使用转多基因改变α-和β-生育三烯酚含量的组成和方法

专利名称：使用转多基因改变α-和β-生育三烯酚含量的组成和方法
技术领域：
本发明领域涉及植物育种和分子生物学，并且尤其涉及到通过使用核酸片段改变 植物中的含油表型，所述核酸片段编码尿黑酸香叶基香叶基转移酶、Y-生育酚甲基转移酶 (VTE4)和2-甲基-6-植基苯醌醇(phytylbenzoquinol)甲基转移酶(VTE3)。
背景技术：
生育三烯酚是维生素E相关的化合物，它主要产生于单子叶植物物种(例如棕榈、 小麦、稻、和大麦)的种子和果实中。生育三烯酚结构上类似于生育酚，包括维生素E形式 的α-生育酚。生育酚在植物界以及光合作用微生物如集胞藻中均存在。生育三烯酚和生育酚均包含连接到烃侧链上的色原烷醇头基。这些分子间仅有 的结构差异在于在生育三烯酚的烃侧链中存在三个双键。此差异与侧链的生物合成起源 有关。生育酚侧链衍生自植基焦磷酸(PP)，并且据信生育三烯酚侧链衍生自香叶基香叶 基-ΡΡ，分别参见图 1 和图 2 (Soil 等人(1980) Arch. Biochem. Biophys.，204 :544_550)。天然存在至少四种形式的或分子种类的生育酚和生育三烯酚分别是α、β、Y 和Δ (α，β，Υ和δ )。这些分子种类包含不同数量的结合到色原烷醇头基的芳族部分上 的甲基。类似于生育酚，生育三烯酚是有效的脂溶性抗氧化剂，因此在人类和动物饮食中具 有可观的营养价值(Packer等人(2001) J. Nutr.，131 :369S_373S)。此外，据信生育三烯酚 具有治疗作用，包括已被证明的下调胆固醇生物合成的能力(Theriault等人(1999)Clin. Biochem. ,32 :309_319 ；Qureshi 等人(1986) J. Biol. Chem.，261 10544-10550)。在生育酚生物合成途径中的第一个关键步骤是用植基焦磷酸异戊烯化尿黑酸以 形成2-甲基-6-植基苯醌醇(MPBQ)。两种不同的甲基转移酶催化生育酚芳族部分的甲基 化(VTE3和VTE4)。2-甲基_6_植基苯醌醇甲基转移酶(VTE3)在环化前作用于生育酚中 间体MPBQ。用生育酚环化酶(VTEl)环化第一个甲基化反应的产物(2，3-二甲基-5-植基 苯醌醇)提供Y-生育酚。用生育酚生物合成的第二种甲基转移酶，Y-生育酚甲基转移 酶(VTE4)，将Y-生育酚进一步甲基化成α-生育酚。相同的酶甲基化Δ-生育酚，从而生 成β-生育酚。已经推测生育三烯酚生物合成的第一个关键步骤涉及缩合香叶基香叶基-PP 和尿黑酸以形成2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌醇(Soil等人(1980)Arch. Biochem. Biophys.，204 :544_550)。因此功能上能将催化此反应的酶描述为尿黑酸香叶基香叶基转 移酶(HGGT)。在环化和初始甲基化之后，生育三烯酚生产的最终步骤将需要将Y-生育三 烯酚甲基化成α-生育三烯酚或将Δ-生育三烯酚甲基化成β-生育三烯酚。已经报道了编码尿黑酸香叶基香叶基转移酶(HGGT)和γ -生育酚甲基转移酶多 肽的基因或cDNA的功能性鉴定。US专利公布US-2007-0199096-A1已经报道了这些核酸组合在植物、种子和微生物宿主中操纵营养上重要的生育三烯酚(如α-和β-生育三烯 酚)的生物合成的用途。发明概述 提供了用于改变α-和β-生育三烯酚含量的组合物和方法以及植物组合物。 所述组合物包含核苷酸分子，该核苷酸分子包含HGGT、Y-生育酚甲基转移酶和2-甲 基-6-植基苯醌醇甲基转移酶的核苷酸序列。可使用所述组合物来转化植物以操纵母育酚 化合物的合成途径。本发明包括在一个实施方案中，转化过的植物在其基因组中包含(a)第一重组核酸分子，所 述第一重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一种核苷酸序列的调控序列，所述 至少一种核苷酸序列选自(i)编码具有Y-生育酚甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列；
(ii)SEQID NO :11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37 或 39 所示的核苷酸序列；
(iii)编码SEQ ID NO 12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38 或 40 所示的氨基 酸序列的核苷酸序列；(iν)与(i)-(iii)所示的任何一种核苷酸序列具有至少80%序列同 一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有Y-生育酚甲基转移酶活性的多肽；和 (ν)与(i)-(iv)的任何一种核苷酸序列完全互补的核苷酸序列；(b)第二重组核酸分子， 所述第二重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一种核苷酸序列的调控序列，所 述至少一种核苷酸序列选自(vi)编码具有尿黑酸香叶基香叶基转移酶活性的多肽的核 苷酸序列；(vii)SEQ ID NO :1、3、5、7、或9所示的核苷酸序列；(viii)编码SEQ ID NO :2、 4、6、8、或10所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(ix)与(vi)-(viii)所示的任何一种核苷 酸序列具有至少80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有尿黑酸香叶 基香叶基转移酶活性的多肽；和(χ)与(vi)-(ix)的任何一种核苷酸序列完全互补的核苷 酸序列；以及(c)第三重组核酸分子，所述第三重组核酸分子包含至少一种可操作地连接 至至少一种核苷酸序列的调控序列，所述至少一种核苷酸序列选自(xi)编码具有2-甲 基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列；(xii)SEQ ID N0:53所示的核苷 酸序列；(xiii)编码 SEQ ID NO :54、61、62、63、64、65、66、67、68、69 或 70 所示的氨基酸序 列的核苷酸序列；(xiv)与(xi)-(xii)所示的任何一种核苷酸序列具有至少80%序列同一 性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的 多肽；(XV)编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所 述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :54、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70所示的氨基酸 序列具有至少95%的序列同一性；以及(xvi)与(xi)-(xv)的任何一种核苷酸序列完全互 补的核苷酸序列；其中所述第一重组核酸分子、第二重组核酸分子和第三重组核酸分子被 稳定地整合进所述转化过的植物的基因组中。在另一个实施方案中，转化过的植物在其基因组中包含至少一种重组核酸分子， 所述重组核酸分子选自上文的第一重组核酸分子、第二重组核酸分子和第三重组核酸分 子，其中所述至少一种重组核酸分子被稳定地整合进所述转化过的植物的基因组中。在另一个实施方案中，转化过的植物可以是选自玉米、小麦、稻、高粱、大麦、小米 和裸麦的单子叶植物。在另一个实施方案中，转化过的植物可以是选自大豆、芸苔属、苜蓿、红花、向日葵、棉花、花生、油菜、拟南芥属、烟草和马铃薯的双子叶植物。在另一个实施方案中，第一重组核酸分子、第二重组核酸分子或第三重组核酸分子的所述至少一种调控序列包含至少一种启动子，所述至少一种启动子选自种子优选的、 组成型的、化学调控的、组织优选的、和发育调控的启动子。在另一个实施方案中，本发明包括转化过的植物的种子，其中所述种子在其基因 组中包含第一重组核酸分子、第二重组核酸分子和第三重组核酸分子。在另一个实施方案中，本发明的转化过的植物相对于遗传背景相似但缺乏所述第 一重组核酸分子、所述第二重组核酸分子和所述第三重组核酸分子的植物产生α “生育三 烯酚、生育三烯酚、或两者含量提高的种子。在另一个实施方案中，本发明包括提高植物中α -生育三烯酚、β -生育三烯酚、 或两者含量的方法，所述方法包括在植物基因组中稳定地整合进(a)第一重组核酸分子， 所述第一重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一种核苷酸序列的调控序列，所 述至少一种核苷酸序列选自(i)编码具有Y-生育酚甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序 列；(ii)SEQ ID NO :11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37 或 39 所示的核苷酸序 列；(iii)编码 SEQ ID NO 12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38 或 40 所示的氨 基酸序列的核苷酸序列；(iν)与(i)-(iii)所示的任何一种核苷酸序列具有至少80%序列 同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有Y-生育酚甲基转移酶活性的多肽； 和(ν)与(i)-(iv)的任何一种核苷酸序列互补的核苷酸序列；(b)第二重组核酸分子，所 述第二重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一种核苷酸序列的调控序列，所述 至少一种核苷酸序列选自(vi)编码具有尿黑酸香叶基香叶基转移酶活性的多肽的核苷 酸序列；(vii)SEQ ID NO :1、3、5、7、或9所示的核苷酸序列；(viii)编码SEQ ID NO :2、4、 6、8、或10所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(ix)与(vi)-(viii)所示的任何一种核苷酸 序列具有至少80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有尿黑酸香叶基 香叶基转移酶活性的多肽；和(χ)与(vi)-(ix)的任何一种核苷酸序列互补的核苷酸序列； 以及(c)第三重组核酸分子，所述第三重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一 种核苷酸序列的调控序列，所述至少-种核苷酸序列选自(xi)编码具有2-甲基-6-植 基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列；(xii)SEQ ID NO :53所示的核苷酸序列； (xiii)编码 SEQ ID NO :54、61、62、63、64、65、66、67、68、69 或 70 所示的氨基酸序列的核苷 酸序列；(xiv)与(xi)-(xii)所示的任何一种核苷酸序列具有至少80%序列同一性的核 苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽； (xv)编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多 肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :54、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70所示的氨基酸序列 具有至少95%的序列同一性；以及(xvi)与(xi)-(xv)的任何一种核苷酸序列完全互补的 核苷酸序列；以及选择转化过的植物，所述转化过的植物相对于遗传背景相似但缺乏所述 第一重组核酸分子、所述第二重组核酸分子和所述第三重组核酸分子的植物α -生育三烯 酚、β-生育三烯酚、或两者含量提高。在另一个实施方案中，使用一种方法，其中通过共转化植物细胞将所述第一、第二 和第三重组核酸分子整合进植物基因组中。在另一个实施方案中，使用一种方法，其中通过再转化转化过的植物细胞将至少一种所述第一重组核酸分子、第二重组核酸分子或第三重组核酸分子整合进植物基因组 中，其中所述转化过的植物细胞包含至少一种所述第一、第二和第三重组核酸分子。在另一个实施方案中，使用一种方法，其中通过育种将至少一种所述第一重组核 酸分子、第二重组核酸分子或第三重组核酸分子整合进植物基因组中。 在另一个实施方案中，使用一种方法，其中第一重组核酸分子、第二重组核酸分子 或第三重组核酸分子的所述至少一种调控序列包含至少一种启动子，所述至少一种启动子 选自种子优选的、组成型的、化学调控的、组织优选的、和发育调控的启动子。在另一个实施方案中，本发明包括用于转化植物和植物细胞以改变含油量的方 法，本文包括用一至三个核苷酸序列单独或以两个或三个核苷酸序列的任何组合来转化植 物。所述方法包括；(a)获取在其基因组中包含第一重组核酸分子的第一植物，所述第一重 组核酸分子包含至少一种可操作地连接至编码具有Y-生育酚甲基转移酶活性的多肽的 核苷酸序列的调控序列；和(b)将步骤(a)的转基因植物与在其基因组中包含第二重组核 酸分子的第二植物杂交，所述第二重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至编码具有尿 黑酸香叶基香叶基转移酶活性的多肽的核苷酸序列的调控序列；(c)将步骤(b)的转基因 植物与在其基因组中包含第三重组核酸分子的第三植物杂交，所述第三重组核酸分子包含 至少一种可操作地连接至编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽的核苷 酸序列的调控序列；(d)获取来自所述步骤(c)杂交的子代植物，其中所述子代植物在其基 因组中包含所述第一重组核酸分子、所述第二重组核酸分子和所述第三重组核酸分子，并 且其中相对于遗传背景相似但缺乏所述第一重组核酸分子、所述第二重组核酸分子和所述 第三重组核酸分子的植物，所述子代植物的α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、或两者的含 量提高。在另一个实施方案中，使用提高植物中α-生育三烯酚、生育三烯酚、或两者 含量的方法，所述方法包括(a)获取在其基因组中包含第一重组核酸分子的第一转化过 的植物，所述第一重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一种核苷酸序列的调控 序列，所述至少一种核苷酸序列选自(i)编码具有Y-生育酚甲基转移酶活性的多肽的核 苷酸序列；( )如 11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37 或 39 所示的核苷酸序 列；(iii)编码 SEQ ID NO :12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38 或 40 所示的 氨基酸序列的核苷酸序列；(iν)与(i)-(iii)所示的任何一种核苷酸序列的完整编码序列 具有至少80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有Y-生育酚甲基转 移酶活性的多肽；和(ν)与(i)-(iv)的任何一种核苷酸序列互补的核苷酸序列；(b)将步 骤(a)的转化过的植物与在其基因组中包含第二重组核酸分子的第二转化过的植物杂交， 所述第二重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一种核苷酸序列的调控序列，所 述至少一种核苷酸序列选自(vi)编码具有尿黑酸香叶基香叶基转移酶活性的多肽的核 苷酸序列；(vii)SEQ ID NO :1、3、5、7、或9所示的核苷酸序列；(viii)编码SEQ ID NO :2、 4、6、8、或10所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(ix)与(vi)-(viii)所示的核苷酸序列的 完整编码序列具有至少80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有尿黑 酸香叶基香叶基转移酶活性的多肽；和(χ)与(vi)-(ix)的任何一种核苷酸序列互补的核 苷酸序列；并且(c)将步骤(b)的转化过的植物与在其基因组中包含第三重组核酸分子的 第三转化过的植物杂交，所述第三重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一种核苷酸序列的调控序列，所述至少一种核苷酸序列选自“(xi)编码具有2-甲基-6-植基苯醌 醇甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列；(xii)SEQ IDNO :53所示的核苷酸序列；(xiii)编 码SEQ ID NO 54或70所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(xiv)与(xi)-(xii)所示的任 何一种核苷酸序列具有至少80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有 2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽；(XV)编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲 基转移酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID N0:54、61、62、 63、64、65、66、67、68、69或70所示的氨基酸序列具有至少95 %的序列同一性；以及(xvi) 与(xi)-(xv)的任何一种核苷酸序列完全互补的核苷酸序列；并选择来自所述步骤(c)杂 交的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含第一重组核酸分子、第二重组核酸分 子和第三重组核酸分子，并且其中相对于遗传背景相似但缺乏所述第一重组核酸分子、所 述第二重组核酸分子和所述第三重组核酸分子的植物，所述子代植物的α -生育三烯酚、 β -生育三烯酚、或两者的含量提高。
在另一个实施方案中，使用任何一种本发明的方法，其中所述植物是选自玉米、小 麦、稻、高粱、大麦、小米和裸麦的单子叶植物。在另一个实施方案中，使用任何一种本发明的方法，其中所述植物是选自大豆、芸 苔属、苜猜、红花、向日葵、棉花、花生、油菜、拟南芥属、烟草和马铃薯的双子叶植物。在另一个实施方案中，本发明包括转化过的种子或本发明的任何转化过的植物的 副产物。在另一个实施方案中，本发明的转化过的种子具有至少20ppm的α -生育三烯酚含量。在另一个实施方案中，本发明转化过的种子包含的α-生育三烯酚的量占转化过 的种子中的总生育酚和生育三烯酚含量的至少20%。在另一个实施方案中，本发明转化过的种子的α -生育三烯酚含量占转化过的种 子中的总生育酚和生育三烯酚含量的至少70%。在另一个实施方案中，本发明转化过的种子包含的α -生育三烯酚和α _生育酚 的合并含量占转化过的种子中的总生育酚和生育三烯酚含量的至少95%。在另一个实施方案中，使用一种改善动物的组织质量的方法，所述方法包括用本 发明的转化过的种子来饲养动物。在另一个实施方案中，所述组织是肉，并且通过选自以下标准的至少一个标准来 测量肉的质量提高的ΡΗ、改善的食物颜色、改善的氧化稳定性、增加的储存寿命以及减少 的汁液渗出(purge)。在另一个实施方案中，所述动物是反刍动物，优选牛。在另一个实施方案中，所述动物是非反刍动物，优选猪或家禽。在另一个实施方案中，分离的多核苷酸包含SEQ ID NO :57。在另一个实施方案中，分离的多核苷酸包含(a)编码具有2-甲基-6-植基苯醌 醇甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列基于Clustal W比对 方法在与SEQ ID NO :54或70进行比较时具有至少95%的序列同一性，或(b)所述核苷酸 序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100%互 补。所述多肽的氨基酸序列优选地包含SEQ ID N0:54或70。所述核苷酸序列优选地包含SEQ ID NO :53。 在另一个实施方案中，本发明包括包含本发明的任何分离多核苷酸的载体。
在另一个实施方案中，本发明包括重组DNA构建体，所述DNA构建体包含与至少一 种调节序列可操纵地连接的任何本发明的分离多核苷酸。在另一个实施方案中，本发明涉及转化细胞的方法，所述方法包括用本发明的任何分离多核苷酸来转化细胞。也包括通过这种方法转化的细胞。在特定实施方案中，所述 细胞是真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞，或原核，例如细菌。在另一个实施方案中，本发明包括生产转基因植物的方法，所述方法包括用本发 明的任何分离多核苷酸或重组DNA构建体来转化植物细胞并从转化过的植物细胞中再生 转基因植物。本发明也涉及由此方法制备的转基因植物，以及从该转基因植物中获取的转 基因种子。在另一个实施方案中，分离多肽具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性，其 中所述多肽的氨基酸序列基于Clustal W比对方法在与SEQ IDNO :54或70进行比较时具 有至少95%的序列同一性。所述多肽的氨基酸序列优选地包含SEQ ID N0:54或70。在另一个实施方案中，用于分离具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多 肽的方法，所述方法包括从细胞或细胞培养基中分离所述多肽，其中所述细胞包含重组DNA 构建体，所述构建体包含可操作地连接至至少一种调控序列的本发明的多核苷酸。在另一个实施方案中，改变宿主细胞中2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶表达水 平的方法，所述方法包括(a)用本发明的重组DNA构建体来转化宿主细胞；以及(b)在适 于表达所述重组DNA构建体的条件下培养转化过的细胞，其中重组DNA构建体的表达导致 转化过的宿主细胞中产生的2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶的水平改变。附图简述和序列表根据以下的详细描述和附图以及序列表，可更全面地理解本发明，以下的详细描 述和附图以及序列表形成本申请的一部分。

图1是生育酚生物合成途径的示意图。图2是生育三烯酚生物合成途径的示意图。图 3A-3C显示 SEQ ID NO :54、61、62、63、64、65、66、67、68、69 和 70 的 2-甲基_6_植
基苯醌醇甲基转移酶多肽的多重比对。使用ClustalW比对方法，用默认参数进行多重比 对。框中包括严格匹配SEQ ID N0:54的残基。将共有序列显示于比对上部。当在该位置 的所有残基相同时，将残基显示于共有序列中。图4显示来自图3A-3C的多重比对的每对多肽的序列同一性百分比和趋异度。发明详述可以在植物、植物细胞、酵母、和微生物中使用HGGT、Y-生育酚甲基转移酶和 2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶多核苷酸的组合以改变细胞中经由来自每个多核苷酸 的相应的酶生成的母育酚，如生育三烯酚。本发明显示特别是可以使用HGGT、Y-生育酚 甲基转移酶和2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶多核苷酸的组合，更具体地讲产生它们 编码的酶，以显著地提高在蔬菜、水果、和农学作物植物(包括谷物，包括但不限于玉米和 大豆种子)的可食用组织中的维生素E相关的抗氧化剂，具体地讲α-和β-生育三烯酚的含量。维生素E抗氧化剂含量的改变也将反映在从这些植物、谷物和种子中获取的油 量。编码HGGT和生育酚甲基转移酶的多核苷酸的用途描述于美国专利公开申请公布 2007-0199096中，该文献以引用方式并入本文。本发明包括用于改变母育酚的组合物和方法。所述组合物和方法用于改善谷物的 抗氧化质量，用作人类的食物和牲畜的饲料。此外，可经由加工提取、纯化或进一步改变母 育酚。如本文所用，“谷物”是指商业种植者除了用于再生产物种目的之外生产的成熟种 子，和/或作为整个植株的整体部分收获的用于青贮饲料的不成熟种子。如本文所用，谷物 包括通常归类为水果、坚果或蔬菜的植物部分。如本文所用，“野生型”是指未转化的生物和未转化的生物的后代。化学制品的分子式可是用多种形式表示。例如，术语“ZnS04 7H20,\"ZnS04. 7H20”、 ‘‘ZnS04*7H20”、和‘‘ZnS04-7H20”在本文中可互换使用。术语“母育酚”一般指生物体系中产生的任何已知生育酚和生育三烯酚分子种类 (例如a-、0-、Y_、和S-)。术语“母育酚含量”指整个植株、组织、或细胞或在微生物宿 主中的生育酚和生育三烯酚总量。术语“母育酚组成”指在任何给定生物体系中产生的多 种母育酚的比率和任何一种母育酚化合物的特性，如抗氧化活性。当本文提出或根据权利 要求提出母育酚的改变时，此类改变可能是母育酚含量和/或母育酚组成的改变。当本文 提出或根据权利要求提出母育酚的提高时，此类提高指母育酚含量和/或母育酚活性的提 尚o术语“生育三烯酚” 一般指生物体系中产生的任何已知生育三烯酚分子种类(例 如a-、0-、Y_、和S-)。术语“生育三烯酚含量”指整个植株、组织、或细胞或在微生物宿 主中的生育三烯酚总量。术语“生育三烯酚组成”指在任何给定生物体系中产生的多种生 育三烯酚的比率和任何一种生育三烯酚化合物的特性，如抗氧化活性。当本文提出或根据 权利要求提出生育三烯酚的改变时，此类改变可能是生育三烯酚含量和/或生育三烯酚组 成的改变。当本文提出或根据权利要求提出生育三烯酚的提高时，此类提高指生育三烯酚 含量和/或生育三烯酚活性的提高。术语“尿黑酸植基转移酶”或“HPT”指催化尿黑酸和植基焦磷酸(或植基二磷酸) 缩合的酶。据信此反应是生育酚生物合成中的关键步骤。已被用于指代这种酶的其他名称 包括“尿黑酸植基焦磷酸异戊烯基转移酶”和“尿黑酸植基二磷酸异戊烯基转移酶”。也使 用缩短形式的植基/异戊烯基转移酶。本文互换使用的术语“尿黑酸香叶基香叶基转移酶”和“HGGT”指催化尿黑酸和香 叶基香叶基焦磷酸(或香叶基香叶基二磷酸)缩合的酶。此反应是生育三烯酚生物合成的 重要步骤，并能导致母育酚含量和/或组成的改变。HGGT酶可包括但不限于那些表1中所 示的酶。表 1 本文使用的术语“ 生育酚甲基转移酶”、“ Y-TMT”、“GTWT和“VTE4”指分别催 化和A-生育酚甲基化成a-和生育酚的酶，以及指分别甲基化和A-生育 三烯酚成a-和生育三烯酚的酶。此反应是生育三烯酚生物合成的重要步骤，并能导 致母育酚含量和/或组成的改变。Y"生育酚甲基转移酶可包括但不限于那些表2中所示的酶。2Y-牛育酚甲某转移酶 关于催化和A-生育三烯酚甲基化的酶只有有限的信息可利用。美国专利申 请2003154513公开了来源于棉花、玉米和蓝细菌淡水藻的序列。这些序列显示与来自拟南 芥(PCT公开W0 99/04622)和大豆(PCT公开W0 00/032757)的生育酚甲基转移酶基 因的相似性。来自单子叶植物玉米的异源表达酶显示了对生育酚和生育三烯酚底物几乎相 同的活性。另一方面，来自双子叶植物棉花或蓝绿藻的生育酚甲基转移酶直系同源物 仅显示对生育三烯酚底物的微量活性。本文互换使用的术语“2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶”、“VTE3”和“MPBQMT” 是指催化2-甲基-6-植基苯醌醇(MPBQ)在环化之前甲基化的酶。此反应是生育三烯酚生 物合成的重要步骤，并能导致母育酚含量和/或组成的改变。2-甲基-6-植基苯醌醇甲基 转移酶可包括但不限于那些在表3中所示的酶。将其中已经移除了推定的转运肽的酶的氨 基酸序列命名为“成熟体”。彪2-甲基-6-棺基苯醌醇甲基转移酶 已经分离并鉴定了拟南芥中的VTE3 (维生素E缺陷型)位点，它编码拟南芥2_甲 基-6-植基苯醌醇甲基转移酶(Cheng等人，2003 PlantCell，15 =2343-2356) 0编码拟南芥 VTE3和VTE4多肽的重组0 NA构建体已经在转基因大豆中进行了共表达(Van Eenennaam 等人，2003 PlantCell，15 :3007-3019)。本发明涉及包含编码2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶多肽的核苷酸序列的分 离多核苷酸，所述多肽基于Clustal W比对方法在与SEQ IDN0 :54或70进行比较时具有至 少95%的同一性。本发明包括使用HGGT、生育酚甲基转移酶和2-甲基_6_植基苯醌醇甲基转移 酶的组合以在包括植物和微生物的生物体中显著地提高维生素E相关的抗氧化剂(具体地 讲是a-和生育三烯酚)的含量。本发明不受公开的实施方案的限制，但包括所有具 有这些活性的酶。本发明也包括此类多核苷酸的分离互补序列，其中所述互补序列和多核苷酸由相 同数目的核苷酸组成，并且所述互补序列和多核苷酸的核苷酸序列100%互补。在另一个实施方案中，本发明涉及病毒和宿主细胞，它们包含如本文所述的本发 明的重组DNA构建体或如本文所述的本发明的分离多核苷酸。可用于实施本发明的宿主细 胞的实例包括但不限于酵母、细菌、和植物。在另一个实施方案中，本发明涉及2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶多肽，所述 多肽基于Clustal W比对方法在与SEQ ID NO :54或70的多肽进行比较时具有至少95% 相同的氨基酸序列。如上文所述，可使用本发明的核酸片段产生转基因植物，转基因植物中公开的多 肽的水平高于或低于正常植物，或它们在正常情况下不产生这些酶的细胞类型或发育阶段 中存在。这将在那些细胞中产生改变母育酚含量和/或组成水平的效应。本发明提供分离核苷酸分子，所述分子包含编码HGGT、生育酚甲基转移酶和 2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶的核苷酸序列的组合。也提供由此类核苷酸序列编码 的分离多肽。在方法中发现核苷酸序列用于改变生物体系如植物中的a-和生育三烯 酚。该方法包括改善谷物的抗氧化剂活性、改变植物或其部分中的生育三烯酚、以及改善宿 主中的母育酚。所述方法包括用至少一个核苷酸构建体转化植物或宿主，所述构建体包含至少一种编码HGGT的核苷酸序列的至少一部分、至少一种编码生育酚甲基转移酶的核 苷酸序列的至少一部分和至少一种编码2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶的核苷酸序列 的至少一部分。如果需要的话，该核苷酸构建体可附加地包含至少一种可操作地连接的调 控序列，它在受关注的植物中启动表达。此类核苷酸构建体能用于提高HGGT、生育酚甲 基转移酶和2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶的表达。还提供了种子和提取油料的新型组成。提供了具有超出期望的高含量a-和 生育三烯酚的种子和提取油料。具有高含量a-生育三烯酚的种子或油料与其他生
育三烯酚物质相比具有更好的a-生育三烯酚生物利用度(Kiyose等人，(2004) J. Clin. Biochem. Nutr. ,35(1) :47_52,题目，Distribution and metabolism of tocopherols andtocotrienols in vivo)。分离种子油的方法是本领域熟知的(Young等人，Processing ofFats and Oils, The Lipid Handbook, Gunstone 等人编辑，第 5 章第 253-257 页；Chapman&Hall London(1994)) 例如，使用一系列涉及从含油种子中萃取和纯化食用油产品的步骤生产大 豆油。使用表4所示的通用步骤来生产大豆油和大豆副产品。大豆油和副产品牛产通用步骤 更准确地说，大豆种子经清洁、回火、脱壳和去皮从而提高了油脂萃取的效率。油 脂的萃取通常利用溶剂(例如己烷)萃取来完成，但也可以通过联合使用物理压榨和/或 溶剂萃取而实现。所得到的油脂称为原油。可以通过使磷脂以及其他极性和中性的脂类 复合物发生水合反应从而促进它们与非水合的甘油三酯部分(大豆油脂)分离，而令上述 原油脱胶。所得到的卵磷脂胶可以被深加工为作为乳化剂和脱模(即抗粘结)剂用于多 种食品和工业品中的具有重要商业意义的卵磷脂产品。脱胶油可以进一步精炼以除去杂质 (主要是游离脂肪酸、色素和残留胶)。通过添加与游离脂肪酸反应形成皂并使上述原油 中的磷脂和蛋白质发生水合反应的腐蚀剂而实现精炼。用水洗去精炼过程所形成的皂类痕 迹。上述皂脚副产品可直接用于动物饲料或将其酸化以回收游离脂肪酸。利用漂白土的吸 附作用除去大部分的叶绿素和类胡萝卜素复合物而实现脱色。精炼的油脂可以是氢化的， 从而得到具有不同熔解性质和构造的脂肪。可以通过在精细控制的冷却条件下结晶，从而 利用冷凝(分馏)从氢化油脂中除去硬脂。脱臭(主要通过真空蒸汽蒸馏)是最后一个 步骤，目的是除去那些令油脂具有臭味或气味的复合物。脱臭过程中还可以除去其他有价 值的副产品，如生育酚和留醇类。包含这些副产品的脱臭馏出液可以出售，其可用于生产 天然维生素E以及其他高价值的药品。经精炼、漂白、(氢化、分馏)以及脱臭的油脂和脂 肪可以直接包装出售，或深加工为更加专门化的产品。关于大豆种子加工、大豆油脂生产 以及副产品利用的更加详尽的参考文献参见Erickson，Practical Handbook of Soybean Processing andUtilization(The American Oil Chemists' Society and UnitedSoybean Board(1995))。许多改善母育酚、生育三烯酚和抗氧化剂活性的专利申请改善谷物贮藏、改善谷 物提取油的稳定性、赋予人消费谷物有益效果、改善消费所述谷物的动物的肉质量、以及产 生用于化妆品、工业和/或营养学的新型母育酚或生育三烯酚(美国专利申请2004266862 ； Karunanandaa等人(2005)Metab. Eng.，7 :384_400)。也已知在植物蔬菜绿色组织如叶片组 织中存在母育酚，它是保护植物免遭在氧光合作用期间由在叶绿体中产生的氧自由基直接 或间接诱导的光氧化损伤所必需的。因此，在绿色植物组织如叶片组织中，除了叶片中的正 常生育三烯酚含量之外的生育三烯酚异常表达可能将导致叶片抵抗此类光氧化损伤的能 力提高，并因此导致植物的光合作用能力提高。这将导致植物在整个生长期间的可收获产 量提高。本发明的核苷酸构建体可附加地包含至少一种调控序列，它在宿主或植物中启动 表达。就玉米而言，可选择的调控序列包括胚芽优选的启动子如16kDa和18kDa油质蛋白 基因的启动子、胚乳优选的启动子如lOkDa玉米蛋白基因的启动子、以及植物启动子如泛 素基因启动子。如果需要，可以将两个或更多个此类核苷酸序列连接或接合到一起形成一种多核 苷酸分子，并且可以使用此类多核苷酸转化植物。例如，能够将一种包含编码HGGT的核苷酸序列的核苷酸构建体与另一种编码相同或另一种HGGT的核苷酸序列连接。编码HGGT和Y-生育酚甲基转移酶的核苷酸序列也可以在核苷酸构建体中连接。此外，也可将编码 HGGT、γ -生育酚甲基转移酶和2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶的核苷酸序列连接到核 苷酸构建体中。同样的，能在不同的核苷酸构建体上提供三个核苷酸序列，并且每个分开的 核苷酸序列能可操作地连接至至少一种启动植物中表达的调控序列。例如，可以使用提高 总HGGT活性并降低总HPT活性的构建体，从而导致所述途径转向产生生育三烯酚而降低生 育酚的产生。也可使用替代方法。如果将分开的核苷酸构建体用于一种HGGT核苷酸序列、一种 Y “生育酚甲基转移酶核苷酸序列和一种2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶核苷酸序列， 三个单独的植物可以用所述核苷酸构建体转化，并且所述植物可以然后进行杂交以生产具 有所需HGGT、γ -生育酚甲基转移酶和2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶核苷酸序列(即， 也称作基因堆叠)基因型的后代。此外，用于下调负责生产植醇焦磷酸(生育酚生物合成的其中一个前体)的香叶 基香叶基还原酶的构建体可以与表达HGGT的构建体顺式连接。此操作的结果将是香叶基 香叶基焦磷酸的含量增加以及生育三烯酚生物合成途径的流量相应增加。也能通过提高流 入类异戊二烯生物合成的莽草酸途径和非甲羟戊酸途径的碳量来提高生育三烯酚的流量。 具体地讲，能通过靶向叶绿体的基因表达达到此流量，所述基因如来自植物的双官能分支 酸变位酶-预苯酸脱氢酶(TYRA)(来自细菌)和对-羟基苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)基 因(Karunanandaa 等人(2005)Metab. Eng. 7 :384_400)。本发明的核酸分子优选地是重组核酸分子(或者也可称为重组DNA构建体)。如 本文所用，“重组”指例如通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实 现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括指已经通过引入异源核酸而 进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事件 (如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，例如没有蓄意人为干扰而发 生的那些。如本文所用，“重组DNA构建体”指非天然存在的核酸片段组合。因此，重组DNA构 建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存 在的方式排列的调控序列和编码序列。术语“重组DNA构建体”和“重组体核酸分子”本文 可互换使用。可使用本发明的方法改变任何植物或其部分中的母育酚或生育三烯酚，并从而改 变抗氧化剂活性。可用于本发明的植物包括但不限于田地作物(例如，苜蓿、大麦、菜豆、玉 米、油菜、棉花、亚麻、豌豆、稻、裸麦、红花、高粱、燕麦、小米、大豆、向日葵、烟草、和小麦)； 蔬菜作物(例如，芦笋、甜菜、西兰花、卷心菜、胡萝卜、菜花、芹菜、黄瓜、茄子、莴苣、洋葱、 胡椒、马铃薯、南瓜、萝卜、菠菜、南瓜、芋头、番茄、和西葫芦)；以及水果和坚果作物(例如， 杏仁、苹果、杏、香蕉、黑莓、蓝莓、可可、樱桃、椰子、越橘、海枣、费约果、榛子、葡萄、柚子、番 石榴、猕猴桃、柠檬、酸橙、芒果、甜瓜、蜜桃、橙、番木瓜果、百香果、桃子、花生、梨、菠萝、开 心果、李子、树莓、草莓、橘子、胡桃、和西瓜)和拟南芥。本发明的一些方法涉及改变采收后 经过加工的谷物和植物其他部分的抗氧化剂含量。经过采收后加工，由此产生的母育酚和 生育三烯酚对磨坊主和其他加工者而言能够成为有价值的回收来源。
来自转基因植物的谷物油或植物油包含含量提高的α-和β-生育三烯酚，可用 它们来饲喂牲畜和家禽以改善肉产品的氧化稳定性。具有实际有益效果的改善实例包括新 鲜牛肉在零售陈列期间的颜色稳定性提高，以及预煮过的肉产品在冷藏条件下贮存时风味 稳定性提高。可以期待这些改善以及其他质量相关的改善，因为生育三烯酚在肌肉组织中 起到断链自由基清除剂的功能，因此减少降低肉质量并减少储存寿命的氧化反应。
例如，可通过用得自高生育三烯酚转基因谷物或植物油的至少约300-ppm的总 α-和β-生育三烯酚配制的饮食饲养牛至少100天来证明牛肉质量的改善。为了进行比 较，一组用标准饮食(无附加的生育三烯酚)饲养的牛(其他条件都相同)可作为对照处 理组(“对照组”)。为了评估鲜肉的颜色稳定性，得自每头动物的肋眼牛排用PVC外包裹 单独包装在泡沫板中并置于仿零售陈列条件下七天。鲜肉颜色由经过培训的专门小组成员 对可见的颜色强度和变色程度按分级标准进行主观评价。也可使用仪器评估颜色，如使用 HunterLab MiniScan 分光光度计或类似的装置评估“a*值”，它是发红程度的量度。这些 检测分析的结果证明来自用高生育三烯酚饮食饲养的牛的牛排随时间平均表现出比来自 对照组的肋眼牛排更好的主观视觉评分和更高的(即更好的)a*仪器值。颜色稳定性的改 善延长了零售陈列时间并因此减少了由于变色导致的打折和丢弃的新鲜产品的量。包括碎 牛肉在内的其他鲜牛肉产品也将表现出改善的颜色稳定性并因此提供对零售商人相似的 有益效果。(也参见WO公布2005/002358，其全部内容以引用方式并入本文)。用于评估生育酚含量和生育酚组成(包括生育酚活性)的方法是本领域已知的。 生育酚含量和组成可以用HPLC组合荧光检测器进行测量。此类方法描述于多个参考文献 中(例如 Kamal-Eldi A. , Gorgen S. , Pettersson J. , Lampi Α. M. (2000) J. Chromatogr., A881 -.2X1-221 ；Bonvehi J. S.，Coll F. V.，Rius I. A. (2000) J. AOAC Intl. ,83 :627_634 ； Goffman F. D.和Bijhme T. (2001) J. Agric. Food Chem.，49 :4990_4994)。此类方法通常涉 及使用正相或反相HPLC基质在复杂混合物中包含的生育酚分子种类的分辨率。然后通过 色原烷醇头基的荧光检测洗脱的生育酚分子种类，使用的激发波长通常在290至295nm的 范围内，而发光波长通常在325至335nm的范围内。使用这种方法，可通过将分离分子种类 与那些已知标准品的保留时间进行比较来测定生育酚混合物的组成。每个生育酚分子种类 的含量能通过其在选择波长下的相对荧光发射强度进行测量。每个生育酚种类的绝对量能 通过测量其相对于内部标准品的荧光发射强度进行测定，在HPLC分析之前加入已知量的 内部标准品到生育酚混合物中。适用的内部标准品包括生育酚类似物，它通常不是天然存 在的(例如5，7_ 二甲基母育酚)，或不存在于给定生育酚混合物中的天然存在生育酚分子 种类。化合物的复杂混合物的总生育酚含量能通过叠加通过HPLC分析测定的每个生育酚 分子种类组分的绝对量得到。用于评估生育三烯酚含量和生育三烯酚组成(包括生育三烯酚活性)的方法是本 领域已知的。生育三烯酚含量和组成可通过HPLC使用上述方法进行测量，用于分析生育三 烯酚含量和组成。使用实施例3和别处所述的HPLC技术(例如Podda M. ,Weber C. ,Traber M. G.，Packer L. (1996) J. Lipid Res. ,37 :893_901)，可容易地从在复杂混合物中的生育酚 分子种类中分辨生育三烯酚分子种类。复杂混合物中的生育三烯酚是否存在以及结构鉴定 能通过气相色谱-质谱联用分析仪进行测定，如Frega N.，Mozzon M.，和Bocci F. (1998) J. Amer. Oil Chem. Soc. ,75 1723-1728 所述。
此外，亲脂抗氧化剂活性可通过检测分析法进行测量，包括抑制亚油酸和β _胡 萝卜素的伴随自氧化，以及别处所述的抗氧化能力指数(ORAC) (Serbinova Ε. Α.和Packer L. (1994)Meth. Enzymo 1.，234 354-366 ；Emmons C. L.，Peterson D. Μ.，Paul G. L. (1999) J. Agric. Food Chem. ,47 4894-4898) ；HuangD 等人(2002) J. Agric. Food Chem.)。此类方 法通常涉及测量测试材料中的抗氧化剂化合物(即母育酚)的能力以抑制模型底物(荧光 素、藻红素)的荧光衰减，所述衰减由过氧基引发剂(2’，2’_偶氮双[20脒基丙烷]二盐酸 盐)诱导。
本发明包括分离的或基本上纯化的核酸或多肽组合物。“分离的”或“纯化的”核 酸分子或多肽或者它们的生物活性部分大体上不含其他细胞物质、或当通过重组技术生产 时的培养基，或者当通过化学合成时大体上不含化学前体或其他化学物质。优选地，“分离 的”核酸不是天然侧接从中获得核酸的生物基因组DNA中的核酸(即，位于核酸序列5'和 3'末端的序列)的序列(优选蛋白编码序列)。例如，在多个实施方案中，分离的核酸分子 可包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb、0. 3kb或0. Ikb的核苷酸序列，该序列天然侧 接从中获得核酸的细胞基因组DNA中的核酸分子。大体上不含细胞物质的多肽包括制备的 具有小于约30%、20%、10%、5% (按干重计)的污染多肽的多肽。当重组生产本发明的多 肽或其生物活性部分时，优选的培养基提供小于约30%、20%、10%、5%、3%或(按干 重计)的化学前体或非受关注多肽的化学制品。本发明也包括公开的核苷酸序列片段和突变体，以及由此编码的多肽。“片段”是 指一部分核苷酸序列或一部分氨基酸序列。核苷酸序列的功能性片段可编码保留天然蛋白 生物活性的多肽片段，如HGGT活性和/或Y-生育酚甲基转移酶活性和/或2-甲基-6-植 基苯醌醇甲基转移酶活性。作为另外一种选择，用作杂交探针的核苷酸序列片段一般不编 码保留生物活性的多肽。因此，核苷酸序列片段的长度范围可以是至少约20个核苷酸，约 30个核苷酸，约50个核苷酸，约70个核苷酸，约100个核苷酸，约150个核苷酸以及最多编 码本发明的多肽的全长核苷酸序列。编码本发明的HGGT多肽的生物活性部分的HGGT核苷酸序列片段将编码至少15、 25、30、50、75、100、或125个邻接氨基酸，或在本发明全长HGGT多肽中存在的最多氨基酸总 数(例如，SEQ I D N0:2、4、6、8和10分别具有407、408、404、380和361个氨基酸)。用作 杂交探针或PCR引物的HGGT核苷酸序列片段一般不需要编码HGGT多肽的生物活性部分。因此，HGGT核苷酸序列的片段可以编码HGGT多肽的生物活性部分，或者它可以是 能用作使用下文公布的方法的杂交探针或PCR引物的片段。能通过分离一部分本发明的其 中一种HGGT核苷酸序列、表达HGGT多肽(例如通过体外重组表达)的所述编码部分和评 估HGGT多肽的编码部分的活性来制备HGGT多肽的生物活性部分。作为HGGT核苷酸序列片段的核酸分子包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、 300、350、400、450、500、550、600、650、或700个核苷酸，或本文所公开的全长HGGT核苷酸序 列中存在的核苷酸的最大数目(例如，SEQ ID N0:l、3、5、7和9分别具有1457、1365、1242、 1730、和1769个核苷酸)。同样的，编码本发明的Y-生育酚甲基转移酶多肽的生物活性部分的Y-生育酚 甲基转移酶核苷酸序列片段将编码至少15、25、30、50、75、100、或125个邻接氨基酸，或在 本发明全长Y-生育酚甲基转移酶多肽中存在的最多氨基酸总数。用作杂交探针或PCR引物的Y-生育酚甲基转移酶核苷酸序列的片段一般不需要编码Y-生育酚甲基转移酶多肽的生物活性部分。因此，Y-生育酚甲基转移酶的核苷酸序列的片段可以编码Y-生育酚甲基转移 酶多肽的生物活性部分，或者它可以是能用作使用下文公布的方法的杂交探针或PCR引物 的片段。Y-生育酚甲基转移酶多肽的生物活性部分可通过分离一部分本发明的其中一种 Y“生育酚甲基转移酶核苷酸序列进行制备，它表达Y“生育酚甲基转移酶多肽的编码部 分(例如通过体外重组表达)，并评估Y-生育酚甲基转移酶多肽的编码部分的活性。作为Y-生育酚甲基转移酶核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少16、20、50、 75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、或 700 个核苷酸，或本文所公 开的全长Y-生育酚甲基转移酶核苷酸序列中存在的核苷酸的最大数目。同样的，编码本发明的2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶多肽的生物活性部分的 2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶核苷酸序列的片段将编码至少15、25、30、50、75、100、或 125个邻接氨基酸，或本发明的全长2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶多肽中存在的最大 氨基酸总数。用作杂交探针或PCR引物的2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶甲基转移酶 核苷酸序列的片段一般不需要编码Y-生育酚甲基转移酶多肽的生物活性部分。因此，2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶核苷酸序列的片段可以编码2-甲 基-6-植基苯醌醇甲基转移酶多肽的生物活性部分，或者它可以是能用作使用下文公布的 方法的杂交探针或PCR引物的片段。可通过分离一部分本发明的其中一种2-甲基-6-植 基苯醌醇甲基转移酶核苷酸序列、表达2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶多肽(例如通过 体外重组表达)的所述编码部分和评估2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶多肽的编码部 分的活性来制备2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶多肽的生物活性部分。作为2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少 16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、或 700 个核苷酸，或 本文所公开的全长2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶核苷酸序列中存在的核苷酸的最大 数目。“突变体”是指大体上类似的序列。就核苷酸序列而言，保守突变体包括那些因为 遗传码子降解导致编码本发明的其中一种HGGT和/或Y -生育酚甲基转移酶和/或2-甲 基-6-植基苯醌醇甲基转移酶多肽的氨基酸序列的序列。天然存在的等位变体如这些能 通过使用熟知的分子生物学技术鉴定的变体，所述技术例如下文所列出的聚合酶链反应 (PCR)和杂交技术。突变核苷酸序列也包括合成来源的核苷酸序列，如那些例如通过使用定 点诱变生成的序列，但其仍然编码本发明的HGGT和/或Y -生育酚甲基转移酶和/或2-甲 基-6-植基苯醌醇甲基转移酶多肽。本发明的特定核苷酸序列通常将具有与本文别处描 述的使用默认参数的序列比对程序测定的特定核苷酸序列相比，至少约80 %，一般至少约 85%，优选地至少约 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%，更优选地至少约 98%、 99%或更高的序列同一性。“突变体”多肽是指通过删除(所谓的截短)或添加一种或多种氨基酸至天然多 肽的N-末端和/或C-末端；在天然多肽的一个或多个位点删除或添加一种或多种氨基酸； 或在天然多肽的一个或多个位点取代一种或多种氨基酸获得的多肽。本发明包括的突变多 肽具有生物活性，即它们持续具有天然多肽的所需生物活性，即，如本文所述的HGGT和/或Y-生育酚甲基转移酶和/或2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性。此类突变体可得自 例如遗传多态性或得自人工操纵。本发明的HGGT和/或Y -生育酚甲基转移酶和/或2-甲 基-6-植基苯醌醇甲基转移酶多肽的天然生物活性突变体与本文别处描述的使用默认参 数的序列比对程序测定的天然多肽的氨基酸序列相比，将具有至少约60 %、65 %、70 %、一 般至少约 75%、80%、85%、优选地至少约 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 更优选地至少约98%、99%或更高的序列同一性。本发明的多肽的生物活性突变体可与多 肽相差仅仅1-15个氨基酸残基，仅仅1-10个，如6-10个，仅仅5个，仅仅4个、3个、2个或 甚至1个氨基酸残基。本发明的多肽可用多种方法进行改变，包括氨基酸取代、删除、截短、和插入。此类操纵方法是本领域一般已知的。例如，HGGT和/或Y -生育酚甲基转移酶和/或2-甲 基-6-植基苯醌醇甲基转移酶多肽的氨基酸序列突变体能通过DNA突变进行制备。用于 诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域熟知的。参见例如Kunkel (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA82 488-492 ；Kunkel 等人(1987)Methods in Enzymo1.，154:367_382 ；美国专 利公开 4，873，192 ;Walker 和 Gaastra 编辑(1983) Techniquesin Molecular Biology, (MacMillan Publishing Company，NewYork)，这些文献以引用方式并入本文。关于不影 响受关注多肽的生物活性的合适氨基酸取代的指导可参见Dayhoff等人的模型，(1978) Atlasof Protein Sequence and Structure，(Natl. Biomed. Res. Found.，Washington, D. C.)，该文献以引用方式并入本文。可优选保守取代，如用一种具有相似性质的氨基酸取 代另一种氨基酸。因此，本发明的基因和核苷酸序列包括天然存在的序列以及突变体形式。同样的， 本发明的多肽包括天然存在的多肽及其突变体和修饰形式。此类突变体将持续具有所需的 HGGT和/或Y -生育酚甲基转移酶和/或2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶的活性。优 选地，在编码突变体的DNA中制造的突变将不会把所述序列置于阅读框之外，并且优选地 将不制备能产生mRNA 二级结构的互补区域。参见EP专利申请公布75，444。不期望本文包括的多肽序列的删除、插入、和取代对多肽特性产生巨大的改变。然 而，当在行动之前预测取代、删除、或插入的确切效应比较困难时，本领域的技术人员将会 知道该效应将通过常规筛选检测分析法进行评估。即，能通过检测分析HGGT和/或γ-生 育酚甲基转移酶和/或2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶的活性来评估活性。突变体核苷酸序列和多肽也包括来源于诱变或重组方法如DNA改组的序列和多 肽。使用此类方法，能操纵一种或多种不同的HGGT和/或Y-生育酚甲基转移酶和/或 2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶编码序列制备具有所需特性的新HGGT和/或γ -生育 酚甲基转移酶和/或2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶多肽。在这种方法中，从一组包含 具有基本的序列同一性、并且能在体外或体内进行同源重组的相关多核苷酸序列中生成重 组多核苷酸文库。例如，使用这种方法，编码受关注的结构域的序列基序可在本发明的HGGT 多核苷酸和/或其他HGGT基因之间改组以获取编码具有改善的受关注特性的新基因，如提 高酶的Km。同样的，使用这种方法，编码受关注的结构域的序列基序可在本发明的Y-生 育酚甲基转移酶多核苷酸和/或其他Y“生育酚甲基转移酶基因之间改组以获取编码具有 改善的受关注特性的新基因，如提高酶的Km。同样的，使用这种方法，编码受关注的结构域 的序列基序可在本发明的2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶多核苷酸和/或其他2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶基因之间改组以获取编码具有改善的受关注特性的新基因， 如提高酶的K2-62-6m。此类DNA改组方法是本领域已知的。参见例如Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.，USA91 10747-10751 ；Stemmer(1994)Nature, 370 :389_391 ；Crameri 等 人(1997) Nature Biotech. , 15 :436_438 ；Moore 等人(1997) J. Mol. Biol.，272 :336_347 ； Zhang 等人(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA94 :4504_4509 ；Crameri 等人(1998) Nature， 391 288-291 ；和美国专利公开 5，605，793 和 5，837，458。可使用本发明的核苷酸序列分离来自其他生物，具体地讲其他植物，更具体地讲 其他单子叶植 物或双子叶植物的相应序列。用这种方法，可使用例如PCR、杂交等方法基于 它们对本文示出序列的序列同源性鉴定此类序列。本发明包括基于它们对本文示出的完整 HGGT和/或Y -生育酚甲基转移酶和/或2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶核苷酸序列 或它们的片段的序列同一性分离的序列。此类序列包括公开序列的直系同源物。“直系同 源物”是指来源于共同的遗传基因并作为物种形成的结果存在于不同物种的多核苷酸。如 本文别处所述，当存在于不同物种的多核苷酸的核苷酸序列和/或它们编码的多肽序列基 本上相同时，则认为它们是直系同源物。各物种之间的直系同源物的功能常常是高度保守 的。在一个PCR方法中，可设计寡核苷酸引物用于PCR反应以从提取自任何受关注 植物的cDNA或基因组DNA中扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方 法是本领域一般已知的，公开于 Sambrook 等人(1989) Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第 2 版，ColdSpring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)。也参见 Innis 等人编辑(1990) PCR Protocols :A Guide to Methods andApplications (Academic Press, New York) ；Innis 禾口 Gelfand 编 辑(1995)PCR Strategies(Academic Press, New York)；以及 Innis 和 Gelfand 编辑(1999) PCR Methods Manual (Academic Press, NewYork)。已知的PCR方法包括但不限于使用成对引物、巢式引物、单个特异引物、简并引 物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。为了避免混淆，“PCR”或“聚合酶链反应”是用于合成大量的特定DNA片段的技术， 其包括一系列重复的循环(Perkin Elmer Cetuslnstruments，Norwalk，CT)。典型地，双链 DNA被热变性，两种与目标片段的3'端区域互补的引物在较低温度下与之退火，然后在中 间温度下得到延伸。一组的上述三个连续的步骤被称为一个循环。在杂交技术中，把所有或部分已知核苷酸序列用过探针，探针选择性地杂交到来 自选择生物的存在于一组克隆基因组DNA片段或cDNA片段的其他对应核苷酸序列上(即， 基因组或cDNA文库)。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其他寡 核苷酸，并且可以用可检测的基团如32P、或任何其他可检测标记物标记。因此例如杂交探 针能基于本发明的HGGT和/或Y -生育酚甲基转移酶序列，通过标记合成寡核苷酸进行制 备。用于制备杂交探针和构建cDNA和基因组文库的方法是本领域一般已知的，并且公开 于 Sambrook 等人(1989)Molecular Cloning :ALaboratory Manual (第 2 片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview, New York)0例如，可将本文公开的完整HGGT和/或Y-生育酚甲基转移酶和/或2-甲 基-6-植基苯醌醇甲基转移酶序列，或它们的一个或多个部分用作探针，所述探针能够特 异性地杂交到相应的HGGT和/或Y-生育酚甲基转移酶和/或2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶序列和信使RNA上。为了在多种条件下完成特异性杂交，此类探针包括在HGGT和 /或Y-生育酚甲基转移酶和/或2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶序列中的独特序列， 其长度优选至少约10个核苷酸，最优选至少约20个核苷酸。此类探针可用于从经选择的 植物中PCR扩增相应的HGGT和/或Y -生育酚甲基转移酶和/或2-甲基-6-植基苯醌醇 甲基转移酶序列。可使用此技术分离来自所需植物的附加编码序列或作为诊断检测分析法 测定植物中是否存在编码序列。杂交技术包括杂交筛选置于板上的DNA文库(噬菌体或菌 落；参见例如 Sambrook 等人(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第 2 版， ColdSpring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)。 可在严格条件下进行此类序列的杂交。“严格条件”或“严格杂交条件”是指在该 条件下探针将以比其他序列更高的可检测程度杂交到其靶序列上(例如至少2倍于背景)。 严格条件是序列依赖性的并将因不同的环境而异。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格 性，可鉴定与探针100%互补的靶序列(同源探测)。作为另一种选择，可调节严格条件以 允许序列中的一些错配，以便检测到更低程度的相似性(异源探测)。通常，探针的长度少 于约1000个核苷酸，优选长度少于500个核苷酸。一般地，严格条件将是如下那些条件在pH7. O至8. 3下盐浓度低于约1. 5M钠离 子，通常约0. 01至1. OM钠离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如10至50个核苷 酸)，温度为至少约30°C，而对于长的探针(例如多于50个核苷酸)，温度为至少约60°C。 严格条件也可以通过加入诸如甲酰胺之类的去稳定剂来实现。示例性的低严格条件包括在 37°C下在含有30至35%甲酰胺、IM NaClU% SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液中杂交，以 及在50至55°C下用IX至2X SSC (20X SSC = 3. 0MNaCl/0. 3M柠檬酸三钠)洗涤。示例性 的中等严格条件包括在37°C下于40至45%甲酰胺、1.0M NaClU% SDS中杂交，以及在55 至60°C下用0. 5X至IX SSC洗涤。示例性的高严格条件包括在37°C于50%甲酰胺、lMNaCl、 1%SDS中杂交，以及在60至65°C下用0. IX SSC洗涤。杂交时间一般小于约24小时，通常 约4至约12小时。特异性通常取决于杂交后洗涤，最后的洗涤溶液的离子强度和温度是关键因素。 对于 DNA-DNA 杂交体，Tm可以用 Meinkoth 和 Wahl (1984) Anal. Biochem. 138 :267_284 =T111 = 81. 5°C+16. 6(log Μ) +0. 41(%GC) -0. 61 (% form) -500/L ；其中 M是单价阳离子的体积摩尔 浓度，％ GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％ form是杂交溶液中甲酰胺的百分 比，而L是以碱基对表示的杂交体的长度。1是(在确定的离子强度和pH下)50%的互补 靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。每出现的错配，Tm降低约1°C;因此，可调节Tm 杂交和/或洗涤条件以与具有期望同一性的序列杂交。例如，如果要寻求具有> 90%同一 性的序列，则可将Tm降低10°C。通常，在确定的离子强度和PH下，严格条件选择为比特定 序列及其互补序列的熔解温度(Tm)低约5°C。然而，极严格条件可采用在比熔解温度(Tm) 低1、2、3或4°C的温度下杂交和/或洗涤；中等严格条件可采用在比熔解温度(Tm)低6、7、 8、9或10°C的温度下杂交和/或洗涤；低严格条件可采用在比熔解温度(Tm)低11、12、13、 14,15或20°C温度下杂交和/或洗涤。利用所述等式、杂交和洗涤组合物以及理想的Tm，本 领域技术人员将会理解，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化已经在本质上进行了描述。 如果所需的错配程度导致Tm低于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，则优选增加SSC 的浓度以便能使用更高的温度。对核酸杂交的一个广泛适用的指导存在于TijSSen(1993)LaboratoryTechniques, Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes,第一部分，第 2 章(Elsevier, NewYork)；以及 Ausubel 等人编 辑(1995)Current Protocols inMolecular Biology,第 2 章(Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York)。 参见 Sambrook 等人(1989)MolecularCloning :A Laboratory Manual(第 2 版，Cold Spring HarborLaboratory Press, Plainview, New York)。本发明包括编码具有HGGT和/或Y -生育酚甲基转移酶和/或2-甲基_6_植基 苯醌醇甲基转移酶活性的蛋白的分离序列和在严格条件下杂交到本文公开的HGGT和/或 Y “生育酚甲基转移酶和/或2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶序列或它们的片段的序 列。 核苷酸(通常以它们的T-单磷酸形式存在)本文常常通过它们的单个字母名称 来指代，如下所示“A”表示腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别就RNA或DNA而言)，“C”表示胞苷 酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R” 表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“W”表示A或T，“H”表示A或 C或T，“D”表示A或G或T，“M”表示A或C，“S”表示C或G，“V”表示A或C或G，“B”表 示C或G或T，“ I ”表示肌苷，并且“N”表示A、C、G、或T。使用以下术语描述在两个或多个核酸或多核苷酸之间的序列关系(a “参考序 列”，(b) “比对窗口”，(c) “序列同一性”，(d) “序列同一性百分比”，以及(e) “基本上相 同”。(a)如本文所用，“参考序列”是用作序列比对基准的定义序列。参考序列可以是 指定序列的一部分或全部；例如，全长cDNA或基因序列的一个片段，或全长cDNA或基因序 列。(b)如本文所用，“比对窗口，，比较参考序列和多核苷酸序列的邻接指定片段，其中 在所述比对窗口中的多核苷酸序列与参考序列(不包含附加或缺失)相比可以包含附加或 缺失(即空位)，以获得两段序列之间的最大匹配。一般来讲，比对窗口的长度为至少20个 邻接核苷酸，任选地可以是30、40、50、100个核苷酸，或者更长。本领域的技术人员懂得为 了避免由于在多核苷酸序列中包含空位导致的它与参考序列的高度相似，通常导入空位罚 分并从匹配数目中减去空位罚分。用于比对的序列比对方法是本领域熟知的。因此，能使用数学算法测定任意两个 序列之间的同一性百分比。此类数学算法的非限制性实例是Myers和Miller算法(1988) CABIOS 4 11-17 ；Smith 等人的局部同源性算法(1981)Adv. Appl. Math. 2 482 ；Needleman 和 Wunsch 的同源比对算法(1970) J. Mol. Biol. 48 443-453 ；Pearson 和 Lipman 的相似性 搜索算法(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. 85 -.2444-2448 ；Karlin 和 Altschul 的算法(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268，Karlin 和 Altschul 的改进算法(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :5873_5877。可利用计算机实施这些数学算法，以比对序列，测定序列同一性。此类具体实施 包括但不限于在 PC/Gene 程序中的 CLUSTAL(得自 Intelligenetics，Mountain View, California) ；ALIGN 程序(版本 2· 0)和 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、和 TFASTA，Wisconsin GeneticsSoftware Package,版本 8 (得自 Genetics Computer Group (GCG) ,575 ScienceDrive, Madison, Wisconsin, USA)。能够使用默认参数进行使用这些程序的比对。CLUSTAL 程序详述于 Higgins 等人(1988)Gene73 :237_244 (1988) ；Higgins 等人(1989) CABIOS 5 151-153 ；Corpet 等人(1988) Nucleic Acids Res. 16 10881-90 ；Huang 等人(1992) CABIOS 8 155-65 ；和 Pearson 等人(1994)Meth. Biol. 24 :307_331。ALIGN 基于 Myers 和 Miller 的算法(1988)，同上。当比对氨基酸序列时，PAM120权重残基表、空位长度罚分12、以及空 位罚分4能与ALIGN程序一起使用。Altschul等人的BLAST程序(1990) J. Mol. Biol. 215 403基于Karlin和Altschul的算法(1990)，同上。能使用BLASTN程序进行BLAST核苷 酸搜索，得分=100，字长=12，以获取与编码本发明的多肽的核苷酸序列同源的核苷酸序 列。能使用BLASTX程序进行BLAST多肽搜索，得分=50，字长=3，以获取与本发明的多 肽同源的氨基酸序列。为了获取用于比对目的的空位比对，可利用Gapped BLAST (BLAST 2.0)，如 Altschul 等人(1997)Nucleic Acids Res. 25 :33 89 所述。作为另外一种选择，可 使用PSI-BLAST (BLAST 2.0)进行重复搜索，它检测分子间的较远关系。参见Altschul等 人(1997)同上。当利用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，能使用相应程序(例如用于 核苷酸序列的BLASTN，用于多肽的BLASTX)的默认参数。也可通过检查进行手动比对。除非另作说明，本文提供的序列同一性/相似性值指使用GAP版本10获得的值， 使用以下参数同一性％使用GAP权重50，长度权重3 ； %相似性使用空位权重12，长度权 重4，或任何等同程序。所谓“等同程序”是指任何序列比对程序，就任何正被讨论的两个序 列而言，在与优选程序生成的对应比对进行比较时，生成具有相同核苷酸或氨基酸残基匹 配和相同序列同一性百分比的比对。GAP 使用 Needleman 和 Wunsch 算法(1970) J. Mol. Biol. 48 443-453,以发现两个 最大化匹配数和最小化空位数的完整序列的比对结果。GAP考虑所有可能的比对和空位位 点，并制备最大数目的匹配碱基和最少的空位。它允许以匹配碱基单位提供空位形成罚分 和空位延伸罚分。GAP必须对它插入的每个空位形成空位形成罚分匹配数。如果选择空位 延伸罚分大于零，GAP必须另外形成对每个空位延伸罚分的空位次数的插入长度的空位罚 分。多肽序列的Wisconsin Genetics Software Package版本10默认的空位形成罚分值 和空位延伸罚分值分别是8和2。核苷酸序列的默认空位形成罚分是50，而默认空位延伸 罚分是3。空位形成罚分和空位延伸罚分能用选自0至200的整数表达。因此例如空位形 成罚分和空位延伸罚分可以是 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、 60,65或更大。GAP提供了比对家族中的其中一个最好的成员。此家族中可能有很多成员，但是其 他成员没有更好的质量。GAP显示了用于比对的四个质量因数质量、比率、同一性、和相似 性。质量是比对序列的最大量度。比率是质量除以较短片段中的碱基数。同一性百分比是 实际匹配的符号的百分比。相似性百分比是相似符号的百分比。忽略来自空位对面的符号。 当一对符号的得分矩阵值大于或等于0.50时(相似性阈值)，对相似性打分。Wisconsin Genetics Software Package版本10中使用的得分矩阵是BLOSUM 62 (参见Henikoff和 Henikoff (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10915)。作为另外一种选择，就本发明而言，用于测定本文公开的HGGT、Y-生育酚甲 基转移酶或2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶序列的序列同一性百分比的核苷酸或多 肽序列比对优选使用存在于LASERGENE 生物信息学计算软件包的MEGALIGN 程序中(DNASTAR Inc. , Madison, WI)的Clustal W，使用以下默认参数。“默认参数”是程序制 造商的预设参数。就氨基酸序列比对而言，用于多重比对的默认参数为空位罚分10，空位 长度罚分0. 20，延迟发散序列30%，以及DNA转换权重0. 50 ；就成对比对而言，默认参数为 空位罚分10. 0和空位长度0. 10。作为另外一种选择，能使用Clustal V比对氨基酸序列 (在 Higgins 和 Sharp (1989) CAB I OS. 5 151-153 中有所描述)，并且可见于 LASERGENE 生 物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.，Madison, WI)的MEGALIGN 程序中。用Clustal V方法进行多重比对的默认参数对应于空位罚分=10，空位长度罚分=10，而对于成对比 对而言它们为 KTUPLE = 1，空位罚分=3，窗口(WINDOW) = 5 以及 DIAGONALS SAVED = 5。 用Clustal V程序比对序列后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“同一性百 分比”。就核苷酸序列比对而言，能使用空位罚分10、空位长度罚分10进行多重比对，以及 使用KTUPLE 2、空位罚分5、窗口 4和Diagonals Saved 4进行成对比对。也可使用任何等 同程序来测定序列同一性百分比。“等同程序”是指任何序列比对程序，就任何正被讨论的 两个序列而言，在与优选程序生成的对应比对进行比较时，生成具有相同核苷酸或氨基酸 残基匹配和相同序列同一性百分比的比对。
(c)如本文所用，在两个核酸或多肽序列的上下文中的“序列同一性”或“同一 性”是指两序列中的残基当在指定比较窗口中比对最大匹配时是相同的。已经认识到当 序列同一性百分比用于多肽时，不同的残基位置常常使保守氨基酸取代出现差异，其中将 氨基酸残基取代为具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基，并因此 不改变该分子的功能特性。当序列出现保守取代差异时，可上调序列同一性百分比进行 纠正以保持取代的保守性质。由此类保守取代导致的序列差异据说具有“序列相似性”或 “相似性”。用于进行此调节的方法是本领域技术人员熟知的。通常这涉及给一个保守取 代评分为部分而不是完全错配，因此提高序列同一性百分比。因此例如其中一种相同氨 基酸得分为1，而非保守取代得分为零，保守取代得分介于零和1之间。例如在程序PC/ GENEdntelligenetics, Mountain View, California)中进行保守取代的得分计算。
(d)如本文所用，“序列同一性百分比，，是指通过在比较窗口中比较两个最佳比对 序列而测定的值，其中比较窗口中的多核苷酸或多肽序列部分与参考序列(参考序列不包 括添加或删除)相比可包括添加或删除(即间隙)以达到两序列的最佳比对效果。所述百 分比的计算方法是，统计相同的核酸碱基或氨基酸残基在两段序列中同时出现的位点的数 量以得到匹配位点数，将此匹配位点数除以比对窗口中的总位点数，再将结果乘以100，从 而得到序列同一性百分比。(e)⑴术语多核苷酸序列“基本上相同”是指多核苷酸包含使用其中一种所述的 比对程序，使用标准参数，与参考序列比对时具有至少70%序列同一性，优选至少80 %，更 优选至少90%，最优选至少95%的序列同一性的序列。本领域的技术人员将认识到能将这 些值适当调节至测定由两个核苷酸序列编码的相应多肽同一性的大小，调节考虑密码子简 并性、氨基酸相似性、阅读框定位等。为此基本上相同的氨基酸序列通常是指至少60%的序 列同一性，更优选地至少70%、80%、90%、最优选地至少95%的序列同一性。核苷酸序列基本上相同的另一个指示是，两个分子在严格条件下是否彼此杂交。 特定序列在限定离子强度和PH的情况下，严格条件通常选择比热解链温度(Tm)低约5°C。 然而，严格条件包括在约1°C至约20°C范围内的低于Tm的温度，取决于所需严格程度或者说合格严格程度。如果它们编码的多肽是基本上相同的，不在严格条件下彼此杂交的核酸 仍是基本上相同的。这可能发生于例如当使用遗传密码子允许的最大密码子简并性制备的 一种核酸拷贝时。两个核酸序列基本上相同的一个指示是当第一种核酸编码的多肽与第二 个核酸编码的多肽免疫杂交反应时。(e) (ii)在肽上下文中的术语“基本上相同”指示所述肽在指定比对窗口上包含具有与参考序列至少70 %的序列同一性，优选80 %、更优选85 %、最优选至少90 %或95 % 的序列同一性的序列。优选地，使用Needleman和Wunsch的同源比对算法进行最佳比对 (1970) J. Mol. Biol. 48 :443_453。两个肽序列基本上相同的一个指示是一种肽与抗第二肽 的抗体发生免疫反应。因此，该肽与第二肽是基本上相同的，例如，其中两个肽仅有保守取 代上的差异。“基本上类似的”肽如上所述序列相同，不同的是由于保守氨基酸变化导致不 具同一性的残基位点产生差异。本文所用术语“核苷酸构建体”并非旨在将本发明限制在包含DNA的核苷酸构建 体。本领域的普通技术人员将认识到，由核糖核苷酸和核糖核苷酸与脱氧核苷酸的组合构 成的核苷酸构建体，尤其是多核苷酸和寡核苷酸，也可被用于本文所公开的方法。因此，本 发明的核苷酸构建体包括所有能被用于本发明转化植物的方法的核苷酸构建体，包括但不 限于那些由脱氧核苷酸、核糖核苷酸、以及它们的组合构成的核苷酸构建体。此类脱氧核苷 酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物。本发明的核苷酸构建体也包括所有形 式的核苷酸构建体，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎环结构等。此外，已经认识到，本发明的方法可使用能够在转化过的植物中引导至少一种多 肽或至少一种RNA (例如与至少一部分mRNA互补的反义RNA)表达的核苷酸构建体。通常 此种核苷酸构建体由多肽或可操作地连接至5'和3'转录调控区的RNA的编码序列构成。 作为另外一种选择，也认识到本发明的方法可使用不能在转化过的植物中引导多肽或RNA 表达的核苷酸构建体。此外，已经认识到，本发明的方法不依赖将整个核苷酸构建体整合到基因组中，仅 仅是，将核苷酸构建体导入细胞的结果是改变了植物或其细胞。在本发明的一个实施方案 中，在将核苷酸构建体导入细胞后，基因组可能发生改变。例如，所述核苷酸构建体或其任 何部分可整合到植物基因组中。本发明的基因组改变包括但不限于添加、删除、和取代基因 组中的核苷酸。当本发明的方法不依赖添加、删除、或取代任何特定数目的核苷酸时，已经 认识到此类添加、删除、或取代包括至少一种核苷酸。本发明的核苷酸构建体也包括可以在改变或突变生物体中基因组核苷酸序列的 方法中使用的核苷酸构建体，包括但不限于同源重组、嵌合向量载体、嵌合突变载体、嵌合 修复载体、混合双工寡核苷酸、自身互补嵌合寡核苷酸、和重组寡核苷碱基。参见美国专 利公开 5，565，350 ；5，731，181 ；5，756，325 ；5，760，012 ；5，795，972 ；和 5，871，984 ；所有这 些专利公开以引用方式并入本文。也参见PCT公开WO 98/49350、PCT公开WO 99/07865、 PCT 公开 WO 99/25821、PCT 公开 W003093428，Jeske 等人(2001)EMB0 20 :6158_6167，和 Beetham 等人(1999)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :8774_8778 ；上述文献以引用方式并入 本文。在表达盒中提供本发明的HGGT、Y-生育酚甲基转移酶和2-甲基_6_植基苯醌 醇甲基转移酶序列，用于在受关注的植物中表达。所述盒将包括至少一种5'和3'调控序列，所述调控序列可操作地连接至本发明的HGGT和/或Y -生育酚甲基转移酶和/或2-甲 基-6-植基苯醌醇甲基转移酶核苷酸序列。“可操作地连接”是指在启动子与另一种序列之 间的功能性连接，其中启动子序列引发和介导与另一种序列相应的DNA序列的转录。通常 可操作地连接是指连接的核酸序列是邻接的，并且是连接两个多肽编码区必需的、邻接并在相同阅读框中。所述盒可附加地包含至少一种将被转化到生物体中的附加基因。作为另 外一种选择，可通过多个表达盒提供附加基因。此类表达盒具有多个限制性位点，用于插入HGGT和/或Y -生育酚甲基转移酶和 /或2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶核苷酸序列，是其处在调控区的转录调节下。所述 表达盒可附加地包含选择性标记基因。在植物中所述表达盒将在5' -3'的转录方向上包括转录和翻译初始区、本发明 的HGGT和/或Y -生育酚甲基转移酶和/或2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶多核苷酸 序列、以及转录和翻译终止功能区。能单独添加或组合添加这些基因。所述转录初始区和 启动子可以是天然的，或与植物宿主同功的或外源的或异源的。此外，所述启动子可以是天 然序列或合成序列。“外源的”是指转录初始区不存在于天然植物中，其中的转录初始区是 导入的。如本文所用，嵌合基因包含一种可操作地连接至一种转录初始区的编码序列，所述 转录初始区是与编码序列异源的。虽然优选使用异源启动子表达序列，可以使用天然的启动子序列。此类构建体 将改变植物、植物细胞或其他宿主中的HGGT和/或Y -生育酚甲基转移酶和/或2-甲 基-6-植基苯醌醇甲基转移酶的表达水平。因此改变植物、植物细胞或其他宿主的表型。终止区可以与转录初始区一起天然存在，可以与所关注的可操作地连接的DNA 序列一起天然存在，或者可以来源于其他来源。使用方便的终止区得自根癌农杆菌的Ti 质粒，例如真蛸碱合酶和胭脂碱合酶终止区。也参见Guerineau等人(1991)Mol. Gen. Genet. 262 141-144 ；Proudfoot(1991)Cell 64 :671_674 ;Sanfacon 等人(1991)Genes Dev. 5 141-149 ；Mogen 等人(1990)Plant Cell 2 :1261_1272 ；Munroe 等人(1990)Gene 91 151-158 ；Ballas 等人(1989)Nucleic AcidsRes. 17 :7891_7903 ；和 Joshi 等人(1987) Nucleic Acid Res. 15 :9627_9639。在适当条件下，可对基因进行优化以提高其在转化过的植物中的表达。即，能够使 用植物优选的密码子合成基因用于改善表达。参见例如Campbell和Gowri ((1990)Plant Physiol. 921-11)对于宿主优选的密码子用途的讨论。本领域有合成植物优选基因的方 法可用。参见例如美国专利公开5，380, 831、和5，436，391，以及Murray等人(1989) Nucleic Acids Res. 17 :477_498，该文献以引用方式并入本文。在细胞宿主中促进基因表达的附加序列的修改形式是已知的。这些序列包括消除 编码伪聚腺苷酸化信号的序列、外显子_内含子接合位点信号的序列、转座子样重复序列、 和其他此类对基因表达不利的特征明显的序列。就一个给定的细胞宿主而言，可以将所述 序列的G-C含量调节至平均水平，所述平均水平通过参考宿主细胞中表达的已知基因进行 计算。当可能的时候，修饰所述序列以避免经推测可能发生的mRNA发夹二级结构。表达盒可在表达盒构建体中附加地包含5'前导序列。此类前导序列能够促进 翻译。翻译前导序列是本领域已知的，包括小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导 序列(脑心肌炎 5'非编码区)(Elroy-Stein 等人(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130)；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀刻病毒)(Gallie等 人(1995)Gene 165(2) :233_238)，MDMV 前导序列(玉米矮小花叶病毒)(Virologyl54 9-20)，和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP) (Macejak等人(1991)Nature 353:90-94)； 非翻译前导序列，来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)(Jobling等人(1987) Nature 325 622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV) (Gallie 等人(I989)，Molecular Biology of RNA，编辑，Cech (Liss，New York)，第237-256页)；和玉米枯黄斑点病毒前导序 列(MCMV) (Lommel 等人(1991) Virology 81 :382_385)。也参见 Della-Cioppa 等人(1987) PlantPhysiol. 84 :965_968。也能利用促进翻译的其他已知方法，例如内含子等。在制备表达盒的过程中，可操作多个DNA片段以在正确方向上，以及，如果适当的 话，在正确阅读 框中提供DNA序列。为了这一目的，可使用衔接子或连接子以接合DNA片 段，或者使用其他操作方法提供方便的限制性位点以移除冗余DNA、移除限制性位点等。为 了这一目的，可使用体外诱变、引物修复、限制性酶切、退火、再取代，例如转换和颠换。可在本发明的实践中使用多个启动子。能基于所需结果选择启动子。核酸能与组 成型的、化学调节的、组织优选的、或其他启动子组合使用用于植物中的表达。此类组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子和在PCT公开WO 99/43838和美国专利6，072，050中公开的其他组成型启动子；CaMV35S核心启动子(Odell 等人，(1985)Nature 313:810-812)；稻肌动蛋白启动子(McElroy 等人(1990)Plant Cell 2 163-171)；泛素启动子(Christensen 等人(1989)Plant Mol. Biol. 12 :619_632 禾口 Christens en 等人(1992)Plant Mol. Biol. 18 :675_689) ；pEMU(Last 等人(1991) Theor. Appl. Genet. 81 :581-588) ；MAS(Velten等人(1984)EMBO J. 3 2723-2730) ；ALS启动子(美 国专利5，659，026)等。其他组成型启动子包括例如美国专利公开5，608，149 ；5, 608，144 ； 5，604，121 ；5，569，597 ；5，466，785 ；5，399，680 ；5，268，463 ；5，608，142 ；和 6，177，611。化学调节的启动子可用于通过施用外来化学调节剂来调节基因在植物中的表达。 根据这一目标，启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学物质来诱导基因表达，或化 学抑制型启动子，其中施用化学物质来抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知 的，并且包括但不限于玉米In2-2启动子，其是通过苯磺酰胺除草剂安全剂来激活的，玉米 GST启动子，其是通过用作芽前除草剂的疏水亲电性化合物而激活的，以及烟草PR-Ia启动 子，其是通过水杨酸激活的。所关注的其他化学调节的启动子包括留类化合物反应性启动 子(参见例如糖皮质激素诱导型启动子，Schena等人(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 10421-10425和McNellis等人(1998)Plant J. 14(2) :247_257)，以及四环素诱导型和四环 素抑制型启动子(参见例如Gatz等人(1991)Mol. Gen. Genet. 227 :229_237，和U. S.专利 5，814，618和5，789，156)，其引入本文以供参考。可利用组织优选的启动子用于靶向提高HGGT和/或Y-生育酚甲基转移酶 和/或2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶在特定植物组织中的表达。组织优选的启 动子包括 Yamamoto 等人(1997)Plant J. 12(2) :255_265 ；Kawamata 等人(1997)Plant Cell Physiol. 38(7) 792-803 ；Hansen 等人(1997)Mol. Gen Genet. 254(3) :337_343 ； Russell 等人(1997)Transgenic Res. 6(2) 157-168 ；Rinehart 等人(1996)Plant Physiol. 112(3) 1331-1341 ;Van Camp 等人(1996)PlantPhysiol. 112(2) :525_535 ； Canevascini 等人(1996)Plant Physiol. 112(2) :513_524 ；Yamamoto 等人(1994)PlantCell Physiol. 35(5) 773-778 ；Lam(1994)Results Probl. Cell Differ. 20 181-196 ； Orozco 等人(1993)Plant Mol Biol. 23(6) 1129-1138 ；Matsuoka 等人(1993)Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20) :9586_9590 ；和 Guevara-Garcia 等人(1993) Plant J. 4(3) 495-505。如果需要的话，可修饰这样的启动子以进行弱表达。 叶优选的启动子是本领域已知的。参见例如Yamamoto等人(1997) Plant J. 12(2) 255-265 ；Kwon 等人(1994)Plant Physiol. 105 :357_67 ；Yamamoto 等人(1994) Plant Cell Physiol. 35(5) :773_778 ；Gotor 等人(1993)Plant J. 3 :509_18 ；Orozco 等人 (1993) Plant Mol. Biol. 23(6) :1129_1138 ；和 Matsuoka 等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20) :9586-9590o根优选的启动子是已知的，并且可以选自文献中记载的很多启动子或者从不 同相容物种中重新分离的启动子。参见例如Hire等人(1992) Plant Mol. Biol. 20 (2) 207-218 (大豆根优选的谷氨酰胺合酶基因)；Keller和Baumgartner (1991) Plant Cell3(10) :1051-1061(根优选的控制元件，在法国菜豆的GRP 1.8基因中)；Sanger等人 (1990) Plant Mol. Biol. 14(3) :433_443 (根癌农杆菌的根优选的甘露氨酸合酶(MAS)启 动子基因)；和Miao等人(1991)Plant Cell 3(1) :11_22 (编码胞质谷氨酰胺合酶(GS) 的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。也参见Bogusz等人(1990)Plant Cell 2(7) :633-641，其中描述了两个根优选的启动子，它们分离自来自固氮非豆科榆科山黄 麻(Parasponia andersonii)的血红蛋白基因，以及相关的非固氮非豆科山麻黄(Trema tomentosa) 0将这些基因的启动子与β _葡糖醛酸酶报道基因连接，并且导入非豆科 (nonlegume)烟草(Nicotiana tabacum)禾口百脉根(Lotus corniculatus)内，在这两种情 况下，均保持了根优选的启动子活性。Leach和Aoyagi (1991)描述了他们对于发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes)的高度表达的rolC和rolD根诱导基因的启动子的分析(参 见Plant Science (Limerick) 79(1) :69_76)。他们推断，增强子和组织特异性DNA决定子在 这些启动子中解离。Teeri等人(1989)使用与IacZ的基因融合以表明编码章鱼碱合酶的 农杆菌属(Agrobacterium)菌T-DNA基因在根尖的表皮中具有特别活性，以及TR2'基因在 完整植物中是根优选的，并且通过叶组织中的伤害来刺激，这是用来与杀虫或杀幼虫基因 一起使用的特别期望的特征组合(参见EMBO J.8(2) :343-350)。与nptll (新霉素磷酸转 移酶II)融合的TRl'基因表现出类似特征。另外的根优选的启动子包括VfEN0D-GRP3基 因启动子(Kuster 等人(1995)Plant Mol. Biol. 29(4) :759_772)；和 rolB 启动子(Capana 等人(1994)Plant Mol. Biol. 25(4) :681_691。还参见 U. S.专利 5，837，876 ;5，750，386 ； 5，633，363 ；5，459，252 ；5，401，836 ；5，110，732 ；和 5，023，179。“种子优选的”启动子包括“种子特异性的”启动子(那些在种子发芽期间有活性 的启动子，如种子贮藏蛋白启动子)以及“种子发芽”启动子(那些在种子发芽期间有活性 的启动子)。参见Thompson等人(1989)BioEssays 10 108，以引用方式并入本文。此类种 子优选的启动子包括但不限于Ciml (细胞分裂素诱导的信使)；CZ19B1 (玉米19kDa蛋白)； milps (肌醇-1-磷酸合酶)(参见WO 00/11177和美国专利公开6，225，529 ；以引用方式并 入本文)。Y-玉米蛋白是胚乳特异性启动子。球蛋白I(Glb-I)是代表性的胚芽特异性启 动子。就双子叶植物而言，种子特异性的启动子包括但不限于菜豆菜豆蛋白、napin、 β-伴球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等。就单子叶植物而言，种子特异性的启动子包括但不限于玉米15kDa玉米蛋白、22kDa玉米蛋白、27kDa玉米蛋白、γ-玉米 蛋白、蜡质基因(waxy)、shrunken Ushrunken 2、球蛋白1等。也参见以下存在的启动子 Endl 和 End2 (W000/12733) ,Lecl (WO 2002/42424)、Jipl (WO 2002/42424) ,EAPl (美国专利 公开公布2004/0210043)、0DP2 (美国专利公开公布2005/0223432)；所有这些文献以引用 方式并入本文。在一个实施方案中，将受关注的核酸靶向转移到叶绿体中进行表达。在这种方法中，其中受关注的核酸不被直接插入叶绿体中，表达盒将附加地包含一种编码转运肽的核 酸，以将受关注的基因产物引导至叶绿体或其他质体中。此类转运肽是本领域已知的。参见 例如 Von Heijne 等人(1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9 104-126 ；Clark 等人(1989) J. Biol. Chem. 264 17544-17550 ；Della-Cioppa 等人(1987)PlantPhysiol. 84:965_968 ；Romer 等 人(1993)Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 1414-1421 ；以及 Shah 等人(1986) Science 233 :478-481。可将本发明的HGGT和/或Y-生育酚甲基转移酶和/或2-甲基_6_植基苯醌 醇甲基转移酶多肽靶向转移到植物细胞中的特定隔室中。用于将多肽靶向转移到特定隔 室的方法是本领域已知的。通常此类方法涉及改变编码多肽的核苷酸序列，通过此类方法 从其编码的多肽中添加或移除特定氨基酸。此类氨基酸包含靶向信号，用于将所述多肽靶 向转移到特定隔室如质粒、核、内质网、液泡、线粒体、过氧化物酶体、高尔基体、以及从细胞 中分泌出来。用于将多肽靶向转移到特定细胞隔室、或分泌出去的靶向序列是本领域技术 人员已知的。叶绿体靶向序列或质粒靶向序列是本领域已知的，并且包括叶绿体小亚基 核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco) (deCastro Silva Filho 等人(1996) Plant Mol. Biol.，30 :769-780 ;Schnell 等人(1991) J. Biol. Chem. ,266(5) :3335_3342) ；5_(烯醇丙 酮酸)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS) (Archer 等人(1990) J. Bioenerg. Biomemb. , 22 (6) 789-810)；色氨酸合酶(Zhao 等人，(1995) J. Biol. Chem. ,270(11) 6081-6087)；质体蓝 素(Lawrence 等人(1997) J. Biol. Chem. ,272(33) :20357_20363)；分支酸合酶(Schmidt 等人(1993) J. Biol. Chem. ,268(36) :27447_27457)；和捕光叶绿素 a/b 结合蛋白(LHBP) (Lamppa 等人(1988) J. Biol. Chem.，263 14996-14999)。也参见 Von Hei jne 等人(1991) Plant Mol. Biol. R印·，9 :104-126 ;Clark 等人(1989) J. Biol. Chem.，264 17544-17550 ； Della-Cioppa 等人(1987)Plant Physiol.，84 :965_968 ;Romer 等人(1993)Biochem. Biophys. Res. Commun.，196 1414-1421 ；以及 Shah 等人(1986) Science, 233 :478_481。表达盒通常将包含选择性标记基因用于选择转化过的细胞。利用选择性标记基 因以选择转化过的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如那些编码新 霉素磷酸转移酶II (NEO)和潮霉素B磷酸转移酶的基因，以及赋予除草化合物抗性的基 因，除草化合物如草胺磷铵、溴苯腈、咪唑啉酮类、和2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D)。通常参 B Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech.，3 506-511 ；Christopherson 等人(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :6314_6318 ;Yao 等人(1992)Cell 71 63-72 ；Reznikoff(1992) Mol. Microbiol.，6 :2419_2422 ；Barkley 等人(1980)，The Operon,第 177-220 页；Hu 等 人(1987)Cell 48 555~566 ；Brown 等人(1987)Cell,49 :603_612 ；Figge 等人(1988) Cell 52 :713-722 ;Deuschle 等人(1989)Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86:5400-5404; Fuerst 等人(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2549_2553 ;Deuschle 等人(1990)Science, 248 480-483 ；Gossen (1993)博士论文，University of Heidelberg ；Reines ^ 人(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :1917_1921 ；Labow 等人(1990)Mol. Cell. Biol.， 10 3343-3356 ；Zambretti 等人(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :3952_3956 ；Baim 等 人(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :5072_5076 ;Wyborski 等人(1991) NucleicAcids Res. ，19 4647-4653 ；Hillenand-ffissman(1989) Topics Mol.Struc. Biol. ，10 143-162 ； Degenkolb 等 人(1991)Antimicrob. Agents Chemother. ,35 1591-1595 ；Kleinschnidt 等人(1988)Biochemistry 27 :1094_1104 ;Bonin(1993)博 士 论文，University ofHeidelberg ；Gossen 等人(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 5547-5551 ；Oliva 等 人(1992) Antimicrob. AgentsChemother. 36 913-919 ；Hlavka φ 人(1985) Handbook of ExperimentalPharmacology,第 78 卷(Springer-Verlag, Berlin) ；Gill 等人(1988) Nature 334:721-724。此类公开以引用方式并入本文。 可在转基因事件回收中用作选择性标记或计分标记、但在最终产品中可能不需 要的其他基因将包括但不限于⑶S( β-葡萄糖醛酸苷酶)，Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5 387)；荧光蛋白，如GFP (绿色荧光蛋白)、YFP (黄色荧光蛋白)、RFP (红色荧光 蛋白)和 CYP (青色荧光蛋白)，WO 00/3432U WO 00/34526, WO 00/34323、W000/34322、WO 00/34318、WO 00/34319、WO 00/34320、WO 00/34325、W000/34326、WO 00/34324，Chalfie 等人(1994) Science, 263 802 ；荧光素酶，Teeri 等人(1989) EMBO J. 8 343 ；和编码花青素 的玉米基因，Ludwig 等人(1990) Science，247 :449。上文列出的选择性标记基因并不旨在进行限制。本发明可使用任何选择性标记基 因。本发明涉及用本发明的核苷酸构建体转化宿主细胞。通常，核苷酸构建体将包含 本发明的HGGT核苷酸和/或Y -生育酚甲基转移酶和/或2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转 移酶全长序列或其功能性片段，该序列可操作地连接至在受关注的宿主细胞中启动表达的 启动子。宿主细胞包括但不限于植物细胞；动物细胞；真菌细胞，尤其是酵母细胞；和细菌 细胞。本发明的方法涉及将核苷酸构建体导入植物。“导入”是指将核苷酸构建体以下述 方法给予植物使构建体进入植物细胞内部。本发明的方法不依赖将核苷酸构建体导入植 物的具体方法，只要使核苷酸构建体进入植物的至少一个细胞的内部即可。用于将核苷酸 构建体导入植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法、和病 毒介导的方法。所谓“稳定转化”是指将核苷酸构建体导入植物并整合到植物基因组中，并且能够 由其后代继承。所谓“瞬时转化”是指将核苷酸构建体导入植物，但并不整合进植物基因组 中。转化方案以及用于将核苷酸序列导入植物内的方案可以根据被定向转化的植物 或植物细胞的类型，例如单子叶植物或双子叶植物而改变。将核苷酸序列导入植物细胞以 及随后插入植物基因组的合适方法包括显微注射(Crossway等人(1986)Biotechniques 4 :320-334)、电穿孑L (Riggs 等人(1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :5602_5606、农 杆菌介导的转化(Townsend等人，美国专利公开5，563，055 ；Zhao等人，美国专利公开 5，981，840)、直接基因转移(Paszkowski 等人(1984)EMB0J. 3 :2717_2722)、和弹道离子加速(参见例如Sanford等人，美国专利公开4，945，050 ；Tomes等人，美国专利公开 5，879，918 ；Tomes等人，美国专利公开5，886，244 ；Bidney等人，美国专利公开5，932，782 ； Tomes等人(1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells viaMicroprojectile Bombardment,，，Plant Cell, Tissue, and OrganCulture-Fundamental Methods,编辑， Gamborg 禾口 Phillips (Springer-Verlag, Berlin) ；McCabe 等人(1988)Biotechnology6 923-926)；以及 Lecl 转化(PCT 公开 00/028058)。还参见 Weissinger 等人(1988)Ann. Re v. Genet. 22 :421_477 ;Sanford 等人(1987) Particulate Science and Technology 5: 27-37(洋葱)；Christou 等人(1988)Plant Physiol. 87 :671_674(大豆)；McCabe 等人 (1988) Bio/Technology 6 :923_926 (大豆)；Finer 和McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P : 175-182 (大豆)；Singh 等人(1998) Theor. App 1. Genet. 96 :319_324 (大豆)； Datta 等人(1990)Biotechnology 8:736_740(稻)；Klein 等人(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 4305-4309 (玉米)；Klein 等人(1988) Biotechnolohy6 559-563 (玉米)； Tomes，美国专利公开5，240，855 ；Buising等人，美国专利公开5，322，783和5，324，646 ； Tomes 等人(1995) "DirectDNA Transfer into Intact Plant Cells via Microproje ctileBombardment,，，Plant Cell, Tissue, and Organ Culture :FundamentalMethods,编 辑，Gamborg(Springer-Verlag, Berlin)(玉米)；Klein 等人(1988)Plant Physiol. 91 440-444 (玉米)；Fromm 等人(1990) Biotechnology 8 :833_839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren 等人(1984) Nature (London) 311 :763_764 ；Bowen 等人，美国专利公开 5，736，369 (谷类)；Bytebier 等人(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :5345_5349 (百 合禾斗)；De Wet 等人(1985), The ExperimentalManipulation of Ovule Tissues,编辑， Chapman 等人(Longman，NewYork)，第 197-209 页(花粉)；Kaeppler 等人(1990)Plant CellReports 9 :415_418 和 Ka印pier 等人(1992)Theor. Appl. Genet. 84 :560_566(颈须 介导的转化)；D，Halluin 等人(1992) Plant Cell4 1495-1505 (电穿孔)；Li 等人(1993) Plant Cell Reports 12:250—255 禾口 Christou 禾口 Ford(1995)Annals of Botany 75: 407-413(稻)；Osjoda 等人(1996) Nature Biotechnology 14 :745_750 (经由根癌土壤杆 菌的玉米)；所有这些文献以引用方式并入本文。 也可通过用病毒或病毒核酸接触植物将本发明的核苷酸构建体导入植物。通常， 这样的方法包括将本发明的核苷酸构建体整合进病毒DNA或RNA分子内。已经认识到本发 明的HGGT和/或Y -生育酚甲基转移酶和/或2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶最初作 为病毒多聚蛋白的一部分被合成，它们随后可通过体内或体外蛋白质水解进行加工以产生 所需的重组多肽。此外，已经认识到本发明的启动子也包括用于病毒RNA聚合酶转录的启 动子。用于将核苷酸构建体导入植物并表达其编码多肽的方法，涉及病毒DNA或RNA分子， 是本领域已知的。参见例如美国专利公开5，889，191,5, 889，190,5, 866，785,5, 589，367和 5，316，931 ；这些专利引入本文以供参考。用于叶绿体转化的方法是本领域已知的。参见例如Svab等人(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :8526_8530 ；Svab 和 Maliga(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 913-917 ；Svab和Maliga(1993)EMBO J. 12 :601_606。该方法通过粒子枪递送包含选择性标 记的DNA并通过同源重组将DNA靶向整合进质粒基因组中。此外，可通过核编码的和质粒定 向的RNA聚合酶的组织优选表达来转录活化静默的质粒转基因，从而完成质粒转化。此类体系已经在 McBride 等人(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 7301-7305 中进行了报道 。可将靶向叶绿体的受关注核酸进行优化以在叶绿体中表达，用于说明在植物核与 该细胞器之间的密码子差异。通过这种方法，可使用叶绿体优选的密码子合成受关注的核 酸。参见例如美国专利公开5，380，831，该专利公开以引用方式并入本文。已经被转化的细胞可根据常规方法在植物中生长。参见例如McCormick等人 (1986)Plant Cell Reports 5:81-84。然后可培养这些植物，并用相同的或不同的转化过 的植株进行授粉，所得杂交体具有鉴定的所需表型特征的组成型表达。可以生长两代或多 代以保证所希望的表型特征的表达稳定地保持和遗传，然后收获种子以保证所希望的表型 特征的表达已经实现。如本文所用，“转化过的植物”包括那些本文提供的直接转化过的植物，以及在它 们的谱系中具有直接转化过的植物并保留基因型变化(如包括由最初转化制备的表达盒) 的植物。术语“转化过的植物”和“转基因植物”本文可互换使用。本发明可用于转化任何植物物种，包括但不限于玉米(Zea mays)、芸苔属植 物(例如B. napus, B. rapa, B. jimcea)，尤其是那些用作种子油源的芸苔属物种、苜蓿 (Medicago sativa)、禾苗(Oryza sativa)、裸麦(Secale cereale)、高梁(Sorghum bicolor、 Sorghum vulgar)、小米(例如珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黄米(Panicummiliaceum)、
(Setaria italica) > ^fc/flfM (Eleusinecoracana)) > (n| H ^ (Helianthus annuus) > tE 花(Carthamustinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草属植 物(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花 (Gossypium barbadense、Gossypiumhirsutum)、甘暮(Ipomoea batatus)、木暮(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea 属物种)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananascomosus)、柑 til (Citrus M^ft ) > nT nT (Theobroma cacao) > ^ (Camellia sinensis)(Musa M
物禾中)、鱼萼梨(Perseaamericana)、无花果(Ficus casica)、番石槽(Psidium guajava)、 S ^ (Mangifera indica) > (Olea europaea) > # jl ^ (Carica papaya) > ^ (Anacardium occidentale)、澳大禾丨J 亚坚果(Macadamia integrifolia)、杏(Prunus amygdalus)、甜菜(Betavulgaris)、甘蔗(Saccharum属物种)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物、 和针叶树。蔬菜包括番爺(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如 Lactucasativa)、青 J3. (Phaseolus vulgaris)、禾马豆(Phaseoluslimensis)、豆U豆(La thyrus 属物禾中)、以 及黄瓜属成员如黄瓜(C. sativus)、香瓜(C. cantalupensis)、和香瓜(melo)。观赏植物 ^ ttll^E (Rhododendron M 禾中)、Will# (Macrophyllahydrangea) > (Hibiscus rosasanensis)、蔷薇(Rosa属物种)、郁金香(Tulipa属物种)、水仙花(Narcissus属物 禾中)、矮牵牛花(Petunia hybrida)、康乃聲(Dianthus caryophyllus)、一口口口红(Euphorbia pu 1 cherr ima)、和菊花。实施本发明时可使用的针叶树包括例如松树如火炬松(P i nu s taeda)、沼泽松(Pinus elliotii)、北美黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)、 禾口 福射丰公(Pinus radiata)；花旗丰公(Pseudotsuga menziesii)；异叶铁杉(Tsuga canadensis)；北美云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoiasempervirens)；真冷杉如银揪 (Abies amabilis)和香脂冷杉(Abiesbalsamea)；和雪松如西岸红雪松(Thuja plicata) 和阿拉斯加黄桧(Chamaecyparis nootkatensis)。优选地，本发明的植物是农作物植物(例如，玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、大麦、稻、高粱、裸 麦、小米、烟草等。)，更优选谷类植物，更优选玉米、小麦、大麦、稻、高粱、裸麦和小米植物。在一些实施方案中，通过用表达盒转化植物细胞来降低或消除本发明的基因活 性，该表达盒表达抑制靶基因表达的多核苷酸。所述多核苷酸可通过阻止靶基因信使RNA 的翻译来直接抑制一种或多种靶基因的表达，或通过编码抑制编码靶基因的基因的转录或 翻译的多肽来非直接地抑制一种或多种靶基因的表达。用于抑制或消除植物中基因表达的 方法是本领域所熟知的，并且任何此类方法可用于本发明以抑制一种或多种植物基因的表 达，如HGGT和/或Y _生育酚甲基转移酶和/或2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶。根据本发明，如果在尚未进行遗传修饰或诱变以抑制靶基因表达的植物中靶基因 的蛋白含量在统计上低于相同靶基因的蛋白含量，则说明靶基因蛋白的表达受到抑制。在 本发明的特定实施方案中，在如本发明所述进行修饰的植物中的靶基因的蛋白含量小于 95%，小于90%，小于85%，小于80%，小于75%，小于70%，小于65%，小于60%，小于 50%，小于40%，小于30%，小于20%，小于10%，或小于5%的非突变型植物或尚未进行遗 传修饰以抑制靶基因表达的植物中的相同靶基因的蛋白含量。靶基因的表达水平可直接进 行测量，例如通过检测分析玉米细胞或植物中的靶基因表达的水平，或可进行间接测量，例 如通过测量玉米细胞或植物中的靶基因酶的活性。根据本发明，当靶基因蛋白的活性不能 通过至少一种本文其他部分描述的检测分析方法检测出来时，则认为靶基因蛋白的活性被 “消除”。可使用多种方法降低或消除靶基因的活性。可使用一种以上的方法降低单个靶基 因的活性。此外，可使用多个方法的组合来降低或消除两个或更多个不同靶基因的活性。下 文给出了降低或消除植物靶基因表达的方法的非限制性实例。用于基因沉默的多种技术是本领域技术人员熟知的，包括但不限于基因敲 除，例如通过插入转位因子如Mu(Vicki Chandler, The MaizeHandbook,第118章 (Springer-Verlag 1994))、其他基因元件如FRT、Lox或其他位点特异性整合位点，通过同 源重组来改变靴基因(Bolon，B. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 95 :4，12，154-61 (2004)； Matsuda 和 Alba, A.，Methods Mol. Bio. 259 :379_90 (2004) ；Forlino 等人，J. Biol. Chem. 274 :53，37923-30 (1999)、反义技术(参见例如，Sheehy 等人(1988)PNAS USA 85: 8805-8809 ；和美国专利公开5，107,065 ；5, 453, 566 ；以及5，759，829 ；美国专利公开公 布20020048814)；有义抑制(例如美国专利公开5，942，657 ；Flavell等人(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :3490_3496 Jorgensen 等人(1996) Plant Mol. Biol. 31 :957_973 ； Johansen 禾口 Carrington (2001) Plant Physiol. 126 :930_938 ；Broin 等人(2002) Plant Celll4 1417-1432 ；Stoutjesdijk 等人(2002)Plant Physiol. 129 :1723_1731 ；Yu 等 人(2003)Phytochemis try 63 :753_763 ；以及美国专利公开 5，034，323、5, 283，184、和 5，942，657 ；美国专利公开公布 20020048814) ；RNA 干涉(Napoli 等人(1990)Plant Cell 2 279-289 ；美国专利公开 5，034，323 ；Sharp (1999) Genes Dev. 13 139-141 ；Zamore 等 人(2000)Cell 101 :25-33 ；和 Mont gomery 等人(1998)PNASUSA 95 :15502_15507)、病 毒诱导的基因沉默(Bur ton，等人(2000) Plant Celll2 :691_705 ；和 Baulcombe (1999) Curr. Op. PlantBio. 2 109-113)；靴-RNA-特异性核酶(Haseloff 等人(1988) Nature334 :585-591，美国专利公开 4,987,071)；发夹结构(Smith 等人(2000) Nature407 :319-320 ;Waterhouse 等人(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 13959-13964, Liu 等人(2002)Plant Physiol. 129 :1732-1743, ffaterhouse 和 Helliwell(2003) Nat. Rev. Genet. 4 :29_38 ；Chuang 和 Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA97 4985-4990 ;Stoutjesdijk 等人(2002)Plant Physiol. 129 1723-1731 ；Panstruga ^ 人(2003)Mol. Biol. R印.30:135-140 ;Smith 等人(2000)Nature 407 319-320 ；Smith 等人(2000)Nature 407:319_320 ;Wesley 等人(2001)Plant J. 27 :581_590 ;Wang 禾口 ffaterhouse(2001)Curr. Opin. Plant Biol. 5 146-150 ；ffaterhouse 和Helliwell(2003) Nat. Rev. Genet. 4 29-38 ；Helliwell 禾口 ffaterhouse(2003)Methods 30:289—295; Pandolfini等人，BMCBiotechnology 3 7 ；美国专利公开公布20030180945 ；美国专利公 开公布 20030175965 ;W0 99/49029 ；W0 99/53050 ；W0 99/61631 ；和 W000/49035)；转录基 因沉默(TGS) (Aufsatz 等人(2002)Proc. Nat，1. Acad. Sci. 99(Suppl. 4) 16499-16506 ； Mette 等人(2000)EMB0 J. 19(19) :5194_5201 ；小 RNA(Aukerman&Sakai(2003)Plant Celll5 2730-2741)；核酶(Steinecke 等人(1992)EMB0 J. 11 1525 ；和 Perriman 等人 (1993)Antisense Res. Dev. 3 253)；寡核苷酸介导的靴向改性(例如，W0 03/076574 和 W0 99/25853)；锌指靶向分子(例如，W0 01/52620 ；W0 03/048345 ；和 W0 00/42219)； 使用扩增子的方法(Angell 和 Baulcombe(1997)EMB0 J. 16 :3675_3684，Angell 和 Baulcombe (1999)Plant J. 20 :357_362，以及美国专利公开6，646，805)；编码结合到受关 注的蛋白上的抗体的多核苷酸(Conrad 和 Sonnewald(2003)Nature Biotech. 21 35-36)； 转座子标签法(Maes 等人(1999) Trends Plant Sci. 4 90-96 ；Dharmapuri 和 Sonti (1999) FEMS Microbiol. Lett. 179 :53_59 ；Meissner 等人(2000) Plant J. 22 :265_274 ；Phogat 等 人(2000) J. Biosci. 25 :57_63 ；ffalbot (2000) Curr. Opin. Plant Biol. 2 103-107 ；Gai 等人 (2000)NucleicAcids Res. 28 :94_96 ；Fitzmaurice 等人(1999) Genetics 153 :1919-1928 ； 用于在经选择的基因中选择Mu插入序列的TUSC方法(Bensen等人(1995)Plant Cell 7 75-84 ;Mena 等人(1996) Science 274 :1537_1540 ；和美国专利公开 5，962，764)；其他形式 的诱变，如乙基甲磺酸诱导的诱变、删除诱变、以及在反向遗传有义(与PCR—起)中使用 的快中子删除诱变，用以鉴定其中已经删除了内源基因的植物品系(Ohshima等人(1998) Virology 243 :472_481 ；Okubara 等人(1994)Geneticsl37 :867_874 ；和 Quesada 等人 (2000) Genetics 154 :421_436 ；TILLING(靶向诱导基因组局部突变技术)(McCallum等人 (2000)Nat. Biotechnol. 18 =455-457)和其他方法或上述本领域技术人员已知的方法的组 合。每个参考均以引用方式并入本文。设计表达盒以降低靶基因的活性，该表达盒可表达RNA分子，它对应于全部或部 分以有义或反义取向、或以有义或反义取向的组合来编码靶基因的信使RNA。RNA分子的超 表达能够导致天然基因的表达减少。因此，筛选用有义抑制表达盒转化的多个植物品系以 鉴定那些对靶基因表达显示最大程度抑制的品系。用于靶基因抑制的多核苷酸可对应于所有或部分编码靶基因的序列、靶基因转录 物的所有或部分5'和/或3'非翻译区域、或编码靶基因的转录物的所有或部分编码区 和非翻译区域、或负责表达靶基因的所有或部分启动子序列。用于有义抑制或其他基因沉 默方法的多核苷酸可与靶序列具有99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、 90%、89%、88%、87%、85%、80%、或更低的序列同一性。当使用多核苷酸部分中断靶基因表达时，通常可使用至少 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、 45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、450、500、550、600、650、700、750、800、或 900 个核 苷酸或lkb或更长的序列。本发明包括在一个实施方案中，转化过的植物在其基因组中包含(a)第一重组核酸分子，所 述第一重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一种核苷酸序列的调控序列，所述 至少一种核苷酸序列选自(i)编码具有生育酚甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列；
(ii)SEQID NO :11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37 或 39 所示的核苷酸序列；
(iii)编码SEQID NO 12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40所示的氨基酸 序列的核苷酸序列；(iv)与(i)-(iii)所示的任何一种核苷酸序列具有至少80%序列同一 性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有生育酚甲基转移酶活性的多肽；和(v) 与(i)-(iv)的任何一种核苷酸序列完全互补的核苷酸序列；(b)第二重组核酸分子，所述 第二重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一种核苷酸序列的调控序列，所述至 少一种核苷酸序列选自(vi)编码具有尿黑酸香叶基香叶基转移酶活性的多肽的核苷酸 序列；(vii)SEQ ID NO :1、3、5、7、或 9 所示的核苷酸序列；(viii)编码 SEQ ID NO :2、4、6、 8、或10所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(ix)与(vi) (viii)所示的任何一种核苷酸序列 具有至少80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有尿黑酸香叶基香叶 基转移酶活性的多肽；和(x)与(vi)-(ix)的任何一种核苷酸序列完全互补的核苷酸序列； 以及(c)第三重组核酸分子，所述第三重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一 种核苷酸序列的调控序列，所述至少一种核苷酸序列选自(xi)编码具有2-甲基-6-植 基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列；(xii)SEQ ID NO :53所示的核苷酸序列； (xiii)编码 SEQ ID NO :54、61、62、63、64、65、66、67、68、69 或 70 所示的氨基酸序列的核苷 酸序列；(xiv)与(xi)-(xii)所示的任何一种核苷酸序列具有至少80%序列同一性的核 苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽； (xv)编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽 的氨基酸序列与SEQ ID N0 :54、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70所示的氨基酸序列具 有至少95%的序列同一性；以及(xvi)与(xi)-(xv)的任何一种核苷酸序列完全互补的核 苷酸序列；其中所述第一重组核酸分子、第二重组核酸分子和第三重组核酸分子被稳定地 整合进所述转化过的植物的基因组中。在另一个实施方案中，转化过的植物在其基因组中包含至少一种重组核酸分子， 所述重组核酸分子选自上文的第一重组核酸分子、第二重组核酸分子和第三重组核酸分 子，其中所述至少一种重组核酸分子被稳定地整合进所述转化过的植物的基因组中。在另一个实施方案中，转化过的植物可以是选自玉米、小麦、稻、高粱、大麦、小米 和裸麦的单子叶植物。在另一个实施方案中，转化过的植物可以是选自大豆、芸苔属、苜蓿、红花、向日 葵、棉花、花生、油菜、拟南芥属、烟草和马铃薯的双子叶植物。在另一个实施方案中，第一重组核酸分子、第二重组核酸分子或第三重组核酸分 子的所述至少一种调控序列包含至少一种启动子，所述至少一种启动子选自种子优选的、 组成型的、化学调控的、组织优选的、和发育调控的启动子。
在另一个实施方案中，本发明包括转化过的植物的种子，其中所述种子在其基因组中包含第一重组核酸分子、第二重组核酸分子和第三重组核酸分子。在另一个实施方案中，本发明的转化过的植物相对于遗传背景相似但缺乏所述第 一重组核酸分子、所述第二重组核酸分子和所述第三重组核酸分子的植物产生a “生育三 烯酚、生育三烯酚、或两者含量提高的种子。在另一个实施方案中，本发明包括提高植物中a-生育三烯酚、生育三烯酚、 或两者含量的方法，所述方法包括在植物基因组中稳定地整合(a)第一重组核酸分子，所 述第一重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一种核苷酸序列的调控序列，所述 至少一种核苷酸序列选自(i)编码具有生育酚甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列；
(ii)SEQID NO :11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37 或 39 所示的核苷酸序列；
(iii)编码SEQID NO 12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40所示的氨基酸 序列的核苷酸序列；(iv)与(i)-(iii)所示的任何一种核苷酸序列具有至少80%序列同一 性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有生育酚甲基转移酶活性的多肽；和(v) 与(i)-(iv)的任何一种核苷酸序列互补的核苷酸序列；(b)第二重组核酸分子，所述第二 重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一种核苷酸序列的调控序列，所述至少一 种核苷酸序列选自(vi)编码具有尿黑酸香叶基香叶基转移酶活性的多肽的核苷酸序列； (vii)SEQ ID NO :1、3、5、7、或 9 所示的核苷酸序列；(viii)编码 SEQ ID NO :2、4、6、8、或 10 所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(ix)与(vi)-(viii)所示的任何一种核苷酸序列具有至 少80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有尿黑酸香叶基香叶基转移 酶活性的多肽；和(x)与(vi)-(ix)的任何一种核苷酸序列互补的核苷酸序列；以及(c)第 三重组核酸分子，所述第三重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一种核苷酸序 列的调控序列，所述至少一种核苷酸序列选自(xi)编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基 转移酶活性的多肽的核苷酸序列；(xii)SEQ ID N0:53所示的核苷酸序列；(xiii)编码SEQ ID NO :54、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(xiv) 与(xi)-(xii)所示的任何一种核苷酸序列具有至少80%序列同一性的核苷酸序列，其中 所述核苷酸序列编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽；(xv)编码具有 2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列 与SEQ ID NO :54、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70所示的氨基酸序列具有至少95%的 序列同一性；以及(xvi)与(xi)-(xv)的任何一种核苷酸序列完全互补的核苷酸序列；以 及选择转化过的植物，所述转化过的植物相对于遗传背景相似但缺乏所述第一重组核酸分 子、所述第二重组核酸分子和所述第三重组核酸分子的植物a“生育三烯酚、3 “生育三烯 酚、或两者含量提高。在另一个实施方案中，使用一种方法，其中通过共转化植物细胞将所述第一、第二 和第三重组核酸分子整合进植物基因组中。在另一个实施方案中，使用一种方法，其中通过再转化转化过的植物细胞将至少 一种所述第一重组核酸分子、第二重组核酸分子或第三重组核酸分子整合进植物基因组 中，其中所述转化过的植物细胞包含至少一种所述第一重组核酸分子、第二重组核酸分子 或第三重组核酸分子。在另一个实施方案中，使用一种方法，其中通过育种将至少一种所述第一重组核酸分子、第二重组核酸分子或第三重组核酸分子整合进植物基因组中。在另一个实施方案中，使用一种方法，其中第一重组核酸分子、第二重组核酸分子 或第三重组核酸分子的所述至少一种调控序列包含至少一种启动子，所述至少一种启动子 选自种子优选的、组成型的、化学调控的、组织优选的、和发育调控的启动子。在另一个实施方案中，本发明包括用于转化植物和植物细胞以改变含油量的方 法，本文包括用一至三个核苷酸序列单独或以两个或三个核苷酸序列的任何组合来转化植 物。所述方法包括；(a)获取在其基因组中包含第一重组核酸分子的第一植物，所述第一重 组核酸分子包含至少一种可操作地连接至编码具有生育酚甲基转移酶活性的多肽的 核苷酸序列的调控序列；和(b)将步骤(a)的转基因植物与在其基因组中包含第二重组核 酸分子的第二植物杂交，所述第二重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至编码具有尿 黑酸香叶基香叶基转移酶活性的多肽的核苷酸序列的调控序列；(c)将步骤(b)的转基因 植物与在其基因组中包含第三重组核酸分子的第三植物杂交，所述第三重组核酸分子包含 至少一种可操作地连接至编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽的核苷 酸序列的调控序列；(d)获取来自所述步骤(c)杂交的子代植物，其中所述子代植物在其基 因组中包含第一重组核酸分子、第二重组核酸分子和第三重组核酸分子，并且其中相对于 遗传背景相似但缺乏所述第一重组核酸分子、所述第二重组核酸分子和所述第三重组核酸 分子的植物，所述子代植物的a-生育三烯酚、生育三烯酚、或两者的含量提高。在另一个实施方案中，使用提高植物中a-生育三烯酚、生育三烯酚、或两者 含量的方法，所述方法包括(a)获取在其基因组中包含第一重组核酸分子的第一转化过 的植物，所述第一重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一种核苷酸序列的调控 序列，所述至少一种核苷酸序列选自(i)编码具有生育酚甲基转移酶活性的多肽的核 苷酸序列;(ii)ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37 或 39 所示的核苷酸序列； (iii)编码SEQ ID NO :12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40所示的氨基酸 序列的核苷酸序列；(iv)与(i)-(iii)所示的任何一种核苷酸序列的完整编码序列具有至 少80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有生育酚甲基转移酶活 性的多肽；和(v)与(i)-(iv)的任何一种核苷酸序列互补的核苷酸序列；(b)将步骤(a)的 转化过的植物与在其基因组中包含第二重组核酸分子的第二转化过的植物杂交，所述第二 重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一种核苷酸序列的调控序列，所述至少一 种核苷酸序列选自(vi)编码具有尿黑酸香叶基香叶基转移酶活性的多肽的核苷酸序列； (vii)SEQ ID NO :1、3、5、7、或 9 所示的核苷酸序列；(viii)编码 SEQ ID NO :2、4、6、8、或 10 所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(ix)与(vi)-(viii)所示的核苷酸序列的完整编码序列 具有至少80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有尿黑酸香叶基香叶 基转移酶活性的多肽；和(x)与(vi)-(ix)的任何一种核苷酸序列互补的核苷酸序列；并 且(c)将步骤(b)的转化过的植物与在其基因组中包含第三重组核酸分子的第三转化过的 植物杂交，所述第三重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一种核苷酸序列的调 控序列，所述至少一种核苷酸序列选自(xi)编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶 活性的多肽的核苷酸序列；(xii)SEQ IDN0 :53所示的核苷酸序列；(xiii)编码SEQ ID NO 54或70所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(xiv)与(xi)-(xii)所示的任何一种核苷酸序 列具有至少80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽；(xv)编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的 多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :54、61、62、63、64、65、66、67、 68、69或70所示的氨基酸序列具有至少95%的序列同一性；以及(xvi)与(xi)-(xv)的任 何一种核苷酸序列完全互补的核苷酸序列；并选择来自所述步骤(c)杂交的子代植物，其 中所述子代植物在其基因组中包含第一重组核酸分子、第二重组核酸分子和第三重组核酸 分子，并且其中相对于遗传背景相似但缺乏所述第一重组核酸分子、所述第二重组核酸分 子和所述第三重组核酸分子的植物，所述子代植物的α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、或 两者的含量提高。
在另一个实施方案中，使用任何一种本发明的方法，其中所述植物是选自玉米、小 麦、稻、高粱、大麦、小米和裸麦的单子叶植物。在另一个实施方案中，使用任何一种本发明的方法，其中所述植物是选自大豆、芸 苔属、苜猜、红花、向日葵、棉花、花生、油菜、拟南芥属、烟草和马铃薯的双子叶植物。在另一个实施方案中，本发明包括转化过的种子或本发明的任何转化过的植物的 副产物。在另一个实施方案中，本发明的转化过的种子具有至少20ppm的α -生育三烯酚含量。在另一个实施方案中，本发明转化过的种子包含的α-生育三烯酚的量占转化过 的种子中的总生育酚和生育三烯酚含量的至少20%。在另一个实施方案中，本发明转化过的种子的α-生育三烯酚含量占转化过的种 子中的总生育酚和生育三烯酚含量的至少70%。在另一个实施方案中，本发明转化过的种子包含的α -生育三烯酚和α _生育酚 的合并含量占转化过的种子中的总生育酚和生育三烯酚含量的至少95%。在另一个实施方案中，使用一种改善动物的组织质量的方法，所述方法包括用本 发明的转化过的种子来饲养动物。在另一个实施方案中，所述组织是肉，并且通过选自以下标准的至少一个标准来 测量肉的质量提高的ΡΗ、改善的食物颜色、改善的氧化稳定性、增加的储存寿命以及减少 的汁液渗出。在另一个实施方案中，所述动物是反刍动物，优选牛。在另一个实施方案中，所述动物是非反刍动物，优选猪或家禽。在另一个实施方案中，分离的多核苷酸包含SEQ ID NO :57。在另一个实施方案中，分离的多核苷酸包含(a)编码具有2-甲基-6-植基苯醌 醇甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列基于Clustal W比对 方法在与SEQ ID NO :54或70进行比较时具有至少95%的序列同一性，或(b)所述核苷酸 序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100%互 补。所述多肽的氨基酸序列优选地包含SEQ ID N0:54或70。所述核苷酸序列优选地包含 SEQ ID NO :53。在另一个实施方案中，本发明包括包含本发明的任何分离多核苷酸的载体。在另一个实施方案中，本发明包括重组DNA构建体，所述DNA构建体包含与至少一 种调节序列可操纵地连接的任何本发明的分离多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明涉及转化细胞的方法，所述方法包括用本发明的任 何分离多核苷酸来转化细胞。也包括通过这种方法转化的细胞。在特定实施方案中，所述 细胞是真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞，或原核，例如细菌。 在另一个实施方案中，本发明包括生产转基因植物的方法，所述方法包括用本发 明的任何分离多核苷酸或重组DNA构建体来转化植物细胞并从转化过的植物细胞中再生 转基因植物。本发明还涉及由该方法制备的转基因植物，以及从该转基因植物中获取的转 基因种子。在另一个实施方案中，分离多肽具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性，其 中所述多肽的氨基酸序列基于Clustal W比对方法在与SEQ IDNO :54或70进行比较时具 有至少95%的序列同一性。所述多肽的氨基酸序列优选地包含SEQ ID N0:54或70。在另一个实施方案中，用于分离具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多 肽的方法，所述方法包括从细胞或细胞培养基中分离所述多肽，其中所述细胞包含重组DNA 构建体，所述构建体包含可操作地连接至至少一种调控序列的本发明的多核苷酸。在另一个实施方案中，改变宿主细胞中2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶表达水 平的方法，所述方法包括(a)用本发明重组DNA构建体来转化宿主细胞；以及(b)在适于 表达所述重组DNA构建体的条件下培养转化过的细胞，其中重组DNA构建体的表达导致转 化过的宿主细胞中的2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶含量改变。以下实施例以例证的方式给出，不以限制的方式给出。
实施例本发明将在下面的实施例中进一步予以定义，其中份数和百分比是以重量计并且 度数是摄氏度，除非另外说明。应当理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案， 但仅是以例证的方式给出的，不以限制的方式给出。根据上面的论述和这些实施例，本领域 的技术人员可以确定本发明的基本特征，并在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对 本发明做出多种改变和修饰，以使其适用于多种用法和条件。因此，除了本文所示和描述的 那些之外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见 的。这些修改形式也旨在属于所附权利要求书的范围内。实施例1通过大麦HGGT和大豆Y _生育酚甲基转移酶的转基因表达在拟南芥中生产 α _和β _生育三烯酚在拟南芥中表达大麦尿黑酸香叶基香叶基转移酶(HGGT) (bdl2c. pk006. o2 ；SEQ ID NO 2)和大豆Y-生育酚甲基转移酶(sahlc. pk004. g2 ； SEQ ID NO 12)的cDNA以证明 这些cDNA用于转基因植物中的α和β-生育三烯酚生产的可行性。使用标准分子工具构建转化载体，该转化载体在大豆β -伴球蛋白启动子控制下 表达大麦HGGT基因(Beachy等人，EMBO J. 4 :3047_3053 (1985))，并在Kti启动子控制下 表达大豆Y-生育酚甲基转移酶基因(Kunitz胰蛋白酶抑制剂，Jofuku等人，(1989)Plant Cell 1:1079-1093)。使用限制性酶NotI从SCl (参见实施例3)中切除包含大豆生育酚甲基转移 酶基因的1. Ikb DNA片段，并将其在Kti启动子后的有义方向上连接到用限制性酶NotI线性化的 KS126 DNA 上(PCT 公开 W004/071467)，得到 KS308 (SEQ ID NO 41)。使用限制性酶AscI从SC38(参见实施例3)中切除包含β _伴球蛋白启动子、HGGT基因、和菜豆蛋白终止子的3. Ikb DNA片段，片段末端用DNA聚合酶I大片段钝化，并将其 连接到KS178DNA上(构造在下文描述)，得到KS270(SEQ ID NO :42)。KS178以前已经用 限制性酶PacI进行了线性化，随后用DNA聚合酶I大片段加上3’突出端。如下构建KS178。使用限制性酶PstI和SmaI从pZSL13LeuB (PCT公开WO 04/071467)中切除包含SAMS/ALS/ALS3，盒的4. Okb DNA片段，片段末端用DNA聚合 酶I大片段钝化，并将其连接到用限制性酶BamHI线性化的KS102 DNA上(PCT公开WO 04/071467)，得到KS178。在连接之前，线性化的KS102载体末端用DNA聚合酶I大片段进 行钝化。使用限制性酶AscI从KS308中切除包含Y _生育酚甲基转移酶表达盒的3. 4kb DNA片段，片段末端用DNA聚合酶I大片段钝化，并将其连接到用限制性酶Sma I线性化的 pBLUESCRIPT II KS-(Stratagene)DNA上。用限制性酶SnaBI线性化所得载体，并将其 连接到包含HGGT表达盒(使用限制性酶PacI和BamHI从KS270中移除)的3. Okb DNA片 段上，得到KS318。在连接之前，该片段末端用DNA聚合酶I大片段进行钝化。使用限制性 酶SalI从KS318中切除包含HGGT和γ -生育酚甲基转移酶表达盒的6. 4kb DNA片段，并 将其连接到用SalI线性化的根癌农杆菌二元载体PZBL120的DNA上，得到KS319。植物转 化载体KS319的T-DNASEQ如ID NO 43所示。申请人:注意到二元载体PZBL120与美国专利公开5，968，793中描述的pZBLl 二元 载体(美国典型培养物保藏中心登陆号209128)相同，除了在Nos/P-nptll-OCS 3’基因 中从核苷酸6494至7456的NOS启动子被963bp的35S启动子(NCBI登录号V00141 ；也称 作 NCBI General IndentifierNo. 58821)置换。新的 35S 启动子-nptll-OCS 3，基因在 PZBL120中用作卡那霉素(Kan)抗性植物选择标记。转基因拟南芥品系的获得与分析通过电穿孔将KS319质粒DNA导入根癌农杆菌NTL4 (Luo等人，Molecular Plant-Microbe Interactions (2001) 14(1) :98_103)。简言之，将 1 μ g 质粒 DNA 与 100 μ L 电感受态细胞在冰上混合。将上述细胞悬液转入一个100 μ L电穿孔杯(间隙宽度为Imm)， 并用参数调至lkV、400 Ω和25 μ F的BI ORAD电穿孔仪进行电穿孔。将细胞转入ImL LB培 养基，并在30°C孵育2h。将细胞铺板于包含50 μ g/mL卡那霉素的LB培养基上。将平板在 30°C培养60h。从转染的农杆菌细胞单克隆接种出重组的农杆菌培养物(500mL LB, 50 μ g/ mL卡那霉素)，并在30°C培养60h。离心(5000X g，IOmin)收集细胞，并重悬于包含0. 05% (V/V)Silwet的1L5% (ff/V)蔗糖中。拟南芥植物在土壤中以30株植物每IOOcm2罐的密度， 在METRO- MIX 360 土壤混合物中生长4周(22°C，16h光照/8h黑暗，100 μ EmH。将拟 南芥植株反复浸入携带上述二元载体KS319的农杆菌悬液，并置于黑暗、高湿度环境24h。 植株在如前所述的标准植物生长条件下培养三至四周，然后收集植物材料并置于纸袋中在 环境温度下干燥一周。用0.425mm筛眼的黄铜筛收集种子。将干净的拟南芥种子(2克，相当于约100，000粒种子)依次用下列溶液清洗消 毒45mL 80% 乙醇，0. 01% triton X_100，45mL 30% (V/V)溶于水的家用漂白剂，0. 01 % triton X-100，最后用无菌水反复冲洗。将含20，000粒种子的等份转入包含150mL无菌的植物生长培养基的方板(20 X 20cm)中，所述培养基包含固化10g/L琼脂中的0. 5 XMS盐、 1. 0% (W/V)蔗糖、0. 05MES/K0H(pH5. 8)、20(^8/11114寺美汀，以及5(^8/1^卡那霉素。通过 将悬于水中的种子悬液与等体积融化熔化的植物生长培养基混勻，将上述种子均勻分散于 上述培养基中。平板在标准生长条件下孵育十天。将卡那霉素抗性幼苗转移到无选择试剂 的植物生长培养基中生长至成熟。生成总计137个转基因品系，它们进行HPLC分析在环境温度下，在200 μ L庚烷 中提取5mg碾碎的种子。如实施例3所述，生育酚和生育三烯酚通过HPLC定量。最高的总 生育三烯酚含量是2，800ppm。最高的α -生育三烯酚含量是400ppm。在这些事件中，25% 的所有生育酚和生育三烯酚由α-生育三烯酚构成。 通过反复的自交使两个事件，#58和#135，形成转基因纯合子。两个事件的Τ2种 子包含25%的卡那霉素敏感种子，指示两个事件都在单个基因位点包含转基因插入序列。 从Τ3种子中生产批量种子，Τ3种子不再分离出卡那霉素敏感的后代。在ImL庚烷中提取 50mg的Τ4种子材料。通过HPLC定量生育酚和生育三烯酚，这些结果见表5。如下文所述， 事件#58表达HGGT和Y-生育酚甲基转移酶基因。事件#135仅仅表达HGGT。口口口細屯好T4 #祁綱聽_成,(AW翻％ ) 表5指示事件#135显然只表达大麦HGGT基因。事件#135的种子生育三烯酚特 征类似于转基因拟南芥组成过表达大麦HGGT基因的叶片的生育三烯酚特征。叶片特征 受Y-生育三烯酚与包含小于3%总生育三烯酚的α-生育三烯酚的控制(参见PCT公 开 WO 03/082899 ；美国专利申请 2004/0034886 ；Cahoon 等人(2003)Nat. Biotechnol. 21 1082-1087)。申请人注意到在品系#135中仅仅检测到痕量的α-生育三烯酚。因此，在拟南芥种子中仅有非常低的能将Y-生育三烯酚转化成α-生育三烯酚的内源酶活性。和上文形成对比，共表达的大豆Y-生育酚甲基转移酶基因与HGGT基因一起在事件#58中导致α-生育三烯酚的显著积聚，其含量为419ppm。在GC分析后使用甲醇钠衍 生化测量庚烷提取物的含油量(参见下文)。使用此分析，测定出事件#58的种子油包含 l，200ppm的α-生育三烯酚。事件#58的α -生育三烯酚占总生育三烯酚和生育酚的最多 约20%。大约30%的Y-生育三烯酚被转化成α-生育三烯酚。申请人注意到因为使用 异源启动子，Y-生育酚甲基转移酶基因的表达可能是低水平的。如果Y-生育酚甲基转 移酶基因在内源的种子优选启动子控制下表达，将非常可能观察到甚至更高水平的α “生 育三烯酚。然而，拟南芥数据已经证明大豆Y-生育酚甲基转移酶基因是用于生产α-和 β-生育三烯酚的甲基化生育三烯酚过程的有效催化酶。本领域的技术人员懂得分别存在于表1和表2中的尿黑酸香叶基香叶基转移酶 (HGGT)和Y-生育酚甲基转移酶也可在拟南芥中表达以证明使用这些cDNA提高转基因植 物中α和β-生育三烯酚生产的可行性。GC/MS俯舰姚舗禾口辅Ξ·細一性总母育酚分析在Agilent 6890气相色谱仪联合Agilent 5973MassSelective Detector(MSD)上进行。将品系#58和#135的拟南芥种子的庚烷提取物的四μ L样本注入 分流/无分流喷射器(2 1分流比率)，保持在3001。在3011^25(^111(10)\0.2511111(薄 膜厚度)Agilent DB5MS柱上，使用氦气作载体(39cm/sec的线速度)进行色谱分离。加热 器温度特征图如下260°C保持4min ；2°C升温至340°C，保持12min。从柱中洗脱的化合物通 过加热(325°C)转运管道导入MSD并进行电离(70eV)。使用标准调谐规程调谐MSD，并在 Scan 模式下运行(10-500 量程)。使用 ChemStation(Agilent)和 AMDIS 版本 2. 1 (National Institute ofStandards and Technology ；NIST)分析数据。通过比较化合物和那些可靠样本的洗脱时间、以及与电子数据库(2.0版，NIST) 比较质谱来确认化合物同一性。该数据库包含α-、β-、Y-和Δ-生育酚，以及内部标准 品(α-生育酚乙酯)。文库不包含任何生育三烯酚。因此通过与在相同色谱条件下运行的 那些可靠标准品比较色谱洗脱和视觉比较质谱来确认这些化合物的同一性。实施例2转基因大豆品系中的生育三烯酚生产大麦HGGT和大豆Y-生育酚甲基转移酶的分子堆叠为了证明转基因大豆品系中生产提高水平的α-和生育三烯酚的能力，以分 子堆叠方式(后代具有两个转基因相关的特性)使用大麦HGGTcDNA(bdl2c. pk 006. o2 ；SEQ ID NO 2)和大豆 Y-生育酚甲基转移酶(sahlc. pk004. g2 ；SEQ ID NO: 12)。使用粒子轰击胚胎愈伤组织，用KS270和KS308的质粒DNA生成转基因大豆品系， 参见实施例1。KS270在617bp的大豆β -伴球蛋白启动子控制下提供大麦HGGT基因。HGGT转 录物的聚腺苷酸化信号来源于菜豆蛋白基因的终止子(来自菜豆Phaseolus vulgaris ； Doyle等人(1986) J. Biol. Chem. 261 =9228-9238) 该质粒也包含大豆ALS基因的抗磺酰脲 类突变体的cDNA，它处于1217bp的SAMS启动子的控制下。HGGT转录物的聚腺苷酸化信号 得自大豆ALS基因的终止子。
KS308在2090bp的大豆Kti启动子控制下提供来自大豆的生育酚甲基转移酶 基因。Y -生育酚甲基转移酶转录物的聚腺苷酸化信号得自Kti基因的终止子。KS308也提 供潮霉素B磷酸转移酶(HPT)抗性基因(Gritz等人(1983) Gene 25 179-188)，它处于来自 花椰菜花叶病毒的1408bp的35S启动子控制下(Odell等人(1985)Nature 313 :810_812)。 潮霉素抗性基因的聚腺苷酸化信号得自胭脂碱合酶基因的终止子，所述胭脂碱合酶基因来 自根癌农杆菌的Ti质粒的T-DNA。 通过粒子枪轰击方法用KS270与KS308的质粒DNA转化大豆胚发生悬浮培养物 (Klein 等人(1987)Nature (London) 327 :70_73，美国专利公开 4，945，050)，该方法使用 BIORAD BI0LISTIC PDS1000/He仪。大豆植株的转化和再生利用了下列储备液和培养基储备液100X 硫酸盐储备液37. Og MgSO4. 7H20,1. 69g MnSO4. H20,0. 86gZnS04. 7H20, 0. 0025g CuSO4. 5H20IOOX 卤化物储备液:30. Og CaCl2. 2Η20，0· 083g ΚΙ,Ο. 0025gCoCl2. 6H20IOOX P, B, Mo 储备液18. 5g KH2PO4,0. 62g H3BO3,0. 025gNa2Mo04. 2H20IOOX Fe EDTA 储备液:3· 724g Na2EDTA, 2. 784g FeSO4. 7H202，4_D 储备液10mg/mL维生素B51000X储备液10. Og肌醇，0. IOg尼克酸，0. IOg吡哆醇HC1，Ig硫胺。培养基(每升)SB196 上述储备液各 10mL，B5 维生素储备液 lmL，0. 463g (NH4) 2S04, 2. 83g KN03, ImL 2,4-D储备液，Ig天门冬酰胺，IOg蔗糖，pH5. 7。SB103 :lpk.Mura shige&Skoog盐混合物，ImL B5维生素储备液，750mg MgCl2六水 合物，60g麦芽糖，2g固化剂 ,pH 5.7。向SB166 :SB103添加5g/L的活性炭而成。SB71-4 =Gamborg' s B5 盐，ImL B5 维生素储备液，30g 蔗糖，5g TC 琼脂，pH 5. 7。将大豆胚胎生成悬浮培养物培养于35mL液体培养基(SB196)，以制备用于转化的 组织，培养条件为摇床(150rpm)培养、28°C，并按16h昼/8h夜的周期提供荧光。通过将约 35mg组织接种至35mL的新鲜液体培养基，培养物每2周传代培养一次。在粒子枪轰击程序中，可能使用纯化的1)完整质粒DNA或，2)仅包含受关注的重 组DNA表达盒的DNA片段。对于每十七次轰击转化，每种DNA质粒制备包含每碱基对1至90 皮克(Pg)的质粒DNA的85 μ L悬液。如下所述，两种重组DNA质粒均共沉淀至金颗粒上。 将悬液中的DNA加入50 μ L 20-60mg/mL 0. 6 μ m的金颗粒悬液，然后与50 μ L CaCl2 (2. 5Μ) 和20 μ L亚精胺(0. 1Μ)合并。混合物振荡混勻5秒钟，用微离心机离心5秒钟，去除上清 液。用150 μ L 100%乙醇清洗包覆了 DNA的金颗粒一次，再次振荡并用微离心机离心，然后 重悬于85 μ L无水乙醇。然后将5 μ L DNA包覆的金颗粒上样至每一大载物盘。将约150至250mg已培养两周的悬浮培养物置入空的60mmX 15mm皮氏培养皿， 并用移液器将残留的液体自上述组织吸走。将上述组织置于距维持屏约3. 5英寸处，每一 盘组织轰击一次。膜破裂压力设为650psi，小室抽真空至-28英寸汞柱。对三个盘进行轰 击，轰击之后将来自每一盘的组织分为两份，放回含液体培养基的瓶中，并如上文所述进行 培养。
轰击后7天，将上述液体培养基替换为含30_50mg/L潮霉素的新鲜SB196培养基。 上述选择性培养基随后每周或每两周更新一次。轰击后七周，观察到鲜绿色的转化组织从 坏死或萎黄的未转化胚胎生成块中长出。将绿色组织分离，接种至6孔培养皿的各个孔中， 以产生新的、克隆繁殖的转化的胚胎生成悬浮培养物。由此，将每一新的品系处理为一个单 独培养孔中的独立转化事件。然后，可以通过传代培养将上述悬液作为集中处于未成熟发 育阶段的胚胎进行悬浮培养，或者也可以通过各个体细胞胚的熟化和萌发，再生为整株的 植物。在各细胞培养孔中培养两周后，将转化的胚胎生成块自液体培养基中移出，并置于不含激素或抗生素的固体培养基(SB166)上培养一周。胚胎于26°C在荧光和白炽光以 16小时昼/8小时夜周期混合照射下培养。一周后，将培养物转入SB103培养基，并在相同 的生长条件下再培养3周。如此培养4周后，体细胞胚变得适宜萌发，此时将其从成熟培养基中移出，并置于 空的皮氏培养皿中干燥1至5天。然后将干燥的胚胎种植于SB71-4培养基中，胚胎可在上 述相同的光照和温度条件下于其中萌发。萌发的胚胎被转入无菌土壤中生长至成熟，以产 生种子。通过KS270和KS308质粒共转化制备了总共十四个事件。Tl种子的母育酚组成检 测分析如下。从种子的子叶组织中获取种子薄片(大约5-15mg组织)。该薄片用IOOyL 庚烷提取2小时。如实施例3所述，用HPLC分析定量生育酚和生育三烯酚。生成并分析总计14个事件。来自五个事件的种子包含显著水平的生育三烯酚。 这些事件中的三个事件也包含显著水平的(> 150ppm) α-和β -生育三烯酚。一个事件 不显示Y-至α-生育三烯酚的转化，并且一个事件仅仅表现出低水平的γ-生育酚甲基 转移酶活性(20-150ppm的α -生育三烯酚)。选择一个事件4060. 2. 5. 1用于进一步的工 作。就事件4060. 2. 5. 1而言，十个Tl种子中的七个显示出转基因特性，指示这些事件可能 在单个基因位点具有单个或多个转基因插入序列。种植阳性_阳性Tl种子，并且从个体植 株中选择Τ2种子。用HPLC分析总计四十八个Τ2种子，其结果可见于表6。事件4060. 2. 5. 1的Τ2后代的母育酚组成(总生育酚(tocph.)和生育三烯酚 (toct.)的％ )
1583002614262238229121 685002622142646831281785002622142639926921895002521142547729061 97500252 31 32636525802075002521142740528262175o02522142744231 38221 150024161 92440820842 3860024221427435281824750024201 52941 1294725960024211 32741 22 34026960024201 52745 3262427960o2 32l1427392231 5289600232 014284432415298210221 03621460387330750022211430386272 331950022181 7304 35271 832161731 OO0OO3830335 1245200003680343525940000362035201691 o0OO035 30363625650000325037182711 0000035703835358500003070391 32741 10oO0302040252649000035 3041181711 00000328042252649000035 304 31．72．70110000384044141．7 31200003370452017080000344046161731 00000335047161741 00000328048181．71800023540
通过转基因品系的自交生成T2种子，该品系是就单个显性转基因特性而言是杂合的。因此，将期望检测到25％(12／48)的非转基因分离体。申请人观察到35％(17／48)的非转基因分离体(参见编号32-48)。种子编号l至3l是转基因分离体。
发现具有转基因相关特性的T2后代包含至 590ppm和最多l，099F)pm 1~o一生育三烯酚以及至二401ppm和最多868f)pm 1~p一生育三烯酚。在这些T2品系中，o一生育三烯酚组成至少22％和最多31％，以及之间的整数的总生育酚和生育三烯酚部分。在GC分析后使用甲醇钠衍生化测定庚烷提取物的含油量。可以用以ppm表示的生育三烯酚浓度计算含油量。具有转基因相关特性的T2后代包含的油具有至少2，6181)pm和最多4，891ppm的。一生育三烯酚以及至少l，7321，pm和最多3，8041)pm 1~p一生育三烯酚。申请人也测试高。一和p一生育三烯酚含量对种子重量的可能的负效应。为此，将四十八个T2种子的种子重量对α-生育三烯酚含量绘制曲线图。未发现种子重量和α-生育三烯酚含量之间的 相关性。此外，在具有高α-和β-生育三烯酚特性的种子中未观察到与种子形状、颜色、 或发芽有关的不正常种子表型。本领域的技术人员懂得分别存在于表1和表2中的尿黑酸香叶基香叶基转移酶 (HGGT)和Y-生育酚甲基转移酶也可在大豆中表达以证明使用这些cDNA用于转基因植物 中α和β-生育三烯酚生产的可行性。概括地说，来自大豆的Y-生育酚甲基转移酶能有效地利用生育三烯酚底物，例如，通过前述方法生成具有高含量α和β-生育三烯酚的种子或提取油。过表达大麦HGGT 和大豆Y-生育酚甲基转移酶基因的大豆的α-生育三烯酚含量超过前文所述的任何非 转基因种子或油的α -生育三烯酚含量至少一个数量级(Packer等人(2001) J. Nutr. 131 369S-373S ；Bertoli 等人(1998) JAOCS 75 1037-1040 ；PCT 公开 WO 00/072862)。这些结 果进一步证明了通过转基因表达编码HGGT和γ -生育酚甲基转移酶多肽的核酸片段来非 正常积聚抗氧化剂分子的作物植物生产α-和生育三烯酚的能力。实施例3&侧胞i藤雜口·附百口口口胃ΦΦΡΦ ΤΞ舰劍錢衬IHGGT禾找百.Y-辅解雜_为了证明在体细胞大豆胚芽和转基因大豆品系中生产提高水平的α-和β-生育 三烯酚的能力，以基因堆叠方式(杂交生成的后代具有两个转基因相关的特性)使用大麦 HGGT cDNA(bdl2c. pk006. o2 ；SEQ ID NO 2)和大豆 Y-生育酚甲基转移酶(sahlc. pk004. g2 ； SEQ ID NO 12)。已经将体细胞大豆胚芽用作预测大豆种子的转基因表型的模型(Kirmey， A.J. (1996) J. Food Lipids 3:273-292)。体细胞大豆胚芽和种子富集了生育酚，但是包含 少量的或无生育三烯酚(Coughlan, unpublished result ；The Lipid Handbook，第 2 版， Gunstone, F. D.,等人编辑，Chapman and Hall, London, 1994，第 129-131 页)。将来自克隆sahlc. pk004. g2的质粒DNA用作制备编码完整的推断开放阅读框的 NotI PCR片段的模板，使用以下PCR引物正向引物5，-AGCGCGGCCGCATGGCCACCGTGGTGAGG ATCCCA-3，(SEQ ID NO :44)，和反向引物δ'-ΑΟεοεΟΟαΧΧΤΤΑΤ ΑΟΟΤΤΤ ΟΑΟΑΤΟΤΑΑΤΟΑΤΟ-β， (SEQ ID NO 45)。使用Pfu聚合酶进行PCR扩增，使用EST sahlc. pk004. g2的DNA作模板。 如制造商规程所述，将此PCR反应的产物通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化并亚克隆到 pCR-Script-AMP(Stratagene)中。经扩增的大豆Y _生育酚甲基转移酶基因开放阅读框 然后以NotI片段的形式释放，并将其克隆到大豆表达载体PKS67的相应位点以生成质粒 pSCl (SEQ ID N0:50)。通过在pRB20 (描述于美国专利公开5，846，784，以引用方式并入本 文)中用包含聚腺苷酸化信号序列的285bp的Nos 3'片段置换SOObp的Nos3'片段，制 备质粒PKS67，该方法描述于D印icker等人(1982) J. Mol. Appl. Genet. 1 :561_573。将连接 产物转化到大肠杆菌中，并且使用潮霉素B选择重组克隆。将限制性消化质粒DNA用于鉴定包含质粒DNA的培养物，其中大豆Y -生育酚甲 基转移酶cDNA的起始密码子非常接近大豆伴球蛋白启动子的转录起始位点。在此质 粒构建体中，自此以后称作SCl，大豆γ -生育酚甲基转移酶cDNA处于617bp片段的大豆β-伴球蛋白启动子的控制下。HGGT转录物的聚腺苷酸化信号得自菜豆蛋白基因的终止子。质粒SCl (SEQ ID NO 50)包含潮霉素B磷酸转移酶基因，它处于花椰菜花叶35S启动 子的控制下，允许通过该基因对抗生素潮霉素B的抗性选择转化过的植物细胞。使用SCl 质粒DNA生成下文所述的大豆转基因体细胞胚芽。大豆体细胞胚芽培养物的转化以下储备液和培养基用于转化和增殖大豆体细胞胚芽■■■献百侧胞肩_碰鹏· *(Gibco BRL)将大豆胚芽悬浮培养物保持在35mL液体培养基(SB55)中，将其置于旋转振荡器 (150rpm)上，在28°C下，用荧光和白炽光的混合光提供16小时昼/8小时夜的光周期。通 过将约35mg组织接种至35mL的新鲜液体培养基，培养物每2至3周传代培养一次。用包含Y-生育酚甲基转移酶序列的质粒转化大豆胚芽悬浮培养物，该转化 通过粒子枪轰击方法(参见Klein等人(1987)Nature 327 :70_73)，使用一台DUPONT BIOLISTIC PDS1000/He 设备进行。将五 μ LpKS93s 质粒 DNA (lmg/L)、50 μ L Cal2(2. 5M)、 和20 μ L亚精胺(0. 1Μ)加入到50 μ L 60mg/mol Imm金颗粒悬液中。搅拌该颗粒制备物3 分钟，在微量离心机(microphage)中离心10秒并移除上清液。用400 μ L 70%乙醇清洗包 覆了 DNA的颗粒一次，然后重悬于40 μ L无水乙醇中。将DNA/颗粒悬浮液用超声波处理三次，每次1秒钟。然后将五μ L DNA包覆的金颗粒上样至每一大载物盘。将约300至400mg已培养两周的悬浮培养物置入空的60mmX 15mm皮氏培养皿，并 用移液器将残留的液体自上述组织吸走。将组织置于离阻挡网大约3. 5英寸的地方并轰击 两次。膜破裂压力设为llOOpsi，小室抽真空至-28英寸汞柱。对两个盘进行轰击，轰击之 后将组织分为两半，放回含液体培养基的瓶中，并如上文所述进行培养。
轰击后十五天，用包含50mg/mL潮霉素的新SB55更换液体培养基。选择性培养基 每周更新一次。轰击后六周，将转化过的绿色组织分离，接种至烧瓶中，以产生新的、转化过 的胚胎生成悬浮培养物。从液体培养物中移除转化过的胚芽簇，并将其置于固体琼脂培养基SB103上，该 培养基包含0.5%木炭以启动成熟。一周后将胚芽转移到去除木炭的SB103培养基中。在 SB103培养基上五周后，分离出成熟的胚芽并置于SB148培养基上。在成熟期间将胚芽保持 在26°C下，用荧光和白炽光的混合光提供16小时昼/8小时夜的光周期。在SB148培养基 上培养三周后，分析胚芽的生育酚表达。每个胚芽簇提供5至20个体细胞胚芽。通过用于转化过的体细胞胚芽的相同方法培养未经转化过的体细胞胚芽。分析转化过的体细胞胚芽在SB148培养基上培养到第六周末期，从25个独立转化品系中收获体细胞胚芽。 五个一组采集体细胞胚芽，称取其鲜重。将多余的培养置于96孔板上在-80°C储存。将收 集的体细胞胚芽冻干18小时，测量干重。用手持式Potter勻质机粗研磨冻干的体细胞胚 芽，然后加入600 μ L庚烷并在室温下暗培养所述样本24小时以提取油和生育酚。滗析出 庚烷并另加300 μ L到样本中。混合提取物并进行离心(5分钟，12000g)。在分析前将上清 液置于琥珀色自动取样机小瓶中储存于-20°C下。使用HPllOO系统(Agilent Technologies)进行提取物的HPLC分析，将25 μ L庚 烷样本加样于Lichrosphere Si 60柱(5微米，4 X 12. 5mm)。用庚烷/异丙醇(98 2v/v) 以lmL/min的流速进行柱洗脱。在六分钟后洗脱出所有四个生育酚异构体，这通过HP1100 荧光检测器进行检测(激发波长295nm，发光波长330歷)。单个生育酚标准品(Matreya) 用HPLC级庚烷洗脱出来，其含量介于1和200ng/ μ L之间，并用其构建一个6-点外标法标 准曲线。同一天在各个油中的生育酚作为样本使用标准曲线进行定量。来自未经转化的对 照品系的样本的总生育酚峰面积与那些25个独立的用Y -生育酚甲基转移酶转化过的潮 霉素抗性品系的峰面积进行比较。鉴定了几个显示超表达大豆Y-生育酚甲基转移酶基因的事件。在许多品系中， 和未经转化的大豆胚芽形成对比(其中Y-生育酚是主要的母育酚分子)，80%的总母育酚 由α-生育酚构成。大豆植株产生自克隆的组织，该克隆组织来源于十个具有高水平α-生 育酚的独立转基因大豆事件。这十个事件中的每个事件生成若干个植株。来自每个转基因 事件的五个Tl种子进行HPLC分析以测定生育酚组分的组成。简而言之，使用组织粉碎机 (Genogrinder)勻化单个干菜豆。用600 μ L在环境温度下提取大约30mg组织粉末2小时。 通过短时间的离心清除庚烷提取物。如前文所述用HPLC分析庚烷提取物的母育酚组成。Tl 种子的α-生育酚百分比在表8中进行了综述。^ 8Tl种子的α-生育酚百分比
选择事件719. 1. 10进行进一步研究。Tl种子的高α -生育酚特性分离体指示此 事件具有单个位点的过表达Y-生育酚甲基转移酶基因插入序列。允许Tl植株进行自交， 并对从单个植株中选择的Τ2种子进行单个种子的HPLC分析。Τ2种子选择经鉴定发现不再 有具有低α-生育酚含量(α-生育酚< 10%总母育酚)的分离种子。种植来自这些选择 的种子，并从这些Τ2植株中收获是转基因纯合子的批量种子。Τ3种子的生育酚定量分析如下进行。使用Imm筛网在FOSS tecator样本磨(FOSS， USA)中碾碎大豆。在5mL庚烷中提取200mg组织两小时；加入α-生育酚乙酸酯作为内部 标准品，其终浓度为38 μ g mL—1。10 μ L经过滤的庚烷提取物进行HPLC分析，该分析使用 Lichrospher柱(250-4HPLC料筒，Si60，5 μ M粒度)，使用包含0. 75%异丙醇的庚烷作流 动相，流速为ImL mirT1。将在相同条件下分离的所有四个生育酚和生育三烯酚的外部标准 品(2.5yg mL-1)用于母育酚定量。使用荧光检测器进行母育酚检测，该检测器分别使用 295nm的激发波长和330nm的发光波长。表9指示EMSP 719. 1. 10表达高水平的Y _生育 酚甲基转移酶活性，它由几乎定量的Y-和Δ-分别至α-和β-生育酚的转化指示。申 请人注意到，未检测到生育三烯酚。
趋事件EMSP 719. 1. 10的纯合T3种子的母育酚组成 生成具有大麦HGGT基因的种子优选表达的转基因大豆品系通过PCR生成DNA片段。新的DNA片段包含大麦HGGT cDNA的完整开放阅读框 (1224bp ；SEQ ID NO :46)，该cDNA在5，和3，位点侧接限制性酶NotI识别的DNA序列。简 而言之，使用寡核苷酸引物将经修饰的HGGT cDNA从大麦发育种子cDNA文库中扩增(参见 PCT公开W003/082899)，所述引物包括NotI位点，它分别启动HGGT cDNA序列的起始密码 子上游的四个核苷酸和终止密码子下游的两个核苷酸。在此反应中使用的有义和反义寡核 苷酸引物序列如下5，-ttgcKgccKcAGGATGCAAGCCGTCACGGCGGCAGCCG-S' (SEQ ID NO 47)禾口5，-ttgcggccgcTTCACATCTGCTGGCCCTTGTAC-3，(SEQ ID NO :48)。(注小写字母和下划线标注的核苷酸序列对应于增加的Not I限制性位点。) 使用Pfu聚合酶进行PCR扩增，并使用PCT公开WO 03/082899中描述的大麦发育种子cDNA 文库的等分试样作模板。如制造商规程所述，将此PCR反应的产物通过琼脂糖凝胶电泳进 行纯化并亚克隆到pCR-Script-AMP (Stratagene)中。经扩增的大麦HGGT开放阅读框然后以NotI片段的形式释放，并将其克隆到大豆 表达载体PKS123 (如下文所述进行构造)的相应位点以生成质粒pSC38 (SEQ ID NO 49)。载体pKS 123的构建以前描述于PCT公开WO 02/008269 (其内容以引用方式并入 本文)。简而言之，质粒PKS123包含潮霉素B磷酸转移酶基因(HPT) (Gritz，L.和Davies， J. (1983)Gene 25 :179_188)，该基因侧接 T7 启动子和转录终止子(T7prom/hpt/T7term 盒)，以及用于细菌中选择和复制的细菌复制起点(ori)(例如大肠杆菌)。此外，pKS123 还包含分别侧接35S启动子(Odell等人，Nature (1985) 313 :810_812)和NOS 3'转录终 止子(D印icker 等人，J. Mol. Appl. Genet. (1982) 1 561 570) (35S/hpt/N0S3，盒)，从而可 用于在植物，例如大豆中进行选择的潮霉素B磷酸转移酶基因。pKS123也包含NotI限制 性位点，侧接有用于β-伴球蛋白(Beachy等人，EMBO J. (1985)4 =3047-3053)的α亚基 启动子和菜豆蛋白基因的3’转录终止区域(Doyle, J.J.等人，J. Biol. Chem. (1986)261 9228-9238)，因此允许克隆到NotI位点中的基因在大豆种子中发生强组织优选的表达。将连接产物转化到大肠杆菌中，并且使用潮霉素B选择重组克隆。将限制性消化 质粒DNA用于鉴定包含质粒DNA的培养物，其中HGGT cDNA的起始密码子非常接近大豆 β-伴球蛋白启动子的转录起始位点。在此质粒构建体中，自此以后称作SC 38，大麦HGGT cDNA处于617bp片段的β-伴球蛋白启动子的控制下。HGGT转录物的聚腺苷酸化信号得自 菜豆蛋白基因的终止子。质粒SC38包含潮霉素B磷酸转移酶基因，它处于花椰菜花叶35S 启动子的控制下，允许通过该基因对抗生素潮霉素B的抗性选择转化过的植物细胞。使用 SC38质粒DNA生成上文所述的大豆转基因体细胞胚芽。制备了总计31个独立事件。如上所述通过HPLC分析进行生育酚和生育三烯酚分析。能鉴定包含可检测水平的生育三烯酚的八个事件，这指示在这些转基因事件中表达大 麦HGGT。在大豆未改变的叶片和种子组织中生育三烯酚含量低于荧光检测的检测限。转基 因大豆植株从一个事件(1052. 5. 2)的体细胞胚芽组织中产生。总计八个Tl种子经过HPLC 分析其生育酚和生育三烯酚，其中六个种子包含可检测水平的生育三烯酚。在Tl种子中的 生育三烯酚特性分离体指示此事件包含插入伴球蛋白HGGT表达盒的单一位点。种植十九个随机选择的Tl种子，并且从个体植株中选择Τ2种子。最初，来自每个 Τ2后代的八个种子进行HPLC分析。此分析允许申请人鉴定五个不产生缺乏生育三烯酚的 种子的Τ2后代。通过HPLC分析另外八个种子，进一步确认了这些后代的不可分离性。将 其中一种选择的纯合的Τ2种子用于制备批量的Τ3种子。将这个种子材料用于定量母育 酚分析，这些结果见表10。表10显示过表达来自大麦的HGGT基因的大豆仅仅积聚γ-和 Δ-生育三烯酚。在这些转基因品系中不能检测到α-或β-生育三烯酚。表 10
事件EMSP 1052. 5. 2的纯合Τ3种子的母育酚组成 表达来自大麦的HGGT蛋白的大豆的生育三烯酚特征指示无分别将γ-和Δ-生 育三烯酚转化成α-和生育三烯酚的可检测活性。虽然不受理论的约束，两个可能的 设想能够解释为何在双子叶植物如大豆的HGGT表达种子中缺乏Y-和Δ -生育三烯酚向 α-和生育三烯酚的转化。第一个设想是来自不合成生育三烯酚的植物的Y-生育酚 甲基转移酶可能不接受生育三烯酚底物。根据此设想，来自单子叶植物的Y-生育酚甲基 转移酶已经进化成生育三烯酚甲基化的催化剂，并且它们与HGGT的共表达将是在双子叶 植物中生物合成高水平α-和β-生育三烯酚所需要的。第二个设想是来自双子叶植物的 Y-生育酚甲基转移酶可能是有效的α-和β-生育三烯酚合酶，但是它们的内源性表达水 平太低，以至于不能完成生育三烯酚底物的转化(即，Y-生育酚甲基转移酶被来自超表达 HGGT的生育酚底物饱和)。诵过遗传杂夺来轺表汰HGGT禾π γ- ^m^wummmmw^ EMSP 719. 1. 10与EMSP 1052. 5. 2杂交以测试大豆γ -生育酚甲基转移酶用于 α-和β-生育三烯酚生物合成的可行性。生成总计20个Fl种子。对总计四个Fl种子进 行Fl种子的母育酚组成定量分析，结果见表11。表11用干来自大.的HGGT某来自大百.的Y _牛育酚甲某转移的禾Φ子优化 轺表汰他句,含转Fl 比较 EMSP 1052. 5. 2 的母育酚特征和 EMSP 1052. 5. 2 与 EMSP719. 1. 10 的杂交 Fl
菜豆的母育酚特征，结果揭示了巨大的差异。尽管α-生育三烯酚在1052. 5. 2亲本中检测 不到，它构成了杂交材料中第二丰富的生育三烯酚物质。申请人注意到Y-生育三烯酚几 乎完全转化成了 α-生育三烯酚。大豆Y-生育酚甲基转移酶也明显地将Δ-生育三烯酚 转化成β “生育三烯酚。可将Fl菜豆的更低的总生育三烯酚浓度(与1052. 5. 2亲本中的 l，261ppm相比较为763ppm)归因于Fl种子中的杂合状态的HGGT转基因或能够指示由于相 同的启动子和/或5’UTR序列导致的两个β -伴球蛋白启动子驱动的转录经受转录或转录 后基因沉默。Fl种子在土壤中发芽并允许自交。用HPLC分析总计四十八个F2种子，所得 结果见表12。表 12EMSP 1052. 5. 2与EMSP 719. 1. 10的杂交F2后代的母育酚组成(总生育酚 (tocph.)百分比和生育三烯酚(toct.)百分比)α -β -γ-A-α- β - γ- A- tocph. toct.No. tocph. tocph. tocph. tocph. toct. toct. toct toct. (ppm) (ppm)1 1070031 37 5 10 217 11282 1070031 38 5 9 248 12203 1060030 36 9 10 196 10674 1370030 37 5 8 279 11245 960030 33 9 13 239 13666 8 6 0 0 30 39 6 11 229 1408
712700303381027110988117003034992581158910600293471322711771015700293189265903111070028291214199100512860028368142271449131260028321210255114414 97002835813227119015107002737712240119616138002731714263996171170027348132281017181180027337142611095191070027367122561207201370027311012210822211170026396102501108228700264071222812602386002635817230140924 127002628141419381825108002637613265115526770025417132371472278700243871522412622810700243291728213852976002437818176117130970021291321219111131217410464023815543210430045452322284331153004743190174034 1164004444231178435206300513722517883621540041462041499378614000000244038841600000025303983170000001830408218000000216041811711000031704280191000002210437819210000226044 34356700002250 45263591100003370
46 23 2 64 10 0 0 0 0 213 047 13 2 69 17 0 0 0 0 261 0
48 12 2 70 16 0 0 0 0 216 0四十八个F2种子的母育酚分析揭示了表达转基因相关特性(参见编号1-30)的 30个F2种子，仅具有HGGT或Y _生育酚甲基转移酶特性的六个和七个种子(分别参见编 号31-36和37-43)，以及五个野生型种子(参见编号44-48)。这些发现非常接近于在两个 亲本杂交的F2后代中的两个不相关的、显性特性的期望分离体，两个亲本分别是每个显性 特性的纯合子。两个转基因特性的F2期望频率为62. 5% (30/48)。具有单个转基因特性 或无转基因特性的F2期望频率是12. 5% (6/48)。发现具有转基因相关特性的F2后代包含至少258ppm和最多487ppm的α -生育 三烯酚以及至少278ppm和最多701ppm的β -生育三烯酚。在GC分析后使用甲醇钠衍生 化测定庚烷提取物的含油量。用以PPm表示的生育三烯酚浓度计算含油量。具有转基因相 关特性的F2后代包含的油具有至少1，670ppm和最多2，940ppm的α -生育三烯酚以及至 少1，800ppm和最多4，080ppm的β -生育三烯酚。申请人也测试高α -和β -生育三烯酚 含量对种子重量的可能的负效应。为此，将四十八个F2种子的种子重量对α-生育三烯酚 含量绘制曲线图。未发现种子重量和α-生育三烯酚含量之间的相关性。概括地说，来自大豆的Y _生育酚甲基转移酶能有效地利用生育三烯酚底物，并 通过前述方法生成具有高含量α和生育三烯酚的种子或提取油。过表达大麦HGGT 和大豆Y-生育酚甲基转移酶基因的大豆的α-生育三烯酚含量超过前文所述的任何非 转基因种子或油的α -生育三烯酚含量至少一个数量级(Packer等人(2001) J. Nutr. 131 369S-373S) ；Bertoli 等人(1998) JAOCS 75 1037-1040 ；PCT 公开 WO 00/072862)。这些结 果进一步证明了通过转基因表达编码HGGT和γ -生育酚甲基转移酶多肽的核酸片段来非 正常积聚抗氧化剂分子的作物植物生产α-和生育三烯酚的能力。实施例4在玉米(Zea mays)种子中的α-和β -生育三烯酚的生产玉米油主要来源于玉米种子胚芽，它通常富集生育酚但只包含少量的或不包含生 育三烯酷(The Lipid Handbook, 2nd Edition, Gunstone, F. D.等人，编辑，Chapman and Hall，London，1994，第129-131页)。在玉米中的大麦HGGT基因的胚芽优选表达导致高水 平生育三烯酚的积聚。70-80%的生育三烯酚以Y-生育三烯酚的形式积聚，仅仅5-10%的 总生育三烯酚组分以α-生育三烯酚形式存在(参见PCT公开WO 03/082899 ；美国专利申 请 2004/0034886，Cahoon 等人(2003) Nat. Biotechnol. 21 1082-1087。基于本专利申请实施例1、2和3中公开的结果，大麦HGGT cDNA(bdl2c. pk006. o2 ； SEQ ID NO 2)和大豆Y-生育酚甲基转移酶(sahlc. pk004. g2 ；SEQ ID NO 12)能在玉米种 子胚芽中表达以提高此组织和提取油的母育酚抗氧化剂含量，以生产新型母育酚组成，该 组成是α-和β-生育三烯酚占优的。如下所述，可以通过用包含大豆Y-生育酚甲基转移 酶开放阅读框的表达盒转化玉米实现此结果，该阅读框在其5’末端可操作地连接至胚芽优 选的启动子，如玉米16kDa油质蛋白基因启动子(Lee,K.和Huang，A.H. (1994)Plant Mol. Biol. 26 1981-1987)，并且大麦HGGT开放阅读框可操作地连接至玉米胚芽富集(EAPl)启 动子和终止子。
表达盒包含来自玉米16kDa油质蛋白基因(OLE PRO)的启动子、来源于sahlc. pkOOl. k8 :fis(SEQ ID NO 13)的cDNA克隆的大豆Y-生育酚甲基转移酶(SEQ ID NO 14) 的编码序列(PCT公开WO 00/032757)和来自根癌农杆菌胭脂碱合酶(NOS)基因的聚腺苷 酸化信号序列/终止子，使用本领域已知的方法和技术构建此表达盒。第二表达盒包含大 麦HGGT编码序列(PCT公开WO 03/082899 ；美国专利申请2004/0034886)，它处于玉米胚芽 富集蛋白(EAPl)启动子和终止子的转录控制下，其中玉米ADHlINTROm插入启动子和编码 序列之间促进表达。将上述两个表达框以及编码选择性标记的基因连接到适用于农杆菌介 导的玉米转化的二元载体中。
同样的，如上所述可以用来源于p0060. coran49r :fis(SEQ IDNO 15) (PCT公开WO 00/032757)的cDNA克隆的玉米Y-生育酚甲基转移酶(SEQ ID N0 16)制备载体，该转 移酶用于替代大豆Y -生育酚甲基转移酶，使用已经描述过的相同启动子/终止子元件和 HGGT表达盒。此外，本领域的技术人员懂得分别存在于表1和表2中的尿黑酸香叶基香叶 基转移酶(HGGT)和Y-生育酚甲基转移酶也可在玉米中表达以证明使用这些cDNA用于转 基因植物中α和β-生育三烯酚生产的可行性。基于农杆菌的方法可用于玉米的转化(见下)。将所得到的二元载体引入农杆菌 LBA4404(PHP10523)细胞，优选通过电穿孔。通过体内重组，在所引入的二元载体和寄宿于 农杆菌细胞的vir质粒(PHP10523)之间形成了共整合质粒。所得到的农杆菌细胞被用于 转化玉米。农杆菌介导的玉米的转化将新鲜分离的授粉后约十天(DAP)的未成熟玉米胚胎，与上述农杆菌共同孵育。 优选的用于转化的基因型为高度可转化的基因型Hi-II (Armstr0ng(1991)，Maize Gen. Coop. Newsletter 65:92-93)。也可以使用通过将Hi-I I与自交原种杂交得到的Fl杂种。 未成熟的胚胎在用农杆菌处理后，可培养于包含毒性水平的除草剂的培养基上。只有获得 了除草剂抗性基因以及与之连接的基因的细胞，才能生长于选择性培养基上。如此选择后 的转基因事件可以得到增殖并再生为整株植物，生成种子并将转基因传递给后代。农杆菌的制备经过改造的根癌农杆菌LBA4404可被构建为包含用于种子优选表达HGGT和 Y “生育酚甲基转移酶基因的质粒，如美国专利5，591，616中所公开(该专利的内容特此 引入本文以供参考)。通过将上述细菌在基本AB培养基上孵育并允许其于28°C孵育约三 天，可制备出用于种子偏好地表达HGGT和Y-生育酚甲基转移酶基因的质粒转化的一块单 菌落原始平板，以将改造后的构建物用于植物转化。基本AB培养基的组成和制备已描述于 PCT专利公布WO 02/009040中(该专利的内容特此引入本文以供参考)。然后可通过将转 化的农杆菌划线接种至包含50 μ g/mL奇放线菌素的YP培养基(0. 5% (w/v)酵母提取物， 1% (w/v)蛋白胨，0.5% (w/v)氯化钠，1.5% (w/v)琼脂)，制备出工作平板。此后，可以在进行玉米转化的前一天制备用于植物转染和共培养的转化的农杆 菌。将50mg/mL奇放线菌素、IOOmM乙酰丁香酮和来自一至二天工作平板的约1/8环量的农 杆菌加入到包含30mL基本A培养基(如PCT专利公布WO 02/009040中所述进行制备)的 烧瓶中。接下来将上述农杆菌于28°C 200rpm摇床培养约十四小时。在对数生长中期，可使 用标准的微生物学技术收集上述农杆菌，并以3至5X 108CFU/mL密度重悬于包含IOOmM乙酰丁香酮的561Q培养基中。561Q培养基的组成和制备描述于PCT专利公布WO 02/009040。未成熟胚芽制备在对玉米植株进行人工授粉后九至十天，发育中的幼胚为不透明的，长约 1-1.5mm。这样的长度是用PHP18749转化的农杆菌进行转染的最佳大小。可将去壳的穗在 50%的市售漂白剂和一滴Tween-20中灭菌30分钟，然后用灭菌水清洗两遍。此时可将未 成熟的胚胎从颖果上无菌地剥离，并置入2mL由包含100 μ M乙酰丁香酮的561Q培养基组 成的灭菌的维持溶液中。农杆菌对胚胎的感染和共培养可将维持溶液从幼胚离体中缓慢倒出并代之以转化的农杆菌。在温和混勻并孵育 约5分钟后，可将农杆菌从上述幼胚中缓缓倒走。然后将幼胚移至一块562Ρ培养基平板， 所述平板的组成已描述于PCT专利公布W002/009040。将上述幼胚按盾片表面向上的方式 置于上述培养基上，于20°C暗培养三天。此步骤之后可继之以在包含100μ g/mL羧苄青霉 素的562P培养基上于28°C暗培养三天，如美国专利5，981，840中所述。转基因事件的诜择将培养后的幼胚转入5630培养基，该培养基可按PCT专利公布W002/009040中所 述进行制备。所述培养基包含用于选择转基因植物细胞的双丙氨膦，与大麦HGGT表达框相 连的BAR基因可赋予转基因植物细胞抗性。间隔十至十四天后，将胚胎转入5630培养基。 在5630培养基上培养六至八周后，可观察到推定的转基因胚胎生成组织的活跃生长。L棺株的再牛将转基因的胚胎生成组织转入288W培养基，并于28°C暗培养至体细胞胚成熟，或 约十至十八天。将具有明显的盾片和胚芽鞘的各成熟的体细胞胚转入272胚萌发培养基， 并于28°C进行光培养。当芽和根出现之后，将植株个体于土壤中盆栽，并利用典型的园艺方 法进行耐寒锻炼。288W培养基包含下列成分950mL去离子水；4. 3g MS盐(Gibco) ；0. Ig肌醇；5mL MS维生素储备液(Gibco) ； ImL玉米素(5mg/mL溶液)；60g蔗糖；8g琼脂(Sigma A-7049， Purified) ；2mL 吲哚乙酸(0. 5mg/mL 溶液 *) ；ImL 0. ImM ABA*;3mL 双丙氨膦(lmg/mL 溶液 *)；以及2mL羧苄青霉素(50mg/mL溶液)。上述溶液的pH调节至pH 5. 6，将上述溶液高压 灭菌。标以星号O的成分在培养基冷却至60°C之后加入。272培养基包含下列成分:950mL去离子水；4. 3g MS盐(Gibco) ；0. Ig肌醇；5mL MS维生素储备液(Gibco) ；40g蔗糖；和1. 5g固化剂 。将此溶液调节为pH5. 6然后高压灭菌。实施例5微生物细胞中嵌合基因的表达编码本发明HGGT和Y -生育酚甲基转移酶多肽的cDNA能用于在微生物中制备 α _和β _生育三烯酚，所述微生物如藻类和蓝细菌细胞，它们包含可操作的生育酚生物合 成途径。期望在这些细胞中编码本发明HGGT的多肽的cDNA的表达导致香叶基香叶基焦 磷酸和尿黑酸的缩合。HGGT反应2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌醇的产物然后能通过宿主 微生物细胞天然存在的生育酚生物合酶和本发明的Y-生育酚甲基转移酶多肽被转化成 α-和β-生育三烯酚。生育三烯酚能通过连接编码本发明的HGGT和Y-生育酚甲基转移酶多肽的cDNA进行生产，所述cDNA具有适于引导经选择的宿主细胞中的基因表达的启 动子元件。能使用技术将所得嵌合基因导入宿主微生物细胞中，例如同源重组(Williams， J.G.K. (1988)MethodsEnzymol. 167 766-778 ；Legarde, D.等人(2000)App. Environ. Microbiol. 66 :64-72)。用可操作地连接至功能性启动子上的本发明HGGT和γ-生育酚甲 基转移酶多肽的cDNA转化过的宿主细胞然后能使用如实施例1所述的技术分析其生育三 烯酚的生产。实施例6 棺物细胞中α-和β-牛育三烯酚的牛产编码本发明HGGT和Y -生育酚甲基转移酶多肽的cDNA能用于在植物细胞中制 备α-和β-生育三烯酚。当编码本发明HGGT和Y-生育酚甲基转移酶多肽的基因与编 码参与将质体分支酸底物转化成尿黑酸或将2-甲基-6-异戊二烯基苯醌醇转化成2，3-甲 基-6-异戊二烯基苯醌醇的酶的基因共表达时，甚至可以获得更高水平的α-和生育 三烯酚产量。为此，转基因植物用DNA构建体生产，该构建体提供细菌或真菌起源的组成型 或种子特异表达的双官能分支酸变位酶预苯酸脱水酶基因(TYRA)以及来自植物或光合作 用细菌的对羟基苯基丙酮酸双氧化酶基因(HPPD)和2-甲基-6-异戊二烯基苯醌醇甲基转 移酶基因(VTE3)。通过与合适的叶绿体靶向肽融合，将TRYA基因产物靶向转移到叶绿体 中。如上文实施例1至3所述进行植物转化。表达高水平TYRA、HPPD和VTE3的转基 因品系通过如上文实施例1-3所述测量生育色原烷醇含量进行鉴定。具有高水平生育色原 烷醇的事件与用表达本发明HGGT和Y-生育酚甲基转移酶多肽的构建体生成的事件杂交。 用于生成后一个事件的合适构建体是KS319 (实施例1)、SCl和SC38 (实施例2)、KS270和 KS308(实施例3)。作为另外一种选择，使用分子生物学的标准方法生成新的DNA构建体， 所述方法提供由本发明的TYRA，HPPD，VTE3和HGGT和γ -生育酚甲基转移酶基因构成的五 个基因的种子特异性或组成型表达。如实施例1-3所述进行植物转化。高水平表达所有五 个基因产物的转基因品系通过如实施例1-3所述测量植物组织的生育色原烷醇含量进行 鉴定。实施例7 转基因大豆品系中的生育三烯酚生产大麦HGGT和玉米Y _生育酚甲基转移酶的分子堆叠为了证明转基因大豆品系生产水平提高的α-和生育三烯酚的能力，大 麦 HGGT cDNA(bdl2c. pk006. o2 ；SEQ ID NO 2)和玉米 Y -生育酚甲基转移酶(p0060. coran49r :fis ；SEQ ID NO 15) (PCT公开W000/032757)以分子堆叠方式使用(后代具有两 个转基因相关的特性)。如下生成大豆中的玉米Y-生育酚甲基转移酶的种子特异性表达构建体。KS126 DNA(参见实施例1)用NotI进行线性化。5’突出端用T4多核苷酸激酶完全补齐，并用小 牛肠磷酸酶脱去磷酸。使用限制性酶DraI和SnaBI从EST克隆中包含玉米GTMT cDNA的 完整ORF的限制性片段，并将其与KS126载体连接。将连接产物导入大肠杆菌中。从重组 克隆中分离质粒DNA并用BamHI对其进行限制性消化。当用BamHI消化时生成2. SkbDNA 片段的质粒克隆包含玉米GTMT基因，其方向使转录物的5’末端接近KTI启动子的3’末端(有义方向)。将该质粒命名为KS325。其序列如SEQ ID NO 51所示。使用粒子轰击胚胎愈伤组织，用KS270 (参见实施例1)和KS325的质粒DNA生成
转基因大豆品系。KS270在617bp的大豆β -伴球蛋白启动子控制下提供大麦HGGT基因。HGGT转录 的聚腺苷酸化信 号来源于菜豆蛋白基因的终止子(来自菜豆Phaseolus vulgaris ；Doyle 等人(1986)J. Biol. Chem. 261 =9228-9238) 0该质粒也包含大豆ALS基因的抗磺酰脲类突 变体的cDNA，它处于1217bp的SAMS启动子的控制下。HGGT转录物的聚腺苷酸化信号得自 大豆ALS基因的终止子。KS325在2090bp的大豆Kti启动子控制下提供来自玉米的Y -生育酚甲基转移酶 基因。Y -生育酚甲基转移酶转录物的聚腺苷酸化信号得自Kti基因的终止子。KS325也提 供潮霉素B磷酸转移酶(HPT)抗性基因(Gritz等人(1983) Gene 25 179-188)，它处于来自 花椰菜花叶病毒的1408bp的35S启动子控制下(Odell等人(1985)Nature 313 :810_812)。 潮霉素抗性基因的聚腺苷酸化信号得自胭脂碱合酶基因的终止子，所述胭脂碱合酶基因来 自根癌农杆菌的Ti质粒的T-DNA。通过粒子枪轰击方法用KS270与KS325的质粒DNA转化大豆胚发生悬浮培养物 (Klein 等人(1987)Nature (London) 327 :70_73，美国专利公开 4，945，050)，该方法使用 BIORAD BI0LISTIC PDS1000/He仪。大豆植株的转化和再生利用了下列储备液和培养基储备液100X 硫酸盐储备液37. Og MgSO4. 7H20,1. 69g MnSO4. H20,0. 86gZnS04. 7H20, 0. 0025g CuSO4. 5H20IOOX 卤化物储备液:30. Og CaCl2. 2Η20，0· 083g ΚΙ,Ο. 0025gCoCl2. 6H20IOOX P, B, Mo 储备液18. 5g KH2PO4,0. 62g H3BO3,0. 025gNa2Mo04. 2H20IOOX Fe EDTA 储备液:3· 724g Na2EDTA, 2. 784g FeSO4. 7H202,4-D 储备液lOmg/mL维生素B51000X储备液10. Og肌醇，0. IOg尼克酸，0. IOg吡哆醇HC1，Ig硫胺。培养基(每升)SB196 上述储备液各 10mL，B5 维生素储备液 lmL，0. 463g (NH4) 2S04, 2. 83g KN03, ImL 2,4-D储备液，Ig天门冬酰胺，IOg蔗糖，pH5. 7。SB103 :lpk. Murashige&Skoog 盐混合物，ImL B5 维生素储备液，750mg MgCl2 六水 合物，60g麦芽糖，2g固化剂pH5. 7。向SB166 :SB103添加5g/L的活性炭而成。SB71-4 =Gamborg' s B5 盐，ImL B5 维生素储备液，30g 蔗糖，5g TC 琼脂，ρΗ5· 7。将大豆胚胎生成悬浮培养物培养于35mL液体培养基(SB196)，以制备用于转化的 组织，培养条件为摇床(150rpm)培养、28°C，并按16h昼/8h夜的周期提供荧光。通过将约 35mg组织接种至35mL的新鲜液体培养基，培养物每两周传代培养一次。在基因枪轰击过程中，可以使用纯化的1)完整质粒DNA ；或2)仅包含所关注的重 组DNA表达框的DNA片段。对于每十七次轰击转化，每种DNA质粒制备包含每碱基对1至90 皮克(Pg)的质粒DNA的85 μ L悬液。如下所述，两种重组DNA质粒均共沉淀至金颗粒上。将 悬液中的DNA加入50 μ L 20-60mg/mL 0. 6 μ m的金颗粒悬液中，然后与50 μ L CaCl2 (2. 5Μ)和20 μ L亚精胺(0. 1Μ)合并。混合物振荡混勻5秒钟，用微离心机离心5秒钟，去除上清 液。用150 μ L 100%乙醇清洗包覆了 DNA的金颗粒一次，再次振荡并用微离心机离心，然后 重悬于85 μ L无水乙醇中。然后将5 μ LDNA包覆的金颗粒上样至每一大载物盘。将约150至250mg已培养两周的悬浮培养物置入空的60mmX 15mm皮氏培养皿中， 并用移液器将残留的液体自上述组织吸走。将上述组织置于距维持屏约3. 5英寸处，每一 盘组织轰击一次。膜破裂压力设为650psi，小室抽真空至-28英寸汞柱。对三个 盘进行轰 击，轰击之后将来自每一盘的组织分为两份，放回含液体培养基的瓶中，并如上文所述进行 培养。轰击后7天，将上述液体培养基替换为含30_50mg/L潮霉素的新鲜SB196培养基。 上述选择性培养基随后每周或每两周更新一次。轰击后七周，观察到鲜绿色的转化组织从 坏死或萎黄的未转化胚胎生成块中长出。将绿色组织分离，接种至6孔培养皿的各个孔中， 以产生新的、克隆繁殖的转化的胚胎生成悬浮培养物。由此，将每一新的品系处理为一个单 独培养孔中的独立转化事件。然后，可以通过传代培养将上述悬液作为集中处于未成熟发 育阶段的胚胎进行悬浮培养，或者也可以通过各个体细胞胚的熟化和萌发，再生为整株的 植物。在各细胞培养孔中培养两周后，将转化的胚胎生成块自液体培养基中移出，并置 于不含激素或抗生素的固体培养基(SB166)上培养一周。胚胎于26°C在荧光和白炽光以 16小时昼/8小时夜周期混合照射下培养。一周后，将培养物转入SB103培养基，并在相同 的生长条件下再培养3周。如此培养四周后，体细胞胚变得适宜萌发，此时将其从成熟培养基中移出，并置于 空的皮氏培养皿中干燥1至五天。然后将干燥的胚胎种植于SB71-4培养基中，胚胎可在上 述相同的光照和温度条件下于其中萌发。萌发的胚胎被转入无菌土壤中生长至成熟，以产 生种子。通过KS270和KS325质粒共转化制备了总共十八个事件。如下分析每个事件的五 个Tl种子的母育酚组成。从种子的子叶组织中获取种子薄片(大约5-15mg组织)。该薄 片用100 μ L庚烷提取2小时。如实施例3所述，用HPLC分析定量生育酚和生育三烯酚。生成并分析总计十八个事件(参见表13)。表 13用KS270和KS325生成的事件的Tl种子薄片的母育酚组成(总生育酚(tocph.) 百分比和牛育三烯酚(toct.)百分比)α - β- y - Δ- α- β- γ - Δ- tocph. toct.事件IDtocph. tocph. tocph. tocph. toct. toct. toct. toct. (ppm) (ppm)4652. 1. 10. IA 1 1 2 3 2 1 44 46 167 21754652. 1. 10. IB 17 2 80 0 0 0 0 0 240 04652. 1. 10. IC 2 1 3 0 2 1 44 47 279 47114652. 1. 10. ID 11 1 88 0 0 0 0 0 310 04652. 1. 10. IE 2 1 4 0 4 2 42 46 317 40704652. 1. 11. IA 1 0 3 0 0 0 44 51 156 3463
4652. 1. 11. IB114000474712721334652. 1. 11. IC10400050469619004652. 1. 11. ID20278000002700 4652. 1. 11. IE105000533920126004652. 1. 2. IA103010425210122044652. 1. 2. IB103010465014939234652. 1. 2. IC111880000019204652. 1. 2. ID103010445115333104652. 1. 2. IE003010415410928314652. 1. 7. IA640038414724020514652. 1. 7. IB640042403516915974652. 1. 7. IC222760000027304652. 1. 7. ID650035453621417564652. 1. 7. IE550032522540036704652. 1.8. IA162830000017504652. 1.8. IB004000474811524294652. 1. 8. IC172820000016004652. 1.8. ID104000455011422774652. 1.8. IE104000514410019624652. 2. 10. IA004000425312422924652. 2. 10. IB004000474714727674652. 2. 10. IC105000484622335024652. 2. 10. ID91900000025404652.2. 10. IE112870000026704652. 2. 11. IA111870000016404652.2. 11. IB650037500119716044652. 2. 11. IC760036500046629504652.2. 11. ID121860000020904652.2. 11. IE670032550044029734652. 2. 13. IA101880000024304652. 2. 13. IB101880000023004652. 2. 13. IC152820000015504652.2. 13. ID111880000028404652.2. 13. IE111880000022904652. 2. 14. IA851410000036004652. 2. 14. IB4400314351226727964652. 2. 14. IC9600 40 44 0134218554652. 2. 14. ID861300 000025414652. 2. 14. IE5400 32 58012622495
4652. 2.6. IA680032540035321924652. 2.6. IB6514 00156003781024652. 2.6. IC87003352004882762
4652. 2.6. ID660033530139929054652. 2.6. IE63160015600358954652. 2. 7. IA214011424920527794652. 2. 7. IB214021434817626604652. 2. 7. IC113021454811021924652. 2. 7. ID114021425017026794652. 2. 7. IE316021484019918894652. 2.9. IA54002831112225224954652. 2.9. IB6500334051121416144652. 2.9. IC4230178372921221484652. 2.9. ID54003033101924525214652. 2.9. IE42101914243619422124652. 3. 15. IA8514 10000021304652. 3. 15. IB762300000037904652. 3. 15. IC132860000018304652. 3. 15. ID772200000116714652. 3. 15. IE782110000024804652. 3. 17. IA870036471136120294652. 3. 17. IB850042441136224194652. 3. 17. IC18100034370147111984652. 3. 17. ID860038451133419414652. 3. 17. IE970038450127613924652. 3. 3. IA440037415927229054652. 3. 3. IB540037453628227144652. 3. 3. IC860036481241626084652. 3. 3. ID440036531223323904652. 3. 3. IE55003143 512 34433194652. 3. 5. IA18280000 00 16104652. 3. 5. IB21277000 00 19204652. 3. 5. IC44002228 1329 20323154652. 3. 5. ID18280000 00 19104652. 3. 5. IE64102827 1420 29624504652. 3.6. IA16282000 00 18204652. 3.6. IB75004343 11 32824514652. 3.6. IC75004144 11 29220604652. 3.6. ID96004142 11 2881654
4652.3. 6.1E15284000002440
4652.3. 8.1A30466000001370
4652.3. 8.1B24373000001800
4652.3. 8.1C16282000001960
4652.3. 8.1D30368000002050
4652.3. 8.1E44649000001940来自十五个事件的种子薄片包含显著水平的生育三烯酚。这些事件中的十个 事件也包含显著水平的(> 150ppm) a-和生育三烯酚。事件4652. 1.7. 1E(艮口， (400+3670) X0. 32 = 1302)中的种子薄片中的a -生育三烯酚含量达到1300ppm。就若干 个事件而言，大于40%的总生育酚和生育三烯酚含量是a-生育三烯酚。种子薄片不提高 完整种子的油组成的全面情况。因此，如实施例2所述对来自选择事件的完整T1种子进行 母育酚分析(参见表14)。表 14KS270和KS325牛成的事件的T1种子的母育酚会目成(总牛育酚(tocph.)百么Hh 和牛育三烯酚(toct.)百分比)a -y -A.-a - 旦-y- A- tocph. toct.
事件ID
tocph.tocph.tocph. tocph. toct.toct.toct.toct.(ppm)(ppm)
4652.1.7. 1A540031453102612355
4652.1.7. IB54003644382142162
4652.2.11. IB45002959122132028
4652.2.11. 1C67002462002241414
4652.2.14. 1C66003053132451694
4652.2.6. 1C79002557023201636
4652.2.6. ID78002757013271986
4652.3.17. IB56002854262101688
4652.3.17. ID76003151142381612
4652.3.6. IB54003651122272077
4652.3.6. 1C65003550122381802
事件 4652. 1. 7.1达到了最高的完整种子的a-生育=三烯酚含量(847ppm)。就进
行完整种子母育酚分析的六个事件而言，至少24%和最多36%的总生育酚和生育三烯酚 含量来源于a-生育三烯酚。在所有六个事件中的和A-生育三烯酚含量与在用大豆 GTMT序列进行的相似实验中生成的最好转基因事件(实施例2)相比处于非常低的水平。 玉米GTMT提供了用于在大豆种子发育过程中甲基化和A -生育三烯酚的优异的酶。实施例8在拟南芥中通过转基因表达大麦HGGT和玉米Y _生育酚甲基转移酶来生产 a-生育三烯酚如下生成用于在拟南芥中共表达大麦尿黑酸香叶基香叶基转移酶和玉米生育酚甲基转移酶的构建体。玉米TMT表达盒由Kti启动子GTMT基因和Kt i终止子构成， 它通过用AscI进行完全消化从KS325(参见实施例7)中以3. 6kb片段的形式切除。此 DNA片段与之前用AscI部分消化过的线性化SC38DNA连接。使用标准技术回收重组克隆 和质粒DNA。将此新质粒称为KS325xSC38。通过用Sail部分消化质粒从其中切除一个包 含大麦HGGT和玉米GTMT基因表达盒的6. 7kb DNA片段，然后将其连接到用Sail线性化的 pZBL120(参见实施例 1)以生成 pZBL120xKS325xSC38。植物转化载体 pZBL120xKS325xSC38 的T-DNASEQ如ID NO 52所示。使用pZBL20xKS325xSC38如实施例1所述生成转基因拟南 芥品系。如实施例1所述生成总计38个品系并用HPLC分析测定T2种子的生育色原烷醇 含量(参见表15)。表 15表汰大寿HGGT禾口絲Y-辅_雜_胃剛__赫口口口_ T2 MM^WM^ (tocph.) g^HK^n^WHMm (toct.) g^HK )a -y -A-a -y -A-tocph.toct.
事件ID
tocph. tocph. tocph. tocph. toct. toct.toct.toct.(ppm)(ppm)
3824114151271244382
173311250040327382
3127114149081421577
3301449070489626
3424112149392180300
3232112149240347418
228118148030254271
3524115148281245348
6233047000165148
121771477162388987
2926113147282318461
2529114147261327407
1525122147220350374
1827116146081344429
2726116145281335435
3328116145071214246
2029116145081330385
132817144091356419
26271201400111284312
3035117140071400354
2131022138081329282
22141111383294358965
138021134060422286
531028033080168117
2849119029020240108
1022039129091260160
113094120003778
2369030100004002
41098100002910
717082100003110
81098100003470
91098200004170
1465034100004260
161098200002660
191098100003790
2468130100003230
3669130100003050
371097200002620
野生型1098100001730
分析38个事件，其中26个显示大于lOOppm的生育二.烯酚，其含量高达990ppm,
在这些26个事件中a -生育三烯酚占至少28%和最多51%的总生育色原烷醇含量。在最 好事件(事件ID 12)的T2种子中，a-生育三烯酚含量达到640ppm(即，(388+987) X 0. 47 =646)。迄今所述的T2材料仍包含25%野生型种子。事件3、12、29、31和32在选择培养 基上发芽。当在选择培养基上生长时，所有六个事件的T2种子生产25%的卡那霉素敏感野 生型种子。每个事件移植15个卡那霉素抗性幼苗到土壤中，允许它们自交繁殖并生长至成 熟。每个事件鉴定三个T3种子，所述种子不再分离卡那霉素敏感幼苗。该种子材料如上所 述进行生育色原烷醇定量(参见表16)。表 16表达大麦HGGT和玉米Y -生育酚甲基转移酶基因的转基因拟南芥品系的纯合T3 种子材料的母育酚组成(总生育酚(tocph.)百分比和生育三烯酚(toct.)百分比)a -y -A-a -y -A-tocph.toct.
事件ID
tocph. tocph. tocph. tocph. toct. toct.toct.toct.(ppm)(ppm)
32912161231229464
33312158230493849
33212158241307545
122422159741407971
12195115514423611031
122139153751441880
292322058672345943
292823053482320647
2917220517155219770
322121064841213675
32222106364291841
32242216154346865
31212226534300795
31223116643213562
31213226345297785在五个事件的纯合T 3种子材料中，a -生育三烯酚占至少51%和最多65%的总 生育色原烷醇含量。在一个事件(事件ID 12)的纯合T3种子中，a-生育三烯酚含量达 到810ppm( BP, (407+971) X0. 59 = 813)。在所有五个事件中的、生育三烯酚含量与在用 大豆GTMT序列进行的相似实验中生成的最好转基因事件(实施例1)相比处于非常低的水 平。玉米GTMT提供了用于在拟南芥种子发育过程中甲基化生育三烯酚的优异的酶。实施例9cDNA文库的制备和cDNA克降的分离和测序cDNA文库可通过许多可用的方法中的任一种制备。例如，通过首先根据生产商的 说明书(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)制备 Uni_ZAP XR 载体中的 cDNA 文 库，可将cDNA引入质粒载体中。根据Stratagene提供的说明书，将Uni-ZAP XR文库转换 成质粒文库。当转换的时候，将把cDNA插入序列包含于质粒载体pBLUESCRIPT 中。此 外，可使用T4连接酶(New England Biolabs)将cDNA直接导入预切过的Bluescr ipt II SK(+)载体(Stratagene)中，随后按照制造商规程(GIBCO BRL Products)转染DH10B细 胞。一旦cDNA插入序列处于质粒载体中，则从随机选取的含重组pBLUESCRIPT 质粒的细 菌菌落制备质粒DNA，或者用对插入的cDNA序列旁侧的载体序列特异性的引物，通过聚合 酶链式反应扩增插入的cDNA序列。将扩增的DNA插入序列或质粒DNA在引物标记法测序 反应(dye-primer sequencing reaction)中进行测序，以产生部分cDNA序列(表达序列 标记或“EST，，；参见 Adams 等人，1991，Science 252:1651-1656)。用 Perkin Elmer Model 377荧光测序仪分析所得的EST。用改进的转座规程产生全长插入序列(FI S)数据。从归档的甘油原种作为单一 菌落回收确定了 FIS的克隆，并通过碱性裂解分离质粒DNA。将分离的DNA模板在基于PCR 的测序反应中与载体引物M13正向和反向寡核苷酸反应并上样至自动化的测序仪上。通过 与对其进行FIS查询的初始EST序列进行序列比对来确认克隆鉴定。将确认的模板通过基于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Tyl转座因子 (Devine 和 Boeke，1994，Nucleic Acids Res. 22 :3765_3772)的 Primer Island 转座试剂 盒(PE Applied Biosystems, FosterCity, CA)进行转座。该体外转座系统在整个一组大 DNA分子中随机地放入独特的结合位点。随后将转座的DNA用于通过电穿孔转化DH10B电 感受态细胞(Gibco BRL/Life Technologies, Rockville, MD)。转座因子含有另外的可选 标记(称为 DHFR;Fling 和 Richards，1983，NucleicAcids Res. 11 :5147_5158)，使得能在 琼脂平板上仅双重筛选含有整合的转座子的那些亚克隆。从每次转座反应随机地选择多个 亚克隆，通过碱性裂解制备质粒DNA，并用对转座子内的结合位点特异性的独特引物从转座 事件位点向夕卜进对亍测序(ABI PRISM dye-terminator ReadyReactionmix)。收集序列数据(ABIPRISM Collections)并用 Phred 和 Phrap (Ewing,等人，1998，Genome Res. 8 175-185 ；Ewing 禾P Green, 1998，Genome Res. 8 186-194)进行装配。 Phred是一种公用软件程序，该程序再次读取ABI序列数据，再次调出(recall)碱基，赋质 量值，并将碱基序列(base call)和质量值写入可编辑的输出文件中。Phrap序列组装程序 使用这些质量值来增加组装的序列重叠群的准确度。通过Consed序列编辑器(Gordon等 人，1998，Genome Res. 8 195-202)检查装配序列。在一些克隆中，cDNA片段可对应基因的3’ -端的一部分并且不会涵盖整个开放 阅读框。为了获得上游信息，使用两种不同规程中的一者。这两种方法中的第一种方法导 致产生含有所需基因序列的部分的DNA片段，而第二种方法导致产生含有整个开放阅读框 的片段。这两种方法均使用两轮PCR扩增以从一个或多个文库获得片段。有时基于以前的 知识(特定的基因应该存在于某些组织中)选择文库，有时则进行随机地选择。获得相同 基因的反应可平行地在若干文库中进行，或者在文库池中进行。文库池通常用3至5个不 同的文库制备并且使其归一化而成为一致的稀释度。在第一轮扩增中，两种方法均使用载 体特异性的(正向)引物，同时还使用基因特异性的(反向)引物，该正向引物对应位于克 隆5’ -端处的载体的一部分。第一种方法使用与已知基因序列的一部分互补的序列，而第 二种方法使用与3’ -非翻译区(也称为UTR)的一部分互补的基因特异性引物。在第二轮 扩增中，两种方法均使用套式引物组。按照生产商的说明书，用市售试剂盒将所得DNA片段 连接进pBLUESCRIPT 载体中。该试剂盒选自可得自包括Invitrogen (CARLSBAD，CA)、 PROMEGA BIOTECH (MADISON, WI)和 GIBCO-BRL (GAITHERSBURG，MD)在内的一些供应商的许 多试剂盒。如上所述，将质粒DNA通过碱性裂解方法分离并进行测序和用PHRED/PHRAP进 行装配。实施例10cDNA克隆的鉴定编码亚铁螯合酶的cDNA 克隆能通过BLAST (Basic Local AlignmentSearch Tool ； Altschul等人(1993) J. Biol. 215 403-410 ；还可参见国立卫生研究院国家医学图书馆的 国家生物技术信息中心的万维网址上对BLAST算法的解释)进行鉴定，寻找与BLAST "nr" 数据库中所包含氨基酸序列(包括所有非冗余GenBank⑶S翻译序列、源自3-维结构 Brookhaven蛋白质数据库(Protein Data Bank)、SWISS-PR0T蛋白质序列数据库的最新 的主要版本、EMBL和DDBJ数据库的序列)的相似性。在所有的阅读框中翻译来自克隆的 DNA 并用 NCBI 提供的 BLASTX 算法(Gish 和 States, 1993，Nat. Genet. 3 266~272)比较与 ‘‘nr”数据库中包含的所有可公开获得的蛋白质序列的相似性。采用国家生物技术信息中 心(NCBI)提供的BLASTP算法，分析cDNA序列编码的多肽与包含在“nr”数据库中的所有 可公开获得的氨基酸序列的相似性。为方便起见，通过BLAST计算仅仅偶然观察到cDNA序 列与所搜索的数据库中所包含序列的匹配的P值(概率)或E值(期望值)，其在本文报导 为“pLog”值，它代表所报导的P值或E值的负对数。因此，pLog值越大，cDNA编码的序列 和BLAST的“匹配”代表同源蛋白的可能性就越大。 EST序列能与如上所述的Genbank数据库进行比较。通过使用BLASTn算法 (Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res. 25 :3389_3402.)对杜邦专利数据库比较具有序 列同源共有区域或重叠区域的核苷酸序列，可找到含更5'端或3'端序列的EST。在两个 或更多个核酸片段之间存在共有或重叠序列时，该序列可装配成单一的连续核苷酸序列，从而使最初的片段在5'或3'初始方向上延伸。一旦确定了最5'的EST后，可以如上所 述，通过全长插入序列来确定其完整的序列。可用tBLASTn算法，通过将已知基因(来自专 有来源或公开数据库的已知基因)的氨基酸序列对EST数据库进行比较，可找到属于不同 物种的同源基因。tBLASTn算法对所有6个阅读框都翻译了的核苷酸数据库进行氨基酸查 询的搜索。该搜索允许不同物种之间的核苷酸密码子使用的差异，并且允许密码子简并。实施例11表ffi编码2-甲某-6-棺某苯酉_享甲某转cDNA克降制备提供来自苦瓜(Momordica charantia)的发育种子组织的mRNA的cDNA文库， 并鉴定编码2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶(MC VTE3)的cDNA克隆fdsln. pk003. e5。 在fdsln. pk003. e5中的cDNA插入序列的蛋白编码区核酸序列如SEQ ID N0:53所示。SEQ ID NO :53编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:54所示。推定成熟蛋白的氨基酸序列， 即，减去转运肽(SEQ ID NO 54的氨基酸1-47)，如SEQ ID NO 70所示。表17中显示的是SEQ ID NO :54和各个指示多肽的BLASTP结果，表达为E值的 pLog。将其中已经移除了推定转运肽的多肽表示为“成熟体”。成熟拟南芥的2-甲基-6-植 基苯醌醇甲基转移酶多肽(SEQ IDN0 :67)的氨基酸序列得自Cheng等人(2003)Plant Cell 15 :2343-2356。表17也显示SEQ ID NO :54和各个指示的氨基酸序列之间的序列同一性百 分比值表 17来自苦瓜的2-甲基-6-棺基苯醌醇甲基转移酶(SEQ ID NO 54)的BLAST结果和 序列同一件百分比 SEQ ID NO :70是推定的来自苦瓜的成熟2_甲基_6_植基苯醌醇甲基转移酶的氨 基酸序列。表18显示SEQ ID NO :70和各个指示的氨基酸序列之间的序列同一性百分比 值表 18
H有来自苦瓜的成孰2-甲某-6-棺某苯酉_享甲某转移_ (SEQ IDN0 70)的序歹1丨 同一件百分比 图 3A-3C 给出 SEQ ID NO :54、61、62、63、64、65、66、67、68、69 和 70 所示的 2-甲
基-6-植基苯醌醇甲基转移酶蛋白的氨基酸序列的比对结果。图4给出图3A-3C中给出的 每对序列的序列同一性百分比和趋异值。用LASERGENE 生物信息计算包(DNASTAR Inc.，Madison, WI)的MEGALIGN
程序进行序列比对和同一性百分比计算。使用Clustal W比对方法，用默认参数进行序列 比对。多重比对的默认参数是空位罚分=10，空位长度罚分=0. 20，延迟发散序列=30%， DNA转换权重=0. 50。成对比对的默认参数为空位罚分=10. 0，空位长度=0. 10。实施例12用大麦HGGT、玉米、-生育甲基转移酶和苦瓜2_甲基植基苯醌醇甲基转移酶 转化的大豆体细胞胚芽的母育酚组成EST 克隆 fdsln. pk003. e5 来源于苦瓜(Momordica charantia)发育种子组织 的cDNA文库，它编码使用CLUSTAL W比对方法，与拟南芥(Plant Cell (2003)，15 (10)， 2343-2356) VTE 3基因产物具有83%序列同一性的蛋白。cDNA插入序列中的开放阅读框 DNA序列如SEQ IDN0:53所示。命名为“MC VTE3”的苦瓜2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转 移酶的预测氨基酸序列如SEQ ID N0:54所示。通过PCR生成DNA片段。使用寡核苷酸引 物从质粒DNA中扩增0RF。在该反应中使用的有义(正向)和反义(反向)寡核苷酸引物 序列如下5，-CACCATGGCTTCTGCAATGCTCAATGG-3，(SEQ ID NO 55)和
5，-CTCCCCAACTCAGATTGGTTGCCCTTC-3，(SEQ ID NO :56)。使用TAQ聚合酶进行PCR扩增，使用EST克隆的质粒DNA作模板。如制造商规 程所述，将该PCR反应的产物通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化并亚克隆到pENTR/D- T0P0 (Invitrogen )中。使用限制性酶AscI和NotI切除包含完整开放阅读框的1042bp片段。 末端用T4聚合酶(INVITROGEN ，USA)按照制造商说明书完全补齐，并与用NotI线性化 的、补齐的PKR561载体连接。通过限制性酶消化分析重组克隆以鉴定连接产物，其中起始 密码子接近于pKR561(有义方向)中的膜联蛋白启动子。具有此取向的质粒自此以后称作pKR561-MCVTE3(SEQ ID NO :57)。以前已经构建载体pKR561如下。载体pKR268(SEQ ID NO 58)以前描述于美国 专利公开7，256，033 (其内容以引用方式并入本文)，它包含NotI位点，该位点侧接大豆膜 联蛋白启动子(美国专利公开7, 129，089)和BD303，终止区(Ann/NotI/BD30盒)。载体 pKR145 (SEQ ID NO 59)以前描述于PCT公开W0 2004/071467 (其内容以引用方式并入本 文)，它包含潮霉素B磷酸转移酶基因[Gritz，L.和Davies，J. (1983)Gene25 :179_188]，该 基因侧接T7启动子和转录终止子(T7pr0m/hpt/T7term盒)、和细菌复制起点(ori)，用于 在大肠杆菌中的选择和复制。此外，PKR145包含侧接35S启动子[Odell等人，(1985) Nature 313 :810-812]和 N0S 3'转录终止子[D印icker 等人，(1982) J. Mol. Appl. Genet. 1 561 570] (35S/hpt/N0S3 '框)，从而可用于在大豆中进行选择的潮霉素B磷酸转移酶基因。 PKR268的BsiWI片段包含Ann/NotI/BD30盒，将其克隆到pKR145的BsiWI片段中，该片段 包含 35S/hpt/N0S3，盒)以制备 pKR561 (SEQ ID NO 60)。转基因体细胞胚的牛成为了在大豆体细胞胚芽中共表达HV HGGT、ZM GTMT(VTE4)和MCVTE3基因，如下 所述用KS325xSC38(参见实施例8)和pKR561_MCVTE3的混合物共轰击大豆组织。在混合 DNA之前，用EcoRI和Bglll消化KS325xSC38以失活赋予潮霉素抗性的载体组分。同样的 用 BamHI 线性化 pKR561_MCVTE3。KS325xSC38 和 pKR561_MCVTE3 以 10 1 的比率组合并 用于如下所述转化大豆体细胞胚芽。在所得DNA混合物中，线性化的pKR561-MCVTE3DNA片 段提供完整的潮霉素抗性表达盒，该表达盒由CaMV 35S启动子、潮霉素磷酸转移酶基因和 nos终止子构成。培养条件将大豆胚芽发生悬浮培养物(cv. Jack)培养于35mL液体SB196培养基(参见下 文)，培养条件为150rpm摇床培养、26°C和按16 8h昼/夜光周期以60-85 y E/m2/s光 强用白色冷光荧光灯照射。每7天至两周，通过将约35mg的组织接种至35mL新鲜的液体 SB196，对培养物进行传代培养(优选的传代培养间隔时间为7天)。用大豆表达质粒对大豆胚胎生成悬浮培养物进行的转化，通过的是基因枪轰击的 方法(KLEIN 等人，NATURE 327 :70 (1987))，所有转化均用 DUP0NT BI0LISTIC PDS1000/ HE设备(氦气型)进行。大豆胚胎牛成悬浮培养物的诱导每月诱导大豆培养物两次，每次诱导之间相隔5-7天。将种植45-55天后的存活 大豆植株的带有未成熟种子的豆荚摘下，将其去壳后置入灭菌后的Magenta盒子中。将大 豆种子置于加入了 1滴象牙皂的5%次氯酸钠溶液(即95mL灭菌蒸馏水加上5mL次氯酸 钠和1滴象牙皂，混勻)中摇动消毒15min。用两瓶1升瓶子的无菌蒸馏水清洗种子，将小 于4mm的种子分别置于显微镜载片上。将上述种子的较小一端切开，将子叶从种皮中挤出。 子叶被转入含SB199培养基的平版(每板25-30个子叶)培养2周，然后转入SB1培养2-4 周。用纤维带包裹平板。此次之后，将次级胚切下，并置于SB196液体培养基中7天。用于轰击的DNA的准备采用包含所关注的基因和选择性标记基因的完整质粒或质粒DNA片段进行轰击。
将一份包含lmg金颗粒的50 ii g灭菌水等份加入5 ii L的1 ii g/ ii LDNA溶液(如前所述制备的DNA片段)、50 ii L的2. 5M CaCl2和20 y L的0. 1M亚精胺中。将混合物用调至 4档的旋涡振荡器脉冲振荡5次，然后用台式微量离心机离心5秒。用150PL 100%乙醇 洗一次，然后在85 iiL 100%乙醇中超声处理使沉淀块悬浮。向上述BI0LISTIC PDS1000/ HE设备的每个飞盘中装入五P LDNA悬液。每一轰击反应(即每个盘)的5 y L等份中包含 约0. 058mg金颗粒。组织制备和用DNA轰击将约100_150mg 7天的胚胎悬浮培养物置于空的60X 15mm无菌皮氏培养皿中，并 将所述培养皿置入空的150X25mm皮氏培养皿。组织在每个盘轰击1次，膜破裂压力设为 650psi，小室抽真空至27-28英寸汞柱。组织置于距维持/终止屏约2. 5英寸处。转化胚的诜择用潮霉素作为选择性标记，进行转化胚的选择。具体而言，轰击后的组织被置入新 鲜的SB196培养基，如前所述进行培养。轰击后6至8天，将上述SB196替换为包含30mg/ L潮霉素的新鲜SB196。选择性培养基每周更新一次。选择后四至六周，观察到绿色的转化 组织从坏死的未转化胚胎发生块中长出。将绿色组织分离，接种至多孔板，以产生新的、克 隆繁殖的转化的胚胎生成悬浮培养物。胚胎的成熟转化的胚胎生成块在白色冷荧光灯(Phillips cool whiteEconowatt F40/CW/ RS/EW)和农用灯泡(Phillips F40 Agro) (40 瓦)以 16 8h 光周期和 90-120 ii E/m2s 光 强照射下，用SB196于26°C下培养一至三周。在此之后将胚芽簇移除到固体琼脂培养基 (SB166)中培养1周，然后传代培养至SB103培养基中培养3周。或者，将胚胎块移入盛于 250mL锥形瓶中的35mL SB228 (ShaM)液体培养基，培养2_3周。组织于SB228中的培养条 件为，130rpm摇床培养、26°C和按16 8h昼/夜光周期以60-85 y E/m2/s光强用白色冷 光荧光灯照射。在此期间，将胚胎个体自培养块移出，并如上文所述筛选其脂肪酸组成的变 化。培养基配方SB 196-FN Lite液体增殖培养基(每升)包含以下成分(每升)10mL MS FeEDTA-100x 储备液 1 ；10mL MS 硫酸盐 _100x 储备液 2 ； 10mL FN Lite Halides-100x 储备 液 3 ；lOmL FN Lite P，B，Mo_100x储备液4 ;1. OmL B5 维生素(lmL/L) ；l.OmL 2，4_D(10mg/ L 终浓度)；2. 83g KN03 ;0. 463g(NH4)2S04 ;1.0g 天冬酰胺；lOg 蔗糖(1%)；调节至 pH5.8。FN Lite储备液编号1-4，如下制备 储备液Number 1_MS Fe EDTA lOOx储备液包含以下成分(每升)3. 724g Na2EDTA (首先加入，暗处搅拌溶解)；和2. 784g FeS04_7H20。储备液编号2-MS Sulfate 100x储备液包含以下成分(每升)37. 0g MgS04_7H20 ； 1. 69g MnS04-H20 ；0. 86g ZnS04_7H20 ；禾口 0. 0025gCuS04_5H20。储备液编号3-FN Lite Halides lOOx储备液包含以下成分(每升)30. Og CaCl2-2H20 ；0. 083g KI ；禾口 0. 0025g CoC12_6H20。储备液编号4-FN Lite P，B，Mo lOOx储备液包含以下成分(每升):18. 5g KH2P04 ； 0. 62g H3BO3 ；和 0. 025g Na2Mo04-2H20。SB1固体培养基包含以下成分(每升)1个包装的MS盐(Gibco/BRL-Cat.No. 11117-066) ； lmL B5 维生素 1000X 储备液；31. 5g 葡萄糖 2mL 2，4_D (20mg/L 终浓度)； 调节至PH5.7 ；和8g TC琼脂。SB199固体培养基包含以下成分(每升)1个包装的MS盐(Gibco/BRL-Cat. No. 11117-066) ； lmL B5 维生素 1000X 储备液；30g 蔗糖；4ml 2，4-D (终浓度 40mg/L)调节 至 PH7.0 ；和 2gmGELRITE 。SB 166固体培养基包含以下成分(每升)1个包装的MS盐(Gibco/BRL-Cat. No. 11117-066) ； lmL B5维生素1000X储备液；60g麦芽糖；750mg MgCl2六水合物5g活性 炭；调节至 pH5. 7 ；和 2g GELRITE 。SB 103固体培养基包含以下成分(每升)1个包装的MS盐(Gibco/BRL-Cat. No. 11117-066) ； lmL B5维生素1000X储备液；60g麦芽糖；750mg MgC12六水合物；调节至 PH5.7;和 2g GELRITE 。SB 71-4固体培养基包含以下成分(每升)1瓶Gamborg's B5盐w/蔗糖(Gibco/ BRL-Cat. No. 21153-036)；调节至 pH5. 7 ；和 5g TC 琼脂。2，4-D 储备液从 PHYT0TECHN0L0GY LABORATORIES Cat. No. D 295-获取预制的 溶液，浓度为lmg/mL。B5维生素储备液包含以下成分(每100mL) :10g肌醇；100mg烟酸；100mg盐酸 吡哆醇；和lg硫胺素。若溶解不够迅速，可将溶液用热搅拌器加以微热。等分试样贮存 于-20°C下。SB 228-大豆组织分化与成熟(SHaM)包含以下成分(每升)600ml DDI H20 ； 100ml FN-Lite Macro Salt for SHaM 10X ； lml MSMicro Salts lOOOx ； 10ml MS FeEDTA lOOx ；6. 82ml CaCl lOOx ；lml B5 维生素 lOOOx ;0. 149g L_ 甲硫氨酸；30g 蔗糖；30g 山梨 醇；调整体积至900mL调节pH至5. 8 ；高压灭菌。向冷却后的培养基(彡30C)加入110mL 4%谷氨酰胺(终浓度30mM)。加入谷氨酰胺后，终体积将变为1010mL。因谷氨酰胺降解相 对迅速，可能最好在即将使用前加入培养基。培养基在谷氨酰胺加入后2周过期；无谷氨酰 胺的基本培养基能保存更长时间。FN-lite Macro for SHAM 10X-储备液 #1 包含以下成分(每升) 4.63g(NH4)2S04(硫酸铵)；28. 3g KN03 (硝酸钾)；3. 7g MgS0/7H20 (七水硫酸镁)；1.85g KH2P04(磷酸二氢钾)；加水至终体积；高压灭菌。MS Micro 1000-储备液 #2 包含以下成分(每 1 升)6. 2gH3B03 (硼酸)；16.9g MnS04*H20 ( 一水硫酸锰)；8. 6g ZnS04*7H20 (七水硫酸锌)；0. 25g Na2Mo04*2H20 ( 二水钼酸 钠)；0. 025g CuS0/5H20(无水硫酸铜)；0. 025g CoC12*6H20 (六水氯化钴)；0. 8300g KI (碘 化钾)；加水至终体积并高压灭菌。FeEDTA 100X-储备液#3包含以下成分(每升):3. 73gNa2EDTA (EDTA钠)；在加入 铁离子前EDTA必须完全溶解；2.78g FeS0/7H20(七水硫酸铁)；加水至终体积并高压灭菌。 此溶液对光敏感。盛装的瓶子应以铝箔包裹以避光。Ca 100X-储备液#4包含以下成分(每升)44g CaCl/2H20 ( 二水氯化钙)；加水 至终体积并高压灭菌。B5维生素1000X-储备液#5包含以下成分(每升)10g硫胺素*HC1 ； lg烟酸；lg 吡哆素*HC1 ；100g肌醇；加水至终体积；冷冻保存。
4%谷氨酰胺-储备液#6包含以下成分(每升)900ml DDI水加热至30°C ；40g L_谷氨酰胺；边搅拌边逐渐加入并施以微热。温度勿超过35°C。加水至终体积。过滤除菌 并冻存。在31°C水浴中热解冻储备液以令结晶完全溶解。母育酚和油分析在液体成熟培养基SB228(SHaM)中培养两周后收集体细胞胚。制备三i^一个事 件。特定植株系中产生的所有胚胎均批量收集，并处理如下。将胚胎置于干冰上或-80°C冰 箱中冷冻两小时，然后冷冻干燥48h。用genogrinder 瓶(1/2〃 X2"聚碳酸酯)和钢珠(SPEX Centriprep (Metuchen, N. J.，U. S. A.)将干燥后的胚胎研磨为细粉。研磨时间为30秒，振动频率为1450次/分钟。 就每个事件而言，称量大约30mg组织，置于Eppendorf管中，每个样本加入5 u L生育酚醋 酸酯(3. 79ng u L—1)作为内部标准品。上述组织在室温下用200 y L庚烷持续摇动萃取2h。 通过离心和过滤清除庚烷提取物，如实施例3所述用HPLC分析10uL提取物。母育酚数据概述于表19中。表 19用KS325xSC38和dKR561_MCVTE3其转化牛成的大豆体细胞胚芽的母育酚组成 (总牛育酚(tOCPh.)百分比和牛育三烯酚(toct.)百分比)
0705]a -y-A-a --y-A-tocph. toct0706]事件IDtocoph.tocoph.tocoph.tocoph.toct. toct. toct. toct.(ppm)(ppm)0707]1917100783l024711230708]1119000772l031713280709]28273005711l01613700710]29306104716l02624540711]1317004218l13024970712]7177813525261994110713]233238134101032443260714]311833134141892015860715]256220327102841900716]12243292258532251580717]301842422413871842040718]1750160707011826690719]151311246242201864270720]141516664051241300721]8511254250211886420722]5711543051201895080723]4611342054192246920724]1321652045391489410725]2740130208011758320726]20601551037351714720727]2552162102315255162
95038310439210241
326088410101653
267089300102222
185089400103006
1660804081028732
2211080600202387
109084500102664
2110940054321651002
38186400102253
666527200102561
249820000003610 如下测量庚烷提取物的油浓度。25 P L提取物与脂肪酸甲酯如下进行反应。将lmL 的25%甲醇钠储备液加入到24mL HPLC级甲醇中。甲醇钠保存于惰性气体中。将5 ii L 的 17:0 TAG (Nu-Chek Prep, Elysian,MN, USA)储备液(lOmg/mL)同 25 ii L 的庚烷组织萃取物一起加入到玻璃培养管中，并加入500 yL的甲醇钠。样品在50°C水 浴中反应15min。令样品冷却至室温，加入lmL 1M NaCl，然后短暂混勻。FAME被萃取至lmL 的庚烷中，通过GC分析对4 u L样品进行定量。鉴定了两个转基因体细胞胚芽事件(事件ID编号19和11)，它们包含非常高水 平的a生育三烯酚(> 70%总母育酚)。这些事件基于DW包含1270和1060ppm的a生 育三烯酚以及基于油量的21，590和18050ppm的a生育三烯酚。HV HGGT、ZM GTMT和MC VTE3的共表达允许积聚非常高水平的a生育三烯酚。生成a生育三烯酚和a生育酚占优 的维生素E特征；其他维生素具有小于5%的总母育酚。此外，显著数目的体细胞胚芽事件 的母育酚特征指示仅有一些存在于用于转化的两个DNA片段上的基因在这些事件中表达。 例如，事件编号24非常可能只表达ZM GTMT和MC VTE3，事件19和21只表达HV HGGT (参 见实施例3)。事件编号7非常可能只表达HGGT和ZM GTMT (参见实施例7)。它的母育酚 特征非常类似于仅表达这两个维生素E生物合成基因的大豆的母育酚特征。具有Y生育 三烯酚占优特征的事件27和17非常可能只表达HV HGGT和MC VTE3。最后，具有、生育 酚占优的母育酚特征并且仅有痕量水平的生育三烯酚的事件如32、26、18和10，非常可能 不表达任何转基因来源的维生素E生物合成基因。总之，所述数据证明通过使用本文所述的仅仅三种类型的维生素E生物合成基 因，能以组合形式生成广范围的维生素E特征。此外，证明了 HV-HGGT、ZM GTMT(VTE4)和 MC VTE3的共表达能导致母育酚含量提高6. 5倍，并且将相对的a生育色原烷醇含量提高 到> 95%的总母育酚的水平。说明书中提到的所有公布和专利申请指示了本发明适合的本领域技术人员的水 平。所有公布和专利申请在相同程度上全文以引用方式并入本文，如同每个单独的公布或 专利申请被特定地和个别地指示全文以弓I用方式并入本文。虽然本发明前文已经通过例证和实施例的方法描述了一些细节，为了更好地理解 本发明，普通技术人员将认识到可以在本发明前文和所附权利要求的范围内进行某些改变 和变型。
权利要求
转化过的植物，所述转化过的植物在其基因组中包含(a)第一重组核酸分子，所述第一重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一种核苷酸序列的调控序列，所述至少一种核苷酸序列选自(i)编码具有γ-生育酚甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列；(ii)SEQ ID NO11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37或39所示的核苷酸序列；(iii)编码SEQ ID NO12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(iv)与(i)-(iii)中的任何一种所示的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有γ-生育酚甲基转移酶活性的多肽；以及(v)与(i)-(iv)中的任何一种核苷酸序列完全互补的核苷酸序列；(b)第二重组核酸分子，所述第二重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一种核苷酸序列的调控序列，所述至少一种核苷酸序列选自(vi)编码具有尿黑酸香叶基香叶基转移酶活性的多肽的核苷酸序列；(vii)SEQ ID NO1、3、5、7、或9所示的核苷酸序列；(viii)编码SEQ ID NO2、4、6、8、或10所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(ix)与(vi)-(viii)中的任何一种所示的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有尿黑酸香叶基香叶基转移酶活性的多肽；以及(x)与(vi)-(ix)的任何一种核苷酸序列完全互补的核苷酸序列；以及(c)第三重组核酸分子，所述第三重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一种核苷酸序列的调控序列，所述至少一种核苷酸序列选自(xi)编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列；(xii)SEQ ID NO53所示的核苷酸序列；(xiii)编码SEQ ID NO54、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(xiv)与(xi)-(xii)中的任何一种所示的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽；(xv)编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO54、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70所示的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；和(xvi)与(xi)-(xv)的任何一种核苷酸序列完全互补的核苷酸序列；其中所述第一重组核酸分子、所述第二重组核酸分子和所述第三重组核酸分子被稳定地整合进所述转化过的植物的基因组中。
2.权利要求1的转化过的植物，其中所述植物选自玉米、小麦、稻、高粱、大麦、小米、裸 麦、大豆、芸苔属、苜猜、红花、向日葵、棉花、花生、油菜、拟南芥属、烟草和马铃薯。
3.权利要求1的转化过的植物，其中所述第一重组核酸分子的所述至少一种调控序列 包含至少一种启动子，所述至少一种启动子选自种子优选的、组成型的、化学调控的、组织 优选的、和发育调控的启动子；其中所述第二重组核酸分子的所述至少一种调控序列包含 至少一种启动子，所述至少一种启动子选自种子优选的、组成型的、化学调控的、组织优选的、和发育调控的启动子；并且其中所述第三重组核酸分子的所述至少一种调控序列包含 至少一种启动子，所述至少一种启动子选自种子优选的、组成型的、化学调控的、组织优选 的、和发育调控的启动子。
4.权利要求1的转化过的植物的种子，其中所述种子在其基因组中包含所述第一重组 核酸分子、所述第二重组核酸分子和所述第三重组核酸分子。
5.权利要求1的转化过的植物，其中所述转化过的植物相对于遗传背景相似但缺乏所 述第一重组核酸分子、所述第二重组核酸分子和所述第三重组核酸分子的植物产生α “生 育三烯酚、生育三烯酚、或两者含量提高的种子。
6.提高植物中α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、或两者含量的方法，所述方法包括 将下列稳定地整合进植物基因组中(a)第一重组核酸分子，所述第一重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一 种核苷酸序列的调控序列，所述至少一种核苷酸序列选自(i)编码具有Y-生育酚甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列；(ii)SEQID NO :11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37 或 39 所示的核苷酸 序列；(iii)编码SEQ ID NO 12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38 或 40 所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(iv)与(i)-(iii)中的任何一种所示的核苷酸序列具有至少80%序列同一性的核苷 酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有Y-生育酚甲基转移酶活性的多肽；以及(ν)与(i)-(iv)的任何一种核苷酸序列互补的核苷酸序列；(b)第二重组核酸分子，所述第二重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一 种核苷酸序列的调控序列，所述至少一种核苷酸序列选自(vi)编码具有尿黑酸香叶基香叶基转移酶活性的多肽的核苷酸序列；(vii)SEQID NO :1、3、5、7、或9所示的核苷酸序列;(viii)编码SEQID NO :2、4、6、8、或10所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(ix)与(vi)-(viii)中的任何一种所示的核苷酸序列具有至少80%序列同一性的核 苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有尿黑酸香叶基香叶基转移酶活性的多肽；和(x)与(vi)-(ix)的任何一种核苷酸序列互补的核苷酸序列；以及(c)第三重组核酸分子，所述第三重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一 种核苷酸序列的调控序列，所述至少一种核苷酸序列选自(xi)编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列；(xii)SEQID NO :53所示的核苷酸序列；(xiii)编码SEQ ID NO :54、61、62、63、64、65、66、67、68、69 或 70 所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(xiv)与(xi)-(xii)中的任何一种所示的核苷酸序列具有至少80%序列同一性的核 苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽；(xv)编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述 多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO :54、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70所示的氨基酸序列 具有至少95%的序列同一性；和(XVi)与(Xi)-(XV)的任何一种核苷酸序列完全互补的核苷酸序列；以及选择转化过的植物，所述转化过的植物相对于遗传背景相似但缺乏所述第一重组核酸 分子、所述第二重组核酸分子和所述第三重组核酸分子的植物α-生育三烯酚、β -生育三 烯酚、或两者含量提高。
7.权利要求6的方法，其中通过共转化植物细胞将所述第一重组核酸分子、第二重组 核酸分子和第三重组核酸分子整合进所述植物基因组中。
8.权利要求6的方法，其中通过再转化转化过的植物细胞将至少一种所述第一重组核 酸分子、第二重组核酸分子或第三重组核酸分子整合进所述植物基因组中，其中所述转化 过的植物细胞包含至少一种所述第一重组核酸分子、第二重组核酸分子或第三重组核酸分 子。
9.权利要求6的方法，其中通过育种将至少一种所述第一重组核酸分子、第二重组核 酸分子或第三重组核酸分子整合进所述植物基因组中。
10.权利要求6的方法，其中所述第一重组核酸分子的所述至少一种调控序列包含至 少一种启动子，所述至少一种启动子选自种子优选的、组成型的、化学调控的、组织优选的、 和发育调控的启动子；其中所述第二重组核酸分子的所述至少一种调控序列包含至少一种 启动子，所述至少一种启动子选自种子优选的、组成型的、化学调控的、组织优选的、和发育 调控的启动子；并且其中所述第三重组核酸分子的所述至少一种调控序列包含至少一种启 动子，所述至少一种启动子选自种子优选的、组成型的、化学调控的、组织优选的、和发育调 控的启动子。
11.提高植物中α-或β -生育三烯酚的方法，所述方法包括(a)获取在其基因组中包含第一重组核酸分子的第一植物，所述第一重组核酸分子包 含至少一种可操作地连接至编码具有Y-生育酚甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列的 调控序列；以及(b)将步骤(a)的所述转基因植物与在其基因组中包含第二重组核酸分子的第二植物 杂交，所述第二重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至编码具有尿黑酸香叶基香叶基 转移酶活性的多肽的核苷酸序列的调控序列；(c)将步骤(b)的所述转基因植物与在其基因组中包含第三重组核酸分子的第三植物 杂交，所述第三重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至编码具有2-甲基-6-植基苯醌 醇甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列的调控序列；(d)获取来自所述步骤(c)杂交的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所 述第一重组核酸分子、所述第二重组核酸分子和所述第三重组核酸分子，并且其中相对于 遗传背景相似但缺乏所述第一重组核酸分子、所述第二重组核酸分子和所述第三重组核酸 分子的植物，所述子代植物的α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、或两者的含量提高。
12.提高植物中α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、或两者含量的方法，所述方法包括(a)获取在其基因组中包含第一重组核酸分子的第一转化过的植物，所述第一重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一种核苷酸序列的调控序列，所述至少一种核苷 酸序列选自(i)编码具有Y-生育酚甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列；(ii)SEQID NO :11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37 或 39 所示的核苷酸序列；(iii)编码SEQ ID NO 12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38 或 40 所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(iv)与(i)-(iii)中的任何一种所示的所述核苷酸序列的完整编码序列具有至少 80%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有Y-生育酚甲基转移酶活性 的多肽；以及(ν)与(i)-(iv)的任何一种核苷酸序列互补的核苷酸序列；(b)将步骤(a)的转化过的植物与在其基因组中包含第二重组核酸分子的第二转化过 的植物杂交，所述第二重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一种核苷酸序列的 调控序列，所述至少一种核苷酸序列选自(vi)编码具有尿黑酸香叶基香叶基转移酶活性的多肽的核苷酸序列；(vii)SEQID NO :1、3、5、7、或9所示的核苷酸序列；(viii)编码SEQID NO :2、4、6、8、或10所示的所述氨基酸序列的核苷酸序列；(ix)与(vi)-(viii)中所示的所述核苷酸序列的完整编码序列具有至少80%序列 同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有尿黑酸香叶基香叶基转移酶活性的多 肽；和(x)与(vi)-(ix)的任何一种核苷酸序列互补的核苷酸序列；以及(c)将步骤(b)的转化过的植物与在其基因组中包含第三重组核酸分子的第三转化过 的植物杂交，所述第三重组核酸分子包含至少一种可操作地连接至至少一种核苷酸序列的 调控序列，所述至少一种核苷酸序列选自(xi)编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列；(xii)SEQID NO 53所示的核苷酸序列；(xiii)编码SEQID NO 54或70所示的所述氨基酸序列的核苷酸序列；(xiv)与(xi)-(xii)中的任何一种所示的核苷酸序列具有至少80%序列同一性的核 苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽；(xv)编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述 多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO :54、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70所示的氨基酸序列 具有至少95%的序列同一性；和(xvi)与(xi)-(xv)的任何一种核苷酸序列完全互补的核苷酸序列；以及选择来自所述步骤(c)杂交的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述第 一重组核酸分子、所述第二重组核酸分子和所述第三重组核酸分子，并且其中相对于遗传 背景相似但缺乏所述第一重组核酸分子、所述第二重组核酸分子和所述第三重组核酸分子 的植物，所述子代植物的α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、或两者的含量提高。
13.权利要求6的方法，其中所述植物选自玉米、小麦、稻、高粱、大麦、小米、裸麦、大 豆、芸苔属、苜猜、红花、向日葵、棉花、花生、油菜、拟南芥属、烟草和马铃薯。
14.权利要求6的植物的转化过的种子或其副产物。
15.权利要求14的转化过的种子，其中所述转化过的种子具有至少20ppm的α-生育三烯酚含量。
16.权利要求14的转化过的种子，其中所述转化过的种子包含的α-生育三烯酚的量占所述转化过的种子中的总生育酚和生育三烯酚含量的至少20%。
17.权利要求14的转化过的种子，其中所述转化过的种子具有的α-生育三烯酚含量 占所述转化过的种子中的总合并的生育酚和生育三烯酚含量的至少70%。
18.权利要求14的转化过的种子，其中所述转化过的种子包含的α-生育三烯酚和 α -生育酚的合并含量占所述转化过的种子中的总生育酚和生育三烯酚含量的至少95%。
19.改善动物的组织质量的方法，所述方法包括用权利要求14的转化过的种子来饲养 所述动物。
20.权利要求19的方法，其中所述组织是肉，并且通过选自以下标准的至少一种标准 来测量所述肉的质量提高的ΡΗ、改善的食物颜色、改善的氧化稳定性、增加的储存寿命以 及减少的汁液渗出。
21.权利要求19的方法，其中所述动物选自牛、猪和家禽。
22.分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含(a)编码具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述 多肽的氨基酸序列基于Clustal W比对方法在与SEQ ID NO :54或70进行比较时具有至少 95%的序列同一性，或(b)所述核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列与所述核苷酸序列由相同数目的 核苷酸组成并且100%互补。
23.权利要求22的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQIDNO 54或70。
24.权利要求22的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包含SEQID NO :53。
25.重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一种调控序列可操作地连接的权 利要求22的多核苷酸。
26.包含权利要求25的重组DNA构建体的细胞、植物或种子。
27.具有2-甲基-6-植基苯醌醇甲基转移酶活性的分离多肽，其中所述多肽的氨基酸 序列基于Clustal W比对方法在与SEQ ID NO :54或70中的一种进行比较时具有至少95% 的序列同一性。
28.权利要求27的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQIDNO 54或70。
全文摘要
本文描述了制备和使用分离核酸来改变植物的含油表型。描述了分离的核酸以及它们编码的多肽，它们改变了转化过的种子和获取自转化过的种子的油中的α-和β-生育三烯酚含量。描述了包含上述核酸的表达盒、宿主细胞和转化过的植物。
文档编号C12N15/82GK101842488SQ200880109949
公开日2010年9月22日 申请日期2008年9月30日 优先权日2007年10月4日
发明者K·迈尔 申请人:纳幕尔杜邦公司