专利名称：：牙鲆弹状病毒的全基因组序列及其测定方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，特别涉及牙鲆弹状病毒的全基因组序列，另外还涉及该序列的测定方法。
背景技术：
：牙鲆弹状病毒(Hiramerhabdovirus,简称HRV)病毒粒子呈枪弹形，大小为80nmX160-180nm，1986年日本首次报道。我国黄海、渤海近岸等地养殖的牙鲆已被发现有此病症。发病季节为冬季和早春，鱼体发病时，水温一般都在15i:以下。本病主要危害牙鲆，人工感染对真鲷、黑鲷有强烈的致病性，从香鱼和无备平舳中也分离到此病毒，对虹鳟也有致病作用。幼苗期和仔鱼期的鱼体易患此病。感染牙鲆弹状病毒的病鱼体表和鳍充血或出血，腹部膨胀，内有腹水。解剖鱼体，肌肉、肠黏膜的固有层出血，生殖腺的结缔组织充血或出血。中国国家质量监督检验检疫总局与韩国海洋水产部于2005年发布的《中韩进出口活水生动物检验检疫协议》中规定，我国出口到韩国的鲈鱼、真鲷、大菱鲆、牙鲆等鱼类必须进行牙鲆弹状病毒的检验检疫。因此，急需对国内所分离出来的牙鲆弹状病毒的基因组序列进行测定和分析，在此基础上，建立牙鲆弹状病毒的快速检测方法和分子流行病学分析，保护我国进出口海水鱼类贸易和我国海水鱼类养殖业的健康发展。
发明内容本发明的目的在于克服上述问题，提供了一种牙鲆弹状病毒的全基因组序列，对牙鲆弹状病毒的全基因组进行了分段扩增、克隆、序列测定及分析，构建了基因组cDNA文库，测定了11037bp的核苷酸序列。另外本发明还提供其测定方法，涉及对基因组中各开放读码框的分析，方法简单，测定精确。本发明为实现上述目的所采用的技术方案是一种牙鲆弹状病毒的全基因组序列，如序列表SEQIDNO.1所示的序列，全长包括11037个核苷酸。所述牙鲆弹状病毒的全基因组序列表编码蛋白核蛋白基因(N)，0RF1位于第170—1348核苷酸，编码核蛋白，从起始密码子到终止密码子共编码的核蛋白包含392个氨基酸，分子量为42.4kDa。所述牙鲆弹状病毒的全基因组序列表编码蛋白磷蛋白(P)，0RF2位于第1448—2131核苷酸，编码磷蛋白，从起始密码子到终止密码子共编码的磷蛋白包含227个氨基酸，分子量为25.8kDa。所述牙鲆弹状病毒的全基因组序列表编码蛋白基质蛋白(M)，0RF3位于第2237—2818个核苷酸，编码基质蛋白，从起始密码子到终止密码子共编码的基质蛋白包含193个氨基酸，分子量为21.5kDa。所述牙鲆弹状病毒的全基因组序列表编码蛋白糖蛋白(G)，0RF4位于第2927—4453个核苷酸，编码糖蛋白，从起始密码子到终止密码子共编码的糖蛋白包含508个氨基酸，分子量为56.6kDa。所述牙鲆弹状病毒的全基因组序列表编码蛋白RNA聚合酶(L)蛋白，0RF5位于第4950—10910个核苷酸，是最大的开放读码框，编码RNA聚合酶蛋白，从起始密码子到终止密码子共编码的核蛋白包含1986个氨基酸，分子量为224.6kDa。所述牙鲆弹状病毒的全基因组序列扩增引物序列如SEQIDNO.2——SEQIDNO.21所示，共10个引物对。所述一种牙鲆弹状病毒的全基因组序列的测序方法，具体工艺是1)病毒分离与PNA的提取；2)合成如SEQIDNO.2——SEQIDNO.21所示的引物，对病毒的全基因组序列分段为10段；3)对病毒基因组的分段进行RT—PCR扩增；4)目的基因片段的回收；5)目的基因序列测定、拼接；6)目的基因组序列验证。所述病毒的分离用HRV病毒悬液感染24h内培养的鲤鱼上皮瘤细胞系(Epitheliomapapulossumofcarp，EPC)，20。C培养，当细胞病变效应出现90%时，收集500mL细胞和培养液，4°C3，000Yrr亩"、、m，.n甘T7卜、)害fCM1、/1°广/JB方、)V、)^RFImTSN1重'、t3画-""y-i"t"i丄ii-yy,.1H3\"丄，丄/7丄ul/|、IJ7l乂画J厶UlLvJ丄、丄半.悬，快速反复冻溶3次，超声波降解，重悬沉淀细胞，4°C4，000Xg离心20min，收集上清(SN2)，与SNl混合，4。C过夜，4°C15，000Xg离心8h，2mLTN缓冲液(50mMTris-HCl，150mMNaCl，pH7.5)重悬，上清液装入15_60%(重量/体积)的蔗糖梯度离心管，4°C200,000Xg离心(Beckman，SW41Tirotor)2h，用针刺破离心管，收集病毒相，用TN缓冲液稀释，200，OOOxg离心lh，用200WTN缓冲液重悬后-20°C保存。所述病毒RNA的提取上述分离后的病毒用RNA提取试剂盒PureLinkViralRNA/DNAMiniKit(invitrogen)提取病毒总RNA。所述合成如SEQIDNO.2——SEQIDNO.21所示的引物，对病毒的全基因组序列分段为10段；引物序列见表1,其中F代表正向引物，R代表反向引物，1-IO分别代表IO对引物的编号，每对引物的扩增产物在1000bp左右。表l:用于HRV基因组测序的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>所述病毒基因组的分段进行RT-PCR扩增以病毒RNA为模版进行RT-PCR分析，RT-PCR实验采用试剂盒SuperscriptIIIFirst-StmndSynthesisSystemkit(invitrogen)来完成。反应体系为5u110XRT—PCRBuffer,10u125mMMgC12，5u110mMd,，1li1RnaseInhibitor(40U/u1)，1u1AMV-OptimizedTaq，1P1AMVRtaseXL(5U/ul),lyl正向引物和反向引物(20uM)，lugHRVRNA。反应条件为50。C预变性15min;之后94°C2min;最后35个循环为94。C变性30s，58。C退火30s，72。C延伸2min。所述目的基因的回收如下述a-e，a)目的DNA的纯化用WizardDNA纯化试剂盒(Promega公司)从PCR扩增产物中纯化目的DNA，具体按照试剂盒操作说明进行；b)目的DNA与载体的连接将10条纯化后的PCR产物克隆入质粒载体pmdl8-T中，具体操作是在O.2mlPCR管中加入链接缓冲液7.5ul，载体lul，PCR纯化产物2.5ul，T4DNA连接酶(3U/ul)lul，然后用灭菌双蒸水将体系定容到15yl，将反应液混匀，4'C连接过夜；c)转化将5pl连接产物加入到200ul感受态细胞DH5a中，冰浴30分钟，42。C热击90秒，快速转移至冰上3分钟；加入37"C预热的LB培养基800u1，37"C震荡培养45分钟，4000rpm离心2分钟，弃部分上清，约留200ul，混匀；均匀涂布在加有16ulX-gal(50mg/ul)和4ulIPTG(200mg/pl)LB板上，倒放平皿，37。C过夜；d)阳性克隆菌的鉴定在涂布有X-gal和IPTG的LB琼脂平板上挑选白色单个菌落，接种于含有AMP(氨苄青霉素)的LB培养基中，37"C震荡培养12小时后，提取质粒；e)质粒的制备用碱裂解法提取质粒。用50P1水溶解质粒DNA，保存在-2(TC。所述病毒全基因组序列测定、拼接如下述a-c，a)序列测定采用ABIPRISM3770型核酸序列测定仪进行测序，具体操作按照仪器说明书进行；b)序列拼接利用软件VectorNtisoftware(InforMaxInc.,USA)将测序结果拼接成完整的病毒基因组序列，基因组长度为11037bp(序列表SEQIDNO.1)，与HIRRV韩国株(GenBankAcc.No.NC_005093)相似，病毒核酸为单链RNA，GC含量50.8%;所述基因组序列验证序列分析基因组在DNAStar软件，http:〃www.softberry.com(SoftberryInc.,MountKisco，N.Y.)禾口http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf(ORFfinder)运行分析，验证所有的开放读码框(Openreadingframes,ORFs)，所有的开放阅读框都由ATG开始，至少编码40个氨基酸才成为一个假定基因；序列验证分别根据每个ORF的序列设计了引物，进行PCR扩增，由于L基因太长，因此设计4对引物，将其分成4段扩增，扩增产物测序，与所预测的ORF序列进行比较，验证HRV的五个开放阅读框的存在和序列。本发明采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、分子克隆和核酸序列测定技术，对牙鲆弹状病毒进行了分段扩增、克隆、序列测定及分析。牙鲆弹状病毒基因组由11037个核苷酸组成，包括5个开放读码框(ORF)，病毒核酸为单链RNA，GC含量50.896，其中的部分核苷酸序列可以用于牙鲆弹状病毒的分子学诊断和相关核酸疫苗的开发。该基因组为中国首次在石鲽鱼中分离出的牙鲆弹状病毒的基因组序列进行测定，对进一步研究该病毒的致病机理和检测方法有着重要的意义。图1是牙鲆弹状病毒基因组ORF序列验证的电泳检测图。图中l-3:核蛋白基因(N);4-6:磷蛋白基因(P);7-9:基质蛋白基因(M);10-12:糖蛋白基因(G);13:DL2000Marker(2000，1000，750，500，250bp);14-16:RNA酶基因第一个片段(L1);17-19:RNA酶基因第二个片段(L2);20-22:RNA酶基因第三个片段(L3);23-25:RNA酶基因第四个片段(L4)。具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作进一步阐述实施例1.一种牙鲆弹状病毒的全基因组序列，如序列表SEQIDNO.1所示的序列，全长包括11037个核苷酸。实施例2实施例l所述一种牙鲆弹状病毒的全基因组序列的测序方法，具体过程如下-1、病毒分离提纯和RNA提取用HRV病毒悬液感染24h内培养的鲤鱼上皮瘤细胞系(Epitheliomapapulossumofcarp，EPC)，20。C培养。当细胞病变效应出现90%时，收集500mL细胞和培养液，4°C3,000Xg离心30min，取上清(SN1)，4°C保存。沉淀用2mLSN1重悬，快速反复冻溶3次，超声波降解，重悬沉淀细胞，4°C4，000Xg离心20min。收集上清(SN2)，与SN1混合，4°C过夜，4°C15，000Xg离心8h，2mLTN缓冲液(50mMTris-HC1，150mMNaCl,pH7.5)重悬，上清液装入15—60%(重量/体积)的蔗糖梯度离心管，4。C200,000Xg离心(Beckman，SW41Tirotor)2h，用针剌破离心管，收集病毒相，用TN缓冲液稀释。200，000xg离心lh，用200WTN缓冲液重悬后-20。C保存。然后用RNA提取试剂盒PureLinkViralRNA/DNAMiniKit(invitrogen)提取病毒总RNA。2、合成如SEQIDNO.2——SEQIDNO.21所示的引物，对病毒的全基因组序列分段为10段根据HRV韩国株基因组序列设计10对引物，其序列见表1，其中F代表正向引物，R代表反向引物，1-IO分别代表IO对引物的编号。每对引物的扩增产物在1000bp左右。表l:用于HRV基因组测序的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>HRV-2-RACGTTCAAGGCGGTCCGGTASEQIDNo.5服V-3-FATCCGGTCCAACCTCAACGAGAACTSEQIDNo.6,-3-RACCTTGGATAGCTTAGCCGCAGGACSEQIDNo.7HRV-4-FTCCTCACGACAGCTGCCAGAGTCTASEQIDNo.8丽-4-RCAGTGCTGACAATGATGGCCAGAAGSEQIDNo.9HRV-5-FCGGTCTTCATGGCAACGATACTCCTSEQIDNo.10服V-5-RCTCTGGAGGAGGATTGTCCGGAGTTSEQIDNo.11,-6-FCGAGACAGCAACGGATCCACTACATSEQIDNo.12服V-6-RGCGATCAGTCTGTCTCCTTCGTTGTSEQIDNo.13HRV-7-FGCAGCATGGATCGAAGAAGGTCACTSEQIDNo.14HRV-7-RCACGCTTCTCTAGGTCGATCGGAGTSEQIDNo.15丽-8-FCGGCAATCATCTCCAGTGAACAATASEQIDNo.16HRV-8-RGCATGATTAGTTCGTCAAGATTGCTSEQIDNo.17HRV-9-FAAGACAGGAAGCAATCTTGACGAACSEQIDNo.18HRV-9-RCCTCCMTCACGACCAATAGGTCAGSEQIDNo.19HRV-10-FGAGTGGCAGAGGCACTGAACATGACSEQIDNo.20丽-10-RGTATAAAAAAGGTAACAGAGAGGTTCTGAAGSEQIDNo.213、病毒基因组的分段RT-PCR扩增以病毒RNA为模版进行RT-PCR分析，RT-PCR实验采用试剂盒SuperscriptIIIFirst-StrandSynthesisSystemkit(invitrogen)来完成。反应体系为5u110XRT-PCRBuffer(缓冲齐U)，10"125mMMgC12，5u110mMd證，1u1RNaseInhibitor(核糖核酸酶抑制剂，40U/ul)，lulAMV-OptimizedTaq(优化逆转录聚合酶)，lulAMVRTaseXL(逆转录酶仪，5U/ul)，lul正向引物和反向引物(20uM)，lugHRVRNA。反应条件为50。C预变性15min;之后94°C2min;最后35个循环为94。C变性30s，58°C退火30s，72。C延伸2min。4、目的基因的回收包括目的DNA的克隆与阳性克隆菌的鉴定，(1)目的DNA的纯化用WizardDNA纯化试剂盒(Promega公司)从PCR扩增产物中纯化目的DNA，具体按照试剂盒操作说明进行。(2)目的DNA与载体的连接将10条纯化后的PCR产物克隆入质粒载体pmdl8-T中，具体操作是在0.2mlPCR管中加入链接缓冲液7.5yl，载体lul，PCR纯化产物2.5ul，T4DNA连接酶(3U/ul)lul，然后用灭菌双蒸水将体系定容到15ul，将反应液混匀，4"C连接过夜。(3)转化将5u1连接产物加入到200u1感受态细胞DH5a中，冰浴30分钟，42'C热击90秒，快速转移至冰上3分钟；加入37。C预热的LB培养基800y1，37。C震荡培养45分钟，4000rpm离心2分钟，弃部分上清，约留200ul，混匀；均匀涂布在加有16ulX-gal(50mg/ul)和4ulIPTG(200mg/ul)LB板上，倒放平皿，37'C过夜。(4)阳性克隆菌的鉴定在涂布有X-gal和IPTG的LB琼脂平板上挑选白色单个菌落，接种于含有AMP(氨苄青霉素)的LB培养基中，37'C震荡培养12小时后，提取质粒。(5)质粒的制备用碱裂解法提取质粒。将细菌培养液倒入离心管中，12000g离心30秒。重复一次。用1mLSTE悬浮菌体沉淀，再离心回收菌体，重复一次，去尽上清液。将沉淀悬浮于100ul预冷的溶液I，强烈振荡混匀；加入200ul预冷的溶液II，颠倒5次(不要强烈振荡)，冰浴放置3分钟。加入150u1预冷的溶液III，倒置管温和振荡10秒，冰浴放置3—5分钟。离心5分钟，上清液加入等体积的酚/氯仿，振荡混匀。离心2分钟，上清液加入2倍体积的乙醇(以及1/10体积的3MNaAc)，室温放置2-10分钟。离心5分钟，将沉淀用70%的乙醇漂洗，稍微离心，室温放置片刻以干燥沉淀。用50ul水溶解沉淀，保存在-2CTC。5、病毒基因组序列测定、序列拼接(1)序列测定采用ABIPRISM3770型核酸序列测定仪进行测序，具体操作按照仪器说明书进行。(2)序列拼接利用软件VectorNtisoftware(InforMaxInc.，USA)将测序结果拼接成完整的病毒基因组序列，基因组长度为11037bp(序列表SEQIDNO.1)，与HIRRV韩国株(GenBankAcc.No.NC—005093)相似。病毒核酸为单链RNA，GC含量50.8%。6、基因组序列分析及验证序歹U分析基因组在DNAStar软件，http:〃www.softberry.com(SoftberryInc.，MountKisco，N.Y.)禾口http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf(ORFfinder)运行分析，验证所有的开放读码框(Openreadingframes,ORFs)。所有的开放阅读框都由ATG开始，至少编码40个氨基酸才成为一个假定基因。经过分析，病毒包含如下5个基因1)核蛋白基因(N)0RF1位于第170—1348核苷酸，编码核蛋白。从起始密码子到终止密码子共编码的核蛋白包含392个氨基酸，分子量为42.4kDa。2)磷蛋白(P)0RF2位于第1448—2131核苷酸，编码磷蛋白。从起始密码子到终止密码子共编码的磷蛋白包含227个氨基酸，分子量为25.8kDa。3)基质蛋白(M)0RF3位于第2237—2818个核苷酸，编码基质蛋白。从起始密码子到终止密码子共编码的基质蛋白包含193个氨基酸，分子量为21.5kDa。4)糖蛋白(G)0RF4位于第2927—4453个核苷酸，编码糖蛋白。从起始密码子到终止密码子共编码的糖蛋白包含508个氨基酸，分子量为56.6kDa。5)RNA聚合酶(L)蛋白0RF5位于第4950—10910个核苷酸，是最大的开放读码框，编16码RNA聚合酶蛋白。从起始密码子到终止密码子共编码的核蛋白包含1986个氨基酸，分子量为224.6kDa。为了验证开放读码框分析结果的正确性，分别根据每个0RF的序列设计了引物(表2)，进行PCR扩增。由于L基因太长，因此设计4对引物，将其分成4段扩增。将扩增产物测序，并与所预测的ORF序列进行比较。验证所做的RT—PCR的结果见图1，所有扩增的片段(箭头所指)长度和序列与预期相符，验证了HRV的五个开放阅读框的存在和该毒株测序的成功。表2:HRV0RF序列验证的RT-PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>SEQUENCELISTING<110>孙颖杰、刘荭、岳志芹、吴斌、李叶〈120〉牙鲆弹状病毒的全基因组序列及其测定方法〈160>37<170〉Patentlnversion3.5〈210>1<211>11037<212>靈<213〉Hir咖erhabdovirus<400>1tacgccaagatgggggc鄉ggacag犯aa60犯3tggC8LCttcagttgtac3Ctg6lt犯Cgtgtt3tagacMgtcta3gt120gatatattctgtttgcgatctctacaacaagaaatcaatatggcgaacct180tttgC3gg3CtCCg鄉3gtgccctcgaag8ctctggcac240gga_gtaitg^tCCC3CC犯g8tcaacttgacgctctacgggtctataccct300ggcgatcatc8卿gggCgLgtcagtcsggtcgg娜gtcccaaaccaaca犯gC3Ct8gg360gatcctttgtgcttttgtcacgtcagsgaBcaaccctgacatgacagatgcagcagtcaa420gctcctggtgg3C3tg犯gttcaaggtggacgtggttcccgtgg3Cg3C3鄉tcggtga480caatctggatgacccc犯ctcaaagctggcggaggtcctgacgg^gag88C3tggtgg3540cctggtgs犯ggccttctgttcacttgtgccctgatggtc犯gt3Cg3tgtggac犯gat600ggccacatactgccagcagaagctggagcgactggccaacagtcagggactc犯cgagct660gaccctgata8gcacg3gtagggC3gttCtggctcggattggggcagcggta卿ccggg720gC3g犯gtt8tctatgggatcattcttatcaacctgstggatcccgccac780tgctgccagggc犯8ggccctttgtgccatg鄉Ctg3gCggaaccggaatgaccatggt840gggtxtattc￡L3tC￡lggCCl:ctaag犯ccttggagctcceicctgcageitctgctgga卿900tctctgcatgaagtccatcatcgactctgcc鄉agg3ttgtc犯gctgatg鄉8tCgt960tgcagacgtcgaggacatgaccgcaaagtatgccatcatgtgcttgggga1020tgggtacttcaagtcctacggg￡Ltcaatga>gaactcacggatcacctgtatcttgatgaa1080C￡LtC3￡LCga<gcagtacgatg鄉ggac犯cCgg鄉3Ctggcaggagtcagggtttcacc1140ccccttccgaaagctggcaaccgagattgctcgccttctgatgacggg犯1200cggatctgccgggccaggtgcctcagatcttgttcgccaggccgagcaggC3gcgcasg31260g謡g3gggCgaggatgatagg3gggCg3gg3g犯Cgg3g1320gggggg卿ggeicg卿3gtactactgagacccggcatctatgtcgccttgggttgcctc1380tattcttag3tggcacgtttgtgt犯asct1440aatcgcaatgtctgataacggttctttgatattcccaagaatgctctgga1500c卿gttgaggC3Cggetcgatgtgtcccag卿gga^tgggi犯ggttgtccggasac肌gc1560g￡lgg￡L3CC￡L￡lgactggsggc卿gC卿3gcggtctccaaag肌gcagg31620ga^accccggaacatgtcccacttgttctg鄉tatgtggaBg3ggac昭1680caccc犯gatgcgctccgag郎ttcgg鄉3Ct犯ttgtCC3g3tC3ggCagtctceitca1740ggccgaratgactcgtcatctgg鄉C3gtggc肌c卿gcaccgggccaatctccaggc1800gctcaccaagtctC8gC3ggagtctccaaagagatcctctcggcagtcat1860ctccatccgrtccaacctcaacgagaactccagtccccgacccaaacccctggaicctgga1920ccaggtcaatgcggag卿gccctcggatttggeigtcgggteccggaccgccttg犯cgt1980ctttggcaaactacggggaa卿ggc鄉ttcgc犯gaagtcaagaacat2040g鄉C3g犯gaagatgagtetg3ggg^gCggaagcttcttc肌g犯ggt2100cctcgatatggtcaagaagaccatgaggtaacatcccactcgccaactcc2160cactcccctagatagaaaaaaatggcacgttagtgtactgttttaacagaaaccaaaacc2220gaaaccatgtctctcttcaagcgaeicc肌gtgatccctcc2280ccctcatctgCtt3gCgg3gscgaggaccgggtgac3gttcta犯tgtegagggcgagat2340c犯gatctcaggg卿Cg3CC肌CC3CCCtCg3tg卿3gatctactactccatgagtct2400ggccgccgcc3ttCtggg3ggg犯tcttcstccctctttccaatctctgacctatctatt2460tC3gC鄉3gatgg^ttcggg3gC3CC3tag犯saggtc33Ctttgggtcccggaaacc2520ggcccccctgaccacctatctggtggc犯aagcccgtgaggtgttcattcagcctcaacc2580aagatccctcCtC3g8ttt3cactgtcagtgtggagggggcgaccatcac2640cttctccgggaggtttctcttttcggccagtC3tgtggggtgtgacgacaaccgggcc朋2700gctggctggcctggatggcttcatcacctcaccca^ctscaagactatta2760tgc3C3gga^actgtcctggcgttgtcc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ce〈220><221〉prim—bind<222>(1)…(25)<223>根据测序要求设计，用于测定牙鲆弹状病毒序列的第八对引物中的正向引物<400>16cggcaatcatctccagtgaacaata25<210〉17<211>25<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>prim—bind〈222>(1)…(25)<223>根据测序要求设计，用于测定牙鲆弹状病毒序列的第八对引物中的反向引物<400〉17gcatgattagttcgtcaagattgct25<210>18<211>25〈212〉DNA<213>ArtificialSequence〈220〉<221>prim—bind<222>(l)...(25)〈223〉根据测序要求设计，用于测定牙鲆弹状病毒序列的第九对引物中的正向引物<400>18aagacaggasgc肌tcttgscgasc25<210>19<211>25<212>DNA〈213〉ArtificialSequence<220><221〉prim—bind〈222>(1)…(25)〈223>根据测序要求设计，用于测定牙鲆弹状病毒序列的第九对引物中的反向引物<400>19cctccaatcacgaccaataggtcag25<210>20〈211〉25<212〉DNA〈213>ArtificialSequence<220><221〉prim—bind<222〉(1)…(25)<223>根据测序要求设计，用于测定牙鲆弹状病毒序列的第十对引物中的正向引物〈400>20gagtggcagaggcactgaacatgac25<210>21〈211〉31<212>DNA〈213>ArtificialSequence<220><221〉prim—bind<222>(l)...(31)<223>根据测序要求设计，用于测定牙鲆弹状病毒序列的第十对引物中的反向引物<400〉21gtat33a犯3ggtaacagagaggttctg肪g31〈210〉22〈211〉19<212>■<213〉ArtificialSequence<220>〈221>prim—bind〈222〉(1)…(19)<223〉根据测序要求设计，用于验证牙鲆弹状病毒N基因序列的正向引物<400>22<210>23<211〉19<212>DNA<213〉ArtificialSequence<220><221>prim一bind<222>(1)…(19)<223>根据测序要求设计，用于验证牙鲆弹状病毒N基因序列的反向引物<400>23tcagtagtactcttcgtcc19<210>24〈211〉21<212>謹<213>ArtificialSequence〈220〉<221>prim—bind〈222〉(l)...(21)<223>根据测序要求设计，用于验证牙鲆弹状病毒P基因序列的正向引物〈400〉24ggatgtctgstascgaaggag21<210>25<211>19<212>薩〈213>ArtificialSequence<220〉<221〉prim—bind〈222〉(l)...(19)<223>根据测序要求设计，用于验证牙鲆弹状病毒P基因序列的反向引物〈400〉25ctacctcatggtcttcttg19〈210>26<211>20〈212〉DNA<213>ArtificialSequence<220〉<221>prim—bind<222>(1)…(20)<223>根据测序要求设计，用于验证牙鲆弹状病毒M基因序列的正向引物〈400>26atgtctctcttcaagcgaac20<210>27〈211〉20<212>DNA〈213>ArtificialSequence<220><221〉prim一bind〈222〉(1)…(20)<223>根据测序要求设计，用于验证牙鄉弹状病毒M基因序列的反向引物<400>27ctatttcccctttttggttg20<210〉28<211〉20<212>腿<213>ArtificialSequence〈220><221>prim—bind〈222〉(1)…咖〈223〉根据测序要求设计，用于验证牙軤弹状病毒G基因序列的正向引物〈400〉28ggatggatcctcgaataatg20<210>29〈211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220>〈221〉prim—bind〈222>(1)…(19)<223>根据测序要求设计，用于验证牙鲆弹状病毒G基因序列的反向引物<400>29atattaccctcgactggcg19〈210〉30<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence〈220><221>prim—bind<222>(l)...(24)〈223〉根据测序要求设计，用于验证牙鲆弹状病毒L基因序列的第一对引物中的正向引物<400>30gcgcgatggatttctttgatttag24<210>31<211〉24〈212〉DNA<213>ArtificialSequence〈220>〈221>prim—bind<222>(l)...(24)<223>根据测序要求设计，用于验证牙鲆弹状病毒L基因序列的第一对引物中的反向引物〈400〉31gcgcgctatttttaactccatctc24<210>32〈211>17<212>DNA〈213>ArtificialSequence<220><221>prim—bind<222>(1)…(17)<223>根据测序要求设计，用于验证牙鲆弹状病毒L基因序列的第二对引物中的正向引物<400>32tta鄉gacggggattc17<210〉33<211>17<212〉腿<213>ArtificialSequence<220><221〉prim—bind<222>(l)...(17)<223>根据测序要求设计，用于验证牙鲆弹状病毒L基因序列的第二对引物中的反向引物〈400〉33attaggtctgcgtccag17<210>34<211>20〈212〉DNA<213>ArtificialSequence<220>〈221>prim一bind<222〉(1)…(20)<223>根据测序要求设计，用于验证牙鲆弹状病毒L基因序列的第三对引物中的正向引物〈400>34atgccggggcagagacaatc20<210>35<211>21〈212〉薩〈213>ArtificialSequence<220>〈221〉prim—bind〈222>(21)<223>根据测序要求设计，用于验证牙鲆弹状病毒L基因序列的第三对引物中的反向引物<400>35atctggactggcatcagagcg21<210〉36〈211〉18〈212〉腿<213>ArtificialSequence<220><221〉prim—bind〈222〉(1)…(18)<223〉根据测序要求设计，用于验证牙軤弹状病毒L基因序列的第四对引物中的正向引物<400>36atgcaatcgacgagaccg18<210〉37〈211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><221>prim一bind<222>(l)...(18)<223〉根据测序要求设计，用于验证牙鲆弹状病毒L基因序列的第四对引物中的反向引物<400>37tctactgcctgccaagag18权利要求1、一种牙鲆弹状病毒的全基因组序列，其特征是如序列表SEQIDNO.1所示的序列，全长包括11037个核苷酸。2、根据权利要求1所述的一种牙鲆弹状病毒的全基因组序列，其特征是牙鲆弹状病毒的全基因组序列表编码蛋白核蛋白基因(N)，0RF1位于第170_1348核苷酸，编码核蛋白，从起始密码子到终止密码子共编码的核蛋白包含392个氨基酸，分子量为42.4kDa。3、根据权利要求1所述的一种牙鲆弹状病毒的全基因组序列，其特征是牙鲆弹状病毒的全基因组序列表编码蛋白磷蛋白(P)，0RF2位于第1448—2131核苷酸，编码磷蛋白，从起始密码子到终止密码子共编码的磷蛋白包含227个氨基酸，分子量为25.8kDa。4、根据权利要求1所述的一种牙鲆弹状病毒的全基因组序列，其特征是:牙鲆弹状病毒的全基因组序列表编码蛋白基质蛋白(M)，0RF3位于第2237—2818个核苷酸，编码基质蛋白，从起始密码子到终止密码子共编码的基质蛋白包含193个氨基酸，分子量为21.5kDa。5、根据权利要求l所述的一种牙鲆弹状病毒的全基因组序列，其特征是牙鲆弹状病毒的全基因组序列表编码蛋白糖蛋白(G)，0RF4位于第2927—4453个核苷酸，编码糖蛋白，从起始密码子到终止密码子共编码的糖蛋白包含508个氨基酸，分子量为56.6kDa。6、根据权利要求1所述的一种牙鲆弹状病毒的全基因组序列，其特征是牙鲆弹状病毒的全基因组序列表编码蛋白RNA聚合酶(L)蛋白，0RF5位于第4950—10910个核苷酸，是最大的开放读码框，编码RNA聚合酶蛋白，从起始密码子到终止密码子共编码的核蛋白包含1986个氨基酸，分子量为224.6kDa。7、根据权利要求1所述的一种牙鲆弹状病毒的全基因组序列，其特征是:牙鲆弹状病毒的全基因组序列扩增引物序列如SEQIDNO.2——SEQIDNO.21所示，共10个引物对。8、一种牙鲆弹状病毒的全基因组序列的测序方法，其特征是具体工艺是1)病毒分离与PNA的提取；2)合成如SEQIDNO.2——SEQIDNO.21所示的引物，对病毒的全基因组序列分段为10段；3)对病毒基因组的分段进行RT—PCR扩增；4)目的基因片段的回收；5)目的基因序列测定、拼接；6)目的基因组序列验证。9、根据权利要求8所述的一种牙鲆弹状病毒的全基因组序列的测序方法，其特征是病毒的分离用HRV病毒悬液感染24h内培养的鲤鱼上皮瘤细胞系(Epitheliomapapulossumofcarp，EPC)，2(TC培养，当细胞病变效应出现90%时，收集500mL细胞和培养液，4°C3，000Xg离心30min，取上清(SNl)，4°C保存，沉淀用2mLSN1重悬，快速反复冻溶3次，超声波降解，重悬沉淀细胞，4°C4，000Xg离心20min，收集上清(SN2)，与SN1混合，4°C过夜，4°C15，000Xg离心8h，2mLTN缓冲液(50mMTris-HCl，150mMNaCl，pH7.5)重悬，上清液装入15—60%(重量/体积)的蔗糖梯度离心管，4。C200，000Xg离心(Beckman，SW41Tirotor)2h，用针刺破离心管，收集病毒相，用TN缓冲液稀释，2Q0，000xg离心lh，用200WTN缓冲液重悬后-20°C保存。所述病毒RNA的提取上述分离后的病毒用RNA提取试剂盒PureLinkViralRNA/DNAMiniKit(invitrogen)提取病毒总RNA。所述合成如SEQIDNO.2——SEQIDNO.21所示的引物，对病毒的全基因组序列分段为10段；引物序列见表1，其中F代表正向引物，R代表反向引物，l-10分别代表10对引物的编号，每对引物的扩增产物在lOOObp左右。所述病毒基因组的分段进行RT-PCR扩增以病毒RNA为模版进行RT-PCR分析，RT-PCR实验采用试剂盒SuperscriptIIIFirst-StrandSynthesisSystemkit(invitrogerO来完成。反应体系为5u110XRT-PCRBuffer,10u125mMMgC12,5ull0mMdNTP,1u1RnaseInhibitor(40U/u1)，1u1AMV-OptimizedTaq，lul腦VRtaseXL(5U/ul)，lul正向引物和反向引物(20uM)，lugHRVRNA。反应条件为5(TC预变性15min;之后94°C2min;最后35个循环为94。C变性30s，58。C退火30s，72。C延伸2min。所述目的基因的回收如下述a-e，a)目的DNA的纯化用WizardDNA纯化试剂盒(Promega公司)从PCR扩增产物中纯化目的DNA，具体按照试剂盒操作说明进行；b)目的DNA与载体的连接将10条纯化后的PCR产物克隆入质粒载体pmdl8-T中，具体操作是在0.2mlPCR管中加入链接缓冲液7.5u1，载体1P1，PCR纯化产物2.5u1，T4DNA连接酶(3U/yl)1p1，然后用灭菌双蒸水将体系定容到15p1，将反应液混匀，4'C连接过夜；c)转化将5ul连接产物加入到200ul感受态细胞DH5a中，冰浴30分钟，42"C热击90秒，快速转移至冰上3分钟；加入37'C预热的LB培养基800U1，37"C震荡培养45分钟，4000rpm离心2分钟，弃部分上清，约留200ii1，混匀；均匀涂布在加有16p1X-gal(50mg/pl)和4ulIPTG(200mg/ul)LB板上，倒放平皿，37。C过夜；d)阳性克隆菌的鉴定在涂布有X-gal和IPTG的LB琼脂平板上挑选白色单个菌落，接种于含有AMP(氨苄青霉素)的LB培养基中，37'C震荡培养12小时后，提取质粒；e)质粒的制备:用碱裂解法提取质粒。用50ul水溶解质粒DNA，保存在-2(TC。所述病毒全基因组序列测定、拼接如下述a-c，a)序列测定采用ABIPRISM3770型核酸序列测定仪进行测序，具体操作按照仪器说明书进行；b)序列拼接利用软件VectorNtisoftware(InforMaxInc.,USA)将测序结果拼接成完整的病毒基因组序列，基因组长度为11037bp(序列表SEQIDN0.1)，与HIRRV韩国株(GenBankAcc.No.NC—005093)相似，病毒核酸为单链RNA，GC含量50.8%。10、根据权利要求8或9所述的一种牙鲆弹状病毒的全基因组序列的测序方法，其特征是基因组序列验证序列分析基因组在DNAStar软件，http:〃www.softberry.com(SoftberryInc.,MountKisco，N.Y.)禾口http://www.ncbi.nlm.riih.gov/projects/gorf(ORFfinder)运行分析，验证所有的开放读码框(Openreadingframes,ORFs)，所有的开放阅读框都由ATG开始，至少编码40个氨基酸才成为一个假定基因；序列验证分别根据每个0RF的序列设计了引物，进行PCR扩增，由于L基因太长，因此设计4对引物，将其分成4段扩增，扩增产物测序，与所预测的ORF序列进行比较，验证HRV的五个开放阅读框的存在和序列。全文摘要本发明属于生物
技术领域：
。一种牙鲆弹状病毒的全基因组序列，如序列表SEQIDNO.1所示的序列，全长包括11037个核苷酸。本发明是采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、分子克隆和核酸序列测定技术，对牙鲆弹状病毒进行了分段扩增、克隆、序列测定及分析。牙鲆弹状病毒基因组由11037个核苷酸组成，包括5个开放读码框(ORF)，病毒核酸为单链RNA，GC含量50.8％，其中的部分核苷酸序列可以用于牙鲆弹状病毒的分子学诊断和相关核酸疫苗的开发。该基因组为中国首次在石鲽鱼中分离出的牙鲆弹状病毒的基因组序列进行测定，对进一步研究该病毒的致病机理和检测方法有着重要的意义。文档编号C12N15/40GK101629179SQ20091001317公开日2010年1月20日申请日期2009年8月13日优先权日2009年8月13日发明者荭刘,斌吴,孙颖杰,岳志芹,叶李申请人:孙颖杰;刘荭;岳志芹;吴斌;李叶