专利名称：鉴定太平洋牡蛎种群的新方法
技术领域：
本发明涉及一种新的快速准确鉴定牡蛎种群的方法。
背景技术：
牡蛎的贝壳可塑性强，贝壳外部形态差异极大，研究人员积极寻求其 它研究手段，以求解决牡蛎分类中存在的疑难问题。大部分学者认为牡蛎 软体部的结构差异很小，可提供的分类证据少。绝大多数的牡蛎具有恒定 的染色体数目(2n=20)，并且核型的差异甚微，无法为区别牡蛎物种提供 证据(参见AhmedM . Cytogenetics of oysters. Cytologia， 1973， 28: 337-346.)。在借助生化手段方面，蛋白质和同工酶电泳技术被用于研究 属间的遗传多样性分析以及对分布区重叠的种群间的种类鉴定，但电泳分 析结果应用于种类鉴别上的有效性，尚存在诸多争议(参见Hedgecock D，0kazaki N B. Genetic diversity within and between population of American oyster(Crassostrea). Malacologia， 1984， 25: 535-549.)。此 外，地理分布常是牡蛎物种鉴定的主要依据之一，但有不少研究表明，一 些具有不同地理分布而被界定为不同种的牡蛎，很容易杂交，产生可存活 的并且具有繁育能力的后代(参见Gaffney P M， Allen S K Jr. Hybridization among Crassostrea species:a critical reviews. Aquaculture， 1993， 116: 1-13.)。因此，由于缺少有效的鉴定 种群的方法，在相当长的一段时期内，牡蛎的种名混乱，同物异名和异物 同名等现象十分严重。
此外异地引种养殖频繁，打破了牡蛎种间的地理隔离，对我国的牡蛎 种质资源造成了严重的影响，进一步加剧了现有牡蛎形态分类的难度。分 类方面的混乱已严重影响到牡蛎的养殖和育种，给杂交育种工作的开展带 来了诸多不便。微卫星最早应用之一是制作DNA指纹图来逝行^体、.:品种'(系}.鉴定。
2006年，D. Lallias等人用微卫星分子标记技术首次绘制出欧洲牡蛎的遗 传图谱(参见D. Lallias， A. R. Bea画nt卞School of Ocean Sciences, College of Natural Sciences, University of Wales, Bangor, Menai Bridge, Gwynedd， 1X59 5AB， UK. A first-generation genetic linkage map of the European flat oyster Ostrea edulis (L ) based on AFLP and microsatellite markers [J]. Mol Ecol. 2006,15(13): 29-42.)
现中国养殖的主要经济牡蛎太平洋牡蛎，为了更好的准确鉴定牡蛎种 群和顺利地进行遗传育种工作，迫切需要一种省时准确的方法，从而达到 保护牡蛎资源的目的。
发明内容
本发明的目的是解决牡蛎种质鉴定和遗传育种存在的不足问题，提供 一种鉴定太平洋牡蛎种群的新方法，应用EST-SSRs分子标记技术，从不同 种群牡蛎(褶牡蛎，近江牡蛎，太平洋牡蛎等)中分离出太平洋牡蛎群体， 方法简单，分析准确。
本发明为实现上述目的采用的技术方案是鉴定太平洋牡蛎种群的新 方法，
1) 样本采集分别采集褶牡蛎、太平洋牡蛎和近江牡蛎不同的种群样 本个体；
2) 基因组提取提取上述样本每种牡蛎群体的多个样本的基因组；
3) 引物设计根据含有微卫星的EST序列设计EST- SSRs引物；
4) PCR扩增利用EST-SSRs引物进行PCR扩增，得到目的片段的PCR 产物；
5) EST- SSRs特异位点的鉴定对PCR产物先进行琼脂糖凝胶电泳， 得到具有清晰且稳定条带的PCR产物，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳， 进行多态性位点检测，鉴定出具有特异的EST微卫星序列的等位基 因位点太平洋牡蛎种群。
所述样本采集分别选取褶牡蛎、太平洋牡蛎、近江牡蛎各40以上个体，每个牡蛎取其闭壳肌0. 1克放入1. 5ml离'心管,中，—力ft六J9^乙醇后放入
-2(TC冰箱中保存备用。
所述基因组提取参照萨姆布鲁克等经典酚-仿抽提法从牡蛎肌肉中提 取牡蛎的全基因组DNA(参见萨姆布鲁克J，弗里奇EF，蔓尼阿蒂斯T，着.分 子克隆实验指南[M].金冬雁，黎孟枫，侯云德，等译.第2版.科学出版 社.1992， 63-481.)。
所述EST-SSRs引物设计从NCBI(http:〃鳳ncbi.nlm. nih.gov/) 的EST库中搜索太平洋牡蛎的EST序列，然后用在线软件SSRIT (http://ww.gramene.org/db/markers/ssrtool)找出含有微卫星的EST 序列，根据这些含有微卫星的EST序列利用在线引物设计软件 Premier3. 0(http://frodo. wi. mit. Edu/cgibin/primer3/primer 3—ww.cgi)设计EST-SSRs引物，引物设计主要参数为引物长18-22bp ， 最适20bp;引物退火温度55-65'C，上下引物之间退火温度不超过5r; GC 含量40%-60%，最适50%; PCR预期产物长150-300bp。
所述EST-SSRs引物设计设计适用于太平洋牡蛎的引物序列
F-------- 5， GCAGAGATGGTCTGGAAAGC 3，
r---------5， ctggctggagaagaacaagg 3,。
所述EST-SSRs的PCR扩增以提取的全基因组DNA样品分别为模板， 对EST-SSRs引物进行PCR扩增。
所述EST-SSRs特异位点的鉴定首先经过琼脂糖凝胶电泳，得到扩增 条带稳定、条带清晰的pcr产物；再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，扩增条带稳 定、条带清晰且有多态性的EST-SSRs引物即是太平洋牡蛎群体。
为检测本发明鉴定方法的精确度，对牡蛎群体特异性微卫星位点的等 位基因纯合体的基因型的序列测定，进行验证对这个特异位点的纯合体 的基因序列进行其扩增产物纯化；将纯化后的标记克隆到载体上，然后测 定其dna碱基序列加以验证。
本发明是以太平洋牡蛎的EST序列设计弓I物的序列。太平洋牡蛎群体 在位点S5PCR扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳上有两个等位基因，表现出此位点的多态性(见图3);而其他牡蛎群体頃茌聚丙:烯酰胺凝胶凝
胶电泳上只有一条带，即一个等位基因存在，没有的多态性(见图4)。 即位点S5在太平洋牡蛎群体中有多态性，而在褶牡蛎和近江牡蛎等群体中 没有。依据聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳图谱上的多态性，从而达到从牡蛎群体中分 离太平洋牡蛎群体的目的。该方法省时有效且可靠性强，可以作为经济牡 蛎遗传种质鉴定、系统进化分析、选育和杂交育种工作提供了依据。
本发明的优点是本发明利用了 EST-SSRs分子标记技术应用于不同种 群牡蛎进行了遗传分析，引物设计合理，二步电泳检测，达到鉴定太平洋 牡蛎种群的目的，方法简单，省时且分析准确。本发明利用EST-SSRs分子 标记技术研究太平洋牡蛎的遗传结构使其区别于近江牡蛎、褶牡蛎的遗传 信息，从分子水平揭示太平洋牡蛎与其他几种群之间的遗传变异，找到了 区分群体遗传结构稳定的重复性好的EST-SSRs的标记位点，为牡蛎的种质 资源保护提供有力的科学依据。
图1显示的是牡蛎基因组琼脂糖凝胶电泳图
图2显示的是太平洋牡蛎养殖群体在位点S5PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳图。
图3显示的是太平洋牡蛎养殖群体在位点S5的EST-SSRs聚丙烯酰胺凝 胶电泳。
图4褶牡蛎、近江牡蛎等群体的在位点S5 EST-SSRs聚丙烯酰胺凝胶 电泳图。
图5太平洋牡蛎位点S5的微卫星测序图(纯合体)。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明用进一步的详细描述，但本发明并不局 限于具体实施例 实施例1
鉴定太平洋牡蛎种群的新方法，按下述工艺过程进行鉴定。1、 样本采集
褶牡蛎自然群体40个样本采自于大连开发区海域；太平洋牡蛎养殖群 体40个样本购自天津王顶堤水产品市场；近江牡蛎40个样本购自海南省 海口山高鲜活水产品批发市场。每个牡蛎取其闭壳肌放入1. 5ml离心管中， 加入95%乙醇后放入-201:冰箱中保存备用。
2、 基因组的提取
按照酚-仿抽提法提取三个牡蛎群体120个个体的总DNA，经0. 8%的琼 脂糖电泳检测，大多数的DNA都比较完整，样品的片段大小在23kb左右， 基本不含其它杂质及RNA，可以用来进行PCR的扩增。如图1显示的是部分 DNA检测的结果。
3、 EST-SSRs引物设计
从NCBI (http:〃ww. ncbi. nlm. nih. gov/)的EST库中搜索太平洋牡蛎 的 EST 序列， 然后用在线软件 SSRIT (http:〃www. gramene. org/db/markers/ssrtool)找出含有微卫星的EST 序列，根据这些含有微卫星的EST序列利用在线引物设计软件 Premier3. 0(http:/7frodo. wl. mit. Edu/cgibin/primer3/primer 3—www. cgi)设计EST-SSRs引物，共设计了 50对引物，引物设计主要参数 为引物长18-22bp ，最适20bp;引物退火温度55-65X:，上下引物之间退 火温度不超过5°C; GC含量40%-60%，最适50%; PCR预期产物长150-300bp。 由上海生工生物工程技术有限公司合成。适用于太平洋牡蛎的引物序列
F-------- 5， GCAGAGATGGTCTGGAAAGC 3，
R---------5， CTGGCTGGAGAAGAACAAGG 3，。
4、 EST-SSRs的PCR扩增
DNA片段的定性检测可以用琼脂糖凝胶电泳检测。首先对上述EST-SSRs 引物进行梯度PCR扩增。
5、 EST-SSRs的特异位点的鉴定
琼脂糖凝胶电泳分辨率较低，PCR扩增DNA片段产物的长度相差在15 bp 以下时则难以区分，只能作初步判断，不可检测差异很小往往是几个碱基的微卫星多态性。所以，本发明先采用琼脂糖凝胶C泳'^JI;,.fi^采超聚丙烯
酰胺凝胶电泳检测，分析微卫星多态性。
(一) 琼脂糖凝胶电泳
PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段在范围内表现为单一条 带，如图2所示。
(二) 聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1) 玻璃板的清洗用试管刷沾上洗涤剂把玻璃板擦洗干净后，用清 水冲洗干净，放入烘箱备用。
(2) 凝胶的灌制玻璃板清洗干净并且烘干后，用胶条将两块板子底 部封住，然后用夹子固定好。将配制好的胶液(30%丙烯酰胺溶液10ml， 5 倍TBE6ml，双蒸水14ml， 10%过硫酸胺溶液200 u 1， TEMED15 ti 1)沿着梳 子插槽边缘缓慢地倒入玻璃板的空隙中(不能产生气泡)，然后立即插入梳 子。如果出现气泡，可以轻轻敲玻璃板，使气泡溢出。 一般聚合30min便 可聚合完全。如室温较低时，聚合时间适当延长。
(3) 上样与凝胶电泳划开玻璃板下端胶带，固定在电泳槽上，电泳 槽上端加满1倍TBE。用注射器冲洗加样孔(轻柔)。
(4) 140V电压，预电泳15分钟，同时准备点样。
(5) 扩增产物与上样缓冲液按体积比l: 5混匀后，用移液枪加入点样 孔内。点样后，不可挪动电泳槽或取下玻璃板。1倍TBE， 130V恒压电泳6个 小时。
(三)、银染方法来观察结果 银染按照许绍斌的方法并略作改进,具体步骤如下
(1) 凝胶的固定电泳结束后，关闭电泳仪,拿出玻璃板并用小刀小心撬 开，移走上层玻璃板，轻轻用小刀把胶剥开一角，放入加有固定液的瓷盘中 (固定液10%乙醇溶液，每板用量为200ml)在摇床上缓缓摇动10min。
(2) 洗胶:倒掉瓷盘中的固定液，用双蒸水洗3次，共计lmin;
(3) 凝胶的染色:倒掉瓷盘中的水,加入染色液(O. P/。AgN03溶液，每板 200ml),在摇床上缓缓摇动染色15min;(4)洗胶:倒掉瓷盘中的染色液，用双蒸水洗3!f，共ifl、ctifi;
(5) 显色加入显色液(2g NaOH， 0. lg Na2C03，加双蒸水到250ml，在 加入800ul甲醛)，振荡显色， 一般5-15min内，带型显现。
(6) 终止待带型清晰时，将胶用清水冲洗干净，以防止污染仪器，然 后放置在扫描仪上扫描。(在胶上铺一层吸水纸以防止扫描仪盖子与聚丙 烯酰胺凝胶之间的气泡影响扫描效果。)
经过琼脂糖凝胶电泳检测的有清晰且稳定条带的PCR产物，再进行聚 丙烯酰胺凝胶电泳检测，最后此弓I物在太平洋牡蛎群体表现出特异性条带 清晰并且有多态性。
太平洋牡蛎群体在位点S5PCR扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳上
有两个等位基因，表现出此位点的多态性(见图3);而其他牡蛎群体中 在聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳上只有一条带，即一个等位基因存在，没有的 多态性(见图4)。位点S5在太平洋牡蛎群体中有多态性，而在褶牡蛎和 近江牡蛎等群体中没有。 实施例2:
牡蛎群体特异性微卫星位点的等位基因纯合体的基因型的序列测定， 为了进一步说明上述特殊位点，本发明对这特异性位点的纯合体基因型进 行了克隆，具体过程如下
经过PCR扩增后的PCR产物100ml经过纯化后进行连接反应，提前制 备LB液体培养基和LB固体培养基，连接反应进行完毕后，连接液在无菌 操作台上进行涂板，然后在培养箱中培养，培养结束后在4度冰箱里进行 显色反应，然后挑取白色的大小适中的单个菌落在液体培养基中摇菌，摇 菌过程也是在培养箱中进行。最后以菌液为模板进行PCR检测，在琼脂糖 凝胶电泳上检测PCR产物，如果胶上有目标片段，证明克隆成功，然后将 菌液送至大连宝生物工程有限公司进行测序。测序结果见图5。从测序的峰 图5可以看出，这些位点是的微卫星，如位点S5在太平洋牡蛎的纯合体中 分别含有7个微卫星。
通过以上说明本发明提供了一种很好的鉴别太平洋牡蛎种群的方法，在三个牡蛎群体的研究中，基因座位S5，在;t乎洋:牡蛎群体.中^",^个等位
基因表现多态，而在褶牡蛎自然群体和近江牡蛎养殖群体中没有扩增出特 异条带。这个位点可以作为区分种群的特异性标记。
权利要求
1、鉴定太平洋牡蛎种群的新方法，其特征是1)样本采集分别采集褶牡蛎、太平洋牡蛎和近江牡蛎不同的种群样本个体；2)基因组提取提取上述样本每种牡蛎群体的多个样本的基因组；3)引物设计根据含有微卫星的EST序列设计EST-SSRs引物；4)PCR扩增利用EST-SSRs引物进行PCR扩增，得到目的片段的PCR产物；5)EST-SSRs特异位点的鉴定对PCR产物先进行琼脂糖凝胶电泳，得到具有清晰且稳定条带的PCR产物，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行多态性位点检测，鉴定出具有特异的EST微卫星序列的等位基因位点太平洋牡蛎种群。
2、 根据权利要求1所述的鉴定太平洋牡蛎种群的新方法，其特征是 样本采集分别选取褶牡蛎、太平洋牡蛎、近江牡蛎，每个牡蛎取其闭壳 肌放入1. 5ml离心管中，加入95。/。乙醇后放入-2(TC冰箱中保存备用。
3、 根据权利要求l所述的鉴定太平洋牡蛎种群的新方法，其特征是 基因组提取采用经典酚-仿抽提法从牡蛎肌肉中提取牡蛎的全基因组DNA。
4、 根据权利要求1所述的鉴定太平洋牡蛎种群的新方法，其特征是 EST-SSRs引物设计从NCBI (http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/)的EST库 中搜索太平洋牡蛎的EST序列，然后用在线软件SSRIT(http:〃www. gramene. org/db/markers/ssrtool)找出含有微卫星的EST 序列，根据这些含有微卫星的EST序列利用在线引物设计软件 Premier3. 0(http://frodo. wi. mit. Edu/cgibin/primer3/primer 3—www.cgi)设计EST-SSRs引物，引物设计主要参数为引物长18-22bp ， 最适20bp;引物退火温度55-65。C，上下引物之间退火温度不超过5。C; GC 含量40°/。-60%，最适50%; PCR预期产物长150-300bp。
5、根据权利要求1所述的鉴定太平洋牡蛎种群酌新.方*^ 其特征是-EST-SSRs引物设计设计适用于太平洋牡蛎的引物序列F--------5， GCAGAGATGGTCTGGAAAGC 3，r---------5， ctggctggagaagaacaagg 3，。
6、根据权利要求1所述的鉴定太平洋牡蛎种群的新方法，其特征是: EST-SSRs的PCR扩增以提取的全基因组DNA样品分别为模板，对EST-SSRs 引物进行pcr扩增。
7、根据权利要求1-6任一所述的鉴定太平洋牡蛎种群的新方法，其特 征是EST-SSRs特异位点的鉴定首先经过琼脂糖凝胶电泳，得到扩增条 带稳定、条带清晰的PCR产物；再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，扩增条带稳定、 条带清晰且有多态性的EST-SSRs引物即是太平洋牡蛎群体。
全文摘要
本发明涉及鉴定牡蛎种群的方法。鉴定太平洋牡蛎种群的新方法，样本采集分别采集褶牡蛎、太平洋牡蛎和近江牡蛎不同的种群样本个体；基因组提取提取上述样本每种牡蛎群体的多个样本的基因组；引物设计根据含有微卫星的EST序列设计EST-SSRs引物；PCR扩增利用EST-SSRs引物进行PCR扩增，得到目的片段的PCR产物；EST-SSRs特异位点的鉴定对PCR产物先进行琼脂糖凝胶电泳，得到具有清晰且稳定条带的PCR产物，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行多态性位点检测，鉴定出具有特异的EST微卫星序列的等位基因位点太平洋牡蛎种群。本发明利用了EST-SSRs分子标记技术，引物设计合理，二步电泳检测，达到鉴定太平洋牡蛎种群的目的，方法简单，省时且分析准确。
文档编号C12Q1/68GK101613741SQ20091001311
公开日2009年12月30日 申请日期2009年8月11日 优先权日2009年8月11日
发明者仇雪梅, 刘少贞, 丽 徐, 柳晓瑜, 王秀利 申请人:大连水产学院