易于接近，因此其应存在于抗原表面。一种可商业获得的计算方法可以预测SE和CE。当抗体的解离常数彡I U M ;合适地彡IOOnM,更合适地彡IOnM时，其可以特异结合抗原。术语”表达”包括多聚核苷酸和多肽的产生，特别是，来源于一种基因或基因片段的RNA产物(例如，mRNA)，并且包括一种RNA或基因或基因片段编码的氨基酸序列产物，以及表达相关的可检测物质的出现。例如，多肽-多肽相互作用，多肽-核酸相互作用，或类似物的复合物的形成，也包括于术语”表达”的范围内。另一实施例为结合配基的结合，例如针对一种基因或其它多聚核苷酸或寡核苷酸的杂交探针或抗体，一种多肽或一种蛋白片断，和结合配基的显色。这样，微阵列点光密度的增加，Northern斑点的杂交,或Western斑点的免疫杂交，或珠阵列，或PCR分析,也包括于术语”表达”的范围内。这里使用的术语”生长激素和相关激素”，指具有相似序列和/或功能的激素，包括，但不局限于生长激素(GH);催乳素(PRL)和催乳素-相关蛋白；人类生长激素基因簇，包括生长激素I (hGHl)，生长激素2 (hHG2)基因，绒毛膜生长激素1(CSH1 ;也称为胎盘催乳素(PL，PL-I, PL-2，PL-3));绒毛膜生长激素2 (CHS2)，人类绒毛膜生长催乳相似激素(CSL)，人类绒毛膜生长催乳相似激素2 (CSL-2)，人类绒毛膜生长催乳相似激素3 (CSL-3)，人类绒毛膜生长催乳相似激素4(CSL-4)基因，和多育曲菌素和多育曲菌素-相关蛋白。人类激素特定地包括于该定义中。本发明的激素包括多重序列代号，例如，GHl也指GH，GHN,和GH-N(正常生长激素)；GH2也指GHL，GHV和GH-V (生长激素变体)；CSL也指CSHLl，CS-5, CSHPUP hCS-L ；CSH1 也指 PL，hCS_A，和 CSMT ；GH2 也指 GHL，GHV, GH-V (生长激素变体);CSH2也指CSB，CSUP hCS-B。这里使用的术语绒毛膜生长素和盘催乳素，和其相应的序列符号，可以交互使用。应当理解，每个激素的引用(例如，hGH，hPRL，或hPL)，或类似术语，将包括全场序列以及任何片断，或其修饰物(包括变体)。“抑制剂”，和GH和/或相关激素的”抑制”或”抑制”，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL，指抑制或减少GH和/或相关激素的基因和相关基因产物的生物学活性和/或表达水平的方面。当期望完全抑制激素的活性时，该需求是必须的。许多”抑制”发生在激素的表达和生产水平上(例如，转录或翻译水平)或通过针对激素的功能。对GH和/或相关激素的”抑制”或”抑制”，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL，指某种减少，例如，在DNA水平(例如，减少DNA合成，增加更替，和/或减少稳定性)，RNA水平(例如，降低转录，增加更替，和/或减少稳定性)，或多肽水平(例如，减少翻译，增加更替，和/或减少稳定性)，或激活，或翻译后修饰。抑制剂也可以减少或抑制激素途径中的下游或上游产物的活性或表达水平。特定方面，抑制剂可以与这里所述的激素 特定结合或反应。对于一种抗体，”特定结合”或”特定免疫反应”指抗体与期望抗原的一个或多个抗原决定簇反应，而不与其它多肽反应(例如，结合)，或与其它多肽以非常低的亲和力结合(例如，Kd > 10_6)。特定实施方案，本发明的抑制剂可用于抑制细胞增殖，细胞存活，和/或细胞运动，特别是针对这里所述的肿瘤细胞。特别地，该试剂可用于一种或多种减少细胞增殖(例如，通过减少细胞分化)，增加细胞死亡(例如，通过增加细胞凋亡或坏死)，或减少细胞入侵和/或转移(例如，通过减少细胞骨架活性，细胞马达)。某些情况下，本发明通常直接抑制GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hRPL，或hPR，其具有维持或减少激素水平的有益方面。根据已知的方法，显示的多聚核苷酸和多肽也可以用于某些目的。这里使用的术语”修饰物”指序列改变产物和序列片段，变体，和衍生物。该术语包括多肽，多聚核苷酸，抗体，和这里描述的相似物。这里使用的术语”单克隆抗体”，” MAb”，或”单克隆抗体合成物”，指具有抗体分子特征的抗体分子群，其包括唯一的轻链基因产物和唯一的重链基因产物。特别地，单克隆抗体的互补决定区(CDRs)是唯一的。MAbs包括可以与抗原特定表位产生免疫反应的抗原结合位点，并以唯一亲和力为特征。术语”寡核苷酸”指一种多聚核苷酸，典型的为一种探针或引物，包括，但不局限于，单链DNAs，单链或双链RNAs，RNA = DNA杂交，和双链DNAs。寡核苷酸，如单链DNA引物寡核苷酸，通常以化学方法合成，例如，使用可商业提供的自动寡核苷酸合成仪，或通过多种其它方法，包括体外表达系统，重组技术，及细胞和机体表达。“纯化抗体”指占自然相关蛋白质和自然产生有机分子的重量百分比至少为60%的抗体。合适地,抗体,例如GPR30特异抗体的重量百分比至少为75%，更合适地为90%，最合适地至少为99%。使用重组制备的蛋白质或保守模体多肽和标准技术，通过亲和色谱法可以获得纯化抗体。“纯化的”或”分离的”指一种核酸，多肽，或其它分子，其已经从自然伴随的成分中分离出。典型地，一种充分纯化的多肽占自然相关蛋白质和自然产生有机分子的重量百分比至少为60 %，70 %，80 %，90 % 95 %，或99 %。例如，充分纯化的多肽可以通过从自然材料中提取获得，或通过细胞中的重组核酸表达，或通过化学合成获得。分离核酸不含某些基因或序列，其为有机体自然产生的基因组。例如，”分离的DNA或RNA”包括，例如，cDNA,克隆基因组DNA，合成DNA，和siRNA结构。“有效剂量”指单独或联合使用一种组合物，产生期望的临床治疗效果所需的有效数量。例如，对于癌症治疗，这只描述的抑制剂的有效剂量可减少或防止哺乳动物中肿瘤的生长或侵染。活性化合物的有效剂量根据治疗途径，年龄，体重，和主体的健康情况而变化。最终，医生或兽医将决定合适的剂量和给药方案。术语”病人”或”主体”包括人类和非-人类的动物。非人来的动物包括，但不局限于，鸟类和哺乳动物，特别是小鼠，大鼠，兔子，猫，狗，猪，绵羊，山羊，牛，和马。这里使用的术语”药物可接受稀释剂，载体和/或分散剂”包括用于制备药物组合物的物质，并且根据本发明，可以与药物共同给药，并且保持其相同的期望效果。其通常为安全的，非-毒性的，并且不具有非期望的生物学或其它特征。药物可接受稀释剂，载体，和/或分散剂的实施例包括溶液，溶剂，分散介质，缓释剂，乳化剂，和类似物。稀释剂，载体，和/或分散剂可以包括少量的添加物，如增强等渗性和化学稳定性的物质。以单数或复数形式使用的”多聚核苷 酸”(例如，” GH”，”hGH”，” hPRL”，或”hPL”，其可以用于论述一种多聚核苷酸)，通常指任何核酸序列，例如，任何多具核糖核酸或多具脱氧核糖核酸，其可以为非修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。非限制性地，其包括单链和双链DNA，包括单链和双链区域的DNA，单链和双链RNA，和包括单链和双链区域的RNA，单链或双链或包括单链和双链区域的DNA和RNA杂交分子。也包括含有RNA或DNA或兼含RNA和DNA的三链区域。特别包括mRNAs，cDNAs，和基因组DNAs，和任何片断，和其修饰物。术语包括含有一种或多种修饰碱基的DNAs和RNAs，如氚化碱基，或非常规碱基，如次黄嘌呤核苷。本发明的多聚核苷酸可以包括编码或非编码序列，或正义或反义序列，或iRNAs如SiRNAs0应当理解每个”多聚核苷酸”或类似术语的的引述将包括全场序列以及任何片断，或其修饰物。这里使用的”多肽”(例如，” GH”，” hGH", ”hPRL”，或”hPL”其可以用于描述一种
多肽)，指一种寡肽，肽，或蛋白质，或其片断，以及自然产生的，重组，合成或半合成分子。这里叙述的”多肽”指自然产生的蛋白质分子的氨基酸序列，”多肽”和类似术语，并不限定于全长分子的完全的，自然氨基酸序列。应当理解”多肽”或类似术语的每次引述，将包括全长序列，以及任何片断或其修饰物。“序列号”可以指每种单独序列的标示符，或任何联合的，或所有这些序列的标示符。术语”充分纯化的”或”分离的”指从细胞，重组，合成，或半合成环境中分离的核酸或氨基酸序列，其相对于环境相关的其它成分的纯度至少为60%，合适地为75%，最合适地为90%或至少99%。”分离的”多聚核苷酸和抗体已经从其自然环境相关的污染分子中被鉴定和分离出。相应的，应当理解分离的多聚核苷酸和抗体的形式与其自然形式不同。更合适地，”分离”并不充分反映纯化序列的精确的范围(例如，特定的百分数)。“治疗”和类似术语指预防，治疗，或改善医学失调(例如，医学疾病，状况，或综合症)，或减少这些失调的至少一种综合症的方法和组合物。特别地，包括预防或延缓医疗疾病的发生的方法和组合物；治愈，改良，减少，延缓，或改善疾病的物理或发展效应；及/或预防，终止，或改善疾病导致的疼痛或痛苦。术语”治疗”将以其最广泛的范畴被理解。该术语并不意指主体经治疗而完全康复。相应的，这里广泛使用的”治疗”包括抑制，减少或预防细胞增殖，细胞存活，和/或细胞运动；改善细胞增殖，细胞存活，和/或细胞运动导致的症状或强度；或在示范性的癌症中，特别是乳腺癌，直肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌，子宫内膜异位中，预防或减少发生细胞增殖，细胞存活，和/或细胞运动的危险性。这里使用的多肽”变体”，指一个或多个氨基酸发生改变的氨基酸序列。相似的，变体抗体中一个或多个氨基酸发生改变。变体多聚核苷酸中一个或多个核苷酸发生改变。变体可能发生”保守的”改变，其中替换的氨基酸具有相似的结构或化学特性，例如，将亮氨酸替换为异亮氨酸。更少见的，变体可以造成”非保守”改变，例如，将甘氨酸替换为色氨酸。类似的微笑改变也可以包括氨基酸删除或插入，或兼包括。可以使用领域中已知的计算机程序获得指导，例如，LASERGENE软件(DNASTAR)以决定哪个氨基酸残基可被替换，插入，或删除而不影响生物学或免疫活性。本发明也包括至少保留一种生物学活 性(例如，对细胞增殖，细胞存活，或细胞运动的效应)或免疫学功能的变体。变体的序列与所描述的序列间的一致性至少为80%，更合适地至少为90%。更合适地，变体的序列与所描述的序列间的一致性至少为95%，至少为97%，至少为98%，至少为99%。如下所述，通过将两种序列进行阵列比较，测定阵列部分一致残基的数量，除以发明(比较)序列中残基的总数，并乘以100，获得百分比一致性。有用的阵列程序为AlignX(Vector NTI)。除非另有说明，在本发明的实践中将使用常规分子生物学(包括重组技术)，微生物学，细胞生物学，和生物化学技术，其包含于本领域的技术中。这些技术在文献中详细描述，例如，分子克隆实验室手册，第2版，Sambrook等，1989 ；以及分子克隆实验室手册，第3版，Sambrook等，2000 ;寡核苷酸合成，MY Gait, ed.，1984 ;动物细胞培养，R. I. Freshney, ed. ,1987 ;酶学方法，学院出版社，Inc.;实验免疫学手册，第4版，D. M. Weir和 CC. Blackwell, eds.，Blackwell Science Inc. , 19887 ;哺乳动物细胞基因转移载体，JAM. Miller 和 MAP. Calos, edsl987 ;目前的分子生物学方法，FEM. Ausubel 等，eds.，1987 ；和PCR :聚合酶链反应，Mullis等，eds.，1994。生长激素和相关激素人类中，hGH基因是包括5种结构和功能相关基因的基因簇中的一部分。垂体特异hGH-N基因和四种结构和功能相关基因(仅在胎盘中表达的hGH-V，hCS-A，hCS_B，和hCS-L)。其以5’至3’方向hGH-N ；N =正常(也称为hGHl)，hCS-L ；L为类似(也称为hPL-1)，hCS-A (也称为 hPL-2)，hGH-V ；V =变体(也称为 hGH2)和 hCS_B(也称为 hPL-3)。5个hGH-hCS基因成簇定位于人类17号染色体q22-24带长臂约50kb的DNA片段上。这些基因被6-13kb的基因间区域分离，其含有29个散布的Alu型中等重复序列元素。基因簇由祖先基因进化而来，该过程开始于3. 5X IO8年前。制备本发明的位点形式将包括重复，插入假定的对照因子，及至少一种基因替换过程。人类中，5种基因在其编码和侧翼区域间超过92%的核苷序列具有一致性。其分子结构也一致；四个小基因内区在一致的区域将转录单元进行划分，使所有开放阅读框的密码子共线性更优化。通过最初转录产物的不同拼接产生两种hGH-N亚型(22kDa和20kDa hGH)的信使 RNAs。22kDa hGH_N 是主要形式，包括了 90% hGH_N 垂体 mRNA。20kDa hGH_N 除了删除了 32-46位氨基酸残基外，与22kDahGH相一致。胎盘表达的hGH_V基因中也可产生22kDahGH-V异构物。未测定到20kDa hGH_V异构物，但具有一种mRNA，其保留第4基因内区内并延伸20密码子至第5基因外区，并可以翻译为26kDa膜结合hGH-V异构体。已经描述了多种其它物种的GH核苷和氨基酸序列。人类GH与hPL的序列一致性(87%)高于猪GH (73%)，牛GH，绵羊GH，马GH和大鼠GH(每种约为65% )，或PRL家族(大约为27% )。只有灵长类GHs与hGH受体结合。特定条件下hGH也可以结合并激活PRL受体。hGH作为一种激素原被合成，其在氨基末端具有信号肽，在细胞分泌时将被去除hGH-N的成熟的22kDa异构体为一种191氨基酸多肽，在血清中是最丰富的hGH异构体。人类hGH的半衰期大约为25分钟。已经测定了哺乳动物GH的三维结构。其含有4个alpha螺旋，每个长度为21-30氨基酸。螺旋以左手方向环绕，并具有一种非常规的上-上-下-下拓扑结构。对于GH唯一拓扑方向，其在两组平行螺旋组间具有长连接环结构，并在螺旋2和螺旋3之间具有短环状区域。hGH在Cys35-Cysl65和Cysl82_Cysl89上具有两个二硫键。Cys残基是环状结构中的成分。GH分子的中心区域包括约20个疏水性氨基酸，更小氨基酸的疏水族将保持4螺旋串的稳定。hGH-N基因的0. 5kb近端启动子包括许多调节DNA元素，其与转录和hGH_N的组织特异表达相关。TATA盒之外，近端hGH-N基因启 动子包括两个假定的垂体_特异转录因子结合位点，表达hGH所需的Pit-I (也称为GHF-1)。然而，hGH-N转录促使位点下游15kb的序列对于hGH-N基因的有效表达也是必需的。近端hGH-N基因启动子也包括cis-活性元素，调节激素信号应答的转录。GH受体(GHR)包括两个区域(氨基酸1_123和氨基酸128-238)，其以多肽链上的四个残基(124-127)相连。每个区域含有7个beta-链，形成两个反向平行的beta-片层三明治结构。GH受体在Cys38-Cys48，Cys83-94，Cysl08-122间也包括三个二硫键。Arg43和Glul69间的氢键及Arg39和Aspl23间的盐桥也可以稳定受体。从氨基酸序列推断的GH分子量为70kDa。糖基化和泛素化等翻译后修饰可以使受体分子量达到100-130kDa。GH受体含有5个N-交联的糖基化位点，每一个使受体的分子量增加约lOkDa。GH受体具有19个潜在的泛素化位点，在多个赖氨酸残基上进行多泛素化。通过配基结合增加受体的泛素化，而其是GH受:体内源化所必需的。在许多有机系统中均观察到GH受体的表达，包括胃肠道，雄性和雌性生殖系统，骨骼肌系统，心肺系统，造血系统和免疫系统，中枢神经系统，珠被，肾和泌尿系统，和内分泌系统。这些系统中GH受体在分化和非-分化细胞中均表达。GH受体在来源于胚胎发育的外胚层，中胚层，和内胚层的细胞中均表达。人类中的GHBP是由膜结合GH受体经金属蛋白酶家族成员的限制性蛋白水解产生的。高至60%循环GH与GHBP结合。GHBP通过降低清楚速度和随后的降解，增加GH在血清中的半衰期。在大鼠，小鼠，和猴子中，GHBP由GH受体前体mRNA的选择性拼接产生。在人类中描述了一些GH受体的小型膜-结合异构体。一种hGH分子与两个受体的细胞外区域相互作用，导致受体的同型二聚体化。hGH具有两个受体结合位点；一个高亲和位点”位点I”和一个低亲和位点”位点2”，其先后与两个分离的受体分子上的结合”袋”相互作用。位点2与hGH的接触，以及受体的两个细胞外区域间约500A的二聚作用，增加第二个受体与复合物的结合稳定性。GH受体中，双-配基结合位点主要由相同的氨基酸残基构成，并包括相似的形状和结构。形成GHBP位点I和2的氨基酸残基位于残基43和218之间的6个成串区域。受体二聚化的结果可能提供了生产生物学应答的信号。为研制有效的GH受体拮抗剂，已经制备了 hGH位点2突变体。PRL是一种包括199个氨基酸，具有四个反-平行alpha螺旋和三个二硫环的23-kDa蛋白质。环的位置是保守的，但其初始结构在不同物种中是不同的。翻译后修饰，如糖基化，磷酸化，切割和聚合，将生成分子异构体(Sinha, Y. N. (1995) Structuralvariantsof prolaction !occurrence and physiological significance，Endocr.Rev. 16，354-369)。人类RPL(hPRL)在Asp31具有N-糖基化，具有不同比例的糖基化和非糖基化形式。糖基化PRL具有更低的PRL受体结合亲和力，并减少一些生物学活性，而磷酸化PRL与受体良好结合,但可能作为一种拮抗剂(Xu, X.等(2001)A molecular mimic ofphosphorylated prolactin markedlyreduced tumor incidence and size when DU145human prostatecancer cells were grown in nude mice. Cancer Res. 61，6098-6104)。PRL的裂解形式(16K PRL)具有 抗_血管生成特性(Struman，I.等.(1999)Opposing actions of intact and N-terminalfragments of the human prolatin/growth hormone family memberson angiogenesis an efficient mechanism for theregulation ofangiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96，1246-1251)。与 IgG 的共聚和结合可以形成大分子量物质；高泌乳素血症病人血清中存在”big”PRL(50-60kDa)和maci'o-PRLdSO-nOkDa)。其他物种中，hRPL，而非PRL或生长激素(GH)，将与肝素结合(Khurana, S.等.(1999) Heparin binding property of humanprolatin a novel aspectof prolactin biology. Endocrinology 140，1026-1029)。PRL在多种垂体外位置合成，包括蜕膜，肌层，乳腺，前列腺，脑和免疫细胞(Ben-Jonathan， N.等(1996)Extrapituitaryprolactin-distribution， regulation，functions and clinical aspects. Endocr. Rev. 17，639-669)。可在循环中被摄取和保留是PRL的另一重要特征。摄取可以传送PRL至液体环境，如脑髓液和乳汁中(Ollivier-Bousquet, M.等(1993)Prolactin transit throughmammary epithelialcells and appearance in milk. Endocr. Regul. 27. 115-124)，而 PRL 在细胞外基质中的保留可以增加临近的应答细胞的浓度。PRL也位于目标细胞的内部(Rycyzyn，M. A.等.(2000) Role of cyclophilin B in prolactin signal transduction andnuclearretrotranslocation. Mol. Endocrinol. 14，1175-1186)，虽然细胞内 PRL 的实际功能或其循环和再生的潜力仍未知。对于结构同源性，hGH和hPL多肽间的序列一致性为85%，而hPRL与其他两个激素的相似度约为 25% (AM Corbacho 等，Journal of Enocrinology，2002，173，219-238)。虽然，hPL显示了相对较低的GHR亲和力(Lowman等，1991)，所有三种人类激素以高亲和力与PRL受体结合(Nicoll等，1986，supra，Goffin等，1996b，supra)。此外，所有三种激素包括190-200氨基酸，而突变蛋白分子量为22-23kDa。通过内部二硫键稳定三维结构，通常由四个反 _ 平行 alpha-螺旋构成(参阅 Goffin 等，1996b，supra，Bole-Feysot C，Goffin V，Edery M，Binart N & Kelly PA1998 Prolactin(PRL)and its receptor, actions, signaltransductionpathways and phenotypes observed in PRLreceptor hnockout mice.Endocrine Reviews 19255-268)。此外，PRL和GH受体在结构和功能上与细胞因子受体超家族类型 I 成员相关(Bazan F 1989A novel family of growth factor receptors a common bindingdomain in the growth hormone， prolactin， erythropoietin andIL_6receptors，and the p75IL_2 receptor beta-chain. Biochemical andBiophysicalResearch Communications 164 788-795， Kelly PA， Djiane J， Postel-Vinay MC &Edery M 1991 The prolactin/growthhormone receptor family. Endocrine Reviews 12235-251，Cosman D 1993 The hematopoietin receptor superfamily. Cytokine595_106)。这些激素受体是跨膜蛋白，其在细胞外和细胞内区域具有高度保守的序列(AMCorbacho et al. ， Journal of Endocrinology，2002，173，219—238 ;see， also， MurakamiM，Narazaki M，Hibi M，Yawata H，Yasukawa K，Hamaguchi M，Taga T & Kishimoto T1991Critical cytoplasmic region of the interleukin 6 signaltransducer gpl30 isconserved in the cytokine receptor family. PNAS88 11349-11353 1991，Cosman1993，supra, 0' Neal KD & Yu-Lee L-Y 1993 The proline-rich motif (PRM) a novelfeatureof the cytokine/hematopoietin receptor superfamily.LymphokineandCytokine Research 12 309-312,Bole-Feysot et al. 1998, supra,Waters MJ，Shang CA，Behncken SN，Tarn S-P, Li H，ShenB & Lobie PE 1999 Growth hormone as a cytokine.Clinical andExperimental Pharmacology and Physiology 26760-764)，在配基结合产生的受体二聚体之后，其均可激活JAK/STAT (Janus激酶/信号感受器和转炉激活物)信号转换途径(IhIe JN & Kerr IM1995 Jaks and Stats in signaling by the cytokinereceptorsuperfamily. Trends in Genetics 11 69—74，Yu—Lee L-Y 1997Molecularactions of prolactin in the immune system. Proceedingsof the Society forExperimental Biology and Medicine 215 35-52.，Bole-Feysot et al. 1998，supra，Waters et al. 1999，supra)。生长激素和癌症最近，许多出版物已经叙述了人类和动物 模型中生长激素与癌症的相关性。虽然转基因小鼠模型清楚地支持GH在癌症中的作用，在人类肿瘤形成中很难获得相应的临床证据，并且富有争议。已知增加循环hGH可以增加IGF-I的表达，而其在多项研究中与恶化危险性相关(C. Laban，S.A.Bustin，PJ. Jenkins，TheGH-IGF-I axis and breastcancer，Trends Endocrinol. Metab. 14 (2003) 28-34 ；H. M. Khandwala, I. E. McCutcheon,A. Flyvbjerg, K. E. Friend,892 The effects of insulin-like growthfactors ontumourigenesis and neoplastic growth, Endocr. Rev. 21 (2000)215-244.894)。 然而，在绝经前妇女乳腺癌的研究中未发现hGH血清水平的改变(R. R. Love, D. R. Rose,T.S.Surawicz, P. A. Newcomb, Prolactin and growth hormone levels inpremenopausalwomen with breast cancer and healthy women with astrong family history of breastcancer, Cancer 68 (1991) 1401-1405)。此外，最近的研究中，hGH的血清浓度与前列腺癌症的危险性负相关(B. Fuhrman,M. Barba, H. J. Schunemann, T. Hurd, T. Quattrin，R. Cartagena，et al.，Basal growthhormone concentrationsin blood and the risk for prostate cancer a case—controlstudy，Prostate 64(2005) 109-115)。肿瘤产生的IGF-I导致的hGH分泌阴性反馈回路可能致使该负相关(S. Yakar，D. Leroith, P.Brodt，The role of the growth hormone/insulin-like growthfactor axis in tumor growth and progression lessons fromanimalmodels，Cytokine Growth Factor Rev. 16 (2005) 407-420 ；R. R. Love, D. R. Rose，T.S.Surawicz, P. A. Newcomb, Prolactin andgrowth hormone levels in premenopausalwomen with breast cancerand healthy women with a strong family history of breastcancer, Cancer 68 (1991) 1401-1405)。人类PRL功能的全谱和其在肿瘤发生中的作用均未完全了解。在乳腺癌中，施用PRL增加了自发和病毒-诱发的乳腺癌的发生，大小和数量，并且在啮齿类中维持致癌物诱发的肿瘤生长(Nandi, S. et al. (1995)Hormones and mammarycarcinogenesisin mice，rats，and humans a unifying hypothesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92，3650-3657)。此外，过量表达编码PRL的基因的转基因小鼠中发生了乳腺癌(Wermbo，H. et al. (1997)Activation of the prolactin receptor but not the growthhormonereceptor is important for induction of mammary tumours intransgenic mice.J. Clin. Invest. 100，2744-2751)。然而，人类中PRL循环水平和乳腺癌的相关性仍未清楚。PRL和子宫内膜肿瘤间的关系仍未清楚。子宫内膜异位妇女人群中具有升高水平的血清PRL,但在子宫内膜肿瘤病人中未发现变化(Gregoriou,G. et al. (1999)Evaluationof serum prolactinlevels in patients with endometriosis and infertility.Gynecol. Obstet. Invest. 48,48-51)。然而,一种永生人类子宫内膜基质细胞系，N5,表达PRL 并且与雌激素和孕丽相关(Brar, A. K. et al. (1999)N5 endometrial stromal cellline a model system to study decidualprolactin gene expression. In Vitro Cell.Dev. Biol. Anim. 35,150-154)。关于前列腺癌，PRL受体在胎儿，青春期前，和成人前列腺上皮细胞中均表达(Leav, I. et al. (1999)Prolactin receptorexpression in the developinghuman prostate and in hyperplastic, dysplastic, and neoplastic lesions.Am. J. Pathol. 154,863-870)。其在良性前列腺增生中可以被检测到，并且其表达高于发育不良的情况，但低于高度癌扩散情况。在肿瘤细胞系中，PRL受体在LNCaP细胞和PC-3 细胞中表达(Peirce, S. K. et al. (2001)Quantification of prolactin receptormRNA in multiple humantissues and cancer cell lines by real time RT-PCR.J.Endocrinol. 171, R1-R443 Leav, I. et al. (1999)Prolactin receptor expressioninthe developing human prostate and in hyperplastic, dysplastic, and neoplasticlesions. Am. J. Pathol. 154，863-870)。然而，PRL 刺激 DU145 和 PC3 细胞的增殖，但在 LNCaP 细胞中无效应(Janssen, T. et al. (1996) In vitro characterization ofprolactin-induced effects on proliferation in the neoplastic LNCaP, DU145, andPC3 models of the human prostate. Cancer 77,144-149)。这样，目前需要生长激素和其在人类肿瘤中的作用的相关性的数据和试剂。与这里描述的发现一致，hGH在多种肿瘤细胞系中高度或适度表达，包括子宫内膜肿瘤细胞系(见实施例)。此外，以全部细胞数量显示,过量表达hGH的子宫内膜肿瘤细胞的生长快于稳定转染空载体的对照细胞。BrdU结合试验显示全部细胞数量的增加是细胞增殖增速的结果。细胞凋亡测定显示自分泌hGH也可以通过正确细胞存活而增加全部细胞数量。此外，细胞增殖和存活的增加可以通过使用针对hGH的抗-hGH抗体有效地逆转。这些抗体抑制自分泌hGH的功能，减少生长速度并抑制细胞增殖和细胞存活(见实施例)。常规的用于治疗癌症病人的治疗方法包括手术，放射治疗，化疗，和性激素治疗。然而，这些传统治疗对许多癌症病人的情况并无效应。由于不受控制的细胞增殖，细胞存活，和/或细胞运动是癌症的特点，数十年间，肿瘤治疗中最直接和有效的方法已经为通过抑制细胞分化而试图阻止肿瘤细胞的生长。传统化疗药物对于健康细胞和肿瘤细胞均有毒害。此外，肿瘤细胞内在的基因不稳定性导致长期暴露于化疗后出现抗药性克隆。本发明的抑制剂提供了新型组合物和方法，通过 针对细胞生长和增殖相关的特异基因，预防，和/或抑制肿瘤生长。特别的，本发明的抑制剂提供了新型组合物和方法，通过针对人类生长激素，和相关激素，治疗，预防，和/或抑制肿瘤生长。本发明的抗体预计将避免具有影响其他抑制抑制剂的效果，包括减少特异性，缺少长期有效期，及有害的免疫应答。抗体也预计将极大改善化疗药物。特别的，抗体将具有加强的比较稳定，例如，针对多肽药物。此外，hGH抗体与hGH结合，而非受体，因此不能提供刺激信号(例如，激动剂或部分激动剂活性)。发明者已经观测到抗体对自分泌hGH的抑制效应，如针对内分泌hGH。因此，所描述的抑制剂(例如，抗体和多聚核苷酸)可 有效治疗分泌自身hGH的肿瘤。由于其并非必须穿刺入肿瘤内部或与细胞表面的受体结合，但可以通过结合肿瘤环境中的可溶性hGH而起作用，因此这些抑制剂更适用于治疗固体肿瘤。抑制剂可以用于其他生产或与GH和相关激素相关的肿瘤，例如，乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌，和子宫内膜异位。相似地，siRNA也可以用于减少这些癌症的激素表达，因此也可提供治疗。因此，这里显示的数据表明hGH促进子宫内膜癌细胞的增殖和存活，通过抗体结合抑制自分泌hGH的功能，可以有效地抑制该增殖和存活。GH和相关激素，特别是hGH和其遍体，hPRL，和hPL，显示了理想的癌症治疗和诊断的新型目标，特别是针对子宫内膜癌或子宫内膜异位，或乳腺癌，结肠癌，肺癌，或前列腺癌。任何抑制这些激素的生物学活性(例如，自分泌活性)的药物均可以用于抑制肿瘤细胞的增殖，存活，和/或运动。这些药物可以包括，例如，化合物(例如，小分子)，拮抗剂，抗体，和iRNAs。相似地，诊断药物(例如，多聚核苷酸和抗体)可用于测定GH和/或相关激素的存在或水平，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL，并测定癌变条件，例如，肿瘤发生，发展，或复发。分离的GH和相关激素，特别是hGH或其变体，hPRL，或hPL，可以发现具有不同用途。例如，激素可以用作这里描述的诊断方法或试剂盒的对照。可选的，激素也可以用于制备更多的用于治疗或诊断的抗体。激素也可以用作研究细胞增殖，细胞存活，和细胞运动，和其他细胞机制的对象。多聚核苷酸和多肽发明包括针对GH和/或相关激素，特别是hGH或其变体，hPRL，或hPL的多肽的使用，包括了 SEQ ID NO :1-26中的至少一种，和其片段，和其修饰物。本发明也包括使用这些多肽，以诊断癌症，特别是子宫内膜癌或子宫内膜异位，或乳腺癌，结肠癌，肺癌，或前列腺癌。本发明进一步包括使用多肽以制备抗体，抑制细胞增殖，细胞存活，或细胞运动。这里使用的多肽包括从以下组中选择的一种序列(a)包括至少一种从SEQ IDNO 1-26中选择的序列，或片段，或其修饰物的多肽；(b)多肽的功能区域包括至少一种从SEQ ID NO :1-26中选择的序列，或片段，或其修饰物；和(c)多肽包括的特定数量的连续残基来源于SEQ ID NO 1-26或其修饰物。一个特别实施方案，本发明包括一种分离的GH多肽或相关激素，特别是hGH或其变体，hPRL，或hPL，其包括的氨基酸序列至少为SEQ ID NO:
1-26中的一种。所有这里包括的这些序列为本发明使用的多肽。多肽可以在不同方法中表达和使用，以测定或检测多肽的活性和/或水平。多肽可用于高-通量合成和分离方法，例如，用于商业生产。这些多肽可用于提升抗体，分离相应氨基酸序列，和定量测定氨基酸序列的水平。本发明包括使用针对GH和/或相关激素，特别是hGH或其变体，hPRL，或hPL的多聚核苷酸，包括SEQ ID NO :27-96中的序列，片段，和其修饰物。本发明也包括使用这些多聚核苷酸诊断癌症，特别是乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌或子宫内膜异位。本发明进一步包括使用这些多聚核苷酸抑制细胞增殖，细胞存活，或细胞运动。相应的，本发明包括使用这些多聚核苷酸制备表达载体和宿主细胞，并制备翻译多聚核苷酸和iRNAs。这里使用的多聚核苷酸包括至少一种从以下组中选择的序列(a)包括的编码序列中至少一条氨基酸序列为SEQ ID NO :1-26中选择的序列，或片段，或其修饰物的多肽；(b) 一条编码序列的互补，反向序列，和反向互补序列，其中编码序列中至少一个氨基酸序列为SEQ ID NO 1-26中选择的序列，或片段，或其修饰物的多肽；(c)编码序列中的开放阅读框中至少一条氨基酸序列为SEQ ID NO :1-26中选择的序列，或片段，或其修饰物的多肽(d) —条编码序列的功能区域，其中至少一条氨基酸序列为SEQ ID NO :1-26中选择的序列，或片段，或其修饰物的多肽；(e)包括至少特定数量编码序列 连续残基的序列，其中至少一条氨基酸序列为SEQ ID NO :1-26中选择的序列，或片段，或其修饰物的多肽；和(f)包括至少特定数量的SEQ IDNO ;27-96中连续核酸的序列，或其修饰物。特别实施方案中，本发明包括一种分离的多聚核苷酸，其包括的编码序列中至少一条氨基酸序列是从SEQ IDNO :1-26组成的组中选择的。另一特别实施方案中，本发明使用一种分离多聚核苷酸，其包括的序列是从从SEQ ID NO :27-96组成的组中选择的。也可以使用多聚核苷酸探针和引物和其修饰物。所有这些多聚核苷酸和寡核苷酸探针和引物在此被包括，作为本发明的多聚核苷酸使用。分离的多聚核苷酸也可以用于基因组作图，物理作图，克隆相关性更高或更低的物种基因。利用本领域中已知的技术，如狭缝杂交技术或微阵列分析，使用多聚核苷酸设计的探针可以用于测定在其细胞中具有充分同源DNA和RNA序列的任何器官中的基因的存在，并测定其表达模式。使用多聚核苷酸设计的引物可以用于测序和PCR扩增。多聚核苷酸也可以用作为组合物，例如，药物组合物。多聚核苷酸也可以用于提供健康益处。对于这些益处，多聚核苷酸可以作为表达载体或包括表达载体的宿主细胞而存在。本领域中的技术人员可知，由于遗传密码子的退化，可以制备多种核酸序列，其编码本发明的多肽，具有任何已知和自然发生基因的核酸序列的最小同源性。这样，本发明关注于个可以通过基于可能的编码选择，以选择性重组获得的每一个可能的变体。这些重组产物根据自然发生的氨基酸序列，依据标准三联遗传密码制备，这些变体将被特别叙述。编码多肽，或其片段，或修饰物的核酸序列，可以在合适的选择条件下与自然发生序列中的核酸序列杂交。然而，适合于制备编码一条多肽，或其片段，或修饰物的核酸序列，其具有充分不同的编码情况。根据宿主中使用的特定密码子的频率，选择密码子以增加多肽在特定原核或真核宿主中多肽表达的速度。其他充分改变核酸序列而不改变编码的氨基酸序列的原因包括制备具有更多期望特征的RNA转录产物，如与自然发生序列制备的转录产物相比，更长的半衰期。本发明也包括完全通过化学合成，制备多肽，或片段，或其修饰物。制备后，使用领域中已知的试剂，合成序列可以插入任何可用的表达载体和细胞系统。此外，化学合成可以用于在编码多肽的序列中，或任何片段，或其修饰物中引入突变。如Wahl，G.M. andS.L.Berger(1987 ；Methods Enzymol. 152 :399-407)和 Kimmel, A. R. (1987 ；MethodsEnzymoI. 152 :507-511)所述,在不同条件下,本发明也包括可与权利要求中的核酸序列杂交的多聚核苷酸序列，特别是SEQ ID NO :27-96中显示的序列。领域中已知和常规运用的DNA测序方法可以用于本发明的任何实施方案实践中。方法中可以使用酶，如DNA聚合酶I Klenow片段，SEQUENASE(U. S. Biochemical Corp,Cleveland, OH), Taq polymerase (Perkin Elmer),耐热 T7 聚合酶(Amer shamPharmac i aBiotech, Piscataway, NJ),或EL0NGASE Amplification系统中发现的聚合酶和校正核酸外切酶组合物(LifeTechnologies, Gaithersburg, MD)。合适地,该过程通过机器自动运行，如 Hamilton Micro Lab 2200(Hamilton, Reno, NV), Peltier Thermal Cycler(PTC200 ；MJResearch, Watertown, MA), ABI Catalyst 和 373 及 377DNA 测序仪(Perking Elmer),或Genome Sequencer 20 (Roche Diagnostics)。可以使用特别核酸序列并使用多种领域中已 知的方法，延伸编码多肽的核酸序列，以测定下游序列如启动子和调节元素。例如，可以运用的一种方法，”限制-位点"PCR，使用广泛的引物在已知位点附近寻找未知的序列(Sarkar, G. (1993)PCR MethodsApplic. 2 318-322)。特别的，当存在交联序列引物和已知区域特异引物时，首先扩增基因组DNA。用相同的交联引物和第一种引物内部的其他特异引物对扩增的序列进行第二轮PCR。使用合适的RNA聚合酶对每轮PCR产物转录，并使用反向转录酶测序。可商业获得的毛细管电泳系统可用于分析测序或PCR产物的大小或验证其核酸序列。特别的，毛细管测序可以使用流行性聚合酶进行电泳分离，四种不同荧光燃料(每种对应一种核苷)，其可被激光激活，并通过电荷耦合器件摄像机测定发射波长。使用合适的软件(例如，GEN0TYPER和Sequence NAVIGATOR,Perkin Elmer)可以将输出/光密度转化为电子信号，从上样至计算机分析和电子数据显示的全过程受计算机控制。毛细管电泳特别适合于在特定样品中以有限数量存在的小片DNA。另一实施方案，编码本发明的多肽的多聚核苷酸或其片段可以用于重组DNA分子，在合适的宿主细胞中直接表达多肽，或片段，或其修饰物。由于遗传密码固有的简并性，其他编码相同或功能相等的氨基酸序列的DNA序列也可以被制备，并且这些序列可以用于克隆和表达该多肽。出于多种原因，本发明的核酸序列可以使用领域中已知的方法改变氨基酸编码序列，包括但不局限于，调整基因产物克隆，加工处理，和/或表达的改变。随机序列重构的DNA，和基因片段重新组装的PCR，和合成寡核苷酸，可以用于构建核酸序列。例如，可以使用定点突变插入新的限制性位点，改变糖基化模式，改变编码优选模式，引入突变，和其他改变。本发明的另一实施方案中，编码多肽的自然，修饰，或重组核酸序列可以与异种序列连接以编码融合蛋白。例如，可以用此方法编码可被商业获得抗体是别的嵌合序列。构建的融合蛋白在本发明的多肽和异种蛋白序列之间也可以含有裂解位点，从而多肽可以从异种配基上裂解并纯化。另一实施方案中，使用领域中已知的化学方法，可以合成全部或不分的编码多肽的序列(see Caruthers,M. H. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, Horn, T. etal. (1980)Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232)。可选的，使用化学方法可以合成氨基酸序列，或其片段。例如，可以使用多种固相技术合成多肽(Roberge, J. Y. et al. (1995) Science269 :202-204 ；Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85 :2149-2154)，也可以使用自动合成仪，例如，ABI431A多肽合成仪(PerkinElmer)。可以分别通过化学合成不同的多肽片段并使用化学方法连接以制备全长分子。全长合成多肽可以通过高效液相分离(e.g., Creighton, T. (1983) ProteinsStructures and Molecular Principles, WHFreeman and Co. , New York, NY)。合成多妝组合物可以通过氨基酸分析或测序验证(例如，Edman降解方法；Creighton, supra)。此夕卜，多肽，或其任何部分的氨基酸序列，可以通过直接合成而改变，并且/或使用化学方法，由其他蛋白，或其任何片段进行合并，以制备修饰分子。为表达具有生物学活性的多肽，编码多肽或其功能相似物的核酸序列，可以插入至合适的表达载体，例如，含有插入编码序列所需的 转录和翻译元件的载体。本领域中的技术人员已知的方法可以用于构建表达载体，其包括编码多肽的序列和合适的转录和翻译控制元件。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术，和体内遗传重组。这些技术描述见 Sambrook, J. et al. (1989)Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold SpringHarborLaboratory Press, Plainview, NY ；also, Sambrook, J. et al. (2000)MolecularCloning, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Plainview, NY ；and Ausubel, F.M.et al. (1989)Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York, NY。多种表达载体/宿主系统可以用于包含和表达编码本发明多肽的序列。包括，但不局限于，微生物，如重组噬菌体，质粒，或粘粒DNA表达载体转染的细菌；酵母表达载体转染的酵母；病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV ;烟草花叶病毒，TMV)或细菌表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。对于细菌，有用的质粒包括Invitrogen的pET，pRSET，pTreHis2,和 pBAD 质粒，Novagen 的 pET 和 pCDF 质粒，和 Sigma-Aldrich 的 Director 质粒。特别的，E. coli可以与表达载体pET—起使用。本发明不受使用的表达载体或宿主细胞的限制。“控制元件”或”调节序列”是与宿主细胞蛋白相互反应以实现转录和翻译的非-翻译区域(例如，增强子，启动子，5’和3’非翻译区域)。这些元件在其能力和特异性方面具有多样性。依据使用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适的转录和翻译元件，包括构成性的和诱导性的启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导性的启动子，如 BLUESCRIPT 噬菌体的杂交 IacZ 启动子(Stratagene，LaJolla, CA)或 pSPORTl 质粒(LifeTechnologies)和其类似物。杆状病毒多角体蛋白启动子可以用于昆虫细胞。来源于植物细胞(例如，热休克，RUBISC0，和储存蛋白基因)或植物病毒(例如，病毒启动子或引导序列)的启动子或增强子也可以克隆入载体。在细菌系统中，根据多肽的使用目的可以选择多种表达载体。例如，当需要大量多肽时，可以使用高通量表达融合蛋白并易于纯化的载体。这些载体包括，但不局限于，多功能E. coli克隆和表达载体，如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中编码多肽的序列可以与氨基末端甲硫氨酸和随后的P-半乳糖苷酶的7个残基序列联合并结合入载体中，以制备一种杂交蛋白;pIN载体(Van Heeke,G.和 S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264 :5503-5509)；和类似物。pGEX载体(Promega, Madison, WI)也可以用于表达带有谷胱甘肽S-转移酶(GST)的多肽融合蛋白。通常，这些融合蛋白是可溶的，并可以通过谷胱甘肽-琼脂糖珠吸附，并以谷胱甘肽洗脱，从裂解细胞中纯化。以这些系统制备的蛋白可以设计成包括肝素，凝血酶，或Xa因子蛋白酶裂解位点，从而克隆的多肽可以从GST配基中分离。酵母中，Saccharomyces cerevisias,也可以使用一种包括结构的或诱导启动子,如alpha因子,醇氧化酶，和 PGH 的载体。参阅 Ausubel 等(supra)和 Grant 等(1987)Methods Enzymol。153 :516-544。
特定的初始信号也可以用于获得更有效的编码本发明多肽序列的翻译。这些信号包括ATG初始密码子和临近序列。在编码多肽的序列中，其初始密码，和上游序列被插入至合适的表达载体中，而不需要额外的转录或翻译控制喜好。然而，当仅插入编码序列，或其片段时，需要外源性翻译控制信号，包括ATG初始密码子。此外，初始密码子应当在正确的阅读框内，以保证全部插入序列的翻译。外源性翻 译元件和初始密码子可以是自然和合成等多种来源的。表达的效率可以通过含有增强子而增强，其适合于使用的特定细胞系统，如文献(Scharf, D.等(1994)Results Probl. Cell Differ. 20 :125-162)中描述。此外，可以根据宿主细胞调节插入序列表达或以期望的模式处理表达多肽的能力，对宿主细胞进行选择。序列的修饰包括，但不局限于，乙酰化作用，羧化作用，糖基化，磷酸化，脂化，和酰化。对多肽”前体”形式裂解的翻译后过程也可以用于促进正确的插入，折叠，和/或融合。具有特定细胞机制和翻译后活性特征机制的不同宿主细胞可以从美国菌种保藏中心(ATCC ;BetheSda，MD)获得，并选择以保证序列的正确修饰和处理。特定的宿主细胞包括，但不局限于，Rhodotorula, Aureobasidium, Saccharomyces, Sporobolomyces,Pseudomonas, Erwinia andFlavobacterium ;或其他生物如 Escherichia, Lactobacillus,Bacillus, Streptomyces,和类似物。特别的宿主细胞包括Escherichia coli,其特别适合于本发明的应用，Saccharomyces cerevisiae， Bacillusthuringiensis, Bacillussubtilis，Streptomyces lividans，和类似物。多种技术可以诱导核酸序列进入体外培养的真核细胞。包括化学方法(Feigneret al.，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA，84 :74137417 (1987) ；Bothwell et al.，Methods forCloning and Analysisof Eukaryotic Genes， Eds. ， Jones and Bartlett PublishersInc. ， Boston， Mass. (1990)， Ausubel et al. ， Short Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons，New York, NY(1992)；和 Farhood，Annal NY Acad. Sci.,716 2334(1994))，use of protoplasts (BothwelI，supra)or electrical pulses (Vatteroniet al.，Mutn. Res. , 291 :163169 (1993) ;SabeInikov，Prog. Biophys. Mol. Biol. , 62 119152(1994) ；Bothwell et al.，supra ;和 Ausubel et al.，supra)，use of attenuatedviruses (Davis et al.，J.Virol. 1996，70 (6)，3781 3787 ；Brinster et al.J.Gen.Virol. 2002，83(Pt 2)，369381 ;Moss，Dev. Biol. Stan.，82 :5563(1994)；和 Bothwelletal.，supra)，as well as physical methods (Fynan et al.，supra ; Johnston et al.，Meth. Cell Biol. , 43 (Pt A) :353 365(1994) ；Bothwell et al.，supra ；和 Ausubel etal.，supra) 0通过阳离子脂质体可以成功地将核酸输送入动物组织中(Watanabe等，Mol.Reprod. Dev. 38 :268274 (1994))，直接注射裸露DNA或RNA入动物肌肉组织(Robinson等，Vacc.，11 957 960 (1993)Hoffman et al.，Vacc. 12 :1529 1533 ； (1994) ；Xiang et al.，Virol. ,199 132 140(1994) ；Webster et al. , Vacc,12 :1495 1498(1994) ；Davis etal.，Vacc, 12 :1503 1509(1994) ；Davis et al.，Hum. Molec Gen.，2 :1847 1851 (1993)；Dalemans et al. Ann NY Acad. Sci. 1995，772，255 256. Conry, et al. Cancer Res. 1995，55(7)，1397-1400)，及胚胎(Naito et al. , Mol. Reprod. Dev. ,39 153 161(1994);和Burdon et al.，Mol. R印rod. Dev.，33 :436442(1992))，肌肉内注射自我重复 RNA 疫苗(Daviset al.，J. Virol. 1996，70(6)，3781 3787 ；Balasuriya et al. Vaccine2002，20(1112)，1609 1617)或使用”基因枪”技术皮内注射DNAQohnston等，supra)。使用特异针对蛋白的多克隆或单克隆抗体，对本发明的多肽表达进行测定和检测的多种方法在本领域中是已知的。示范例包括免疫吸收方法(ELISA)，放射免疫(RIA)，和荧光激活细胞分选(FACS)。可以以单克隆抗体与多肽上的两个非-干扰表位反应，使用双-位点，基于单克隆的免疫方法，也可以使用竞争结合方法。其他方面描述了另外的方法，如 Hampton, R 等(1990 ;Serological Mehods, a laboratory Manual, APS Press, StPaul, MN)和 Maddox, D. E.等(1983 ；J. Exp. Med. 158 :1211-1216)。本领域中的技术人员已知多种标记和结合技 术，并可以在不同核酸和氨基酸分析中使用。制备标记的杂交物或PCR探针，以测定多肽相关序列的方法包括寡核苷酸标记，缺口平移，末端-标记或使用标记核苷进行PCR扩增。可选的，编码多肽，或任何片段，或其修饰物的序列，可以克隆入载体以制备mRNA探针。这些在本领域中已知的载体可通过商业获得，并可以通过合适的RNA聚合酶，如17，T3，或SP6，或标记的核苷，在体外合成RNA探针。这些过程可以通过使用多种商业获得的试剂盒而完成，如Amersham Pharmacia Biotech,Promega,和USBiochemical。可用于测定的合适的报告分子或标记物,包括放射性核素,酶，荧光，化学发光，或显色剂及底物，辅酶，抑制物，磁粉，和类似物。表达载体或转化了表达载体的宿主细胞可以在适合于表达和从培养基中回收多肽的条件中培养。培养基可以包括体外或体内表达成分。体外表达成分包括兔网织红细胞裂解物，E. coli裂解物，小麦胚提取物,例如，Invitrogen的Expressway 或RiPs系统，iNtRON Biotechnology 的 Genelator 系统，Novagen 的 EcoPro 或 STP3 系统，Promega的TNT&Quick Coupled系统，和QIAGEN的EasyXpress系统。根据序列和/或使用的载体，培养基中的多肽可以是分泌的或细胞内的。特定方面，编码噬菌体多肽的表达载体可以设计成包括信号序列，其可分泌多肽至原核或真核细胞膜外。其他结构可以包括一种可以促进多肽纯化的氨基酸区域。这些区域包括，但不局限于，金属螯合多肽，如组氨酸-色氨酸(例如，6XHIS)模块，其可以通过固定金属纯化，可通过固定免疫球蛋白纯化的蛋白A区域，和在FLAGR延伸/亲和纯化系统中使用的区域(Immunex Corp, Seattle, WA)。可使用的表位标签包括 3X- FLAG8，HA, VSV-G, V5, HSV,GST, GFP, MBP, GAL4，和P -牛乳糖。可使用的质粒中包括生物素标记(例如，Promega的PinPointTM质粒),I丐调蛋白结合蛋白(例如，Stratagene的pCAL质粒),链霉素结合多肽(例如，Stratagene 的 InterPlay 质粒),c_myc 或FLAG^标签(例如，Sigma-AIdrich的免疫沉淀质粒)，或组氨酸标签(例如，QIAGEN的QIAExpress质粒)。表达载体可包括Factor Xa或肠激酶特异的可裂解的连接序列(Invitrogen, SanDiego，CA)，以促进纯化。例如，载体在纯化区域和多肽间可以包括一个或多个连接。这些表达载体表达的融合蛋白包括本发明的多肽和带有硫氧还蛋白或肠激酶切割位点的编码6个组氨酸残基的核酸。组氨酸残基促进IMAC纯化(固定金属例子亲和色谱，如Porath，J.等描述(1992)Prot. Exp. Purif. 3 :263-281)，而肠激酶切割位点提供了从融合蛋白中纯化多肽的方法。Kroll，D. J等描述了含有融合蛋白的载体(1993 ;DNACell Biol. 12 441-453)。抑制GH和/或相关激素的多聚核苷酸
如此所述，根据本发明的一个实施方案中，多聚核苷酸可以用于抑制GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL。这些多聚核苷酸可以是DNA，RNA,单链，或双链。这里所指的本发明使用的多聚核苷酸为”分离”的多聚核苷酸。分离的多聚核苷酸可以通过本领域中已知的技术获得。例如,可以使用Sambrook，J.等描述的重组DNA技术(1989)分子克隆实验室手册(第2版)，冷泉港实验室出版社,Plainview,NY andSambrookand Russell(2000)Molecular Cloning A LaboratoryManual(3rd Edition), Cold SpringHarbor Laboratory Press, Planinview, NY.相似地，可以使用化学合成，如憐酸胺和固相化学。多聚核苷酸可以根据描述的核酸序列数据，已 知的核苷碱基的相互交互关系，已知的同源物序列，和使用的特定的核酸技术进行设计，以下将进行例证。一个实施方案，干扰RNAs (iRNAs或siRNAs)可以用于抑制GH和/或相关激素的表达，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL。iRNA技术中使用的多聚核苷酸与其目标100%互补。然而，可喜的是，该需要对于iRNA保留目标特异性和抑制翻译的能力并非必须。示范性的iRNA分子可以为带有3’ 二核苷酸悬臂的18至21bp双链RNAs，而更短或更长的分子也可以使用。当iRNA以合适的核酸载体通过体外制备时，其典型地为具有茎-环结构的RNA分子，例如，19个核苷茎部和9核苷环状，并在3’末端具有2-3Us。Cenix提供了设计siRNA 的适用算法(Dresden, Germany, via Ambion, TX)。示范性的siRNA分子可以包括以下序列一方面，iRNA包括了以下组中选择的核酸序列5' -GAGGGCAGTGCCTTCCCAA-3' (SEQ ID NO 33)5' -GCCTATATCCCAAAGGAAC-3' (SEQ ID NO 34)5' -CCTGGTGTACGGCGCCTCT-3' (SEQ ID NO 35)5' -CTGACAGCAACGTCTATGA-3' (SEQ ID NO 36)5' -GTATTCATTCCTGCAGAAC-3' (SEQ ID NO 37)5' -CAGCCTGGTGTACGGCGCC-3' (SEQ ID NO 38)5' -CGATGACGCACTACTCAAG-3' (SEQ ID NO 39)合适的方面，iRNA包括以下组中选择的序列5' -GAGGGCAGTGCCTTCCCAATTCAAGAGATTGGGAAGGCACTGCCCTC-3' (SEQ ID NO :40)I--- 正义链 ---1—Loop—- 反义链 -5' -GCCTATATCCCAAAGGAACTTCAAGAGAGTTCCTTTGGGATATAGGC-3' (SEQ ID NO 41)I--- 正义链 ---1—Loop—- 反义链 -5' -CCTGGTGTACGGCGCCTCTTTCAAGAGAAGAGGCGCCGTACACCAG-3' (SEQ ID NO 42)I--- 正义链 ---1—Loop—- 反义链 _|5' -CTGACAGCAACGTCTATGATTCAAGAGATCATAGACGTTGCTGTCAG-3' (SEQ ID NO 43)I--- 正义链 ---1—Loop—- 反义链 _|5' -GTATTCATTCCTGCAGAACTTCAAGAGAGTTCTGCAGGAATGAATAC-3' (SEQ ID NO :44)I--- 正义链 ---1—Loop—- 反义链 _|5' -CAGCCTGGTGTACGGCGCCTTCAAGAGAGGCGCCGTACACCAGGCTG-3' (SEQ ID NO 45)I--- 正义链 ---1—Loop—- 反义链 -5' -CGATGACGCACTACTCAAGTTCAAGAGACTTGAGTAGTGCGTCATCG-3' (SEQ ID NO 46)
I--- 正义链 ---1—Loop—- 反义链 _|另一合适的方面，iRNA包括以下组中选择的核酸序列5' -XXXXGAGGGCAGTGCCTTCCCAATTCAAGAGATTGGGAAGGCACTGCCCTCXXXX-3'I--- 正义链 ---1—Loop—- 反义 链 _|(SEQ ID NO -Al)5' -XXXXGCCTATATCCCAAAGGAACTTCAAGAGAGTTCCTTTGGGATATAGGCXXXX-3'I--- 正义链 ---1—Loop—- 反义链 _|(SEQ ID NO 48)5' -XXXXGCCTGGTGTACGGCGCCTCTTTCAAGAGAAGAGGCGCCGTACACCAGXXXX-3'I--- 正义链 ---1—Loop—- 反义链 _|(SEQ ID NO 49)5' -XXXXGCTGACAGCAACGTCTATGATTCAAGAGATCATAGACGTTGCTGTCAGXXXX-3'I--- 正义链 ---1—Loop—- 反义链 _|(SEQ ID NO:50)5' -XXXXGTATTCATTCCTGCAGAACTTCAAGAGAGTTCTGCAGGAATGAATACXXXX-3'I--- 正义链 ---1—Loop—- 反义链 _|(SEQ ID NO:51)5' -XXXXGCAGCCTGGTGTACGGCGCCTTCAAGAGAGGCGCCGTACACCAGGCTGXXXX-3'I--- 正义链 ---1—Loop—- 反义链 _|(SEQ ID NO:52)5' -XXXXGCGATGACGCACTACTCAAGTTCAAGAGACTTGAGTAGTGCGTCATCGXXXX-3'I--- 正义链 ---1—Loop—- 反义链 _|(SEQ ID NO:53)“X”表示任何数量的额外核苷，其存在于有利于克隆和表达iRNA的终止信号和限制性位点。非-限制性实施例，以下核酸可以用于在设定的载体中克隆和表达本发明使用的iRNAs BamHIHind III5' -ggatccGAGGGCAGTGCCTTCCCAATTCAAGAGATTGGGAAGGCACTGCCCTCTTTTTGGAAaagtcc-31I 正义链I Loop I反义链I终止子(SEQ ID NO:54)BamHIHind III5' -ggatccGCCTATATCCCAAAGGAACTTCAAGAGAGTTCCTTTGGGATATAGGCTTTTTGGAAaagtcc-31I 正义链I Loop I反义链I终止子(SEQ ID NO:55)BamHIHind III5' -ggatccGCCTGGTGTACGGCGCCTCTTTCAAGAGAAGAGGCGCCGTACACCAGGCTTTTTTGGAAaagtcc-3!I 正 义链I Loop I反义链 I终止子(SEQ ID NO :56)BamHIHind III5' -ggatccGCTGACAGCAACGTCTATGATTCAAGAGATCATAGACGTTGCTGTCAGAGTTTTTTGGAAaagtcc-3'I 正义链I Loop I反义链 I终止子(SEQ ID NO :57)BamHIHind III5' -ggatccGTATTCATTCCTGCAGAACTTCAGAGAGTTCTGCAGGAATGAATACTTTTTTGGAAaagtcc-31I 正义链I Loop I反义链 I终止子(SEQ ID NO :58)BamHIHind III5' -ggatccGCAGCCTGGTGTACGGCGCCTTCAAGAGAGGCGCCGTACACCAGGCTGTTTTTTGGAAaagtcc-3'I 正义链I Loop I反义链 I终止子(SEQ ID NO :59)BamHIHind III5' -ggatccGCGATGACGCACTACTCAAGTTCAAGAGACTTGAGTAGTGCGTCATCGTTTTTTGGAAaagtcc-3'I 正义链I Loop I反义链I终止子(SEQ ID NO :60)根据这里的”实施例”章节中描述的技术可以制备iRNA分子。关于怎样制备和设计此类分子的额外信息可见，例如，McManus MT and Sharp PA(2002)Gene silencingin mammals bysmall interfering RNAs. Nature Rev. Genet. 3 :737747 ；Dillin A(2003)The specifics of small interfering RNA specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA100(11) :6289-6291 ；and Tuschl T(2002)Expanding small RNA interference. NatureBiotechnol. 20 446-448 本领域中的技术人员将理解siRNA为短/小干扰RNA，其包括双链RNA，典型地包括21至23碱基对，其可以通过化学合成。比较而言，shRNA指小发卡RNA，也称为基于载体的siRNA，其包括单链RNA，其通过体外或体内表达。典型地，shRNA包括与目标mRNA(正义链)同源的序列，一段”环状”区域和与目标序列互补的序列(反义序列)。ShRNA形成发卡二级结构，该结构通过酶切割，去除发卡，转变为siRNA。这样，这里描述的序列可以用于制备shRNAs，并转变为期望的siRNAs。本发明的另一实施方案中，使用反义分子。这里使用的术语”反义”将被广泛应用。其指任何可以结合激素转录物的核酸(合适地为RNA，也包括单链DNA)。典型地，反义分子或多聚核苷酸包括15至25核苷，其可以与目标mRNA完全互补。然而，也可以使用更长的反义多聚核苷酸，包括全长序列。同时，保留了目标特异性和抑制表达能力的与目标非完全互补的反义分子也可以被使用。本发明相关领域的普通技术人员可以根据 这里描述的，及提供的序列数据，使用反义分子。关于反义技术的额外信息可见，例如Kandimalla ER, Manning A, Lathan C,Byrn RA, Agrawal S. Design, biochemical, biophysical and biological propertiesofcooperative antisense oligonucleotides ；Nucleic Acids Res. 1995Sep 11;23(17) :3578-84 ；Tseng BY, Brown KD. Antisenseoligonucleotide technology in thedevelopment of cancertherapeutics ；Cancer Gene Ther. 1994 Mar ；I (I) :65-71;Bryschff,Schlingensiepen KH. Design and application of antisenseoligonucleotidesin cell culture, in vivo, and as therapeutic agents ；Cell MoI Neurobiol. 1994Oct ； 14 (5) :557-68 ；Han J, Zhu Z, Hsu C, Finley WH. Selection of antisenseoligonucleotides on thebasis of genomic frequency of the target sequence ；Antisense ResDev. 1994 Spring ；4(I) :53_65。根据本发明，DNA酶，单链DNA，核酶，和三链DNA也可以抑制激素。本领域的普通技术人员可以根据这里所描述的，提供的序列数据和目前的方法学，容易地获得核酶，DNA酶，三链，和单链DNA。然而，这些技术的示范性方法学见JosephSambrook和Davidff. Russell. Molecular Cloning A LaboratoryManual(third Edition), Cold SpringHarbor Laboratory Press, NY.本发明使用的多聚核苷酸，包括反义链，iRNA，核酶和DNA酶可以通过化学修饰以增加稳定性或防止降解。例如，核酸分子可以包括非自然碱基类似物，修饰糖基，特别是在核糖的2’位点，或改变的磷酸骨架。本发明使用的多聚核苷酸也可以包括定位降解任何与其结合的转录产物的序列。例如，可以包括Rnase H特异性序列。另一实施例是外源引导序列(EGSs),其可以募集核酶(Rnase P)以降解反义分子结合的转录产物。通过在转录物，活性基因的完全互补物，mRNAs，或特定细胞的转录物中筛选同源的候选序列，以确保反义多聚核苷酸，iRNAs，核酶，DNA酶，和cDNAs的类似物的特异性。技术人员可以选择合适的算法设计和保证这些多聚核苷酸的特异性。本发明使用的多聚核苷酸可以为体外制备的核酸分子形式，如，单链DNA，iRNA,反义RNA，或DNA酶。可选的，其可以作为适合于产生合适的核酸的载体形式被使用，例如，反义链分子，iRNA，或核酶。本发明将使用任何领域中已知的载体。例如，使用带有CMV启动子的裸露质粒。病毒载体也是合适的，例如腺-相关病毒(AAV)和慢病毒。以下提供了合适的启动子和病毒载体的合适例子。使用这些病毒载体的优点之一是相对于对组织或肿瘤的定点给药，其可以通过系统性给药。本发明使用的载体或结构可以包括合适的基因元件，例如领域中已知的启动子，增强子，复制起点，包括诱导性的，构建性的，或组织特异的启动子。特定实施方案中，载体包括的诱导性启动子与编码本发明的核酸的区域连接(例如，反义链或合适的siRNA)，从而通过控制转录诱导物的存在或缺失，对核酸的表达进行控制。另一实施方案中，本发明的核酸分子的侧翼具有在基因组期望位点促进同源重组的区域，从而达到期望核酸的染色体内整合(Koller 和 Smithies, 1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :8932-8935 ；Zijlstra等，1989, Nature 342:435-438)。当然，载体也可以位于染色体外。
本发明的另一实施方案中，将使用PNAs。PNAs是多肽-核酸杂交产物，其中磷酸骨架已经被N-(2-乙基)-甘氨酸单元构成的非手性中性 骨架替换(见，例如，EurekahBioscienceCollection. PNA 和 Oligonulcotide Inhibitors of HumanTelomerase.G. Gavory 和 S. Balasubramanian, Landes Bioscinece, 2003)。喊基 A, G, T, C 通过亚甲基擬基连接与氨基氮结合(P. E. Nielsen 等，Science 1991, 254 :1497-1500 ;Μ· Egholm 等,Naturel993. 365 :566-568)。PNAs高度特异结合互补序列，相对于类似的DNA或RNA具有更高的亲和力(M. Egholm等，supra)。相对于对应的DNA/DNA或DNA/RNA复合物，PNA/DNA或PNA/RNA杂交物也显示了更高的热稳定性(M. Egholm等，supra)。由于非自然性氨基骨架不被核酸酶或蛋白酶识别，PNAs也具有高度化学和生物学稳定性(V. Demidov等，BiochemPharmacol 1994,48:1310-1313)。典型地，PNAs至少为5个碱基长度，并包括末端赖氨酸。PNAs也可以聚乙二醇化以进一步增加其有效期(Nielsen，P. E.等(1993)Anticancer Drug Des. 8 :53-63)。非限制性例子中，反基因PNAs可以与基因编码DNA链中唯一序列相互补，并设计成可抑制mRNA的合成。 抑制GH和/或相关激素的抗体本发明包括GH和/或相关激素的抗体，特别是hGH或人类生长激素基因簇编码的激素，多育曲菌素产物或催乳素基因产物，例如，hPRL，或hPL。例如，与激素或其修饰序列的至少一部分结合的抗体。本发明的特定方面，抗体可以用于抑制一种或多种此类激素。应当理解，抗体的片段或修饰物不需要完全与抗体相同。即，片段或修饰产物不需要募集免疫系统细胞至结合激素的体内位点。产生综合抗体是非必需的。本发明涉及领域的普通技术人员知道制备抗体片段的方法。本发明的抗体片段可以包括完整抗体的一部分，通常为抗体的抗原结合或可变区域。作为常规示范例，可以通过将完整抗体蛋白水解制备片段，或通过重组核酸技术直接制备片段。本发明相信这里描述的抗体，抗体片段，或其修饰物，可应用于激素-介导功能的调控。特别的，发明已经显示抗体可以用于抑制激素水平和/或活性，从而可以应用于治疗主体中的多种失调。应当理解基本的抗体结构单元包括一个四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一个”轻”链(约25kDa)和一个”重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括100至110或更多氨基酸构成的可变区域，对应于抗原识别。每条链的碳末端为一个恒定区域，对应于效应功能。人类轻链分类为kappa和lambda轻链。重链分类为mu,delta, gamma, alpha,或epsilon,并且抗体类型为IgM, IgD, IgA,和IgE。轻链和重链中，可变区和恒定区通过约12或更多氨基酸的” J”区域连接，重链中也包括一个约为10多个氨基酸的”D” 区域。参阅，Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, ff, ea, 2nd ed. Raven Press,N..Y. (1989))。每条轻链/重链对的可变区域形成抗体结合位点。可以根据类型和表位图谱，某些情况下，根据其抑制激素与其受体结合的能力，对本发明的抗体进行特征化。本发明已经定义了可用于制备抑制抗体的激素范围。抑制激素结合或活性的药物已经在方法中应用于治疗这里描述的多种失调。识别GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL，但不能抑制受体结合的抗体，也是所期望的。如之后描述，这些抗体可用于测定和纯化这些激素，以及诊断和监控主体中失调的发展情况。这些抗体也可以用于分析激素的翻译后修饰产物，或其他修饰的序列。抗体的人源化可以用于减少在其他动物中制备的抗体的免疫原性。可以使用领域中已知的激素获得人源化抗体或抗体的人源化。将啮齿类单克隆抗体进行人源化的最常规方法是 CDR 移植(Reichmann，L，M. Clark, H. Waldman, and G Winter. 1998.Reshaping human antibodies for therapy. Nature 332L323—327 ；Jones PT，Dear PH,Foote J，Neuberger MS，Winter G 1986. Replacing the complementarity determiningregions in a humanantibody with those from a mouse. Nature 321 :522-25)和表面重构(Pedersen，J. T.，A. H. Henry, S. J. Searle, B. C. Guild，M. Roguska，and A. R. Rees. 1994.Comparison of surface accessibleresidues in human and murine immunoglobulinFv domains. Implication for humanization of murine antibodies. J. MoI. Biol. 235 959-973) o也可以通过表位-指导选择获得人源化 抗体(Wang et al，J. ImmunologicalMethods 241 :171-184，2000)。Maynard，J，和 georgioud 的方法，Antibody engineering.Annu RevBiomed Eng 2:339-375。提供了进一步的不范例。可以根据合理的设计方法和重复优化制备人源化抗体，例如，通过计算机模型化的定点突变框架残基。可以使用噬菌体显示的其他可选的人源化方法。见，例如，Baca, M.，L. G. Presta, S. J. O ! Connor，and J. A. Wells. 1997. Antibody humanizationusingmonovalent phage display. J. Biol. Chem. 272 :10678-10684 ;Hoogenboom，H. R.，A. P. de Bruine, S. E. Hufton，R. M. Hoet，J. W. Arends, and R. C. Roovers. 1998. Antibodyphage displaytechnology and its applications. Immunotechnology. 4 :1—20 ;Jespers，L. S.，A. Roberts，S. M. Mahler，G. Winter, and H. R. Hoogenboom. 1994. Guiding theselection of human antibodies fromphage display repertoires to a single epitopeof an antigen. Biotechnology (NY) 12 :899-903 ；Rader, C. and C. F. Barbas, III. 1997.Phage display of combinatorial antibody libraries. Curr.Opin.Biotechnol.8 503—508 ;Rader，C，D. A. Cheresh，and C.F. Barbas，III. 1998. A phage display approachfor rapid antibodyhumanization !designed combinatorial V gene libraries.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 95 :8910-8915 ;Rosok，M. J.，D. E. Yelton，L. J. Harris,J. Bajorath，Κ. E. Hellstrom，I. Hellstrom，G. A. Cruz, K. Kristensson，H. Lin, W. D. Huse，and S. M. Glaser. 1996. Acombinatorial library strategy for the rapid humanizationof ant i car c inoma BR96 Fab. J. Biol. Chem. 271 :22611-22618.其他方面，可以使用以人类免疫球蛋白位点重构的转基因动物制备人类抗体，例如，XenoMouse品种。这些品种使得可以在动物中制备完全的人类抗体(Mendez，M. J. , L. L. et al. 1997. Functional transplant of megabase human immunoglobulinlocirecapitulates human antibody response in mice. Nat.Gen. 15 146-156)。XenoMouse动物，包括了含有66个人类重链和23Kppa轻链免疫球蛋白基因的酵母人工染色体(YACs)，其中内源性重链和kappa位点通过目标性删除在功能上失活(Mendez等，supra) ο小鼠表达人类mu，delta，gamma2，和kappa链和小鼠lambda链，其中人类kappa-小鼠lambda比率为75 : I (Mendez等，supra)。XenoMouse动物已经显不可以产生针对抗原的人类抗体(Green，LL，et al. 1994. Antigen-specific humanmonocIonaIantibodies from mice engineered with human Ig heavyand light chain YACs. Nat.Gen. 7 :13-21 ；Mendez et al.，supra)，并可以对T-依赖的抗原如多糖产生应答。一个实施例中，两种或多种具遗传差异的XenoMouse动物组可以用于制备抗体，例如，Xm2a_3品种，以含有重链和轻链基因的双YAC重新构建；及Xm2a-5品种，以两个YAC重构，其中一个含重链而另一个含轻链基(Jakobovits，A. 1995. Production of fullyhuman antibodiesby transgenic mice.Curr. Opin. Biotechnol. 6 :561-566 ；see,also,Russell ND et al.，Production of protectivehuman antipneumococcal antibodies by transgenic micewith humanimmunogIobuIin loci.Infect Immun. 2000 Apr ；68 (4) :1820-6)。本发明相关领域的技术人员将理解 术语”双功能抗体”和”三功能抗体”。这些分析以短肽连接的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该短肽过于短小以至于无法在同一条链上的两个区域配对。其促进了与一条或多条其他链的互补区域的配对，并促进了带有两种或多种功能性抗原结合位点的二聚或三聚分子的形成。这些抗体分子可以是单特异性或多特异性的(例如，双功能抗体的双特异性)。这些抗体分子可以通过使用本发明相关领域中的标准方法由两种或多种抗体制备。见，例如，Todorovska etal. Designand application of diabodies， triabodies and tetrabodiesfor cancer targeting.J. Immunol. Methods. 2001 Feb I ;248(1_2) :47-66 ；Holliger P，Prospero T，and WinterG， Diabodies smallbivalent and bispecific antibody fragments， Proc Natl AcadSci USA，90，6444-6448，1993 ;and Tomlinson I and Holliger PiMethodsfor generatingmultivalent and bispecific antibody fragments， Methods Enzymol，326，461—479，
2000o抗体的制备将根据领域中的标准方法进行。例如，可使用Bean描述的多克隆抗体的制备方法(Eric S. Bean (2001) Polyclonal Antibodies. In Basic Methodsin Antibody Productionand Characterization antibodies. Howard, G, and BethelD. (ed. ), CRC Press, 5 :21-50,2000)。根据 Stewart 的方法(Sandy J. Stewart(2001)Monoclonal Antibody Production. In BasicMethods in Antibody Production andCharacterization antibodies. Howard, G. and Bethel D. (ed. ), CRC Press,6 :51-68,2000),或根据单克隆抗体制备技术和应用，Lawrence B Schook eds, Marcel Dekker Inc,New York, 1987,可以制备单克隆抗体和对应的杂交瘤。杂交瘤可以使用领域中的标准方法进行亚克隆，生长和维持。例如，其可以在体内培养基中生长和维持，例如DMEM或RPMI-1640。可选的，也可以在选取的动物中以腹水瘤形式进行体内培养。本发明的抗体可以根据发明相关领域中已知的标准方法从培养上清，腹水，或血清中分离。以下提供了这些技术的一个示范例。然而，在其他示范例中，分离或纯化可以通过一种或多种方法进行，如亲和色谱，例子交换色谱，作用色谱，凝胶亲和色谱，嗜硫凝胶色谱，色谱聚焦，A-蛋白或G-蛋白琼脂糖柱，羟磷灰石柱，洗涤剂提取，电泳，渗压震扰处理，包涵体纯化，硫酸铵沉淀，液体聚合物离心，过滤，和透析。可以使用领域中多种标准技术从转化细胞，或培养基，或转基因动物中获得本发明中的重组抗体。本发明抗体的氨基酸序列可以使用标准方法测定，例如，使用Edman降解和HPLC,或质谱分析(M. ff. Hunkapiller,R. M. Hewick, WJ. Dreyer, and L. E. Hood. 1983. High-Sequencing with a Gas-PhaseSequenator. MethodsEnzymol. 91 :399)。标准方法可以用于鉴定对抗体制备有用的氨基酸序列。可以预测多肽的抗原决定族片段，例如，通过 Abie Pro 3. O PeptideAntibody Design (hypertext transferprotocol //world wide web.changbioscience.com/abie/abie.html)。更特别的，抗原决定族片段可以根据 Hopp-Woods scale (Hopp TP, Woods KR. Predictionof proteinantigenic determinants from amino acid sequences. ProcNatl Acad Sci USA.1981Jun ；78 (6) :3824-8.)和 / 或 Kyte 和 Doolittle scale (Kyte J, Doolittle RF.A simplemethod fordisplaying the hydropathic character of a protein. J MoI Biol. 1982May5 ；157(1) :105-32.)进行预测。特别的计算机算法包括MAPAG (Aguilar RC, ReteguiLA, Roguin LP Int J BiomedComput. 1994 Nov-Dec ；37 (3) :225-35) ；PEOPLE (Alix AJ:Vaccine. 1999 Sep ； 18 (3-4) :311-4) jPHYDRPHIL(E A Mesri 等，J Clin Microbiol. 1990June ；28 (6) :1219-1224)。这些表位可以是构象特异性的，其可以包括非连续残基，并可以由预测的抗原决定簇序列不同部分构成(例如，以下SEQ IDNO 10-20中的任何部分)，或一个或多个预测抗原决定簇序列的联合(例如，SEQ ID NO 10-20中的一个或多个联合)，或一个或多个全长序列(例如，SEQ ID NO 10-20中的一个或多个)。自然多肽中具有的抗原决定簇序列，其可能包括任何氨基酸或其派生物的组合，并可形成类似3-D结构(例如，表面残基)。下表I显示了 hGH的预测抗原决定簇区域(ADs)。表2显示了 hGH的预测构象表位。表3显示了 hGH的预测序列表位。表4显示了 hPRL的预测抗原决定簇。表5显示了hPRL的预测构象表位。这些表中，小写字母表示该氨基酸与多肽3D结构的形成较少关联(例如，作为抗原决定簇的可能性较小)，而大写字母表示该氨基酸与多肽3D结构的形成关联较大(例如，更有可能作为抗原决定簇)。表I
权利要求
1.一种抑制肿瘤细胞增殖或存活的方法，包括将以下抑制药物接触所述的细胞 a)人类生长激素基因簇基因成员，多育曲菌素或催乳素基因；或 b)人类生长激素基因簇基因成员，多育曲菌素或催乳素基因的多肽产物。
2.一种在需要的主体中治疗或预防癌症，细胞增殖失调或细胞存活失调的方法，包括包括将以下抑制药物处理所述的细胞 a)人类生长激素基因簇基因成员，多育曲菌素或催乳素基因；或 b)人类生长激素基因簇基因成员，多育曲菌素或催乳素基因的多肽产物。
3.根据权利要求I或2的方法，其中人类生长激素基因簇基因成员是从以下组中选择的，人类生长激素l(hGHl)基因，人类生长激素2(hHG2)基因，绒毛膜生长激素I(CSHl)基因，绒毛膜生长激素2(CHS2)基因，人类绒毛膜生长催乳相似激素(CSL)基因，人类绒毛膜生长催乳相似激素2(CSL-2)基因，人类绒毛膜生长催乳相似激素3 (CSL-3)基因，人类绒毛膜生长催乳相似激素4(CSL-4)基因。
4.根据权利要求I或2的方法，其中多育曲菌素基因是多育曲菌素或多育曲菌素相关蛋白基因。
5.根据权利要求I或2的方法，其中催乳素基因是催乳素或催乳素相关蛋白基因。
6.根据权利要求I或2的方法，其中所述的抑制药物是一种可以抑制人类生长激素基因簇基因成员，多育曲菌素基因或催乳素基因的多肽产物表达的分离的siRNA。
7.根据权利要求I或2的方法，其中所述的抑制药物是一种可以抑制人类生长激素基因簇基因成员多肽产物表达的分离的siRNA。
8.根据权利要求1，2，6，7中任意一项的方法，其中人类生长激素基因簇基因成员的多肽产物是从以下组中选择的，催乳素(PRL)，催乳素-相关蛋白，生长激素I (hGHl)，生长激素2 (hHG2)，绒毛膜生长激素I (CSHl)，绒毛膜生长激素2 (CHS2)，人类绒毛膜生长催乳相似激素(CSL)，人类绒毛膜生长催乳相似激素2 (CSL-2)，人类绒毛膜生长催乳相似激素.3 (CSL-3)，人类绒毛膜生长催乳相似激素4 (CSL-4)，多育曲菌素和多育曲菌素_相关蛋白。
9.根据权利要求1，2，6，7中任意一项的方法，其中所述的多育曲菌素基因的多肽产物是多育曲菌素或多育曲菌素-相关蛋白。
10.根据权利要求1，2，6，7中任意一项的方法，其中所述的催乳素基因的多肽产物是催乳素或催乳素-相关蛋白。
11.根据权利要求7的方法，其中所述的分离siRNA包括从SEQIDNOs :33-60和97-98组成的组中选择的核酸序列。
12.根据权利要求7的方法，其中所述的抑制药物是一种与人类生长激素基因簇基因成员，多育曲菌素基因或催乳素基因肽产物的线性或构象表位结合的抗体。
13.根据权利要求12的方法，其中所述的抑制药物是一种结合人类生长激素多肽或人类催乳素多肽的抗体。
14.根据权利要求13的方法，其中所述的人类生长激素多肽是从包括SEQIN NOs .10-20的组中选择的。
15.根据权利要求13的方法，其中所述的人类催乳素多肽是从包括SEQIN NOs :21-26的组中选择的。
16.根据权利要求I的方法，其中所述的肿瘤细胞是上皮肿瘤细胞。
17.根据权利要求16的方法，其中所述的上皮肿瘤细胞是从肺癌，结肠癌，乳腺癌，前列腺癌，子宫内膜癌中选择的。
18.根据权利要求2的方法，其中所述的细胞增殖失调是子宫内膜异位。
19.根据权利要求1-18中任意一项的方法，进一步包括第二种化合物的治疗，其中所述的第二种化合物是一种化学治疗或抗-肿瘤药物。
20.一种特异结合人类生长激素多肽的抗体，其中所述的抗体结合所述的人类生长激素多肽上的构象表位。
21.根据权利要求20的抗体，其中所述的构象表位是从表2中显示的构象表位中选择的。
22.—种特异结合人类生长激素多肽的抗体，其中所述的抗体结合所述的人类生长激素多肽上的序列表位。
23.根据权利要求22的抗体，其中所述的序列表位是从表3中显示的序列表位中选择的。
24.一种特异结合人类生长激素多肽的抗体，其中所述的抗体包括从表I显示的抗原决定簇中选取的抗原决定簇。
25.一种特异结合人类催乳素多肽的抗体，其中所述的抗体结合所述的人类催乳素多肽上的构象表位。
26.根据权利要求25的抗体，其中所述的构象表位是从表5中显示的构象表位中选择的。
27.一种特异结合人类催乳素多肽的抗体，其中所述的抗体包括从表4显示的抗原决定簇中选取的抗原决定簇。
28.—种包括根据权利要求20-27的任何之一的抗体的组合物，其中所述的组合物进一步包括一种药物可接受载体。
29.—种包括从包括SEQ ID NO :33-39和97-98的组中选择的核酸序列的siRNA，其中所述的分离siRNA可以抑制人类生长激素多肽的表达。
30.一种包括一条正义RNA链和一条反义RNA链的分离的siRNA，其中正义和反义RNA链形成一个RNA复合物，其中所述的分离siRNA包括从SEQ ID NOs :40-60组成的组中选择的核酸序列，并所述的siRNA可以抑制人类生长激素多肽的表达。
31.根据权利要求29或30的siRNA，其中人类生长激素多肽是从以下组中选择的，催乳素(PRL)，催乳素-相关蛋白，生长激素I (hGHl)，生长激素2 (hHG2)，绒毛膜生长激素I (CSHl)，绒毛膜生长激素2 (CHS2)，人类绒毛膜生长催乳相似激素(CSL)，人类绒毛膜生长催乳相似激素2 (CSL-2)，人类绒毛膜生长催乳相似激素3 (CSL-3)，人类绒毛膜生长催乳相似激素4 (CSL-4)，多育曲菌素和多育曲菌素-相关蛋白。
32.一种包括根据权利要求29-31任何之一的siRNA的组合物，其中所述的组合物进一步包括一种药物可接受载体。
33.一种在主体中诊断癌症，细胞增殖失调或细胞存活失调的方法，包括将所述主体的实验样本与根据权利要求20-27任何之一的抗体接触，并测定结合所述样品的抗体的水平，其中相对于结合对照样品的水平，结合所述样品的抗体的升高水平显示存在癌症，细胞增殖失调或细胞存活失调。
34.根据权利要求33的方法，其中所述的癌症是上皮癌。
35.根据权利要求34的方法，其中所述的上皮癌是从肺癌，结肠癌，乳腺癌，前列腺癌，子宫内膜癌中选择的。
36.根据权利要求33的方法，其中所述的细胞增殖失调是子宫内膜异位。
37.根据权利要求1-19或33-36中任意一项的方法，其中所述的主体是人类。
全文摘要
本发明包括生长激素和相关激素的新型抑制剂，包括促乳素，和胎盘催乳激素，和其它激素。本发明特别包括抗体，抗体片断，和其修饰物，以及多聚核苷酸，反义多聚核苷酸，干扰RNAs，小干扰RNAs，和使用这些物质抑制一种或多种上述激素的方法。特别方面，本发明包括制备这些抑制剂，包括一种或多种这些抑制剂的组合物的方法，以及使用一种或多种抑制剂抑制细胞，特别是肿瘤细胞的方法，例如，抑制细胞增殖，细胞存活，或细胞运动性。本发明也包括使用一种或多种描述的组合物或抑制剂，进行诊断和监控的方法，特别是治疗肿瘤的方法。
文档编号C12N15/113GK102711773SQ200880100916
公开日2012年10月3日 申请日期2008年5月30日 优先权日2007年5月30日
发明者P·罗比 申请人:奥克兰联合服务有限公司