专利名称：来自静止中心的植物干细胞系及其分离方法
技术领域：
本发明涉及来自植物静止中心的细胞系及其分离方法，具体涉及单细胞来源的来 自静止中心的同质细胞系及其分离方法，所述单细胞得自植物的静止中心而没有进行单独 的去分化步骤。
背景技术：
过去植物已经被用作食物来源，但其作为食物来源的含义目前扩展到包括用于范 围广泛的化学物质的来源，包括药物、香水、色素、农业化学物质和染料。特别是，由于大多 数来自植物的有用物质具有生理活性，包括抗病毒、抗菌、抗癌和抗氧化活性，植物被认为 是可开发新药的理想来源，并且正在进行活跃的研究以便阐明许多植物来源物质的化学结 构与活性之间的关系。但是，生理活性物质难以开发成药物，其主要原因如下。第一，植物中生理活性物 质的含量非常有限。第二，植物的生长速度非常慢。第三，来自植物的生理活性物质仅仅少 量存在于特定的植物器官中。第四，导致自然破坏有关的环境问题。第五，来自植物的生理 活性物质具有非常复杂的化学结构，因此需要多步骤聚合过程，从而引起高生产成本的经 济问题。由于这些原因，稳定提供来自植物的生理活性物质用于商业化非常困难。同时，植物细胞培养方法，一种生物基因工程技术已经长期被评估为最理想的技 术，其可提供植物来源的有用物质而不会引起环境问题。根据韩国专利公开1995-0000870， 通过植物细胞培养技术生产有用物质提供了许多比直接从植物中提取有用物质的方法更 好的优点。特别是，与现有提取方法不同，植物细胞培养方法已经被认为允许连续生产而不 受外部环境影响以便解决突出问题诸如生态系统破坏的最佳方法。但是，尽管在植物细胞 培养方面存在兴趣并付出努力，在植物细胞培养工业化方面成功的例子仍然不足。这是因 为细胞生长中的变异和在大量植物细胞培养中产率仍作为主要问题存在。如果植物细胞在植物表达系统中使用，由植物细胞分化的组织例如叶、茎和种子 称为其细胞不再分裂(divide)的永久组织。由于这种原因，需要事先进行去分化步骤以便 将组织转化成具有分裂能力的细胞系。去分化步骤意味着当对植物组织或器官进行培养 时，对已经分化以便执行特定功能的组织或细胞进行去分化。但是，在该去分化步骤中，由 于体细胞无性系变异(somaclonal variation)，可在细胞系中发生剧烈变化。特别是，仅仅当在长期培养期间稳定保持快速细胞生长和高代谢物产量时，通过 植物细胞培养生产有用物质才可被工业化。但是，大多数细胞由于传代而发生许多变化。因 此，在通过植物细胞培养生产有用物质中克服细胞变异的问题以及开发用于获得遗传稳定 的细胞系的方法非常迫切。同时，由于植物必须吸收其生长所需的足够量的水分或矿物质，根的表面积相当 大。在根尖中，存在根顶端分生组织细胞，它们分裂、膨胀、伸长并分化形成初级根部组 织。根顶端分生组织被保护性根冠覆盖，根顶端分生组织中心中的细胞被称为“静止中 心”(quiescent center)，因为它们分化缓慢。静止中心被形成初级分生组织的祖细胞覆至
ΓΤΠ ο但是，有关根顶端分生组织的生理特性的研究不足，尽管这些特定在植物的根系 统中非常重要。特别是，由许多研究，其中诸如玉米被用于研究静止中心的生理特性或者根 顶端分生组织在培养基中培养以形成根，但是其中没有在根系统的各种组织包括根冠、维 管组织、中柱鞘、内皮、皮层和表皮中仅仅分离静止中心以建立细胞系的例子。因此，静止中心是遗传学上最稳定的组织，其分离使得能够研究植物的开发和遗 传来源。因此，需要开发从静止中心分离同质细胞系的方法。近年来，干细胞生物学领域新 近出现，与干细胞有关的许多实验，包括有关在发育过程中涉及的信号的研究已经在进行。 但是，在动物的情况下，分离和培养干细胞的方法早已建立，相反，在植物的情况下，有关干 细胞分离的研究很少或者没有。因此，考虑来自静止中心的细胞系的诱导和分离可促进干 细胞生物学的发展。因此，本发明的发明人付出了极大的努力来开发分离单细胞来源的来自静止中心 的细胞系的方法并开发可在植物表达系统中使用而不需要去分化步骤的植物细胞。结果， 本发明的发明人已经分离了来自静止中心的细胞系，并且发现在长期培养过程中分离的细 胞系发生了很小的变化或者没有变化，可以稳定地培养，并在低温储藏过程中显示了高度 的细胞存活率(Viability)，由此完成了本发明。
发明内容
发明目的本发明的目的在于提供可稳定培养的来自静止中心的细胞系。本发明的另一目的在于提供分离来自静止中心的细胞系而不需要去分化步骤的 方法。技术方案为了实现上述目的，在一个方面，本发明提供了分离来自静止中心的细胞系的方 法，所述方法包括培养含有静止中心的植物根部组织，然后从培养组织中收集未分化的白
^iJi/口、 (white tissue)。在另一方面，本发明提供了来自静止中心的细胞系，所述细胞系来自植物的静止 中心并具有如下特征(a)在悬浮培养过程中其以单个细胞存在；(b)其显示细胞核比那些来自静止中心之外其他组织细胞系的细胞核大的形态学 特征；(c)其被粘液物质围绕；(d)在长期培养过程中其被稳定保持而没有形态学变化；以及(e)在低温储藏过程中其显示较高的存活率。在还一方面，本发明提供了保存细胞系的方法，其包括冷冻所述来自植物根部静 止中心的细胞系。通过下列详细描述和随附的权利要求书，本发明的其他特征和方面将是容易想到 的。
图IA是细胞系的光学显微照片，其通过培养水稻植物的含有静止中心的根部组 织诱导，但处于从休眠的根部分离之前的状态，图IB是来自静止中心的细胞系的照片，其 从组织中被分离并培养4周。图2示出了通过在分别含有2，4-D (A)、CPA⑶、IAA (C)、IBA⑶、NAA (E)和毒莠定 (picloram) (F)的培养基中培养含有静止中心的水稻植物的根部组织得到的组织的光学显 微照片。图3示出了显示来自水稻植物的静止中心之外其他根部组织的细胞系(图3(a)) 和来自静止中心的细胞系(图3(b))的形态学观察的显微照片。图4示出了通过在分别含有2，4-D (A)、CPA⑶、IAA (C)、IBA⑶、NAA (E)和毒莠定 (picloram) (F)的培养基中培养玉米植物的含有静止中心的根部组织得到的组织的光学显 微照片。图5显示了在培养时期来自静止中心之外其他根部组织的细胞系中发生的形态
学变化。图6显示了在培养时期来自静止中心的细胞系的形态学稳定性。图7A是来自静止中心的细胞系的光学显微照片(400x放大)，图7B是来自根部组 织的细胞系的光学显微照片(400x放大)。图8示出了显示来自静止中心之外其他根部组织的细胞系(图8(a))与来自静止中心的细胞系(图8(b))之间的对比光学显微照片。图9是显示来自不同于静止中心的根部组织的细胞系和来自静止中心的细胞系 的聚集速度的示意图。图10示出了显示来自静止中心之外其他根部组织的细胞系(图8(a))与来自静 止中心的细胞系(图8(b))之间的在低温储藏之后存活率的对比光学显微照片。图11是显示来自静止中心之外其他根部组织的细胞系与来自静止中心的细胞系 之间的在低温储藏之后存活率的对比示意图。
具体实施例方式除非特别限定，这里使用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员通常所理 解的具有相同含义。一般说来，这里使用的各种术语的定义在本领域是公知且常用的。在一个方面，本发明涉及分离来自静止中心的细胞系的方法，所述方法包括培养 含有静止中心的植物根部组织，然后从培养组织中收集未分化的白色组织。优选地，在本发明中使用的含有静止中心的植物根部组织通过使灭菌植物种子发 芽得到，或者其为由来自植物的一部分的愈伤组织分化的根部组织。而且，在培养过程中使 用的培养基可以是本领域技术人员已知的任何细胞系诱导培养基，但组织培养优选在选自 N6培养基、MS培养基、GamborgB5培养基、LS培养基和KAOM培养基中的任意一种培养基中 进行。更优选地，组织培养在含有2，4-D的培养基中进行。此外，在本发明中，来自静止中 心的细胞系的收集优选在组织培养3-6周之后进行。在本文中，术语“静止中心”指的是包括定位在根顶端分生组织中央的500-1000 个不活跃细胞的球状或盘状单细胞群。该细胞群的细胞已知长期处于细胞周期的Gl期细胞并以大约15-20天的间隔分裂。这些细胞常常以不活跃状态存在，并且当它们在切割或 者通过辐射处理过程中受到伤害时分裂。特别是，当植物的根穿透到土壤中时，根冠有效地 保护了根顶端分生组织，但是由于保护的不完全，根顶端分生组织在根生长过程中有时会 受到伤害。此时，静止中心的细胞分裂再次形成顶端分生组织和根冠。而且，当暴露于X射 线中时，细胞停止分裂，但是静止中心细胞立即开始分裂形成正在分裂的细胞而不受X射 线的影响。换言之，静止中心是遗传稳定细胞储存在其中的位置。静止中心分化成作为根 部基本分生组织的原形成层、基本分生组织和原表皮层。 静止中心可从植物的根部得到。优选地，其可从来自灭菌种子发芽小苗的根部得 到，或者可从来自植物的一部分的愈伤组织分化而成的根部组织得到。优选通过从根尖除 去根冠并从切割表面收集大约Imm厚度的部分得到在细胞系诱导培养基中培养的外植体。 在组织培养之前，可根据本领域技术人员已知的一般方法对收集的植物根部组织进行灭菌 步骤。但是，当有灭菌种子发芽小苗的根被使用时，对收集的根部组织不用进行单独的灭菌 步骤。细胞系诱导培养基可以是本领域技术人员已知的任何培养基，其例子包括N6培养 基(Chu C. C. ，Proc. Symp. Plant Tissue Cult. ，Peking, 43,1978)，MS 培养基(Murashige Τ.和 Skoog F.，Physiol. Plant, 15 :473，1962)，Gamborg B5 培养基(Gamborg 0. L.等 人，Exp.Cell Res. ,50 :151，1968)，LS 培养基(LinsmaierE. M.禾Π Skoog F.，Physiol. Plantarum.，18 :100，1965)，KAO M培养基(Kao K. N.和 Michayluk M. R.，Planta. (Berl.)， 126 105，1975)，但不限于这些培养基。 更优选地是，根部组织在含有生长素的2，4-D培养基中培养。这里，2，4-D以2mg/ L的浓度被包含，更优选2-7mg/L。对于细胞系诱导的特定培养条件、培养周期等给予植物 细胞的种类和性质确定，这些因素的确定对本领域技术人员来说是容易想到的。在组织培养期间，观察了来自静止中心以外的根部组织的细胞与来自静止中心的 细胞之间形态学差异。来自静止中心以外的根部组织的细胞系为非同质的并且显示局部分 化，但来自静止中心的细胞系为同质的并且不显示局部分化。而且，但视觉观察时，来自静 止中心以外的根部组织的细胞系为黄色，而来自静止中心的细胞系为白色并被粘液物质围 绕。即，来自静止中心的细胞系显示为“未分化的白色组织”。粘液物质被认为是粘蛋白原。 粘蛋白原已知为由根冠周围的细胞和根部的表皮细胞分泌的复合多糖，包括糖、有机酸、维 生素、酶和氨基酸。因此，基于形态学差异，仅仅来自静止中心的细胞系可被选择。图IA是显示分离 之前来自静止中心的细胞系的照片。在图IA中，红色圆形部分是来自静止中心的细胞系。 图IB是显示分离后培养4周的来自静止中心的细胞系的照片。来自静止中心的细胞系的收集优选在培养3-6周之后进行，更优选在含有静止中 心的植物根部组织接种在培养基中培养4-5周之后。大约接种之后3-6周，来自静止中心 的细胞系被诱导，因此其分离变得容易。由于静止中心是所有植物都具有的组织，本发明的分离来自静止中心的细胞的 方法可应用于所有植物，因此来自静止中心的细胞系可得自所有植物。即，在本发明的一 个实施例中，细胞系从水稻和玉米植物的根部组织的静止中心分离，但对本领域技术人员 来说显而易见的是，本发明的方法可被应用于具有静止中心的所有植物。从其得到来自 静止中心的细胞系的植物的例子可包括但不限于水稻植物、玉米植物、豌豆、燕麦(Avena
6sativa)、洋葱和拟南芥(Arabidopsis)。其静止中心的生理学性质已经被研究的植物的 例子可包括玉米植物、拟南芥、洋葱、燕麦和豌豆等[Maize :Georgina Ponce等人，Plant Cell and Environment,28 719,2005 ；Keni Jiang φ A, Development,130 1429,2003 Arabidopsis :Noriko Kamiya 等人，The Plant Journal, 35 429,2003 ；Peter Doerner, Current Biology,8 :R42,1998 ；AlIium cepa :R. Liso, NewPhyto 1. ，110 -.469,1998 ；Avena sativa :F. A. L. Clowes, New Phytol. ,129,1982 ；Pisum sativum :Peter Doemer, Current Biology,8 :R42，1998]。在另一方面，本发明涉及来自静止中心的细胞系，其来自植物的静止中心并具有 如下性质(a)在悬浮培养过程中其以单个细胞存在；(b)其显示细胞核比那些来自静止中心之外其他组织细胞系的细胞核大的形态学 特征；(c)其被粘液物质围绕；(d)在长期培养过程中其被稳定保持而没有形态学变化；以及(e)在低温储藏过程中其显示较高的存活率。本发明的来自静止中心的细胞系显示细胞核相对较大的形态学特征。观察到细胞 核的尺寸大约为2-4 μ m，大于来自静止中心之外其他组织的细胞系的细胞核。本发明的来自静止中心的细胞系还显示非常稳定的细胞生长而没有形态学变化， 即便当其被长期培养时也是如此。在本发明的一个例子中，观察到来自静止中心的细胞系 被稳定培养而没有形态学变化，即便当其被培养超过16周以上时也是如此。另一方面，当 来自静止中心以外的根部组织的细胞系长期培养时，在细胞团(cell aggregation)中观察 到一些局部分化，特别是，不定根的发育清楚地被显示。另外，与以单细胞培养的微生物细胞不同，植物细胞以细胞团的形式被培养。这 种细胞团引起细胞团内部与外部之间的环境差异，由此引起细胞生长和有用物质产生的变 化。但是，本发明的来自静止中心的细胞系不具有这种变化的可能性，因为在悬浮培养过程 中其以单个细胞被培养。根据本发明的来自静止中心的细胞可在植物表达系统中使用以稳定生产有用物 质。而且，根据本发明的来自静止中心的细胞可根据植物细胞悬浮培养法进行培养，特定培 养方法可按照本领域已知的那样进行。在还一方面，本发明涉及保藏植物细胞系的方法，包括冷冻所述来自植物根部的 静止中心的细胞系。此外，在低温储藏过程中植物细胞显示低存活率，但当其根据常规细胞低温储藏 方法进行时，本发明的来自静止中心的细胞系显示了超过85%的非常高的存活率。如果细 胞系可被低温储藏，则能够稳定提供原材料并构建非常有价值的主细胞库(substantial master cell bank)。因此，本发明的来自静止中心的细胞系可以长期稳定的方式被提供。世界现在正处于保护研究材料(生物资源)的战争之中，并且用于开发各种新药 和改善食物质量的生物资源包括人体组织、植物种子、微生物、细胞和基因的保存和鉴定已 经变成了非常重要的国际性财产(national properties) 0因此，由于保护研究材料导致国际竞争，要求构建细胞系库用于开发、收集、保藏并分配在生物科学相关领域研究中用作必须材料的细胞系。因此，当所述植物细胞库被构 建时，研究材料的供应可得到缓解，采用植物细胞系的研究周期可被缩短。实施例此后，将参照实施例进一步详细描述本发明。对本领域技术人员来说容易想到的 是，这些实施例仅仅用于解释的目的，而不是用于限制本发明的范围，因为这些实施例可被 修改成其他各种形式。实施例1 来自水稻植物静止中心的细胞系的分离1-1 植物材料的制备将水稻种子去壳，使用70%酒精表面灭菌1分钟，在2%次氯酸钠溶液中浸泡1小 时，然后使用无菌水洗涤一次或两次。将洗涤的种子使用无菌水充分洗涤30分钟，然后干 燥到完全除去湿气。将干燥的种子接种到N6培养基(CHU MEDIUM, Chu C. C.，Proc. Symp. Plant Tissue Cult.，Peking, 43,1978)中并在25°C下培养5天，使它们发芽。N6培养基的组分在下表1 中显示。表 权利要求
一种分离来自静止中心的细胞系的方法，所述方法包括培养含有静止中心的植物根部组织，然后从培养组织中收集未分化的白色组织，其中所述细胞系来自植物的静止中心并具有如下特征(a)在悬浮培养过程中其以单个细胞存在；(b)其显示细胞核比那些来自静止中心以外的细胞系的细胞核大的形态学特征；(c)其被粘液物质围绕；(d)在长期培养过程中其被稳定保持而没有形态学变化；以及(e)在低温储藏过程中其显示较高的存活率。
2.根据权利要求的1所述的分离来自静止中心的细胞系的方法，其特征在于，所述含 有静止中心的植物根部组织通过使灭菌的植物种子发芽得到或者来自植物的一部分的愈 伤组织分化的根部组织得到。
3.根据权利要求的1所述的分离来自静止中心的细胞系的方法，其特征在于，组织培 养在含有2，4-D的培养基中进行。
4.一种来自静止中心的细胞系，其来自植物静止中心并具有下列特征(a)在悬浮培养过程中其以单个细胞存在；(b)其显示细胞核比那些来自静止中心以外的细胞系的细胞核大的形态学特征；(c)其被粘液物质围绕；(d)在长期培养过程中其被稳定保持而没有形态学变化；以及(e)在低温储藏过程中其显示较高的存活率。
5.根据权利要求4所述的来自静止中心的细胞系，其特征在于，所述植物选自下组，包 括水稻植物、玉米植物、豌豆、燕麦、洋葱和拟南芥。
6.一种保存植物细胞系的方法，其特征在于，包括冷冻根据权利要求4或5的来自植物 根部静止中心的细胞系。
全文摘要
本发明涉及来自植物静止中心的细胞系及其分离方法，具体涉及从静止中心细胞分离的单细胞来源的同质细胞及其分离方法，所述单细胞得自植物的静止中心而不需要进行单独的去分化步骤。
文档编号C12N5/04GK101939415SQ200880108092
公开日2011年1月5日 申请日期2008年9月22日 优先权日2007年9月21日
发明者俞英美, 李恩景, 洪顺美, 陈荣雨 申请人:云火公司