专利名称：可高效表达的成熟鸡α干扰素基因及其多肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及鸡α干扰素基因及其多肽的制备方法。
背景技术：
对于兽用抗病毒生物制品来说，与传统的化学药物和疫苗相比，重组α干扰素具 有广谱高效的抗病毒活性而且不会产生耐药性与药物残留等安全性问题，但是重组鸡α 干扰素基因不能在大肠杆菌中表达或者表达量很低，而且重组鸡α干扰素在制备中复性 困难，工艺复杂，也导致生产成本过高，无法实现规模化生产。
发明内容
本发明目的是为了解决现有重组鸡α干扰素基因不能在大肠杆菌中表达或者表 达量很低，以及重组鸡α干扰素在制备中复性效果差的问题，而提供可高效表达的成熟鸡 α干扰素基因及其多肽的制备方法。可高效表达的成熟鸡α干扰素基因的序列为ATGTGCAATC ATCTGCGTCC GCAAGATGCG ACCTTTAGCC ATGATAGCCT GCAGCTGCTGCGCGATATGG CGCCGACCCT GCCGCAGCTG TGCCCGCAGC ATAACGCGAG CTGCAGCTTTAACGATACCA TCCTGGATAC CAGCAACACC CGCCAGGCCG ATAAAACCAC CCATGATATCCTGCAGCATC TGTTTAAAAT CCTGAGCAGC CCGAGCACCC CGGCGCATTG GAACGATAGCCAGCGCCAGA GCCTGCTGAA CCGCATTCAT CGCTATACCC AGCATCTGGA ACAGTGCCTGGATAGCAGCG ATACCCGCAG CCGCACCCGC TGGCCGCGCA ACCTGCATCT GACCATTAAAAAACATTTTA GCTGCCTGCA TACCTTTCTG CAGGATAACG ATTATAGCGC GTGCGCGTGGGAACATGTGC GCCTGCAGGC GCGCGCGTGG TTTCTGCATA TTCATAACCT GACCGGCAACACCCGCACCT AA。制备可高效表达的成熟鸡α干扰素多肽的方法按以下步骤实现一、应用在线软 件http://gcua. schoedl. de/(www. mrgene. com)分析出成熟鸡α干扰素基因中的稀有密 码子，然后通过大肠杆菌偏好密码子表，将成熟鸡α干扰素基因中的稀有密码子全部同义 替换为大肠杆菌偏好性密码子，经合成，得优化后的鸡α干扰素基因；二、将优化后的鸡α 干扰素基因克隆到表达载体PWL中，然后转化到大肠杆菌感受态细胞ToplO中，经筛选后诱 导表达，离心后得湿菌，然后对湿菌进行包涵体的提取和溶解；三、溶解后的包涵体经葡聚 糖凝胶S^hadex G50复性及纯化，收集蛋白，即完成可高效表达的成熟鸡α干扰素多肽的 制备。本发明将成熟鸡α干扰素基因进行优化改造，使原本不能在大肠杆菌中表达的 鸡α干扰素基因得以高效表达，表达量可达总菌体蛋白的30% ；同时，采用变性剂浓度梯 度凝胶过滤色谱对成熟鸡α干扰素进行复性并同时纯化；在预先平衡的色谱柱中从上到 下形成相应的变性剂梯度变化，在进样后，由于样品中的蛋白质远远大于变性剂分子，其在 色谱柱的停留比变性剂短，同时，通过色谱柱的变性剂浓度逐渐减少，变性的蛋白慢慢折叠形成具有天然构象与活性功能的蛋白然后与变性剂分离，所得鸡α干扰素，纯度可达98% 以上，产品的回收率为34. 14士2% ；与传统的复性及纯化的方法相比，本发明的复性及纯化 的效果好，工艺流程得到简化，提高了效率和收率，还可以将变性剂回收再利用，从而降低 生产成本，适用于规模化生产，而且本发明中所得可高效表达的成熟鸡α干扰素多肽，经 微量病变试验测定其抗病毒活性为1. 12X108IU/mg。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一本实施方式可高效表达的成熟鸡α干扰素基因的序列为ATGTGCAATC ATCTGCGTCC GCAAGATGCG ACCTTTAGCC ATGATAGCCT GCAGCTGCTGCGCGATATGG CGCCGACCCT GCCGCAGCTG TGCCCGCAGC ATAACGCGAG CTGCAGCTTTAACGATACCA TCCTGGATAC CAGCAACACC CGCCAGGCCG ATAAAACCAC CCATGATATCCTGCAGCATC TGTTTAAAAT CCTGAGCAGC CCGAGCACCC CGGCGCATTG GAACGATAGCCAGCGCCAGA GCCTGCTGAA CCGCATTCAT CGCTATACCC AGCATCTGGA ACAGTGCCTGGATAGCAGCG ATACCCGCAG CCGCACCCGC TGGCCGCGCA ACCTGCATCT GACCATTAAAAAACATTTTA GCTGCCTGCA TACCTTTCTG CAGGATAACG ATTATAGCGC GTGCGCGTGGGAACATGTGC GCCTGCAGGC GCGCGCGTGG TTTCTGCATA TTCATAACCT GACCGGCAACACCCGCACCT AA。
具体实施方式
二 本实施方式制备可高效表达的成熟鸡α干扰素多肽的方法按 以下步骤实现一、应用在线软件http://gCua. schoedl. de/分析出成熟鸡α干扰素基因 中的稀有密码子，然后通过大肠杆菌偏好密码子表，将成熟鸡α干扰素基因中的稀有密码 子全部同义替换为大肠杆菌偏好性密码子，经合成，得优化后的鸡α干扰素基因；二、将优 化后的鸡α干扰素基因克隆到表达载体PWL中，然后转化到大肠杆菌感受态细胞ToplO 中，经筛选后诱导表达，离心后得湿菌，然后对湿菌进行包涵体的提取和溶解；三、溶解后的 包涵体经葡聚糖凝胶S^hadex G50复性及纯化，收集蛋白，即完成可高效表达的成熟鸡α 干扰素多肽的制备。本实施方式步骤一中合成是由上海生物工程技术服务有限公司完成。本实施方式步骤一中所得优化后的鸡α干扰素基因经在线网站http://gCUa. schoedl. de/sequential_v2. html (www. mrgene. com)以及软件 RNAstructure 的分析，密码 子以及5’端自由能明显优于未优化前的天然鸡α干扰素。本实施方式步骤二中所得湿菌为每IL LB液体培养基可得到湿菌3 5g。本实施方式中收集蛋白，经浓缩后做SDS-PAGE，只见单一条带，纯度可达98%以 上，回收率为34. 14士2%。本实施方式中所得可高效表达的成熟鸡α干扰素多肽，经微量病变试验测定其 抗病毒活性为1. 12X108IU/mg。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
二不同的是步骤二中筛选后诱导表 达是筛选阳性克隆菌株的培养物，然后按体积比1 100将培养物接种于含50 μ g/ml Amp 的LB液体培养基中，在30°C下振荡培养至0D_为0. 6 0. 8，再置于42°C恒温水浴中热激诱导表达，然后在42°C下继续诱导培养4h，离心后得湿菌。其它步骤及参数与具体实施方 式二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
三不同的是步骤二中包涵体的提取 和溶解的步骤为a、每Ig诱导后湿菌用IOml Buffer A重悬后，5000g离心15min，取沉淀 再用IOml Buffer A重悬，然后在超声功率为400W、间歇性超声破碎15min，经离心后加入 等体积的Buffer B搅拌Ih后离心，取沉淀；b、将沉淀用IOml Buffer C重悬后搅拌15min， 然后用三蒸水冲洗两遍，再用IOml Buffer D溶解，即完成；其中步骤a中IOml Buffer A 由IOmMTris-HCl (pH 8. 0) UOmM EDTA和IOOmM NaCl组成；步骤a中间歇性超声破碎按工 作5s、停止5s循环进行；步骤a中Buffer B由Buffer A和8MUrea (尿素)组成；步骤b 中 IOml Buffer C 由 IOmM Tris-HCl(pH 8. 0)、ImMEDTA 和 IM NaCl 组成；步骤 b 中 IOml Buffer D 由 IOOmM Tris-HCl (pH 8. 0)、0. 2mM EDTA、6M GuHCl (盐酸胍)和 8M Urea 组成。 其它步骤及参数与具体实施方式
三相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
三或四不同的是步骤三中溶解后的 包涵体经S印hadex G50复性及纯化步骤为a、采用Bradford法测定溶解后的包涵体中的 蛋白浓度，然后将蛋白浓度调整为0. 8 1. 2mg/mL作为样品；b、将溶胀好的S印hadex G50 装柱后用PBS平衡至少一个柱体积，然后用Buffer D做变性剂梯度，至层析柱中Buffer D 中的GuHCl和Urea的浓度逐渐减少，梯度占整个柱体积的30% ；C、将样品加入柱中，上样 量为柱体积的1/15 1/20，然后用PBS洗脱，紫外检测仪监视流出样，收集流出峰；其中步 骤b和c中PBS的pH值均为7. 2。其它步骤及参数与具体实施方式
三或四相同。序列表<110>东北农业大学<120>可高效表达的成熟鸡α干扰素基因及其多肽的制备方法<160>2<210>1<211>492<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1). . . (492)<220><223>可高效表达的成熟鸡α干扰素基因的多肽。<400>1atg tgc aat cat ctg cgt ccg caa gat gcg acc tttMet Cys Asn His Leu Arg Pro Gln Asp Ala Thr Phe1510ctg cag ctg ctg cgc gat atg gcg ccg acc ctg ccgLeu Gln Leu Leu Arg Asp Met Ala Pro Thr Leu Pro2025
age cat gat age 48 Ser His Asp Ser 15
cag ctg tgc ccg 96 Gln Leu Cys Pro 304/5页
cagcataacgcgagetgcagetttaacgataccateCtggataccage144
GlnHisAsnAlaSerCysSerPheAsnAspThrlieLeuAspThrSer
354045
aacaccCgCcaggccgataccacccatgatateCtgcagcatCtg192
AsnThrArgGlnAlaAspLysThrThrHisAsplieLeuGlnHisLeu
505560
tttateCtgageageCCgageaccCCggcgcattggaacgatage240
PheLyslieLeuSerSerProSerThrProAlaHisTrpAsnAspSer
65707580
cagCgCcagageCtgCtgaacCgCattcatCgCtatacccagcatCtg288
GlnArgGlnSerLeuLeuAsnArglieHisArgTyrThrGlnHisLeu
859095
gaacagtgcCtggatageagegataccCgCageCgCaccCgCtggCCg336
GluGlnCysLeuAspSerSerAspThrArgSerArgThrArgTrpPro
100105110
CgCaacCtgcatCtgaccattcattttagetgcCtgcatacc384
ArgAsnLeuHisLeuThrlieLysLysHisPheSerCysLeuHisThr
115120125
tttCtgcaggataacgattatagegcgtgcgcgtgggaacatgtgCgC432
PheLeuGlnAspAsnAspTyrSerAlaCysAlaTrpGluHisValArg
130135140
CtgcaggcgCgCgcgtggtttCtgcatattcataacCtgaccggcaac480
LeuGlnAlaArgAlaTrpPheLeuHislieHisAsnLeuThrGlyAsn
145150155160
accCgCacctaa492
ThrArgThr
<210>2
<211>163
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可高效表达的成熟鸡α干扰素基因的多肽。
<400>2
MetCysAsnHisLeuArg ProGlnAspAlaThrPheSerHisAspSer
151015
LeuGlnLeuLeuArgAsp MetAlaProThrLeuProGlnLeuCysPro
202530
GlnHisAsnAlaSerCysSerPheAsnAspThrlieLeuAspThrSer
3540450095]AsnThrArg Gln Ala Asp Lys Thr Thr His Asp IleLeuGlnHis Leu0096]5055 600097]PheLyslie Leu Ser Ser Pro Ser Thr Pro Ala HisTrp AsnAsp Ser0098]6570 75800099]GlnArgGln Ser Leu Leu Asn Arg lie His Arg TyrThrGlnHis Leu0100]8590 950101]GluGlnCys Leu Asp Ser Ser Asp Thr Arg Ser ArgThr ArgTrp Pro0102]100 1051100103]ArgAsnLeu His Leu Thr lie Lys Lys His Phe SerCysLeuHis Thr0104]115 1201250105]PheLeuGln Asp Asn Asp Tyr Ser Ala Cys Ala TrpGluHisVal Arg0106]130 1351400107]LeuGlnAla Arg Ala Trp Phe Leu His lie His AsnLeuThrGly Asn0108]145150 1551600109]ThrArgThr
权利要求
1.可高效表达的成熟鸡α干扰素基因，其特征在于可高效表达的成熟鸡α干扰素基 因的序列为ATGTGCAATCATCTGCGTCCGCAAGATGCGACCTTTAGCCATGATAGCCTGCAGCTGCTGCGCGATATGGCGCCGACCCTGCCGCAGCTGTGCCCGCAGCATAACGCGAGCTGCAGCTTTAACGATACCATCCTGGATACCAGCAACACCCGCCAGGCCGATAAAACCACCCATGATATCCTGCAGCATCTGTTTAAAATCCTGAGCAGCCCGAGCACCCCGGCGCATTGGAACGATAGCCAGCGCCAGAGCCTGCTGAACCGCATTCATCGCTATACCCAGCATCTGGAACAGTGCCTGGATAGCAGCGATACCCGCAGCCGCACCCGCTGGCCGCGCAACCTGCATCTGACCATTAAAAAACATTTTAGCTGCCTGCATACCTTTCTGCAGGATAACGATTATAGCGCGTGCGCGTGGGAACATGTGCGCCTGCAGGCGCGCGCGTGGTTTCTGCATATTCATAACCTGACCGGCAACACCCGCACCTAA。
2.制备如权利要求1所述的可高效表达的成熟鸡α干扰素基因的多肽的方法，其特 征在于制备可高效表达的成熟鸡α干扰素多肽的方法按以下步骤实现一、应用在线软件 http://gcua.schoedl.de/分析出成熟鸡α干扰素基因中的稀有密码子，然后通过大肠杆 菌偏好密码子表，将成熟鸡α干扰素基因中的稀有密码子全部同义替换为大肠杆菌偏好 性密码子，经合成，得优化后的鸡α干扰素基因；二、将优化后的鸡α干扰素基因克隆到表 达载体PffL中，然后转化到大肠杆菌感受态细胞ToplO中，经筛选后诱导表达，离心后得湿 菌，然后对湿菌进行包涵体的提取和溶解；三、溶解后的包涵体经葡聚糖凝胶kphadex G50 复性及纯化，收集蛋白，即完成可高效表达的成熟鸡α干扰素多肽的制备。
3.根据权利要求2所述的制备可高效表达的成熟鸡α干扰素多肽的方法，其特征在于 步骤三中溶解后的包涵体经kphadex G50复性及纯化步骤为a、采用Bradford法测定溶 解后的包涵体中的蛋白浓度，然后将蛋白浓度调整为0.8 1.2mg/mL作为样品；b、将溶胀 好的kphadex G50装柱后用PBS平衡至少一个柱体积，然后用Buffer D做变性剂梯度，至 层析柱中Buffer D中的GuHCl和toea的浓度逐渐减少，梯度占整个柱体积的30% ；C、将 样品加入柱中，上样量为柱体积的1/15 1/20，然后用PBS洗脱，紫外检测仪监视流出样， 收集流出峰；其中步骤b和c中PBS的pH值均为7. 2。
全文摘要
可高效表达的成熟鸡α干扰素基因及其多肽的制备方法，它涉及鸡α干扰素基因及其多肽的制备方法。它解决了现有重组鸡α干扰素基因不能在大肠杆菌中表达或者表达量很低，以及重组鸡α干扰素在制备中复性效果差的问题。可高效表达的成熟鸡α干扰素基因的序列见SEQ ID NO1。方法一、将成熟鸡α干扰素基因中的稀有密码子全部同义替换为大肠杆菌偏好性密码子，经合成得优化后的鸡α干扰素基因；二、克隆到表达载体中，然后转化到大肠杆菌感受态细胞中，经筛选后诱导表达，离心后得湿菌，再进行包涵体的提取和溶解；三、进行复性及纯化，收集蛋白。本发明成熟鸡α干扰素基因能在大肠杆菌中高效表达，表达量可达总菌体蛋白的30％，复性效果好。
文档编号C12N15/21GK102121013SQ20091007328
公开日2011年7月13日 申请日期2009年11月27日 优先权日2009年11月27日
发明者王君伟, 王巍, 马波, 高明春, 魏双施 申请人:东北农业大学