专利名称：降低哺乳动物细胞的细胞内脂肪的方法
技术领域：
本发明总体上涉及控制组织样本之间的一些生物变异的方法。更具体而言，本发 明涉及清除或降低哺乳动物(例如，肝脏)细胞的脂肪的方法。
背景技术：
在体外细胞培养物(尤其是哺乳动物细胞的培养物)提供了无价的资源以研究 不仅这些细胞的生物学行为而且还有外来化合物(例如，药品)对那种行为的影响。虽然 “无限增殖”细胞系或“转化”细胞系在这个方面可以是有用的，但在本领域人们充分意识到 无限增殖这一过程引入了通常未知的基因突变，这可危及这些数据的使用。为了消除这种 可能性，研究者通常寻找“原代”细胞用于他们的研究(即，从哺乳动物组织新鲜获得的细 胞)。然而，原代细胞的使用引起一系列独特的挑战。例如，组织捐赠者(尤其是人类捐 赠者)总是供不应求。而且，大部分细胞类型不是“可再生的”，并且基因上不同的动物的组 织之间的比较需要证明那些基因差别，而这通常是不可能的。简而言之，控制哺乳动物组织 的捐赠者之间的生物变异仍然是困难的。制药工业(其中原代细胞被寻求用于毒理学研究)提供了这种困难的很好的例 子。因为细胞的脂肪含量对毒性分析具有不利影响，研究者寻求具有最低脂肪含量(例如， 少于约30%的细胞内脂肪)的原代细胞。然而，美国肥胖发生率在过去的25年已急剧上升， 肥胖发生率导致细胞间的游离脂肪酸和肝内脂质的增长。因此，来自器官获取组织(Organ Procurement Organization, 0P0)的较大比率的器官是脂肪变性的(steatotic)(即，“含 脂肪的”)并且事实上是无用的。由于器官捐赠者普遍短缺，以及具有可接受的脂肪变性水 平的捐赠器官的比率不断减小，亟需一种降低或清除细胞内脂肪的方法。
发明内容
在一种实施方式中，本发明提供先体外后体内降低包括祖细胞在内的哺乳动物细 胞的细胞内脂肪酸的方法，所述方法包括(a)获得细胞(例如，肝祖细胞)悬浮液；和(b) 在至少两种药剂存在的条件下培养所述细胞一段时间，所述一段时间足以降低所述哺乳动 物细胞的细胞内脂肪酸的总量，所述至少两种药剂有利于1)降低脂肪酸重新合成，2)激 活或合成脂肪酸氧化酶，以及3)激活极低密度脂蛋白(VLDL)生成。虽然所述哺乳动物组 织优选地为人的组织，并且更优选地为人的肝脏，本发明的方法可被应用于胰腺、肠、心脏 和骨骼肌肉。所述细胞可以是包括冷藏的细胞和/或组织在内的胎儿组织、新生儿组织或 成人组织。
C75相关分子(例如，T0FA和C75)、胆汁酸(胆酸和鹅脱氧胆酸(chenoxycholic acid))、FXR核受体活化剂、SHP、SREBP-lc的阻遏物或它们的组合物中的任何一种可抑制 脂肪酸生物合成。通过脂肪酸氧化酶的转录、翻译或活化可激活脂肪酸氧化。例如，通过肉毒碱棕榈 酰转移酶(CPT-1)、中链酰基-CoA-脱氢酶(MCAD)和/或长链酰基-CoA-脱氢酶(LCAD) 的转录激活或翻译激活可实现脂肪酸氧化。以这种方式适于激活脂肪酸氧化的化合物可以 是贝特类(fibrate)(例如，苯扎贝特、非诺贝特、氯贝特)、PPAR族激动剂、合成的PPAR激 动剂(例如，GW501516和GW0742)、噻唑烧二酮类(thiazolindinedione)(例如，批格列酮 (pioglitozone)和罗格列酮(rosiglitazone))、环氧花生三烯酸(例如，14，15二羟基花生 三烯酸)、CPT-1、MCAD、LCAD或它们的组合物。此外，本发明的某些实施方式可含有抗氧化 剂，添加所述抗氧化剂以减少细胞内氧化损伤。在本发明的另一种实施方式中，在维持稳定 的脂肪变性水平之后，脂肪酸激活剂(oxidator)得以去除或抑制。适于激活VLDL的化合物可包括胆碱、胆碱的衍生物(例如，胆碱、溶血磷脂酰胆 碱、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺)、饱和脂肪酸(例如，月桂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、花生酸)、 单饱和脂肪酸(例如，油酸、棕榈油酸)、多元不饱和脂肪酸(例如，花生四烯酸、二十碳五烯 酸)或它们的组合物。因此，适于激活VLDL的其他一些化合物包括刺激磷脂酰胆碱合成和 /或刺激磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶(PEMT)活性的药剂。这样，本领域技术人员可以理解，本发明公开的内容所依据的构思可容易地用作 为实现本发明的那几个发明目的而设计的其他一些结构、方法和系统的基础。因此，重要的 是，权利要求被认为包括了不偏离本发明的精神和保护范围的等同解释。
图1是相差图像，该相差图像显示了在使用本文所述的细胞内脂质清除剂孵育前 (图A)和孵育后(图B)的肝细胞中的细胞内脂质沉积物。冷藏肝细胞被接种在Williams E 完全培养基内，第一天在其上覆盖Matrigel ,第二天用脂质清除剂处理并在第四天拍照。 箭头指示细胞内脂质沉积物(白色圆形物)。放大标尺代表100微米。
具体实施例方式本发明涉及降低或清除哺乳动物细胞的脂肪的方法。虽然参照人源肝细胞群描述 了所述方法的大多数(如果不是全部的话)讨论和实施例，但是本文的教导应不局限于肝 细胞。事实上，可期望本领域的技术人员将本文的教导应用于需要降低细胞内脂肪的任何 哺乳动物细胞(例如，脂细胞、神经元、心肌细胞)。因此，本发明的范围意指任何组织和所 有组织的哺乳动物细胞。尽管本发明具有广泛的适用性，肝细胞是本发明的应用的优选的细胞类型， 至少因为13%至50%的捐赠肝脏中存在高水平脂肪变性或肝脂肪变性(fatty liver degeneration)。在这些例子中，脂肪清除或降低的方法可以是特别适用的和适当的。除非另有明确的说明，术语“降低(reduce或reducing)”被定义为“变小”或“减 少”(例如，在细胞内脂肪的总量或浓度方面)。虽然在一些实施方式中，本发明可被用于 “清除”(即，基本去除大部分细胞内脂肪)，除非另有明确的说明，术语“清除”意指细胞内脂肪“降低”为约5%至约10%细胞内脂肪的范围，而并不是必须完全“消除”脂肪。术语 “完全清除”意指细胞内脂肪“降低”至等于或少于5%细胞内脂肪的范围，优选地少于 细胞内脂肪的范围，并且可包括所有细胞内脂肪的基本消除。“需要(in need) ”降低或清除细胞内脂肪的细胞是被视为受益于细胞内脂肪降低 或清除的任何细胞群。本发明不拟用任何特定的细胞内脂肪浓度以断言“需要”降低脂肪。 在肝脏组织的例子中，具有高于30%脂肪的肝细胞典型地不能用于移植或毒性分析。因此， 高于40%或50%脂肪的肝细胞将“需要”降低脂肪以用于移植和/或毒性分析。然而，可 希望降低具有另外的“可接受的”脂肪水平的细胞(例如，肝细胞)的脂肪含量。例如，具 有小于30%脂肪的肝细胞可仍然“需要”降低脂肪以满足或维持实验要求。在本发明的一种实施方式中，通过在药物存在条件下孵育需要降低脂肪的细胞来 降低细胞内脂肪酸，所述药物利用生物学途径调节脂肪酸新陈代谢、脂肪酸分解代谢和/ 或脂肪酸输出。不需要理论支持或不限于理论，本发明人相信脂肪变性是由两方面之间的 不平衡介导的，所述两方面之一是脂肪酸吸收和重新生物合成，所述两方面的另一个是氧 化和输出。因此，当吸收或生物合成超过了肝脏氧化脂质和/或输出脂质的能力时，发生脂 肪变性。因此，本发明试图部分地通过外源剂来调节脂肪变性，所述外源剂抑制脂质生物合 成、上调氧化酶或促进极低密度脂蛋白(VLDL)分泌。通过实施本发明的教导，本领域技术人员可控制任何给定细胞群中细胞内脂肪的 范围。例如，如果肝细胞A和肝细胞B的悬浮液分别含有60单位和80单位的细胞内脂肪 含量，并且理想的脂肪含量为20单位，实施本发明的方法，技术人员可以能够将悬浮液A中 的脂肪含量降低约67%并且将悬浮液B中的脂肪含量降低75%以达到细胞内脂肪含量的 预定的水平(或水平范围)。按照这种方法，人们不必等待“理想的”捐赠者以获得期望脂 肪含量的肝细胞，而可使一个或一个以上捐赠者的肝脏通过本发明的脂肪降低方法以获得 具有“控制”水平脂肪的肝细胞群。按照这种方法，本发明能够使细胞群的处理被标准化以 降低细胞内脂肪。所述细胞具有多种应用，该应用包括毒性分析和在生物辅助设备中的应 用以及细胞疗法。本发明能够降低细胞内脂肪水平，优选地不干扰正常细胞的功能。本发明人已发 现就大多数药剂而言，单一药剂对降低脂肪变性具有极小(如果有的话)的影响。然而，当 试剂被结合使用时，这些试剂在协同降低脂肪水平方面惊人地起作用。更具体而言，本发明 人是首位提出当抑制脂肪酸生物合成与激活脂肪酸氧化和/或分泌相结合(即，扰乱两种 或两种以上脂肪酸途径)时，在脂肪变性的降低方面存在协同效应。以下实施例举例说明本发明，但是本发明决不局限于这些特定的实施例。本领域 的普通技术人员将会在这些实施例中发现实现本发明的其它方式。而且，虽然为了便于实 验本发明的实施例以肝细胞的情形呈现，但本领域的普通技术人员根据下面公开的教导可 容易地将本文所述的方法和试剂转化为其他细胞系和细胞类型。通过抑制脂质生物合成降低细胞内脂肪脂肪酸重新生物合成部分地由LXR核受体调节。所述LXR核受体可激活许多转录 因子(例如SREBP-lc)，所述转录因子继而可激活脂肪生成所包括的许多基因。因此，在本 发明的一种实施方式中，在具有试剂(例如，但不限于胆酸、鹅脱氧胆酸、油酸、T0FA、FAS和 /或MEDICA)的培养基内孵育需要降低细胞内脂肪的细胞，所述试剂靶定脂肪酸重新生物合成所包括的蛋白质。典型地，50 ii M至500 ii M胆酸的最终浓度、50 u M M 200 u M鹅脱氧 胆酸的最终浓度、25 ii M至100 ii M油酸的最终浓度、1 P M至10 ii M T0FA的最终浓度、5 y M 至50 ii M FAS的最终浓度或2 ii M至70 ii M MEDICA的最终浓度足以最低限度地影响脂肪酸合成。最近，人们证明无毒水平的胆汁酸激活FXR核受体，所述FXR核受体继而激活LXR 核受体的阻遏物(称为SHP)。因此，在本发明的另一种实施方式中，在具有试剂的培养基内 孵育需要降低细胞内脂肪的细胞，所述试剂例如，但不限于胆酸和鹅脱氧胆酸，所述试剂靶 定所述LXR核受体的阻遏物。通过激活脂肪酸氧化酶降低细胞内脂肪脂肪酸氧化是调节脂肪变性的另一种途径。在线粒体和过氧化物酶体内均发生 氧化。线粒体催化食物中大量的短链脂肪酸、中链脂肪酸和长链脂肪酸的氧化，
并且这种途径构成氧化脂肪酸以产生能量的主要过程。此外，长链脂肪酸和极长链脂肪 酸(VLCFA)也由细胞色素P450 CYP4AOJ-氧化系统产生代谢变化为二羧酸，所述二羧酸 用作过氧化物酶氧化的底物。因此，在本发明的一种实施方式中，在具有过氧化物酶 体增殖物激活受体a (PPARa)活化剂的培养基内孵育需要降低细胞内脂肪的细胞，该活 化剂上调了调节脂肪酸氧化所包括的酶。典型地，50 y M至500 y M苯扎贝特、0. 2 y M至 2iiMGW501516、lnM至 20nM GW0742、10 ii M至 100 ii M非诺贝特、100 ii M至 500 ii M氯贝特、10 至 100WY-14643.2U M 至 25 ii M 吡格列酮、2 ii M 至 25 ii M 14，15-DHET 或 500ppm 至 2000ppm N0-1886足以支持脂肪酸氧化。通过激活VLDL分泌降低细胞内脂肪肝脏是哺乳动物体内血浆脂蛋白的合成和分泌的主要器官。甘油三酯仅是脂肪变 性所包括的一类脂肪。甘油三酯被打包为极低密度脂蛋白(VLDL)用于细胞的输出。因此， 刺激肝内脂质输出是脂肪降低的目标。甘油三酯被打包为VLDL用于细胞的输出。此外，VLDL包括60%磷脂酰胆碱(PC)， 并且如果不含胆碱，VLDL不能被制造，甘油三酯不可被输出，继而肝细胞成为脂肪变性细 胞。约70%的PC集合体(pool)从饮食胆碱中合成。然而，动物和人缺乏胆碱的饮食导致 在大鼠体内甘油三酯和肝脂肪变性的肝内积累。因此，在本发明的一种实施方式中，在具 有附加胆碱的培养基内孵育需要降低细胞内脂肪的细胞以增加肝PC的生成，从而促进甘 油三酯的输出，继而降低脂肪变性。在本发明的另一种实施方式中，诸如溶血磷脂酰胆碱、 磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、月桂酸、棕榈酸和肉豆蔻酸之类的其他一些药物可被用于激活 VLDL合成和/或分泌。典型地，50 ii M至200 ii M胆碱最终浓度、50 y M至500 y M溶血磷脂 酰胆碱最终浓度、50 y M至500 y M磷脂酰胆碱最终浓度、50 y M至500 y M磷脂酰乙醇胺最 终浓度、100 ii M至1000月桂酸最终浓度、100 ii M至1000 u M棕榈酸最终浓度或100 y M至 1000 u M肉豆蔻酸最终浓度足以支持高VLDL合成和/或分泌。下表部分概括了本发明的某些实施方式。所列浓度(表1和表2)为培养基内用 于孵育需要降低脂肪的细胞的试剂的浓度。表 1 表1 (续)
虽然本发明的一些实施方式可包括一种试剂的使用，本发明也拟结合使用两种或 两种以上试剂。优选地，当使用结合试剂时，至少一种试剂选自下列每一类别脂质生物 合成的抑制剂、氧化酶的活化剂或用于分泌VLDL的活化剂。事实上，不需要理论支持或不 限于理论，本发明人相信使用单一类别的试剂在降低细胞内脂质方面可能是低效的(如果 不是无效的话)，因为细胞可抵消一种途径的抑制，例如通过上调另一种途径。因此，上述 类别的两种试剂的结合，优选地三种试剂的结合是理想的。表2提供一些优选的“混合物 (cocktail) ” 组合。
下列的实施例举例说明本发明，但是本发明决不局限于这些特定的实施例。本领 域的普通技术人员将会在这些实施例中发现实现本发明的其它方式。 用脂质清除剂处理之后的肝细胞显示出降低肝内脂质并且改善细胞形态将捐 赠者的冷藏的脂肪变性肝细胞在补充了 200i!M胆酸、200i!M苯扎非特和lOOyM胆碱的 Williams E培养基中种植并且繁殖两天。在种植之前，几乎所有细胞含有多种细胞内脂质 沉积物(图1)。然而，在“混合物”药剂中处理48小时之后，脂质沉积物显著的降低了约 80%。确实，已处理的细胞的大部分缺少在未处理的细胞中发现的较大量的细胞内脂质沉 积物(图1)。本申请的发明人也已发现本发明的方法也改善了脂肪降低后的肝细胞的性能。更 具体而言，降低了脂肪的肝细胞显示出具有包括穿插有清晰通道、假定的胆小管的带状结 构的形态，所述形态表示在体内的成肝细胞。出人意料地，与脂肪变性的肝细胞比较而言， 这个数据显示本发明的降低脂肪的方法不表现出对细胞功能不利的影响，反而帮助并改善 细胞功能。图像化细胞内脂肪变性为了使细胞内脂质沉积物图像化，用油-红0(0il-Red 0，溶剂红27，苏丹红5B, C. I. 26125，C26H24N40)将细胞染色，脂肪染色剂(例如，脂溶性的) 重氮染料用于中性甘油三酯和脂质以及一些脂蛋白的染色。简言之，在10%福尔马林中固 定细胞，用PBS漂洗三次，用油-红0染色15分钟，并在细胞拍照之前用水清洗三次。尼罗 红(Nile Red)是另一种可用于以类似的方法显现细胞内脂质沉积物的染色剂。定量细胞内脂肪变性异丙醇(isopranol)可用于洗脱细胞中的油红0染色剂 (如果有的话)；洗脱剂的吸光度(A540)可用于比较被处理的细胞与未处理的细胞的油红0 染色水平(即，肝内脂质沉积物的水平)。另一种方法是拍摄细胞的电子显微照片并分析它 们(例如，用Metamorph 软件)以计算显微可见区域内脂质沉积物所占据的面积百分比。 然后，脂肪变性的面积百分比可被转化为体积百分比。儿童捐赠者的肝细胞可被作为对照 组使用，所述细胞典型地无脂肪变性。脂肪变性水平的直接测量是确定肝细胞培养物中甘 油三酯(TG)的量。因为TG是肝内脂质的储藏形式，确定细胞溶解产物(lysate)中的TG 水平可提供肝内脂质水平的定量测量。本发明的方法能够使来自不同的捐赠者的一代细胞群标准化以降低细胞内脂肪 含量。这些降低了脂肪的细胞可被用于各种被提议的研究，并且这些降低了脂肪的细胞扩 展了用于理论、临床和药物研究的不可移植的肝脏的范围。在又一些其他实施方式中，本发 明的方法能够清除细胞内脂肪至本领域中不存在的水平或已知的水平。例如，本发明提供 具有脂肪完全清除(少于约5%，优选地少于约3%，更优选地少于约1%，以及最优选地基 本无细胞内脂肪)的肝细胞群。术语“约”已被在此记载以及记载在整个说明书中以解释 各种变化，所述各种变化可由测量中固有的不精确引起并可被化学和药学领域的技术人员 理解。虽然已结合具体实施方式
描述了本发明，可以理解，本发明能够进一步修改并且 本申请有意覆盖本发明后续的任何变化、用途或者修改。总体而言，本发明的实质不仅限于 本申请公开的内容，而且还包括本发明所属技术领域的公知常识或惯用手段以及可应用于 前文所述的和后附的权利要求中的必要技术特征的内容。
1权利要求
一种降低哺乳动物细胞的细胞内脂肪酸的方法，所述方法包括(a)获得需要清除脂肪酸的哺乳动物细胞，以及(b)用一种药剂孵育所述哺乳动物细胞一段时间，所述一段时间足以降低所述哺乳动物细胞的细胞内脂肪酸的总量，所述一种药剂来自下列组中的至少两组(i)脂肪酸生物合成的抑制剂(ii)脂肪酸氧化酶的活化剂；以及(iii)用于生成极低密度脂蛋白(VLDL)的活化剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞是人类细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞是成人肝细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述细胞是肝细胞或脂肪细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述肝细胞是原代肝细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述脂肪酸生物合成的抑制剂是胆酸、鹅脱氧胆 酸、油酸、C75、T0FA、FAS 或 MEDICA。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述脂肪酸生物合成的抑制剂是胆酸。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述胆酸的浓度为0y M至500 y M。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述胆酸的浓度为15011|1至250111。
10.如权利要求1所述的方法，其中，所述脂肪酸氧化酶的活化剂是贝特类、PPAR激动 剂、噻唑烷二酮类、环氧花生三烯酸、CPT-1、MCAD、LCAD或它们的组合物。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述PPAR激动剂是苯扎贝特、GW501516、GW0742 或它们的组合物。
12.如权利要求11所述的方法，其中，苯扎贝特的浓度为15011|1至250111。
13.如权利要求11所述的方法，其中，GW0742的浓度为0ii M至20 ii M。
14.如权利要求11所述的方法，所述方法进一步包括抗氧化剂。
15.如权利要求1所述的方法，其中，所述用于生成VLDL的活化剂是胆碱、胆碱的衍生 物、饱和脂肪酸、单饱和脂肪酸、多元不饱和脂肪酸或它们的组合物。
16.如权利要求1所述的方法，其中，所述用于生成VLDL的活化剂是胆碱。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述胆碱的浓度为0y M至200 y M。
18.如权利要求1所述的方法，其中，通过用胆酸、苯扎贝特和/或胆碱孵育将脂肪酸清除。
19.如权利要求1所述的方法，其中，所述悬浮液用0ii M至200 ii M的胆酸、OnM至lOnM 的GW0742以及0 ii M至70 ii M的胆碱孵育。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述悬浮液用200iiM胆酸、200iiM苯扎贝特和 lOOiiM胆碱孵育。
21.—种基本不合脂肪酸的成熟肝细胞。
22.—种降低细胞群的细胞内脂肪至预定水平的方法，所述方法包括(a)获得哺乳动 物细胞；(b)用一种药剂孵育所述哺乳动物细胞一段时间，所述一段时间足以降低哺乳动 物细胞悬浮液中细胞内脂肪酸的总量至细胞内脂肪的预定水平。所述一种药剂来自下列组 中的至少两组(i)脂肪酸生物合成的抑制剂；(ii)脂肪酸氧化酶的活化剂；(iii)用于生成极低密度脂蛋白(VLDL)的活化剂。
全文摘要
本发明提供降低或清除哺乳动物细胞的脂肪的方法。所述方法包括在环境中培养所述细胞，所述环境有利于1)降低脂肪酸重新合成，2)激活或合成脂肪酸氧化酶，和/或3)从细胞中向外输出脂质。本发明还提供基本不含脂肪酸的细胞。
文档编号C12Q1/02GK101878296SQ200880108111
公开日2010年11月3日 申请日期2008年7月24日 优先权日2007年7月27日
发明者约瑟夫·查尔斯·鲁伊斯 申请人:维斯塔治疗公司