专利名称：宫颈癌的一种检测方法
专利说明宫颈癌的一种检测方法 研究背景 宫颈癌在女性恶性肿瘤中位列第二，仅次于乳腺癌，全球范围内发病率占女性肿瘤总发病的12％，2000年全球约新增47万女性患者，五年内累计有140万女性被诊断患有宫颈癌，其中死亡的28.8万患者中80％来自发展中国家。
分子和流行病学的研究表明绝大多数宫颈癌发病是由于暴露接触高风险类型的人乳头状瘤病毒(HPV)所致，后者的基因型共有14种，其中HPV16型、18型是超过70％宫颈癌患者的致病原。
宫颈筛查目前被认为是控制宫颈癌发病的最有效手段，因为经济发展状况和收入水平的原因，不同国家和地区的筛查手段有所不同。在西方发达国家，多采用细胞学检查，尤其是液基细胞学检查和HPV病毒DNA检测等方法；而在发展中国家和欠发达地区，则多采用宫颈涂片结合巴氏染色或乙酸染色法(VIA)来进行初步筛查。液基细胞学检查和HPV病毒DNA检测具有准确度和灵敏度均较高等特点，同时花费也高。宫颈涂片巴氏染色或VIA方法相对花费低廉，但同时也有灵敏度不高，假阴性高等不足。
发明概述 研究表明，宫颈癌细胞中酸性磷酸酶表达极为丰富，而在正常的宫颈细胞中其表达非常微弱，几乎检测不到。本发明正是基于此研究结果，在制备宫颈涂片基础上，采用酸性磷酸酶染色法，即酸性磷酸酶水解磷酸萘酚AS-BI生成萘酚AS-BI与重氮化反应生成的重氮盐与反应在细胞内生成深红色沉淀，来鉴别癌变细胞。与传统宫颈涂片检查相比，该方法具有成本低，快速简便，灵敏度高，假阴性率低等特点。该方法既适合于宫颈涂片，同样适用于液基细胞质学检查。
实验方法 一、配制染色贮备液 1.碱性品红溶液(4％)碱性品红，40克/升，溶于2摩尔/升盐酸，4 ℃避光保存 2.固酱紫溶液Fast GBC base，7克/升，溶于0.4摩尔/升盐酸，4℃避光保存 3.萘酚AS-BI磷酸溶液萘酚AS-BI磷酸，12.5克/升，溶于二甲基甲酰胺，4℃避光保存 4.亚硝酸钠溶液亚硝酸钠40克/升，4℃保存 5.柠檬酸盐缓冲液柠檬酸，18毫摩尔/升，柠檬酸钠，9毫摩尔/升，氯化钠12毫摩尔/升，pH3.6，4℃保存 6.苏木素染色液苏木素6.0克/升，碘化钠，0.6克/升，硫酸铝52.8克/升，常温保存 7.醋酸盐溶液醋酸盐溶液2.5摩尔/升，pH5.2，4℃保存 二、酸性磷酸酶染色步骤 1)准备新鲜的固定液25毫升柠檬酸盐溶液，65毫升丙酮，8毫升37％甲醛； 2)准备充足的去离子水预热到37℃； 3)固定液预先于室温放置，涂片浸入固定液固定30秒后，用去离子水冲洗充分； 4)在管子中加0.5毫升碱性品红溶液或固酱紫溶液和0.5毫升亚硝酸钠溶液，轻微翻转30秒混合，静置2分钟； 5)准备酸性磷酸酶染色
染色液预热到37℃，避光 6)涂片放入染色液中，37℃水浴避光20-40分钟； 7)去离子水中充分冲洗涂片，然后在苏木素染色液中复染2-3分钟； 8)用自来水冲洗涂片2-3分钟； 风干，镜检。
说明书附图 附
图1临床确诊宫颈癌患者宫颈涂片染色示意图，箭头所示红色为酸性磷酸酶着色部位，图中A所示细胞为酸性磷酸酶染色阴性细胞，B为阳性细胞，C和D为另一患者的酸性磷酸酶阳性细胞。
附图2 E为健康对照宫颈涂片染色示意图，无酸性磷酸酶阳性着色。F为宫颈癌细胞系Hela细胞染色示意图，箭头所示红色为酸性磷酸酶着色部位，G为细胞放大2倍后效果。
权利要求
1.一种对受试者进行宫颈癌诊断的方法，该方法包括制备受试者宫颈细胞涂片，分析来自受试者宫颈细胞中酸性磷酸酶的表达情况，以判断宫颈细胞中是否有酸性磷酸酶染色阳性细胞；其中所述涂片中酸性磷酸酶的染色阳性是指受试者的涂片中有癌变细胞。
2.权利要求1的方法，其中酸性磷酸酶的检测作为诊断宫颈细胞癌变的方法；
3.权利要求2的方法，其中酸性磷酸酶的检测是利用重氮盐与萘酚盐在酸性磷酸酶的存在下进行反应，在胞内生成不溶的红色沉淀；
4.权利要求1的方法，其中酸性磷酸酶染色阳性是指进行酸性磷酸酶染色后在细胞内生成不溶的红色沉淀；
5.权利要求3的方法，其中重氮盐是指偶氮化合物与亚硝酸钠反应生成的不稳定化合物；
6.权利要求5的方法，其中偶氮化合物指的是碱性品红或固酱紫(Fast GBC base)；
7.权利要求3的方法，其中萘酚盐指的是萘酚AS-BI磷酸盐或其衍生物；
8.权利要求3的方法，其中染色反应时间为10-60分钟。
全文摘要
本发明提供了检测或诊断宫颈癌的一种简便方法。在制备宫颈涂片基础上，该方法采用酸性磷酸酶染色法，即酸性磷酸酶水解磷酸萘酚AS-BI生成的萘酚AS-BI与重氮化反应生成的重氮盐与反应在细胞内生成深红色沉淀，来鉴别癌变细胞。与传统宫颈涂片检查相比，该方法具有成本低，快速简便，灵敏度高，假阴性率低等特点。该方法既适合于宫颈涂片，同样适用于液基细胞学检查。
文档编号C12Q1/42GK101724684SQ20091014447
公开日2010年6月9日 申请日期2009年8月11日 优先权日2009年8月11日
发明者方圣云, 沈玉先, 方辉, 张协平, 胡健力, 王法财 申请人:合肥爱克森特生物技术有限公司