专利名称：一种由西洋参果实发酵培养制备皂甙类化合物的方法
一种由西洋参果实发酵培养制备皂甙类化合物的方法
一背景技术：
本发明涉及一种细胞发酵培养方法，具体地说是一种利用西洋参果实汁液细胞发酵培养 制备皂甙类化合物的方法。
二背景技术：
人类对植物次生代谢物质的利用有着悠久的历史，当今对植物次生代谢物质的研究更是 如火如荼。但植物次生代谢物质的产量受植物产量和次生代谢物含量的限制，有些次生代谢 物质在自然界的含量甚微，从而局限了植物次生代谢物质的广泛应用。随着生物技术长足进 步，人们把目光聚集在如何利用生物技术以获取植物次生代谢物质的研究方法上来。为此， 相关研究领域的科学家们开始不懈的探索和试验，经过近几十年的研究发现，通过植物细胞 的规模培养可以实现植物次生代谢物质高效生产。
通过植物细胞的大规模培养，生产植物次生代谢物较从天然植物中提取，及人工仿生合 成的化合物，更具有其独特的优点-
(一) 不破坏自然资源。
(二) 不受地域、季节、土壤、病虫害等自然条件限制。
(二)与人工合成相比，细胞培养工艺、设备简单；节约能源；产业投资少；生产过程中 儿乎没有环境污染，对生产者安全性高。
(四) 与利用植物体提取生物活性物质相比，细胞培养方法，生产周期短、细胞个体差异 小、生长过程可以人工控制、代谢过程可以人为合理调节，有利于降低成本、提高效率。
(五) 对于某些天然产物经修饰后，可以产生药效更好的物质，也可以通过此技术获得结 构复杂的修饰物前体。
(六) 对于分泌到胞外培养液中的生物活性物质，规模生产更方便。规模化生产在这方面 的研究及成果应用比较多，如，我国学者罗士韦采用液体悬浮培养人参细胞，产率可日增一 倍，而培养物中总人参皂甙含量高达10.5%，超过人工栽培人参的皂甙含量(9.6%)，每立方 米培养液可获干参13. 98公斤。日本Uitsui公司通过对紫草细胞培养生产出尚无法人工合 成的紫草素，培养细胞的产率为天然细胞产率的1000倍，现在日本紫草来源主要是细胞组 织培养。另外，紫杉醇、长春花碱等许多植物次生代谢产物在生产上均已取得较大的成绩， 有的培养规模可达万吨以上。这些实验及实践证明，亲本植株能合成的次生代谢物质都可以 通过植物细胞的培养方式来生产，因而，被认为这是一条利用生物技术生产次生代谢物质(如药物、天然色素、香料、天然调味品)的新的有效途径。
西洋参(尸awox《wz'"gweyb/iwm Zi"". 英文名American Ginseng)属五力口禾斗(Jra/z'aceae)
人参属(尸a"ox)多年生草本，和中国人参(尸朋ax G/"^rg C. A Me"r)属同一祖先不同 的新种及变种。西洋参又称花旗参，美国参，原产于北美洲的加拿大南部的安大略(Ontario), 魁北克(Quebec),蒙塔利尔(Montreal)及美国北部的威斯康星洲(Wisconsin),生长在茂 密的原始森林中。人们(尤其是亚洲人)对西洋参的喜爱主要是原于它的药用和保健作用， 是我国的传统中药。其中，西洋参皂甙是被公认为人参和西洋参的主要活性成分。在我国传 统医药中主要有镇定、安神、止惊、解热等多种药理作用。在增强免疫、改善记忆、抑制癌 细胞生长、双向免疫调节和调节内分泌等多种活性作用。现代药理研究证明，西洋参全身所 有器官中均含有皂甙类化合物。传统药用主要是根部，而叶、茎、花、果实作为"废弃物"。 目前国内对皂甙类化合物研究比较深入，少数单体在抗肿瘤方面具有特殊作用。并且， 在医药上已经广泛应用，在功能食品开发方面越来越受到重视。除了利用它的生理活性外， 也把它作为功能食品的添加剂。目前，市场对皂甙类化合物需求量增长迅速，而目前的生产 方式又不能满足市场的需求。
发明内容
本发明旨在为人们提供--种可供药用的西洋参皂甙，所要解决的技术问题是利用西洋参 果实汁液细胞中原有皂甙，在酶的诱导下实现规模化制备皂甙类化合物。
本发明的技术方案以西洋参果实为原料，包括培养基的配置、杀菌、种子培养、发酵培 养以及分离和提取，所述的培养基配制就是将西洋参果实汁液600 800ml、葡萄糖60 80g、 硫酸铵l 3g，稀释至1升的培养液并调pH值3 4作为培养基；所述的种子培养就是将葡 萄酒酵母菌接种到上述培养基中诱导培养母种，使母种酵母菌数》107个/1111;所述的发酵培 养就是将母种接到上述培养基中发酵培养，培养结束后分离、提取皂甙类化合物；种子培养 和发酵培养的工艺条件是暗培养，温度26 29'C、时间不少于6天，培养系统能通透C02 气体。
优选每升培养基中含西洋参果实汁液650 700ml、葡萄糖65 70g、硫酸铵1 3g、单 宁含量低于lg/L， pH值3.2 3.5。
本发明以西洋参果实为原始材料，获取西洋参果汁，并且调配适宜的营养成分作为酵母 培养基；同时，选择优良葡萄酒酵母菌进行扩大培养，从而建立生产皂甙类化合物的培养体 系。设计了相应的生长、生产培养基配方。该方法有培养周期短、效率高、对环境无污染等 特点。本发明较已有技术相比具有如下优点
(1) 生产过程完全可控，不受自然环境的影响
(2) 无农药及重金属残留；
(3) 提取工艺简单；
(4) 低成本，节约大量耕地，提高资源利用率和西洋参的综合经济价值。
(5) 生产效率高每1000ml培养液中，含干物质70-97g，可提取分离西洋参总皂甙6-9g。
四
附图所示是西洋参总皂甙薄层层析分析图。
图中1、标准样品；2、果实；3、发酵液；4、西洋参茎梗
五具体实施例方式
现以实验室培养为例，非限定实施例叙述如下
1、 培养基的配制、杀菌
取充分成熟西洋果实，破碎，去除种子，连同果肉、果皮及汁液650 700ml，葡萄糖 65 70g、硫酸铵1 3g、然后用蒸馏水稀释至1升。用柠檬酸调pH值到3. 2 3. 5。
用亚硫酸或S02杀菌。采用滴加、搅拌方法，使得亚硫酸或S02加入果汁后均匀一致， 达到杀菌效果。
2、 种子培养
将葡萄酒酵母菌接种到培养基中，于27 28t:下暗培养诱导培养母种，直至母种酵母 菌数达到>107个/1111，培养系统能通透C02气体。
3、 发酵培养
将母种接到培养基中进行发酵培养，温度27 28'C、暗培养不少于6天，培养系统能 通透C02气体。培养结束后分离、提取皂甙类化合物。
4、 分离提取西洋参皂甙
发酵原液首先用50-70%乙醇提取，提取液脱溶回收乙醇后用水饱和的正丁醇萃取，萃 取液脱溶回收正丁醇后用丙酮沉淀，低温下沉淀完全后过滤，用水溶解，上大孔树脂柱层析 柱分离，用50-70%乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇得到分离物经干燥后分析测定西洋参皂甙。
权利要求
1、一种西洋参果实发酵培养制备皂甙类化合物的方法，包括配制培养基、杀菌、种子培养、发酵培养以及分离和提取，其特征在于所述的种子培养是将葡萄酒酵母接种到液体培养基中培养诱导酵母菌形成母种，母种酵母菌数≥107个/ml，然后将母种接种到液体培养基中进行发酵培养；种子培养和发酵培养均为暗培养，温度26～29℃、时间不少于6天；所述的液体培养基为每升培养基中含西洋参果实汁液600～800ml、葡萄糖60～80g、硫酸铵1～3g、pH值3～4。
2、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的液体培养为每升培基中含西 洋参果实汁液650 700ml、葡萄糖65 70g、硫酸铵1 3g、单宁含量低于lg/L， pH值3. 2 3.5。
全文摘要
一种西洋参果实发酵培养制备皂甙类化合物的方法，包括配制培养基、杀菌、种子培养、发酵培养以及分离和提取，其特征是首先将葡萄酒酵母接种到液体培养基中培养诱导酵母菌形成母种，母种酵母菌数≥10<sup>7</sup>个/ml，然后将母种接种到液体培养基中进行发酵培养；种子培养和发酵培养均为暗培养，温度26～29℃、时间不少于6天；所述的液体培养基为每升培养基中含西洋参果实汁液600～800ml、葡萄糖60～80g、硫酸铵1～3g、pH值3～4。本方法建立了生产皂类化合物培养体系，而且周期短、效率高、对环境无污染。
文档编号C12P33/20GK101619340SQ20091014450
公开日2010年1月6日 申请日期2009年8月13日 优先权日2009年8月13日
发明者丁之恩, 平 严 申请人:安徽农业大学