专利名称：一种可产生β-甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种地衣芽孢杆菌。
背景技术：
β -甘露聚糖酶是水解1，4_β -D-吡喃甘露糖主链的内切水解酶，属于半纤维素 酶类，作用底物主要是半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖以及甘露聚糖。在 食品、医药、造纸、纺织印染、石油开采及生物研究技术等多方面得到广泛应用，是一种非常 重要的工具酶类。目前的工业生产所使用的菌株多为真菌，且酶活仅为2300U/mL。
发明内容
本发明的目的是解决现在利用真菌产生β “甘露聚糖酶存在酶活低的问题，而提 供一种可产生β-甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌。本发明可产生β-甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis) HDGLJT-01经鉴定属于地衣芽孢杆菌(Bacillus)新种，保藏于中国典型培养物保藏中 心，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2009年11月29日，保藏编号为CGTCC NO.M209288;可产生β -甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌为革兰氏阳性兼性厌氧杆菌，宽为 0. 5 0. 8 μ m，长为1. 5 2. 0 μ m，无鞭毛、中生椭圆形芽孢，耐盐10 %，生长温度范围为 30°C 55°C，菌体单个排列或呈链状；可产生甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌在固体培养 基上生长菌落为乳白色，圆形，边缘不整齐，表面粗糙不透明，菌落直径为0. 5 1. 5mm。本发明可产生β -甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌接触酶试验为阳性、淀粉水解试验 为阳性、明胶水解试验为阳性、伏普试验为阳性、D-葡萄糖产酸试验为阳性、硝酸盐还原试 验为阳性，L-阿拉伯糖产酸、D-木糖产酸、D-甘露醇产酸、柠檬酸盐利用、丙酸盐利用、葡萄 糖产气试验为阴性、酪氨酸水解试验为阴性、吲哚试验为阴性。本发明可产生β -甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌的16S rDNA序列长度 为1605bp ；BLAST比对分析可知，与其最相近的种属是地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis (DQ020262)，相似性为 99. 8% 0本发明可产生β-甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌，所产的β-甘露聚糖酶为酸性甘 露聚糖酶，分子量约为38kD，适合反应温度为50°C 60°C，最适温度为55°C，保温30min 后，酶半失活的温度T1/2为70°C;适合反应的pH值为4. 5 6. 0，pH值为酸性时稳定性好， 中性和偏碱性时稳定性差，该酶表现出较好的耐高温活性，最高酶活性达5168U/mL。Bacillus licheniformis属于地衣芽孢杆菌(Bacillus)，保藏于中国典型培养物 保藏中心，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2009年11月29日，保藏编号为CGTCC No. M209288。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式可产生β -甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)HDGLJT-01经鉴定属于地衣芽孢杆菌(Bacillus)新种，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2009年11月29日，保藏编号为 CGTCC NO.M209288 ；可产生β -甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌为革兰氏阳性兼性厌氧杆菌， 宽为0. 5 0. 8 μ m，长为1. 5 2. 0 μ m，无鞭毛、中生椭圆形芽孢，耐盐10%，生长温度范围 为30°C 55°C，菌体单个排列或呈链状；可产生β -甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌在固体培 养基上生长菌落为乳白色，圆形，边缘不整齐，表面粗糙不透明，菌落直径为0. 5 1. 5mm。本实施方式可产生β -甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌的16S rDNA序 列长度为1605bp ；BLAST比对分析可知，与其最相近的种属是地衣芽孢杆菌 Bacilluslicheniformis (DQ020262)，相似性为 99. 8% 0参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对可产生β _甘 露聚糖酶的地衣芽孢杆菌进行生理生化鉴定可产生β“甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌接触 酶试验为阳性、淀粉水解试验为阳性、明胶水解试验为阳性、伏普试验为阳性、D-葡萄糖产 酸试验为阳性、硝酸盐还原试验为阳性，L-阿拉伯糖产酸、D-木糖产酸、D-甘露醇产酸、柠 檬酸盐利用、丙酸盐利用、葡萄糖产气试验为阴性、酪氨酸水解试验为阴性、吲哚试验为阴 性。本实施方式可产生β-甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌，所产的β-甘露聚糖酶为 酸性甘露聚糖酶，分子量约为38kD，适合反应温度为50°C 60°C，最适温度为55°C，保温 30min后，酶半失活的温度T1/2为70°C ；适合反应的pH值为4. 5 6. 0，pH值为酸性时稳定 性好，中性和偏碱性时稳定性差，该酶表现出较好的耐高温活性，最高酶活性达5168U/mL。
具体实施方式
二 本实施方式可产生β -甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)HDGLJT-01从主生物阶段怄麻液中筛选得到的。筛选按以下步骤进行取 主生物阶段怄麻液2mL置于IOOmL富集培养基培养中，在37°C、160r/min的环境中富集培 养2天；然后接种于魔芋粉分离培养基上，在37°C条件下培养2天，获得单菌落，即为地衣 芽孢杆菌。本实施方式中富集培养基由5g魔芋粉、Ig K2HPO4 ·3Η20和IOOOmL蒸馏水组成，并 调节PH值7. 2，在121°C下灭菌15min。本实施方式中魔芋粉分离培养基由5g魔芋粉、IOg蛋白胨、2g酵母膏、0.2g MgCl2 MH2OUg K2HPO4 ·3Η20、2(^ 琼脂粉禾口 IOOOmL 蒸馏水组成，并调节 pH 值 7. 2，在 121°C 下灭菌15min。本实施方式中所得地衣芽孢杆菌，所产的β -甘露聚糖酶经测试为酸性甘露聚糖 酶，分子量约为38kD，适合反应温度为50°C 60°C，最适温度为55°C，保温30min后，酶半 失活的温度T1/2为70°C ；适合反应的pH值为4. 5 6. 0，pH值为酸性时稳定性好，中性和 偏碱性时稳定性差，该酶表现出较好的耐高温活性，最高酶活性达5168U/mL。序列表<110>黑龙江大学<120> 一种可产生β -甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌<160>1
<210>1<211>1605<212>DNA
〈213〉可产生β-甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)HDGLJT-O1〈220〉〈223〉可产生β-甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) HDGLJT-01 16SrDNA 基因序列〈400〉1gctcccggccgccatggcgg ccgcgggaat tcgattagag tttgatcctg gctcaggacg 60aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgagcggac agatgggagc ttgctccctg 120atgttagcgg tggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact 180ccgggaaaccggggctaata ccggatggtt gtttgaaccg catggttcaa acataaaagg 240tggcttcggctaccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg 300gctcaccaag gcaacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga 360gacacggcccagactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt 420ctgacggagcaacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag 480ggaagaacaa gtaccgttcg aatagggcgg taccttgacg gtacctaacc agaaagccac 540ggctaactacgtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat 600tgggcgtaaa gggctcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc 660ggggagggtcattggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg aattccacgt 720gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc 780tgtaactgacgctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt 841ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag tgctgcagct 900aacgcattaagcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga 6902cgggggcccgcacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 1020ccaggtcttgacatcctctg acaatcctag agataggacg tccccttcgg gggcagagtg 1080acaggtggtgcatggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1140gagcgcaacccttgatctta gttgccagca ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg 1200tgacaaaccggaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct 1260acacacgtgctacaatggac agaacaaagg gcagcgaaac cgcgaggtta agccaatccc 1320acaaatctgttctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc 1380tagtaatcgcggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1440gtcacaccacgagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagg taacctttta ggagccagcc 1500gccgaaggtgggacagatga ttggggtgaa gtcgtaacaa ggtagccgta atcactagtg 1560aattcgcggccgcctgcagg tcgaccatat gggagagctc ccaac160权利要求
1. 一种可产生β-甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌，其特征在于可产生β-甘露聚糖 酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)HDGLJT-01经鉴定属于地衣芽孢杆菌 (Bacillus)新种，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期 为2009年11月四日，保藏编号为CGTCC No. M209288 ；可产生β -甘露聚糖酶的地衣芽孢 杆菌为革兰氏阳性兼性厌氧杆菌，宽为0. 5 0. 8 μ m，长为1. 5 2. 0 μ m，无鞭毛、中生椭 圆形芽孢，耐盐10%，生长温度范围为30°C 55°C，菌体单个排列或呈链状；可产生β -甘 露聚糖酶的地衣芽孢杆菌在固体培养基上生长菌落为乳白色，圆形，边缘不整齐，表面粗糙 不透明，菌落直径为0. 5 1. 5mm。
全文摘要
一种可产生β-甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌，它涉及一种地衣芽孢杆菌。解决了现在利用真菌产生β-甘露聚糖酶存在酶活低的问题。可产生β-甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌属于地衣芽孢杆菌新种，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2009年11月29日，保藏编号为CGTCC No.M209288；可产生β-甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌为革兰氏阳性兼性厌氧杆菌，宽为0.5～0.8μm，长为1.5～2.0μm，无鞭毛、中生椭圆形芽孢。本发明中地衣芽孢杆菌所产的β-甘露聚糖酶经测试为酸性甘露聚糖酶，分子量约为38kD，该酶表现出较好的耐高温活性，最高酶活性达5168U/mL。
文档编号C12N1/20GK102071156SQ20091007347
公开日2011年5月25日 申请日期2009年12月22日 优先权日2009年12月22日
发明者凌宏志, 宋刚, 平文祥, 葛菁萍, 赵丹, 高冬妮 申请人:黑龙江大学