专利名称：来自具有储藏根的草本植物形成层的植物干细胞系及其分离方法
技术领域：
本发明涉及来自具有储藏根的草本植物形成层的植物细胞系及其分离方法，更具 体涉及具有细胞分裂能力的来自形成层的同质细胞系及其分离方法，所述细胞系从具有储 藏根的草本植物的含有形成层的储藏根组织得到而不需要单独的去分化步骤。
背景技术：
人参(Panax ginseng C. A. Meyer)含有大量有用物质，诸如人参皂苷、聚乙炔化合 物、多酚化合物、含具有宿主防御功能的蛋白质的多糖、具有抗补体活性的多糖以及酸性多 糖。但是，其难以培养并可引起与杀虫剂污染、环境破坏等有关的问题。另外，其非常昂贵， 因为其必须培养至少4年以便将其储藏根用于医疗目的，因此需要大量的人力和成本。由于这种原因，已经进行了有关使用生物工程方法在体外生产大量人参细胞或者 大量生产人参不定根、毛根以及类似物的方法的研究。据报道，通过使用这种细胞培养方法 体外培养人参细胞得到的细胞团(被称为愈伤组织)的生长速度高于野外得到的人参植物 (韩国专利注册10-0333559)，并且培养的人参细胞的皂苷含量没有明显低于人参根的皂 苷含量(Asaka 等人，PlantMed.，59 :345，1993)。因此，通过培养人参不定根(人参或者野山参-Korea Forest Service, CBNBiotech, Neobio, KT&G Research Institute, Microp 1 ants Bioscience feBiotechnology等)或者人参细胞(Nitto Denkojapan等)得到的物质正在被用作食物 和化妆品的原材料(韩国专利注册10-0601903、韩国专利注册10-0637342、韩国专利公开 10-2004-0014584)。特别是，野山参(true wildginseng)非常稀有并且非常昂贵，集中在培 养不定根及其种子以大量生产人参产品的研究已经在各个公司和研究所活跃地进行(韩 国专利公开 10-2005-0078372)。当培养草本植物诸如人参、野山参及类似物时，待用作培养材料的组织是根，即储 藏根。储藏根组织是在土壤中长期掩埋以形成与土壤微生物的各种关系同时在其生命过程 中吸收土壤中的水分和无机养分的部分。为了在植物细胞或者组织培养中使用储藏根组 织，需要对组织进行灭菌。但是，有许多难以从根部组织中通过表面灭菌除去微生物的报 道，因为高浓度的灭菌液将破坏组织，而低浓度的灭菌液将引起组织被各种真菌和细菌污 染。尤其是在土壤中长期生长的野外培养的人参和野山参的情况下，这种污染现象变得严 峻(韩国专利注册 10-0478213 ;Teng，W. L.等人，Plant Cell Tissue OrganCult.，68 :233， 2002)。而且，为了在植物储藏组织中生产大量的人参储藏根细胞，在目前已知的任何类 型的生产方法中都必须将人参组织进行处理以便使储藏根(分化的组织)去分化成未分化 的组织。在此过程中，不可避免地会出现体细胞无性系变异。换句话说，为了使用植物组织 培养技术大量生产人参细胞，必须使用遗传稳定的样品作为材料以便减少体细胞无性系变 异。据韩国专利公开10-2005-0078372报道，即便使用任何人参组织基本上都出现体细胞
4无性系变异。同时，形成层是使茎和根加厚以便允许植物体积(volumetrically)增大。据报 道，当其中出现大多数活跃细胞分裂的分生组织形成层被用作植物细胞组织培养的外植体 时，细胞的迅速和大量生产成为可能(韩国专利注册10-0533120)。有关这种形成层的结 构和超微结构的研究由于在材料使用方面的内在技术困难而进展缓慢。据报道，由于形成 层由一些狭窄、细长薄壁细胞层构成，在提取过程中很容易受到损伤。而且据报道，高度空 泡化的活跃分生组织细胞即便通过采用电子显微镜的常规方法或者通过新近发展的技术 也难以固定以便在原位研究蛋白质、RNA和其他分子的位置(LachaudSuzarme等人，Life Science,633,1999)。另外，连续形成层的机械切片没有被广泛使用，这被认为是由于分离具有很长的 长度和很薄的细胞壁的形成层细胞的技术难度。在许多研究中，已经报道，在次级维管组织 的结构反映了形成层的假设的前体下，形成层细胞的形状、尺寸和排列的特征间接地以形 成层衍生物的结构为基础(Kitin, P.等人，Ann. Bot. ,86 =1109,2000) 0换句话说，一些研 究表明在直接使用形成层作为在各种领域进行研究的材料存在许多困难。由本发明的部分发明人开发的韩国专利注册10-0533120公开了使用从植物的茎 收集的形成层诱导愈伤组织的方法。该注册专利涉及用于迅速大量得到植物细胞的植物细 胞培养方法，并提到通过从植物茎部收集的形成层诱导愈伤组织而不是使用一般的种子培 养方法的植物细胞培养方法。该注册专利建议了在添加高浓度植物激素毒莠定和赤霉素的 情况下通过使用木本植物茎的形成层诱导形成层细胞的方法，但在该注册专利中，愈伤组 织仅仅从木本植物茎的形成层被诱导。由于愈伤组织是通过去分化过程形成的组织，该注 册专利仍具有由去分化引起的变异问题。此外，本发明的一些发明人开发了 PCT/KR2006/001544发明，其解决了由去分化 引起的变异问题，并涉及提供可稳定增殖并具有高度遗传稳定性的细胞系的方法。在该PCT 申请中公开的方法也使用木本植物茎的形成层，但由于草本植物诸如人参植物的形态学和 生理学特征与木本植物的不同，存在开发考虑草本植物特征的改进发明的需要，以便诱导 来自草本植物的储藏根组织的形成层的细胞系。因此，本发明的发明人付出了极大的努力以得到植物细胞系，其为具有分裂能力 并且不经过去分化过程的同质细胞系，因此在培养过程中没有体细胞无性系变异。结果，本 发明的发明人通过将渗透压施加到含有形成层的储藏根组织并在含有特定植物激素的培 养基中培养储藏根，分离了来自形成层的细胞系，并发现分离的细胞系为同质细胞系，其具 有无限分裂能力，不需要去分化过程即可分离以便不具有体细胞无性系变异，由此在遗传 上高度稳定并且在生理上是均一的，由此完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目的在于提供来自草本植物储藏根形成层的细胞系，其具有分裂能 力，同质并可在培养过程中稳定增殖。本发明的另一目的在于提供分离所述细胞系而不使用去分化步骤的方法。为了实现上述目的，在一个方面，本发明提供了分离来自具有储藏根的草本植物 形成层的细胞系的方法，所述方法包括下列步骤
(a)得到含形成层的具有储藏根的草本植物的储藏根组织；(b)通过在含有IAA(吲哚-3-乙酸)或者IBA(吲哚_3_ 丁酸)的培养基中培养 得到的含有形成层的储藏根组织以诱导来自形成层的细胞系，其中在培养过程中、之前或 之后将渗透压施加到含有形成层的储藏根组织；以及(c)收集诱导的形成层细胞系。在另一方面，本发明提供了细胞系，其来自具有储藏根的草本植物形成层，并具有 下列特征(a)其固有地处于未分化状态；(b)其为同质细胞系；并且(c)其以大量液泡为形态学特征。在再一方面，本发明提供了保藏草本植物细胞系的方法，包括冷冻来自具有储藏 根的草本植物形成层的细胞系。通过下列详细描述和随附的权利要求书，本发明的其他特征和方面将更加明确。
图1示出了在本发明中使用的户外培养的人参的典型特征；图2示出了从植物储藏组织中制备的含有形成层的人参储藏根的外植体的特征；图3(a)示出了具有分裂能力的同质细胞系在人参根部的含形成层的外植体的形 成层中特异性地被诱导，图3(b)示出了当使用常用培养系统时，外植体的剖面的细胞均被 诱导；图4(a)示出了来自人参根部形成层的细胞系在将其从培养基中分离之前被诱 导、分离并允许在生长培养基中增殖，图4(b)显示来自形成层的细胞系被分离并允许大量 增殖，图4(c)显示来自形成层的细胞系在光学显微镜下以单细胞水平被观察，并且图4(d) 显示来自人参子叶的愈伤组织(KCTC10224)在光学显微镜下以单细胞水平被观察；图5(a)显示具有分裂能力的同质细胞系在含有野山参形成层的外植体的形成层 中特异性地被诱导，图5(b)显示来自形成层的细胞系被分离并允许大量增殖，并且图5(c) 显示单细胞水平的来自形成层的细胞系的光学显微照片；图6示出了来自形成层的同质细胞系在含有胡萝卜根部形成层的外植体中被诱 导；图7示出了根据培养阶段的来自人参形成层的细胞系㈧和来自人参子叶的细胞 系(B)的生长曲线；图8(a)是显示来自人参形成层的细胞系以单细胞种群存在的显微照片，图8(b) 是显示来自人参子叶的同质细胞系以大细胞团种群存在的显微照片；图9示出了来自野山参形成层的细胞系的摇瓶培养(图9 (a))、3L生物反应器培 养(图9 (b))和20L生物反应器培养(图9 (c))的照片；图10是示意性示出了通过紫外线(UVB)照射而增加的MMP-I表达在使用不同 浓度的来自野山参形成层的同质细胞系提取物或其培养物处理并使用UVB照射的正常人 皮肤成纤维细胞(NHF)中是否受到野山参形成层的同质细胞系提取物或其培养物的抑制 的图表。在图10中，人参湿细胞，人参干细胞，培养人参细胞的培养基，El 第一诱发期(elicitation 1 stage)，E2 第二诱发期，G 生长期，以及RA 维甲酸；图11是示意性使出了由紫外线(UVB)照射引起的活性氧增加在使用变化浓度 的来自野山参形成层的同质细胞系提取物或其培养物处理并使用UVB照射的正常人皮 肤成纤维细胞(NHF)中是否受到野山参形成层的同质细胞系提取物或其培养物的抑制 的图表。在图11中，人参湿细胞，人参干细胞，培养人参细胞的培养基，El 第一诱发期 (elicitation 1 stage), E2 第二诱发其月，G 生长其月。
具体实施例方式除非特别限定，这里使用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员通常所理 解的具有相同含义。一般说来，这里使用的各种术语的定义在本领域是公知且常用的。在一个方面，本发明涉及分离来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系的方法。当使用已经为分化组织的叶子、茎或根时，它们必需经历去分化过程，其中将分化 组织恢复成未分化组织，以便形成愈伤组织。在去分化过程中，出现体细胞无性系变异，导 致细胞不稳定。同时，本发明的发明人已经进行了有关具有很少或者没有体细胞无性系变 异的植物细胞系统方面的研究。结果，本发明的发明人发现，当细胞系仅仅在作为分生组织 的形成层中被专一性地诱导时，分生组织本身活跃的细胞分裂能力可被使用而不需要去分 化，从而体细胞无性系变异不出现，因此遗传上高度稳定和生理学上均勻的同质细胞系可 被诱导。在这个发现的基础上，本发明的发明人分离了来自形成层的细胞系。根据本发明的分离方法包括下列步骤(a)得到含形成层的具有储藏根的草本植物的储藏根组织；(b)通过在含有IAA (吲哚-3-乙酸)或者IBA (吲哚_3_ 丁酸)的培养基中培养 得到的含有形成层的储藏根组织，其中在培养过程中、之前或之后将渗透压施加到含有形 成层的储藏根组织；以及(c)收集诱导的形成层细胞系。在本发明的方法的步骤(b)中，进行渗透压的施加以便专一性诱导形成层中的细 胞系。优选地，其在含有IAA或IBA的培养基中培养组织之前进行，使形成层以外的一般组 织(即皮层、韧皮部、木质部和木髓)失去分裂能力，由此当它们受到形成层分裂专一性激 素诸如IAA或IBA处理时变得坏死。优选地，步骤(c)通过在含有2，4-D (2，4-二氯苯氧乙酸)、毒莠定和IBA中的一种 或多种的培养基中增殖被诱导的来自形成层的细胞，然后收集来自形成层的细胞来进行。现在将详细描述根据本发明的方法。(1)灭菌步骤和使用渗透压处理的步骤首先，制备草本植物的含有形成层的储藏根组织，然后进行灭菌步骤。这里，灭菌 步骤分两步进行。然后，使用渗透压处理进行了灭菌步骤的含有形成层的储藏根组织，使形 成层以外的一般组织(即皮层、韧皮部、木质部和木髓)在极端环境下失去分裂能力，由此 当使用形成层专一性激素诸如IAA或IBA处理时变得坏死，并且仅仅在具有活跃细胞分裂 能力的形成层中具有分裂能力的同质细胞系被专一性诱导。这里，糖诸如蔗糖、糖醇诸如山 梨醇和盐诸如氯化钠可被用作渗透剂，但不限于此。
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这里，优选地，渗透剂以0. 5 2M的量被使用，并且渗透剂以冷却状态或者在室温 下使用16 24小时，然后将其除去。但是，本发明的范围不限于此，因为渗透剂的浓度、处 理时间和温度可根据植物种类和组织状态而变化。同时，本发明的特征在于，在使用渗透压处理之后，进行除去渗透压的步骤和使 细胞适应诱导培养基的步骤。为了缓解渗透压，迅速将渗透剂的浓度降低到例如0. 03 0.05M，然后对外植体进行处理。这里，处理时间优选为1 15分钟。而且，如果外植体连 续暴露于上述的低浓度渗透剂，渗透剂的低浓度不同于诱导形成层专一性细胞系培养基的 渗透剂的浓度，这种不同在培养过程中也可作为渗透压。出于这种原因，使外植体适应诱导 培养基的步骤优选进一步进行。使外植体适应诱导培养基的步骤通过以与诱导培养基中 相同浓度的渗透剂进行渗透剂除去步骤处理外植体来进行。这里，外植体优选使用浓度为 0. 08 0. IM的渗透剂处理1 15分钟。在本发明的一个实施例中，将使用渗透压处理的情形与没有使用渗透压处理的对 照组进行比较。这里，形成层专一性细胞系的诱导在没有使用渗透压处理的对照组中没有 出现，表明使用渗透压处理的步骤对于诱导来自具有储藏根的草本植物的形成层的细胞系 来说是必须的。(2)来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系的诱导在使用渗透压处理之后，为了诱导来自草本植物形成层的细胞系，将已经进行渗 透压处理的组织置于含有IAA或者IBA的细胞培养基中，使得仅仅在形成层中专一性诱导 细胞分裂，从而得到来自形成层的同质细胞系。优选地，将含有形成层的外植体置于含有 0. 5 3. Omg/L的IAA或IBA的培养基中。如果将IAA加入到细胞系诱导培养基中，其结合包含在植物中的内源IAA以诱导 形成层活性方面的协同作用(synergistic effect) 0由于这种协同作用的原因，由于分 化组织与作为形成层的分生组织之间的细胞分裂活性的差异，同质细胞系仅仅在形成层中 被专一性诱导。同时，据报道IAA是初级天然植物生长素，而IBA是次级天然植物生长素 (Andrew 等人，Ann. Bot.，95 :707，2005)。在本发明的一个实施例中，在使用渗透压处理之后，使用另一种植物激素植物生 长素诸如毒莠定、2，4-D，CPA和NAA处理外植体。但是，据显示，仅仅IAA和IBA对诱导来 自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系是有效的。(3)来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系的增殖可将如上所述诱导的来自形成层的同质细胞系转移到含有植物生长调节激素的 优化生长培养基中以便得到大量的同质细胞系。这里，作为生长调节剂，优选使用2，4-D (2， 4- 二氯苯氧乙酸)，毒莠定和IBA中的一种或多种。2，4-D、毒莠定和IBA中的任何一种优 选以1 5mg/L的量使用，更优选以2mg/L的量使用。在本发明中使用的培养基是用于植物组织培养的常用培养基，其例子可包括但不 限于N6培养基，SH培养基，MS培养基，AA培养基，LS培养基，B5培养基，WPM培养基，LP 培养基，White培养基，GD培养基，DKff培养基，DCR培养基等等。在另一方面，本发明涉及细胞系，其来自具有储藏根的草本植物形成层，并具有下 列特征(a)其固有地处于未分化状态；
(b)其为同质细胞系；并且(c)其以大量液泡为形态学特征。另外，根据本发明的来自形成层的细胞系的特征在于(a)在悬浮培养过程中其以单个细胞存在；(b)与来自具有储藏根的草本植物形成层以外的其他组织的细胞系相比，其在生 物反应器中对剪切应力具有较低的敏感性；以及(c)与来自具有储藏根的草本植物形成层以外的其他组织的细胞系相比，其具有 较高的生长速度并被稳定培养。在本发明的一个实施例中，看到根据本发明的来自形成层的细胞系不仅可在3L 生物反应器中大规模培养，而且可在20L生物反应器中大规模培养。而且看到，与来自形成 层以外的组织的细胞系相比，根据本发明的来自形成层的细胞系具有对剪切应力低5 9 倍的敏感性，并且与来自形成层以外的组织的细胞系相比，具有高3 5倍的生长速度。同 时，当将来自形成层的细胞系培养11个月或者更久时，其显示与来自形成层以外的组织的 细胞系最大400倍的生长速度差异。在本发明的另一实施例中，根据本发明的细胞系提取物和培养基具有抑制降解皮 肤胶原以形成皮肤皱纹的MMP-I的表达的效果，因此表明它们具有防止并减少皱纹的效 果。在本发明的再一实施例中，可以确定细胞系提取物和培养基具有抑制通过UV诱导的活 性氧的效果，由此表明它们具有抗氧化效果。在又一目的中，本发明涉及保藏草本植物细胞系的方法，包括冷冻来自具有储藏 根的草本植物的形成层的细胞系的方法。在本发明的一个实施例中，对来自人参子叶的非同质细胞系和来自人参形成层的 同质细胞系进行低温储藏实验。结果看到，当解冻时来自人参子叶的非同质细胞系没有重 新生长，而当解冻时来自人参形成层的同质细胞系开始重新生长并增殖。如果细胞系可被低温储藏，则能够稳定提供原材料并构建丰富的总细胞系库 (substantial master cell bank)。因此，本发明的来自具有储藏根的草本植物形成层的 细胞系能够作为草本植物细胞系的长期稳定的供应源。世界现在正处于保护研究材料(生物资源)的战争之中，并且用于开发各种新药 和改善食物质量的生物资源包括人体组织、植物种子、微生物、细胞和基因的保存和鉴定已 经变成了非常重要的国家财产(national properties)。因此，由于保护研究材料导致国家 竞争，要求构建细胞系库用于开发、收集、保藏并分配在生物科学相关领域研究中用作必须 材料的细胞系。因此，当所述植物细胞库被构建时，研究材料的供应可得到缓解，采用植物 细胞系的研究周期可被缩短。本发明的特征在于使用储藏根的形成层并可被应用于具有普通储藏根的所有种 类的草本植物。换言之，在本发明的一个实施例中，将细胞系从人参、野山参和胡萝卜储 藏根形成层中分离出来，但对本领域技术人员来说显而易见的是，本发明的方法可被应 用于任何草本植物，只要该草本植物具有储藏根。具有储藏根的草本植物的例子包括但 不限于轮叶党参(Codonopsislanceolata)、羌活(Ostericum koreanum KITAGAWA)、桔 才更(Platycodongrandiflorum) ^ Bf M (Pueraria thunbergiaana)、东；!匕 zh 当归(Aralia contonentalisKitagawa)、防风(Ledebouriella seseloides)、卓月鲜当归(Angelica gigasNAKAI)、胡萝卜、红薯、，玛咖(Maca)、木薯、人参，野山参，培养的野生人参等等。而且，本发 明的具有储藏根的含有形成层的储藏组织意味着不仅包括户外植物的储藏根组织，而且包 括组织培养物(不定根和来自不定根的细胞系)。实施例此后，将参照实施例进一步详细描述本发明。对本领域技术人员来说容易想到的 是，这些实施例仅仅用于解释的目的，而不是用于限制本发明的范围，因为这些实施例可被 修改成其他各种形式。实施例1 从具有储藏根的草本植物形成层分离细胞系(1)-人参1-1 植物材料的制备图1示出了在本发明中使用的户外培养的人参的典型特征。如图1所示，仅仅选 择并收集光滑且没有创伤的人参。将收集的人参在流动自来水下洗涤以从人参外表面除去 土壤或者其他污染。然后，将人参的细根全部去除以便仅仅留下主根，并使用液体洗涤剂清 洗主根的表面，然后将主根在流动的自来水中保持直立(left to stand)。将洗涤的组织 置于洁净工作台中的灭菌烧瓶中并使用70%酒精灭菌30秒到1分钟。然后将组织使用灭 菌蒸馏水漂洗，然后使用1 1. 5%次氯酸钠(Jimsei，Japan)消毒5 8分钟。然后，弃 去消毒液，将组织使用灭菌蒸馏水漂洗一次或多次，然后使用消毒液第二次进行处理大约 5-8分钟。这里，为了使消毒液渗透到组织中，将数滴TWEEN 20(聚氧乙烯山梨醇酐单月桂 酸酉旨，polyoxyethylenesorbitan monolaurate (Junsei, Japan))力口入至Ij消毒液中，然后将 处理的组织使用灭菌蒸馏水漂洗3 5次。然后，为了防止灭菌组织的褐变(browning)， 将灭菌的主根置于含有抗氧化剂的BIM(褐变抑制培养基)，然后摇瓶培养大约30分钟到1 小时。然后，使用灭菌滤纸从组织中除去湿气。表1 :BIM的成分和浓度(加入与1/4总浓度对应量的盐)
权利要求
一种分离来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系的方法，所述方法包括下列步骤(a)得到含形成层的具有储藏根的草本植物的储藏根组织；(b)通过在含有IAA(吲哚 3 乙酸)或者IBA(吲哚 3 丁酸)的培养基中培养得到的含有形成层的储藏根组织而诱导来自形成层的细胞系，其中在培养过程中、之前或之后将渗透压施加到含有形成层的储藏根组织；以及(c)收集诱导的形成层细胞系。
2.根据权利要求1所述的分离来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系的方法，其 特征在于，所述步骤(c)通过在含有2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、毒莠定和IBA中的一种或 多种的培养基中增殖诱导的来自形成层的细胞，然后收集来自形成层的细胞来进行。
3.根据权利要求1所述的分离来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系的方法，其 特征在于，所述步骤(b)中IAA或IBA的含量为0. 1 5mg/L。
4.根据权利要求2所述的分离来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系的方法，其 特征在于，2，4-D (2，4-二氯苯氧乙酸)、毒莠定和IBA中任何一种的含量为1 5mg/L。
5.根据权利要求1-4任意之一所述的分离来自具有储藏根的草本植物形成层的 细胞系的方法，其特征在于，所述草本植物选自下组，包括人参、轮叶党参(Codonopsis lanceolata)、宪活(Ostericum koreanum KITAGAWA)、桔梗(Platycodon grandiflorum) > 野葛(Pueraria thunbergiaana)、东北土当归(Aralia contonentalis Kitagawa)、防风 (Ledebouriella seseloides)、朝鲜当归(Angelica gigas NAKAI)、胡萝卜、红薯、玛咖 (Maca)禾口木薯。
6.一种细胞系，其来自具有储藏根的草本植物形成层，并具有下列特征(a)其固有地处于未分化状态；(b)其为同质细胞系；并且(c)其以大量液泡为形态学特征。
7.根据权利要求6所述的细胞系，其特征在于，另外具有如下特征(i)其在悬浮培养过程中以单个细胞存在；( )与来自具有储藏根的草本植物形成层以外的其他组织的细胞系相比在生物反应 器中对剪切应力具有较低的灵敏度；和(iii)与来自具有储藏根的草本植物形成层以外的其他组织的细胞系相比具有较高的 生长速度并可被稳定地培养。
8.根据权利要求6所述的细胞系，其特征在于，通过下列方法分离，所述方法包括如下 步骤(a)得到含形成层的具有储藏根的草本植物的储藏根组织；(b)通过在含有IAA(吲哚-3-乙酸)或者IBA (吲哚-3- 丁酸)的培养基中培养得到 的含有形成层的储藏根组织而诱导来自形成层的细胞系，其中在培养过程中、之前或之后 将渗透压施加到含有形成层的储藏根组织；以及(c)收集诱导的形成层细胞系。
9.根据权利要求8所述的细胞系，其特征在于，所述步骤(c)通过在含有2，4-D(2， 4-二氯苯氧乙酸)、毒莠定和IBA中的一种或多种的培养基中增殖诱导的来自形成层的细胞，然后收集来自形成层的细胞来进行。
10.根据权利要求6所述的细胞系，其特征在于，所述草本植物选自下组，包括人 参、轮叶党参(Codonopsis lanceolata)、羌活(Ostericum koreanumKITAGAWA)、桔梗 (Platycodon grandif lorum)、里予胃(Pueraria thunbergiaana)、东；!匕 i 当归(Aralia contonentalis Kitagawa)、防风(Ledebouriella seseloides)、卓月鲜当归(Angelica gigas NAKAI)、胡萝卜、红薯、玛咖(Maca)和木薯。
11.一种保藏草本植物细胞系的方法，包括冷冻来自权利要求6-10中任一项的具有储 藏根的草本植物形成层的细胞系。
全文摘要
本发明涉及来自具有储藏根的草本植物形成层的植物细胞系及其分离方法，更具体涉及具有细胞分裂能力的来自形成层的同质细胞系及其分离方法，所述细胞系从具有储藏根的草本植物的含有形成层的储藏组织得到而不需要单独的去分化步骤。来自具有储藏根的草本植物形成层的细胞系具有活跃的分裂能力并且是同质的。而且，其在培养过程中是稳定的，因为其没有经过去分化步骤。因此，通过对其增殖的优化，细胞系可在短时间内大量增殖。因此，本发明的来自具有储藏根的草本植物的形成层的细胞系能够生产由于与培养周期、培养土壤的选择、培养成本以及类似因素有关的各种问题而难以在户外培养的大量有用植物。
文档编号C12N5/04GK101939414SQ200880108091
公开日2011年1月5日 申请日期2008年9月22日 优先权日2007年9月21日
发明者张美玉, 李恩景, 陈荣雨 申请人:云火公司