专利名称：一种脱除乙硫醇的优势菌及其引种驯化方法
技术领域：
本发明涉及一种脱臭(异味)菌及其驯化方法，特别涉及一种脱除乙硫醇的优势菌的 驯化方法。
背景技术：
乙硫醇是硫系恶臭气体的主要组分，由于其往往与H2S、甲硫醇等硫系恶臭气体混合 排放，且含量要远低于H2S，因而常为人们所忽视。但其臭源广泛，毒性高，短时间吸入， 会使人精神萎糜、厌食或呕吐；长期吸入，会使人的中枢神经和血液循环系统受到伤害。 乙硫醇嗅阈值低，空气中的含量达到十亿分之一便可产生臭味，并易为衣服、皮肤、眼角 膜和鼻黏膜等吸附，臭味经久不散而被列为硫系类脱臭的重点。而且沸点低，化学稳定性 差。乙硫醇不仅对人体有危害，它与空气可形成爆炸性混合物。遇明火、高热极易燃烧爆 炸。与氧化剂接触会猛烈反应，接触酸和酸雾产生有毒气体，与水、水蒸气反应放出有毒 的或易燃的气体，与次氯酸钙、氢氧化钙发生剧烈反应。乙硫醇比空气重，能在较低处扩 散到相当远的地方，遇明火会引着回燃。随着人们生活水平提高，影响人类健康的恶臭问 题正逐渐引起关注和重视。人们现在研究出来的处理恶臭的方法主要有物理法、化学法和 近几年兴起的生物法。物理法和化学法技术较为成熟，但有其局限性，存在动力消耗大、 投资运行费用高、控制条件苛刻、产生二次污染等缺点。而生物法摆脱了以上的缺点，而 被人们广泛关注起来。
生物法的研究在工艺方面，有生物过滤工艺、生物洗涤工艺和由生物过滤和生物洗涤 工艺结合的生物滴滤工艺。工艺方面的研究基本成熟。目前具代表性的生物处理工艺，其 生物相来源于自然或人工环境中的混合菌群，虽然经驯化，但总体的代谢选择性和有效生 物的比例均较低，单位体积的处理负荷不高。国内外对脱硫菌株的研究，主要就是针对它 的生长速度，和容易控制等方面来进行。但对特效优势菌的研究很少，尤其对危害严重的 乙硫醇尚无特效降解菌。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能够脱除乙硫醇的特效优势菌及其引种驯化方 法，它能从生活污泥和工业污泥中分离筛选驯化出脱除乙硫醇的特效优势菌。
4为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现
本发明脱除乙硫醇的优势菌，是指保藏于"中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生
物中心"，保藏登记号为CGMCC NO.2808;分类命名Lysinibacillus sphaericus，微生物 菌株RG-1。保藏日期为2008年12月17日。
所述脱除乙硫醇的优势菌的特征为细菌形态为短杆状，适合pH值为6.5 8.0，温度 为20 35°C。在不同温度、pH值、摇床转速、培养时间、不同接种量、不同乙硫醇含量 对脱硫率的影响测定结果表明该菌在经DNA测定和电镜扫描观察，测定该菌为CTB138-1 AY345539.1 (Genbank accession number FJ544252)。
一种脱除乙硫醇的优势菌的引种驯化方法，它包括以下步骤
a. 选择在含硫化物的环境(生活污泥或工业污泥)中采集混合菌作为原始菌种混合液， 装入无菌纸袋或己经灭菌好的三角烧瓶中；
b. 采用添加乙硫醇的牛肉膏蛋白胨培养基作为驯化培养基，其中驯化培养基各成份按重 量比份为
1.5 3.0
8 15 3 7 0.1 3 80 93
按上述组分及加入量配成液体的驯化培养基，pH为6.5 8.0，放入微波炉中加热，使 驯化培养基混合均匀，微波炉条件为温度85t: 96。C，加热时间为3 8min，在l.lkPa下 加热灭菌后冷却，待用。
c. 在步骤a所述的原始菌种混合液中，每日按(营养成份/原始菌种混合液)=(4 6)g/(10 20)L加入营养成份，在2(TC 25 。C环境中恒温培养，所述营养成份的组成按重量 比份为
4~6 0.1 0.3 0.05 0. 08 1.1 1.8 氯化钙 1.2 1.9 硫酸亚铁 0.02 0.07
牛肉膏
蛋白胨
NaCl
乙硫醇
蒸馏水
葡萄糖
磷酸氢二钾实施过程每日将原始菌种混合液连续曝气，并每天在同一时间停曝lh，等原始菌种 混合液静置后，去掉部分上清液，加入营养成份补充营养，继续曝气。经过3 6天的强化 培养，强化培养后的混合液的悬浮物质量浓度(MLSS )达到9000 11000 mg丄—、pH值稳 定，此时污泥培养已经成熟，得到硫基菌种混合液，以进行菌种的驯化及筛选。
d. 菌种的驯化，用灭菌后的接种针沾取步骤c所述硫基菌种混合液，接种于上述步骤b 中液体的驯化培养基中，在30 'C摇床好氧培养(动态培养)驯化，一个驯化周期为7 9天。
e. 筛选优势菌种，当硫基菌种在液体驯化培养基中驯化到第7天时，细菌基本生长成 熟，在无菌室中将液体驯化培养基中的菌株，用接种棒采用多次平行划线法接种到平板培 养基中，放入恒温培养箱中进行静态培养，在无菌室挑出少量细菌，接种于体积分数为1% 1.5%乙硫醇的液体培养基中进行动态培养，用连续稀释分离法进行筛菌，筛选4 8次后， 获得脱除乙硫醇的优势菌种。
优选的，pH为7.0 7.2。
本发明与现有技术相比具有的有益效果为
本发明的驯化方法具有操作简单，方法易行，成本低等特点，经多次驯化实验，乙硫 醇异味去除率达85%以上，筛选驯化出的脱除乙硫醇优势菌种可为近年来快速发展的用于 环境保护的生物脱臭技术提供优势菌群，稳定高效运行提供保证。具有适用范围广、维护 管理简单、运行成本低、环境负荷低、无二次污染等优点，可广泛应用于污水处理厂、垃 圾处理场、畜牧养殖场、食品厂、餐饮店以及办公楼、别墅区等。随着经济的发展，人们 对环境质量要求的提高，这种利用自然界微生物进行环境保护的生物技术，尤其对来源广 泛的乙硫醇恶臭气体净化将有广阔的发展前景。
具体实施例方式
本发明主要驯化筛选脱除乙硫醇恶臭气体的优势菌种。脱除乙硫醇的优势菌种是指对 乙硫醇有高效脱除效率的菌种。
本发明的原理细菌脱除乙硫醇的特性是通过对细菌在适宜环境中的驯化培养来实现 的。首先在自然界中取一定量的混合菌种，该菌种的生长环境含有硫或硫化物。放置于含 有乙硫醇的培养基中进行驯化培养，培养一定时间，在这种培养基中生存的细菌就有了一 定的脱除乙硫醇的特性。再将此培养基中的细菌进行平板画线培养筛选，即可得到纯种脱 除乙硫醇的细菌。
下面结合实施例对本发明作进一步详述。 实施例1
本发明的引种驯化方法，包括以下步骤a. 选择某城市河边取泥样采集混合菌，装入无菌纸袋中备下一歩处理。
b. 采用添加乙硫醇的牛肉膏蛋白胨培养基作为驯化培养基，制备成平板固体驯化培养 基、斜面固体驯化培养基。其中驯化培养基包括以下组分
牛肉膏 1.5g 蛋白胨 8g
NaCl 5 g
乙硫醇 1.3 g
蒸馏水 85.2 g
pH 7.0 7.2
按上述药品及加入量配得的液体培养基，需先放入微波炉中加热，使药品混合均匀， 微波炉条件为温度85'C，加热时间为4min。在1.1 kPa下加热灭菌后冷却，待用。
c. 在原始菌种混合液中，每日加入营养成份，在25 'C环境中恒温培养。营养成份组成
及加入量如下
葡萄糖 3g
尿素 0.3 g
磷酸氢二钾 0.05 g
硫酸镁 1.5 g
氯化钙 1.8 g
硫酸亚铁 0.07 g
同时每日将原始混合液连续曝气，并每天在同一时间停曝lh，等混合液静置后，去掉 部分上清液，每日加入纯乙硫醇lml，继续曝气。经过5天的强化培养后，混合液的悬浮 物质量浓度(MLSS)已达到9800mg丄—、pH值稳定，此时污泥培养已经成熟，作为微生物 的驯化及筛选。
d. 菌种的驯化是通过选择性培养基来完成。选择性培养基是液体驯化培养基，驯化培养 基中的S源为乙硫醇。用灭菌后的接种针沾取混合液，接种于放有1%乙硫醇的液体培养基 中，30 'C摇床好氧培养(动态培养)驯化， 一个驯化周期为7天。
e. 筛选优势菌种当细菌在液体驯化培养基中驯化到第7天时，细菌基本生长成熟。 在无菌室中将液体培养基中的菌株，用接种棒采用5次平行划线法接种到平板培养基中， 放入恒温培养箱中进行静态培养。在无菌室挑出少量细菌，接种于体积分数为1%乙硫醇的 液体培养基中进行动态培养，用连续稀释分离法进行筛菌。筛选8次后，制作载玻片在显 微镜下观察，细菌形态为短杆状，经DNA测定和电镜扫描，测定该菌为CTB138-1AY345539.L在温度20 35°C、 pH值6.5 8.0、摇床转速150r.min—'、培养时间40 53h、
乙硫醇含量为1%的条件下,进行乙硫醇菌对脱乙硫醇效率的影响测定。结果表明该菌在
pH值为7.0，温度为25。C，培养时间为40h时乙硫醇脱除率达85。/。以上。 实施例2
本实施例的引种驯化方法，与实施例1的不同之处在于选择在含硫化物的工业污泥(如 制革废水)中采集混合菌。 实施例3
本实施例的引种驯化方法，与实施例1的不同之处在于营养成份包括下列组成-
葡萄糖 5.8g
尿素 0.25g
磷酸氢二钾 0.074g
硫酸镁 1.59g
氯化钙 1.91g
硫酸亚铁 0.06g
实施例3中，本实施例的引种驯化方法，与实施例1的不同之处在于液体驯化培养基
包括下列组成-
牛肉膏1.6g
蛋白胨8g
NaCl"g
乙硫醇0.25g
蒸馏水85.65g
pH7.0 7.2
实施例4
本实施例的引种驯化方法，与实施例1的不同之处在于筛选优势菌种时，将动态驯化
的成熟菌采用4次平行划线法接种到平板驯化培养基中，放入恒温培养箱中进行静态培养。 于无菌室用接种环选杆状细菌，接种于体积分数为1.5%乙硫醇的液体驯化培养基中进行动 态培养，用连续稀释分离法进行筛菌。
上述实施例仅用来进一步说明本发明的引种驯化方法，但本发明不局限于本实施例。 凡依据本发明的技术方案实质内容对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与替换等， 均落入本发明的保护范围内。
权利要求
1、一种脱除乙硫醇的优势菌，其特征是，该菌为保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏登记号为CGMCC NO.2808；分类命名Lysinibacillussphaericus；所述该菌的特征为细菌形态为短杆状，适合pH值为6.5～8.0，温度为20～35℃。
2、 一种脱除乙硫醇的优势菌的引种驯化方法，其特征是，它包括以下步骤a. 选择在含硫化物的环境中采集混合菌作为原始菌种混合液，装入无菌纸袋或已经灭菌 好的三角烧瓶中；b. 采用添加乙硫醇的牛肉膏蛋白胨培养基作为驯化培养基，其中驯化培养基各成份按重 量比份计为-牛肉膏 1.5 3.0;蛋白胨 8 15; NaCl 3 7;乙硫醇 0.1 3;蒸馏水 80 93 ;按上述组分及加入量配成液体的驯化培养基，pH为6.5 8.0，放入微波炉中加热，使 驯化培养基混合均匀，微波炉条件为温度85'C 96'C，加热时间为3 8min，在l.lkPa下 加热灭菌后冷却，待用；c. 在步骤a所述的原始菌种混合液中，每日按营养成份/原始菌种混合液=4 6g/10 20 L加入营养成份，在20。C 25 。C环境中恒温培养，所述营养成份的组成按重量比份为葡萄糖 4 6;尿素 0.1 0. 3;磷酸氢二钾 0.05 0.08;硫酸镁 Ll 1.8; 氯化钙 1.2 1.9;硫酸亚铁 0.02 0.07;实施过程每日将原始菌种混合液连续曝气，并每天在同一时间停曝lh，等原始菌种 混合液静置后，去掉部分上清液，加入营养成份补充营养，继续曝气。经过3 6天的强化培养，混合液的悬浮物质量浓度达到9000 11000mg丄—1， pH值稳定，此时污泥培养已经 成熟，得到硫基菌种混合液，以进行菌种的驯化及筛选；d. 菌种的驯化，用灭菌后的接种针沾取步骤c所述的硫基菌种混合液，接种于上述步 骤b中液体的驯化培养基中，在30 'C摇床好氧培养驯化， 一个驯化周期为7 9天；e. 筛选优势菌种，当硫基菌种在液体驯化培养基中驯化到第7天时，细菌基本生长成 熟，在无菌室中将液体驯化培养基中的菌株，用接种棒采用多次平行划线法接种到平板培 养基中，放入恒温培养箱中进行静态培养，在无菌室挑出少量细菌，接种于体积分数为1% 1.5%乙硫醇的液体培养基中进行动态培养，用连续稀释分离法进行筛菌，筛选4 8次后， 获得脱除乙硫醇的优势菌种。
3、如权利要求2所述的脱除乙硫醇的优势菌的引种驯化方法，其特征是，所述pH为 7.0 7.2。
全文摘要
一种脱除乙硫醇的优势菌及其引种驯化方法，从含有硫或硫化物的生活污泥和工业污泥等不同来源的泥样中取一定量的混合菌种，在含有乙硫醇的培养基中驯化、培养混合菌种，一定时间后在这种培养基中生存的细菌就有了一定的脱除乙硫醇的特性，利用连续稀释分离法和平板划线法多次分离筛选其菌株，得到脱除乙硫醇的优势菌种。经DNA测定和电镜扫描观察，测定该菌为CTB138-1 AY345539.1，细菌形态为短杆状。测定结果表明乙硫醇脱除率达85％以上。
文档编号C12N1/20GK101497869SQ20091007370
公开日2009年8月5日 申请日期2009年1月22日 优先权日2009年1月22日
发明者任爱玲, 斌 郭 申请人:河北科技大学