专利名称：：一种细菌外毒素的生产方法
技术领域：
：本发明涉及一种微生物的制备方法，尤其是指一种细菌外毒素的培养、提取、浓缩、纯化的工艺方法。
背景技术：
：细菌外毒素是细菌生长过程中从菌体内代谢出来的一种大分子蛋白。这些大分子蛋白具有各种毒力。目前细菌外毒素已在医学、灭害等许多领域得到应用，如C型肉毒梭菌菌苗、类毒素已应用到预防医学领域，1989年美国FDA正式批准A型肉毒毒素作为新药投产上市。目前A型肉毒毒素已应用到临床医学和美容除皱领域，如可以用于神经科、眼科等领域的肌张力障碍性疾病——眼睑痉挛、面肌痉挛、斜视及痉挛性斜颈等的治疗，B型、E型肉毒毒素也已经进入临床试验，C型D型肉毒毒素可以用来灭鼠，苏金云杆菌正在灭苍蝇蚊子方面试用。最近国际上已经开始破伤风杆菌毒素的应用实践。细菌外毒素还可以应用于国防建设。目前流行使用的细菌培养方法是传统的发酵法。它是将菌种直接接种于培养基中，细菌在培养基中生长繁衍，培养时培养基、细菌及细菌的外毒素混合在一起，细菌在具有营养物、排泄物的混合环境中生长。如果需要单纯的外毒素就必须采用分离的技术手段将细菌外毒素从混合体中分离出来。这样的培养及提纯方法不但细菌及外毒素的产量低、收获率小，而且提纯工艺复杂。由于细菌的生长环境不好，因此细菌的质量也不高。目前美国制备A型肉毒毒素的工艺是包括肉毒梭菌全培养酸沉淀一一毒素磷酸盐緩冲液提取一一硫酸铵浓缩及自然结晶等步骤。这种方法在工艺时间、消耗、收率等方面存在着一定的问题。中国专利97118838.6也公开了一种A型肉毒结晶毒素的生产工艺及生产该毒素所需的冻干保护液，该发明的工艺为产毒培养基-产毒培养-除菌过滤-毒素的精制提纯-毒素的稀释、冻干。其主要技术方案包括用酪蛋白、胰酶粉、酵母透析液、蒸馏水、葡萄糖制作培养基的过程，产毒的培养、除菌过滤、毒素的精制提纯、毒素的稀释冻干等工序。其收取的毒液是培养基和细菌外毒素的混合液，其工艺步骤中必须包括酶化、透析、层析等步骤，才能把细菌外毒素从毒液中分离出来。1896年俄国人梅尼契诃夫发明了培养细菌的新方法一一透析培养法。透析培养是用透析膜将培养基和培养物分开，细菌、培养物所在的部分叫培养室，培养基(即养份)所在的部分叫培养基室，培养物通过培养室和培养基室之间的透析膜吸取培养基的养份，而培养物的小分子排泄物又通过透析膜进入培养基室。因此净化了细菌的生长环境。但是透析法一直束之高阁，只是在实验室内使用，无法工业化生产，主要原因是透析法一直使用嚢袋式的透析器，将透析嚢袋浸泡于培养基液中，透析嚢袋处于自由状态，由于存放培养物的透析囊袋在培养基中浸泡、移动等原因，囊袋容易破裂。而且其要求培养基所占的体积是培养物所在体积的IO倍，也就是说一般的透析培养法的透析比为10:1。而透析嚢袋的体积不可能做的太大，否则更容易破损。所以透析法虽然可以获得高活性高质量的细菌及其衍生物，但由于成本高、成功率低，很少有人使用。虽然后来透析培养法经过了部分改进，但仍然沿用培养基比培养物为10:1的透析培养比。
发明内容本发明需要解决的技术问题是提供一种能够高效、稳定的生产高品质细菌外毒素的方法。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是一种细菌外毒素的生产方法，包括细菌及产毒培养、细菌外毒素的提取、纯化、保藏工序；其生产方法包括如下步骤A、产毒培养细菌的产毒培养是在微生物透析培养器中进行，微生物透析培养器包括培养基室和培养室，培养基室和培养室之间设置有透析膜及支撑保护透析膜的装置，培养基室为一个，培养室装配培养基室上，培养室的数量是培养基室的倍数，培养基室的容积与培养室的总容积之比根据微生物的培养时间的长短在3:l到l:6之间选定，微生物的生长所需要的设施设置在培养基室中，由培养基室为微生物提供生长条件，以确保培养室优良的生长环境；微生物透析培养器的形状应采用立体几何原理中表面积大而体积相对小的形状；其培养步骤包括Al.调制培养液和产毒培养基，A2.根据生产量的大小和培养时间来选择、组装相应的透析培养器，将培养基和培养液分别加注到透析培养器的培养基室和培养室内，高温灭菌后冷却到35°C~4(TC,培养基与培养液的比例是由细菌及微生物的品种和生长周期决定；高温灭菌可以在113。C条件下灭菌30分钟；'A3.将经过适当培养的培养菌菌种，接种到培养室内，接种量为按培养室中培养液量的3°/~5%，按培养菌的培养时间和培养温度进行产毒培养；透析培养的产量与透析面积成正比。B、除菌过滤经镜;险为纯培养后，用收液管收取从透析器培养室中培养好的培养菌菌液，然后在《0。C的环境下离心处理，取上清液，用OO.22mm除菌滤寿反或者无石棉除菌膜过滤，即得外毒素毒液；离心处理最好在低温高速离心机上以6000转/分钟的速度离心IO分钟。C、沉淀浓缩将毒液与-70。C的无水乙醇按1:2的比例混合，将混合液倒入离心罐，放入-20。C的环境(如冰拒)中静置8~12小时，然后在《(TC的环境下以12000转/分钟的速度离心25~30分钟，去上清液，所剩固体即是变性的细菌外毒素。D、透析结晶将离心后所得固体物用适量的硫酸铵溶液溶解并充分混合，然后倒入透析袋内，将透析袋周围贴紧大分子吸附剂，在<5°C环境中用大分子吸附剂将透析袋内的硫酸铵溶液吸出，透析袋内所剩固体物即为结晶毒素。可以重复此步骤，直到OD260/OD280值小于0.6为止。E、保藏，将纯度达到OD260/OD280值小于0.6、毒力合格的结晶物放入《15X:的保护剂中稀释，并按蛋白质的冻干曲线冻干，然后冷藏。本发明的细菌的培养方法的进一步具体方案为培养基室的容积与培养室的总容积之间的关系是培养时间越长培养基室的容积与培养室的总容积之比越大，反之亦反，培养时间大于120小时时，培养基室的容积与培养室的总容积之比为3:1;培养时间为96~120小时时，培养基室的容积与培养室的总容积之比为2.5:1,培养时间为72~96小时时，培养基室的容积与培养室的总容积之比为2:1,培养时间为48-72小时，培养基室的容积与培养室的总容积之比为1.5:1,培养时间为24~48小时时，培养基室的容积与培养室的总容积之比为1:1-2,培养时间小于24小时时，培养基室的容积与培养室的总容积之比为1:3~6。本发明的培养液的进一步限定为培养液为0.6°/NaCl溶液。本发明的培养基的进一步限定为所述产毒培养基根据菌种的具体情况选择，并按照1000ml培养基加入200±50g酵母浸膏的比例加入酵母浸膏。培养基尽可能选择消化型的。本发明的保藏工序中所用的保护剂的成分为保护剂由明胶、蔗糖、甘露醇、蒸馏水配制而成。本发明的保藏工序中所用的保护剂的比例为保护剂中明胶、蔗糖、甘露醇、蒸馏水的配比为3/5/5/100。本发明的保藏工序中所用的保护剂的保护剂配制方法为按配置量分别称取明胶、蔗糖、甘露醇，先将明胶加入蒸馏水，加热到明胶全部溶化为止，再加入蔗糖和甘露醇，充分溶解后，滤球过滤，在113。C条件下经30分钟灭菌。由于采用了上述技术方案，本发明取得了如下的技术进步采用本发明的方法生产毒素，优化细菌生长环境，扩宽细菌的繁殖空间，从而使细菌外毒素制品的成本、价格大幅度下降，产量剧增，透析培养法每毫升菌数可达101。-1011,比发酵法每毫升菌数的108~109提高了IOO倍，其收获率可以由原来技术的17%~33%提高到90%。采用本发明的方法进行细菌及其衍生物的培养，大大筒化了细菌外毒素的浓缩、提纯工艺，免除了繁瑣的分离工序，4吏提纯时间由原来自然透析的12~15天缩短为12-24小时左右，大大缩短了生产周期，减少了工作人员及用工时间，大大提高了生产效率，最大限度的减少了制作过程中制品的耗损，提高了产量，节约了时间和原材料。给细菌外毒素的利用提供了坚实的物质基础，具有巨大的经济效益和社会效益。使用本发明的方法，使微生物的生长环境得到优化，其生物活性得到最大限度的保留，其制品的质量和效价随之提高。本发明的细菌外毒素的生产与使用都对环境不造成污染。细菌外毒素的生产设备前后均经过高温、高压灭菌消毒，容器也是如此。因此，无有毒、有害、有菌的气体、废水、废弃物排放。在使用时，细菌外毒素是蛋白质，在自然界中极易降解，没有残留，不会造成积蓄中毒和二次中毒，是绿色环保的工艺和产品。本发明所得的毒液仅仅是细菌和外毒素，不会包含培养基，除菌过滤过程中采用低温环境下高速离心处理，可迅速除去绝大多数细菌菌体，因此省略了现有发酵法培养外毒素的分离生产方法中的酶化、透析、层析等步骤，可以节约过滤时间，减轻劳动强度，减少能源和村料消耗。采用高速离心处理等强制透析工艺，可以缩短结晶时间，自然透析结晶的时间一般为12~15天，而强制透析的结晶时间则缩短为12小时左右。沉淀浓缩工序中采用有机溶剂乙醇可以使毒液中的细菌外毒素从毒液中变性沉淀出来，而达到分离的目的，过冷有机溶剂浓缩速冻是为了使外毒素不会因温度的緩慢下降而丧失活性，最大P艮度的保护毒素的生物活性，提高质量。采用透析袋及吸附剂进行结晶处理，可将袋中的緩沖液吸附干净，同时作为的杂质小分子物质(如残余营养液、细菌的代谢物、及NaCl溶液等)随緩沖液透析千净，即达到纯化的目的。本发明的保护剂配比筒单，原料易得，是药剂中广泛使用的物质，具有安全、无不良反应的优点。保护剂中加入甘露醇可以消减毒素作用于人体的不良反应，改善人体注射部位的机能的恢复，另外，甘露醇是一种赋形剂，加入甘露醇的保护剂在制成外毒素制品后，制品的品相外观好。具体实施例方式下面通过一个生产A型肉毒素制品的具体实验过程对本发明做进一步详细说明，并将实验结果与美国、中国兰州生产的两种A型肉毒素进行了对比1、微生物透析培养器本发明的细菌的产毒培养是在微生物透析培养器中进行，微生物透析培养器包括组装在一起的培养基室和培养室，培养基室和培养室之间设置有透析膜及支撑保护透析膜的装置，培养基室为一个，培养室的数i是培养基室的倍数，培养室装配培养基室上，培养基及细菌的生长所需要的设施设置在培养基室中，由培养基室为细菌提供食物及其它生长条件；微生物透析培养器的形状应采用立体几何原理中表面积大而体积相对小的形状。培养基室的容积与培养室的总容积之比根据微生物的培养时间的长短在3:1到1:6之间选定，培养基室的容积与培养室的总容积之间的关系是培养时间越长培养基室的容积与培养室的容积之比越大。2、菌种、培养液及培养基实验过程中所使用的菌种是四川大学生物技术研究所在西北固原、若尔盖地区土壤中分离的一种一般品质的菌抹，并进行初步培养。培养液为0.6%NaCl溶液。产毒培养基选择巿售的普通厌氧菌培养基，并向培^基中加入酵母浸膏，加入的比例为每1000ml培养基加200g酵母浸膏，选择培养基室和培养室的容积比例为2.5:1，并将培养基室和培养室组装在一起形成透析培养器。将调配好的培养基和培养液分别加注到培养基室和培养室内。在113。C条件下经30分钟灭菌，然后冷却到35°C-40°C。3、产毒培养将菌种按培养室中培养液量的3%~5%,接种到培养室，在合适的培养温度进行产毒培养，培养时间为110小时。4、除菌过滤对培养菌进行镜鉴，经镜检为纯培养后，将培养好的培养菌菌液从透析器培养室中通过收液管收取，然后经低温高速离心机(<0°C、6000转/分钟)10分钟离心。取上清液，用OO.22咖的除菌滤板或者无石棉除菌膜过滤，即得毒液。5、浓缩沉淀将无水乙醇冷冻到-7(TC左右以2:1的比例与毒液混合，将混合液》丈入-20。C水拒中静置8~12小时，'然后经低温高速离心机(<0°C、.12000转/分钟)25~30分钟离心。取上清液，所剩固体即是变性的细菌外毒素。6、透析结晶将离心后所得固体物加入适量的饱和硫酸铵溶液，充分混合后倒入透析袋内，置于〈5。C的水柜中并用大分子吸附剂贴紧，将透析袋内的^l酸铵溶液连同作为杂质小分子物质(如残余营养液、细菌的代谢物、及NaCl溶液等)吸出，透析袋内所剩固体物即为结晶毒素。可以重复此步骤，直到OD260細80值小于0.6为止。7、检测毒力用电子秤称量l毫克的结晶物，用緩沖液复性后使用小白鼠测定毒力。8、保存保藏，将保护剂冷却到《15。C后加入毒素，按使用要求灌装，按蛋白质的冻干曲线冻千。冻干后的毒素再次用小白鼠测定毒力，进行无菌检测和含水量检测，合格后冷藏。其中保护剂的配方为明胶3g,蔗糖5g，甘露醇5g,蒸馏水100ml。保护剂配制方法为按配置量分别称取明胶、蔗糖、甘露醇，先将明胶加入蒸馏水，加热到明胶全部溶化为止，再加入蔗糖和甘S醇，充分溶解后，滤球过滤，在113。C条件下经30分钟灭菌。A型肉毒素制品的性能对比表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>对比实验使用的菌种是HALL林美国一个州立大学食品检验所分离的高毒菌林。这是一种品质非常优良的菌种。本发明所使用的菌种是四川大学生物技术研究所在西北固原、若尔盖地区土壤中分离的一般菌林。表中所述的效价是以除皱时每个注射点的起效时的用量为标准，是以除皱效果为标准的每个注射点起效的生物单位，U表示生物单位。本发明的A型肉毒素除皱时的起效用量只有0.7U即可起效，除皱有效期为6~9个月，远长于其它两种方法生产的A型肉毒素。如杲使用本具体实施方式以外的其它菌种，或者培抓条件发生变化而使培养时间发生变化时，应该使用其它透析比的微生物透析培养器，也就是微生物透析培养器的培养基室和培养室的比例也应该随培养时间发生变化。权利要求1、一种细菌外毒素的生产方法，包括细菌及产毒培养、细菌外毒素的提取、纯化、保藏工序，其特征在于包括如下步骤A、产毒培养细菌的产毒培养是在微生物透析培养器中进行，微生物透析培养器包括培养基室和培养室，培养基室和培养室之间设置有透析膜及支撑保护透析膜的装置，培养基室为一个，培养室装配培养基室上，培养室的数量是培养基室的倍数，培养基室的容积与培养室的总容积之比根据微生物的培养时间的长短在3∶1到1∶6之间选定，微生物的生长所需要的设施设置在培养基室中；其培养步骤包括A1.调制培养液和产毒培养基，A2.根据生产量的大小和培养时间选择、组装相应的透析培养器，将培养基和培养液分别加注到透析培养基室和培养室内，高温灭菌后冷却到35℃～40℃，A3.将经过适当培养的培养菌菌种，接种到培养室内，接种量为按培养室中培养液量的3％～5％，按培养菌的培养时间和培养温度进行产毒培养；B、除菌过滤收取培养好的培养菌菌液，然后在≤0℃的环境下离心处理，取上清液，过滤，即得外毒素毒液；C、浓缩沉淀将毒液与-70℃的无水乙醇按1∶2的比例混合，将混合液放入-20℃环境中静置8～12小时，然后在≤0℃的环境下以12000转/分钟的速度离心25～30分钟，去上清液，所剩固体即是变性的细菌外毒素；D、透析结晶将离心后所得固体物用适量的硫酸铵溶液溶解并充分混合，然后倒入透析袋内，在≤5℃环境中用大分子吸附剂将透析袋内的硫酸铵溶液吸出，透析袋内所剩固体物即为结晶毒素；E、保藏将纯度达到OD260/OD280值小于0.6、毒力合格的结晶物放入≤15℃的保护剂中稀释，并按蛋白质的冻干曲线冻干，然后冷藏。2、根据权利要求l所述的一种细菌外毒素的生产方法，其特征在于所述培养基室的容积与培养室的总容积之间的关系是培养时间越长培养基室的容积与培养室的总容积之比越大，反之亦反，培养时间大于120小时时，培养基室的容积与培养室的总容积之比为3:1;培养时间为96~120小时时，培养基室的容积与培养室的总容积之比为2.5:1,培养时间为72-96小时时，培养基室的容积与培养室的总容积之比为2:1,培养时间为48~72小时时，培养基室的容积与培养室的总容积之比为1.5:1，培养时间为24~48小时时，培养基室的容积与培养室的总容积之比为1:1-2，培养时间小于24小时时，培养基室的容积与培养室的总容积之比为1:3~6。3、根据权利要求l所述的一种细菌外毒素的生产方法，其特征在于所述培养液为0.6%NaCl溶液。4、根据权利要求l所述的一种细菌外毒素的生产方法，其特征在于所述产毒培养基根据菌种的具体情况选择，并按照1000ml培养基加入200±50g酵母浸膏的比例加入酵母浸膏。5、根据权利要求l所述的一种细菌外毒素的生产方法，其特征在于所述保护剂由明胶、蔗糖、甘露醇、蒸馏水配制而成。6、根据权利要求5所述的一种细菌外毒素的生产方法，其特征在于所述保护剂中明胶、蔗糖、甘露醇、蒸馏水的配比为3/5/5/100,全文摘要本发明公开了一种细菌外毒素的生产方法，包括细菌及产毒培养、细菌外毒素的提取、纯化、保藏工序，细菌的产毒培养是在微生物透析培养器中进行，微生物透析培养器包括培养基室和培养室，培养基室和培养室之间设置有透析膜及支撑保护透析膜的装置，培养基室的容积与培养室的总容积之比根据微生物的培养时间的长短在3∶1到1∶6之间选定，微生物的生长所需要的设施设置在培养基室中；其生产方法包括产毒培养、除菌过滤、浓缩沉淀、透析结晶、保藏工序。采用本发明的方法生产毒素，优化细菌生长环境，简化了细菌外毒素的浓缩、提纯工艺，其收获率可以由原来的17％～33％提高到了90％，提纯时间由原来自然透析的12～15天缩短为12～24小时左右。文档编号C12P21/02GK101619339SQ20091007518公开日2010年1月6日申请日期2009年8月19日优先权日2009年8月19日发明者张鹏成,朱明温,涛林,林雅静申请人:涛林