专利名称：一种黑曲霉菌种及其在厌氧发酵制备低聚果糖中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属低聚果糖制备领域，涉及一种厌氧发酵法生产低聚果糖的方法。
背景技术：
低聚果糖是指2 8个果糖基为链节，以一个葡萄糖基为链的端基，以果糖基一果糖连 接键为主体骨架连结形成的功能性低聚糖。低聚果糖是一种能激活人体益生菌群增殖，促 进人体微生态平衡的益生元，被公认为具有调节胃肠道功能、降低血酯、调节机体平衡、 提高免疫力等健康作用，也是一种典型的水溶性膳食纤维，已被广泛用作功能性配料或者 直接服用。
目前，国内外工业化生产的方法主要是先筛选出产低聚果糖酶菌种，然后破碎菌体制 备固定化酶制剂，采用好氧发酵技术进行低聚果糖的生产，工艺路线较长，设备投入多。 另外好氧发酵技术通风量大，无菌空气制备系统能耗高。通常制备的低聚果糖产品外观混 浊、颜色黄、色泽差，产品透光率85%以下，产品应用范围受到限制，同时菌体只能利用一 次。
发明内容
本发明的目的在于实现一种新的厌氧发酵生产低聚果糖产品方法，该方法可简化工艺路 线，去除无菌空气制备系统，菌体实现回收循环利用，减少了设备投入，产品具有无色透 明，透光率达歪1」90%以上，保质期长，成本低等特点。
本发明提供了一种黑曲霉菌种(A9Pe2^i""s ; &e" BLBll，已在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所， 保藏时间2009年3月17日，保藏号CGMCC No. 2952。
本发明同时提供了一种应用黑曲霉菌种(A5per^7hsBLB11厌氧发酵蔗糖溶液 生产低聚果糖产品方法。包括黑曲霉BLB11生产用菌种的培养，使用生产菌种厌氧发酵蔗糖 溶液和分离提纯、加工制备高纯度低聚果糖。
本发明采用的技术方案包括如下步骤 1.菌种分离和筛选
从禹城市甜菜园土壤中分离得黑曲霉菌株BLB-09，操作方法如下 称取10g土壤，加入90mL无菌水中，震荡摇匀，酒精擦拭后移入超净工作台。准备6 支装有9mL无菌水的试管，编号1~6。用移液枪移取1000uL悬浊液置于1号试管，再 移取1000"L1号试管悬浊液置于2号试管，依次做六个试管梯度稀释。用移液枪分别取4、 5、 6号試管溶液各200pL (每个试管取2~4份)置于合适的培养基平板，用涂抹棒均匀 涂抹，培养至平板长出成熟菌落，鉴定并分离纯化黑曲霉菌落，将单菌落接种斜面，并接 种摇瓶，初筛测定产低聚果糖的转化率。根据摇瓶产低聚果糖的转化率水平筛选出斜面出
3发菌株一黑曲霉BLB-09。
分离斜面培养基马铃薯30g、蔗糖3.0g、 K2HP04 0. lg、 MgS040.05g、 1.5 2.0g琼脂， 蒸馏水100mL，自然pH值，12rC灭菌1小时。培养温度28~30°C。
摇瓶种子培养基麸皮3 g、尿素0.5 g、蔗糖5 g、可溶性淀粉2 g 、 K2HP04 0. lg、 MgS040.05g，蒸馏水100mL，自然pH值，121。C灭菌1小时。培养温度28 30。C。
采用紫外线、微波及硫酸二乙酯复合诱变处理。通过产低聚果糖的转化率测定筛选得到
优良的高产胞外酶菌株，用于厌氧发酵产低聚果糖的生产。具体操作步骤如下
菌种诱变
1) 紫外线诱变接种环挑取黑曲霉BLB-09斜面孢子于装有无菌水的三角瓶中，置于磁
力搅拌器上振荡lh，使孢子萌发。将孢子悬液倒入含无菌大头针的无菌平皿。打开平皿盖，
在事先预热好的20 W的紫外灯下24 cm处照射Os、 20s、 40s、 60s、 80s、 100s、 120 s，不 同照射剂量菌液稀释到10"，黑暗处放置1 h。再用生理盐水分别稀释菌液到l(T3，吸取稀 释好尚菌液O.l mL涂布56 Be'麦芽汁琼脂培养基平板，每个稀释度涂布3个平板。将涂好 的平皿用黑布包好，置生化培养箱28 'C培养5d左右，至长出成熟菌落，统计致死率。
2) 微波诱变选取紫外诱变后致死率90%以上菌株进行筛选，得优良菌株UV-62继续 微波处理。
采用频率为2450 MHz，功率1200 W的微波炉，低火，分别以0、 20、 40、 60、 80、訓s 辐射处理菌株UV-62，操作步骤如紫外诱变，然后菌液稀释涂布50 Be'麦芽汁琼脂培养基平板， 培养5d，挑取单菌落至斜面培养。经筛选得优良菌株WB-26。
3)硫酸二乙酯诱变对菌株WB-26进行硫酸二乙酯处理。取活化好的菌种WB-26斜 面，用0,2mol/L， pH7.0的磷酸缓冲液洗下孢子，装入带玻璃珠的三角瓶中震荡2h，镜检菌 悬液，调节孢子数为10:l(rS/mL。取出制备好的孢子悬液lOmL，加入1%硫酸二乙酯0.2mL， 混匀后置于恒温震荡箱中，28°C，分别震荡IO， 20， 30， 40， 50， 60， 70min，待反应完成 后后，立即加入25y。硫代硫酸钠溶液0.5mL终止反应。同时另取孢子悬液10mL。不加硫酸 二乙酯作为对照。用0.2mol/L， pH7.0的磷酸缓冲液将对照及诱变后的孢子悬液分别稀释至 IO"4。分别吸取1(T2、 l(T3、 10^的孢子悬液0.2mL加到5GBe'麦芽汁琼脂培养基平皿上涂布， 然后置生化培养箱28'C培养5d左右，至长出成熟菌落，统计致死率，并从平皿中随机挑选 单菌落，
筛选选取平板菌落进行摇瓶培养，测定转化率。
转化率测定以10%蔗糖溶液为底物，加入适量菌体细胞，总体积为20mL，置于三角瓶 中，在最适反应温度，转速200r/min的恒温回旋式摇床中反应60min，取出于85°。水浴10min 将菌体灭活，冷至室温，于10000r/min台式离心机上离心2min，取上层清液，作为HPLC 法测定蔗果三糖含量的试液。从中筛选出高转化率菌株黑曲霉(A;wg//tom'gw) BLBll。
2、生产用菌种培养 _
产低聚果糖黑曲霉菌种BLB-11经斜面培养后，接入一级或二级种子培养基中培养，得 到扩大培养的生产用菌种；定期镜检至菌丝生长到对数期末，然后即可转入发酵罐使用。
斜面培养基5GB6麦芽汁琼脂培养基麦芽浸膏3克、葡萄糖10克、酵母浸膏3克、
4蛋白胨5克、琼脂20克水1000毫升；pH自然，温度28 3(TC
种子培养基麸皮3 g、尿素0. 5 g、蔗糖5 g、可溶性淀粉2 g 、 K2HP040. lg、 MgS040. 05g， 蒸馏水100mL，自然pH值，121。C灭菌1小时。培养温度28 30。C。
3、 厌氧发酵
将菌种以P"4(mV/V的量(菌种与蔗糖溶液体积比)转入蔗糖溶液中，在厌氧发酵罐中 进行厌氧发酵转化，蔗糖浓度10 60%， pH值4 7,反应温度25 6(TC,厌氧发酵反应 10 36小时，得到低聚果糖含量50%以上的反应液；
优选的蔗糖溶液浓度为40 60%，菌种加入量为10 20%。
4、 分离提纯、加工
发酵完成后用0.1 1微米的微滤膜行过滤回收菌体，菌体回收利用于下一批次生产， 料液进行灭菌处理，加入新型生物絮凝剂，絮凝温度60 9(TC，时间10 30分钟，使菌体 蛋白形成大的颗粒；
料液进行过滤脱色处理，脱色温度60 9(TC，脱色10 30分钟，过滤速度明显加快， 糖液清亮，透光率达到90%以上；
对脱色过滤后的料液采用固定床离交净化、浓縮、干燥、包装等手段制取相应的液体或 固体产品。
发明效果
本发明表明菌种在厌氧发酵罐中厌氧转化蔗糖生成低聚果糖，包括蔗果三糖、蔗果四 糖、蔗果五糖、蔗果六糖等，发酵过程不需要空压设备提供无菌空气，减少设备投入，降 低能源消耗。发酵结束后，反应液利用微滤膜回收菌体，料液经过灭菌、加入生物絮凝剂， 使菌体形成大的颗粒，提升过滤速度。然后通过精制除去糖液中的杂质，制备的低聚果糖 透光率达到90%以上，产品组分50 60%,产品质量明显提升。
如工业化生产低聚果糖50吨转化罐，原好氧发酵生产低聚果糖需要配备相应的空气压 缩机、无菌空气管路系统，而且无菌空气过滤滤芯也要经常更换。50吨单罐配备无菌空气 系统投资大约在40万元，每小时耗电量240kWh以上，100吨单罐配备无菌空气系统投资大 约在70万元，每小时耗电量420kWh以上，能源消耗大。生产量越大，罐体越多，设备投 资及相关基础投资更大。采用厌氧发酵转化技术可以去除好氧发酵所需的如上述大量的基 础投资和无菌空气制备设备投资，节省占地空间，同时减少大量的能源消耗。微滤膜技术 实现菌体的回收利用，进一步减少能源消耗，精制手段使产品质量明显提升。
具体实施例方式
实施例1 取4000克蔗糖加入15升厌氧发酵罐中，加水6000克，加热溶解后，调解料 液pH值5，然后接入扩大培养的低聚果糖生产菌种，菌种接入量10% (V/V)，温度控制在 50'C，反应时间15小时。发酵转化完毕，微滤膜过滤回收菌体，菌体回收利用于下一批次 生产，然后料液升温至10(TC灭菌10分钟，加入适量生物絮凝剂，絮凝温度60 9(TC，絮 凝完毕料液中加入0. 05 0. 1%活性炭脱色处理，处理30分钟，后经精制、浓縮、包装等处 理，得到低聚果糖含量57.2%的成品液体，产品透光率94.6%。
实施例2取6000克蔗糖加入15升厌氧发酵罐中，加水5000克，加热溶解后，调解料液pH值5.5，然后加入扩大培养的低聚果糖生产菌种，菌种接入量20%，温度控制在3(TC， 反应时间20小时。发酵转化完毕，微滤膜过滤回收菌体，菌体回收利用于下一批次生产， 然后料液升温至10(TC灭菌10分钟，加入适量生物絮凝剂，絮凝温度60 9(TC，絮凝完毕 料液中加入0.05 0.1%活性炭脱色处理，处理30分钟，后经精制、浓縮、包装等处理，得 到低聚果糖含量58%的成品液体，产品透光率93. 2%。
实施例3 取5000克蔗糖加入15升厌氧发酵罐中，加水5000克，加热溶解后，调解料液 pH值6，然后加入扩大培养的低聚果糖生产菌种，菌种接入量15%，温度控制在50'C，反 应时间25小时。发酵转化完毕，微滤膜过滤回收菌体，菌体回收利用于下一批次生产，然 后料液升温至10(TC灭菌10分钟，加入适量生物絮凝剂，絮凝温度60 9(TC，絮凝完毕料 液中加入0.05 0. 1%活性炭脱色处理，处理30分钟，后经精制、浓縮、包装等处理，得到 低聚果糖含量56. 8%的成品液体，产品透光率92. 6%。
实施例4 取6000克蔗糖加入15升厌氧发酵罐中，加水5000克，加热溶解后，调解料液 pH值7，然后加入扩大培养的低聚果糖生产菌种，菌种接入量20%，温度控制在3(TC，反 应时间30小时。发酵转化完毕，微滤膜过滤回收菌体，菌体回收利用于下一批次生产，然 后料液升温至10(TC灭菌10分钟，加入适量生物絮凝剂，絮凝温度60 9(TC，絮凝完毕料 液中加入0.05 0.1%活性炭脱色处理，处理30分钟，后经精制、浓縮、包装等处理，得到 低聚果糖含量56. 5%的成品液体，产品透光率93. 2%。
权利要求
1.一种黑曲霉菌种(Aspergillus niger)BLB-11，已于已于2009年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.2952。
2. —种应用黑曲霉"印^^7'77i/s /7&er) BLB-ll菌种厌氧发酵制备低聚 果糖方法，其特征包括黑曲霉BLB11生产用菌种的培养，使用生产菌种厌氧发酵 蔗糖溶液和分离提纯加工制备高纯度低聚果糖。
3. 如权利要求2所述的应用黑曲霉(Asper^7"s/7iger) BLB-ll菌种厌氧发 酵制备低聚果糖方法，其特征在于黑曲霉BLB11生产用菌种的培养方法为黑 曲霉菌种BLB-11经斜面培养后，接入一级或二级种子培养基中培养，得到扩大培 养的生产用菌种；定期镜检至菌丝生长到对数期末，然后即可转入发酵罐使用；斜面培养基5GB6麦芽汁琼脂培养基麦芽浸膏3克、葡萄糖10克、酵母 浸膏3克、蛋白胨5克、琼脂20克水1000毫升；pH自然，温度28 30。C;种子培养基麸皮3 g、尿素0. 5 g、蔗糖5 g、可溶性淀粉2 g 、 K2HP04 0. lg、 MgS040.05g，蒸馏水100mL，自然pH值，121'C灭菌1小时。培养温度28 30。C。
4. 根据权利要求2所述的应用黑曲霉U^wg说^ BLB-11菌种厌氧 发酵制备低聚果糖方法，其特征在于用于生产的BLB11菌种的培养方法为5° B 6麦芽汁琼脂培养基麦芽浸膏3克、葡萄糖10克、酵母浸膏3克、蛋白胨5 克、琼脂20克水1000毫升；pH自然，温度28 30。C。
5. 如权利要求2所述的应用黑曲霉(^y/ wgz7/^ "/ger) BLB-ll菌种厌氧发 酵制备低聚果糖方法，其特征在于生产低聚果糖的操作工艺方法为将生产用菌种 转入厌氧发酵罐内，在厌氧条件下，控制蔗糖浓度10 60%，菌体细胞加入量 1-40%， pH值4 7，反应温度25 6(TC，厌氧发酵反应10~36h，得到含低聚果 糖反应液，反应液经过微滤膜除菌、脱色、精制、浓縮得到低聚果糖液体产品， 喷雾干燥得到固体低聚果糖产品。
6. 如权利要求5所述的应用黑曲霉(A/^g///^ "/gw) BLB-ll菌种厌氧发 酵制备低聚果糖方法，其特征在于蔗糖溶液浓度为40 60%，菌种加入量为10 20%。
7. 根据权利要求2所述的应用黑曲霉U^w^7/"s "/ger) BLB-11菌种厌氧 发酵制备低聚果糖方法，其特征在于厌氧发酵后对反应液进行微滤膜除菌，菌体 循环使用。
8. 根据权利要求2所述的应用黑曲霉(^pwgz7/^ "/ge。 BLB-11菌种厌氧 发酵制备低聚果糖方法，其特征厌氧发酵后对反应液进行脱色处理，脱色温度 60 90°C，脱色10 30min，然后进行过滤处理。
全文摘要
本发明涉及一种新的制备低聚果糖的方法，采用菌体厌氧发酵技术生产低聚果糖，低聚果糖组分含量50％以上。本方法工艺简单，减去好氧发酵生产低聚果糖所需配备的无菌空气制备系统及相关的电力用品，设备投入少，能源消耗低，可大大节约能源。本发明适用于生产低聚果糖的为黑曲霉(Aspergillus niger)BLB-11，经过一级或二级培养得到扩大培养的菌种，菌种转入厌氧发酵罐内，在厌氧条件下，调整蔗糖浓度10～60％，菌体细胞加入量1-40％，pH值4～7，反应温度25～60℃，厌氧发酵转化反应10～36h，得到低聚果糖含量50％以上的反应液，反应液经过微滤、脱色、精制、浓缩得到低聚果糖液体产品，浓缩后经干燥处理得到固体低聚果糖产品。
文档编号C12N1/14GK101659924SQ20091001845
公开日2010年3月3日 申请日期2009年9月29日 优先权日2009年9月29日
发明者张友亮, 栾庆民, 熊晓兰, 袁卫涛, 陈杰喜 申请人:保龄宝生物股份有限公司