专利名称：Hsv/φc31杂合性扩增子载体系统及其制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种新型HSV/OC31杂合性扩增子载体系统及其 制备方法和应用。
背景技术：
基于单纯疱疹病毒I型(herpes simplex virus type 1，HSV_1)的载体包括重组 病毒型和重组质粒型两种类型。后者又称为复制缺陷性(Iteplication-defective)载体或 扩增子载体(amplicon vectors)。扩增子载体由一个含有HSV DNA复制起点序列oris和 包装信号 pac 的质粒组成[Spaete RR et al. The herpes simplex virusamplicon :a new eucaryotic defective-virus cloning-amplifying vector. Cell ;1982;30 :295_304]。 在HSV辅助病毒作用下被允许以串联体形式包装入HSV病毒，无HSV辅助病毒时，这些载 体可以通过与一组已删除HSV基因组保留pac信号序列的粘粒或BAC质粒共转染而得 到包装[Wade-Martins R，et al. An infectioustransfer and expression system for genomic DNA loci in human and mousecells. Nat Biotechnol. 2001 ;19 :1067-70]。由 于HSV扩增子载体不携带任何病毒基因，从而不诱导病毒蛋白的合成，因而，HSV扩增子载 体对感染的细胞或机体来讲无毒性和无致病性[Frampton AR, et al. HSV trafficking and development of genetherapy vectors with applications in the nervous system Gene Therapy 2005，12，891-901]。该载体的另一个优点是有较大的转基因容量，通常 可达 22Kb,最大可达 150kb[Epstein AL HSV-l-based amplicon vectors :design and applications GeneTherapy 2005，12，S154-S158]；此外，该载体包装成的病毒有相当高的 滴度，能够有效转移目的基因到许多不同的靶细胞[Qi J，et al. Functional expression ofATM gene carried by HSV amplicon vector in vitro and in vivo. Gene Ther. 2004, 11 ；25-33.]，因而，HSV扩增子载体已成为在体内外进行基因功能研究和基因治疗实验的 有用工具。然而，HSV扩增子载体系统的主要不足在于转基因的表达是瞬时的(transient) [Frampton AR,et al. HSV trafficking and development of genetherapy vectors with applications in the nervous system Gene Therapy 2005，12，891-901]，因而，限制了在 基因功能研究上的广泛应用，尤其在需要长期基因表达的遗传病基因治疗。研究发现，HSV扩增子载体DNA在感染细胞胞核中处于非整合的环状状态，该 存在方式是其转基因瞬时表达的原因[Epstein AL。HSV-l-based amplicon vectors design and applications Gene Therapy 2005，12，S154-S158]。而基于慢病毒载体 (lentivirus-based vector, LV)反转录病毒载体，及重组腺相关病毒(recombination adeno-associated virus，rAAV)介导的基因转移，虽然，外源基因可被整合在染色体上 而得到长期表达，但这些整合是随机的，易导致插入突变；对于基因功能研究来说，插入 突变的表型常混淆基因功能的分析，而对于基因治疗来说，导致安全性问题[Thomas CE, Ehrhardt A and Kay MA. Progress and problems withthe use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genetic，2003，4，246-258]。最近，有数个研究小组已发现了 AAV、逆转录病毒和慢病毒载体感染体外培养细胞，易插入基因活跃区[Miller DG, PetekLM, RussellDff. Adeno-associated virus vectors integrate at chromosome breakage sites. Nat Genet. 2004 ；36 767-73. ] ；2002年末以来，在法国有10例重症联合免疫缺 陷(SCID)儿童经逆转录病毒载体介导的基因治疗成功治愈后，其中有3例相继发生了类 白血病样的事件，其中一例已证实与逆转录病毒载体随机插入使LM02癌基因激活有关 [Hacein-Bey-Abina S, etal. . LM02_associated clonal T cell proliferation in two patients after genetherapy for SCID-X1. Science. 2003 ；302 :415_9]。这些研究凸显了 病毒载体的使用存在着潜在的安全隐患，因而，发展既有效又安全的新型病毒载体已成为 目前国内外遗传病基因治疗领域的重要方向和趋势。因此，在解决基于HSV扩增子载体介 导基因转移的转基因不能长期表达的问题同时，必须要考虑安全性问题，理想的策略则是 对HSV扩增子载体进行遗传修饰使其实现位点特异性或靶向性整合。目前，国外已有数家实验室在该领域进行了探索，主要策略是通过HSV与 整合元件的结合所构成的杂合性扩增子载体来介导整合。一方面，利用腺相关病毒 (adenoassociated virus, AAV)编码的R印蛋白能够介导携带有AAV末端反向重复序列 (inverted terminal repeats, ITR)的转基因整合于人基因组19号染色体AAVSl位点上 的特性，将AAV-ITR及rep基因克隆到HSV扩增子载体上，建立杂合性HSV/AAV扩增子载 {φ [Bakowska, et al. . Breakefield. Targeted transgene integration intotransgenic mouse fibroblasts carrying the full-length human AAVSl locusmediated by HSV/ AAV rep hybrid ampiicon vector. Gene Ther. 2003 ; 10 :1691—1702]。最初的研究结果显 示了杂合HSV/AAV扩增子载体介导的转基因可特异整合在AAVSl位点并稳定表达，然而，病 毒感染效率甚低，仅2-7%，其原因与Rep蛋白对包装细胞和感染细胞的毒性有关。最近， Liu等在上述策略的基础上，利用Cre/LoxP位点特异重组酶系统来调控r印基因的表达， 不仅解决了 rep基因不适当表达所致的毒性问题，而且也改善了病毒感染效率。在携带有 编码Cre位点特异重组酶基因的293细胞上，病毒感染效率达到22%，其中，在70%感染细 胞上发生了 AAVSl位点特异性整合[18]。然而，该策略的关键是依靠了 Cre重组酶在靶细 胞系上的表达，而Cre重组酶在靶细胞系上的持续表达可引起染色体的不稳定，也就是说 Cre重组酶的引入解决了 Rep蛋白毒性问题，但同时Cre重组酶又带来了新的安全性问题， 因而，该策略有其局限性.另一方面，利用SB转座酶系统(Sloping Beautytranspossase system)与HSV扩增子载体结合构成杂合性HSVsb扩增子载体[BowersWJ，et al. Neuronal Precursor-Restricted Transduction via in Utero CNS GeneDelivery of a Novel Bipartite HSV Amplicon/Transposase Hybrid Vector. Mol Ther. 2006，13 :580_588.]，结 果显示转座元整合和目的基因的长期表达，但转座元整合常引起插入性突变，因而，杂合性 HSVsb扩增子载体更有安全性隐患。最近，来源于嗜菌体的OC31整合酶系统由于能够在不需要加任何辅助因子 情况下介导携带有位点(attB)外源基因位点特异整合在哺乳细胞基因组假attP位 _t (Thyagarajan B, et al. Site-specific genomic integration in mammalian cellsmediated by phage phiC31 integrase. Mol Cell Biol 2001，21 :3926_3934。 01ivaresEC, et al. Site-specific genomic integration produces therapeutic FactorIX levels in mice. Nat Biotechnol 2002，20 :1124_1128)，因而，OC31 整合酶系统的上述生化和生物学特性使其成为遗传操作中独特而有用的工具。但是近来的研究表 明，OC31整合酶也会导致诉诸细胞产生染色体畸形的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种位点特异整合性的杂合性HSV/c5C31扩增子载体系统， 以克服HSV扩增子载体介导的转基因不能长期表达的问题，又可大大减少甚至避免了插入 突变的风险，使该载体成为集有效性、安全性和操作简便性于一体的新型病毒载体系统。本发明的另一个目的是提供上述载体系统的制备方法。本发明的位点特异性整合杂合性HSV/OC31扩增子载体系统，将OC31整合酶系 统与HSV扩增子载体有机结合，不仅解决基于HSV扩增子载体介导的转基因不能长期表达 的问题，也大大减少甚至避免了插入突变的风险。所获得的HSV/OC31扩增子载体系统中，OC31整合酶受巨细胞病毒启动子(CMV) 的调控，当OC31整合酶表达时该酶可特异识别载体上attB序列和哺乳细胞基因组假attP 位点，并介导attBXattP重组，由此导致载体整合在哺乳细胞基因组假attP位点上，因此 可解决基于HSV扩增子载体介导基因转移不能整合的问题。同时，由于attB位点位于CMV 调控区和编码OC31整合酶基因之间，因而，一旦ΦC31整合酶介导attBXattP重组后，可 导致OC31整合酶基因失去被CMV的调控，从而使OC31整合酶表达失活，因而，也避免了 长期Φ031整合酶基因对细胞可能毒性，具有安全性特点。本发明提供了一种杂合性HSV/C5C31扩增子载体系统。该载体系统包含杂合 性HSV/OC31扩增子载体及5个无辅助病毒包装粘粒C0S6Aa、C0S14、C0S28、C0S56和 C0S48 Δ a ；杂合性HSV/OC31扩增子载体质粒由HSV扩增子载体pHSV_GFP、巨细胞病毒启 动子、attB位点、Φ031整合酶基因编码序列和多聚腺嘌呤组成，attB位点位于巨细胞病毒 启动子和Φ031整合酶基因编码序列之间。PCMV-C31载体由美国斯坦福大学Calos教授惠赠。attB序列至少含有34碱基 GTGCCAGGGCGTGCCCTTGGGCTCCCCGGGCGCG(SEQ ID NO 1)，文章出自 “Groth，et al. Aphage integrase directs efficient site-specific integration in human cells, PNAS, 2000，97，5995-6000”。野生型OC31位点特异整合酶基因OC31(，简称为C31，NCBI登陆 号为AX816372)。编码OC31位点特异重组酶质粒CMV int,突变体的克隆载体pINT_T，来 源于美国Carlos博士实验室惠赠，来源于文章Groth AC, Olivares EC, Thyagarajan B， Calos MP. A phage integrase directs efficientsite-specific integration in human cells. Proc Natl Acad Sci USA2000,97 5995-6000 ；Sclimenti CR,Thyagarajan B,Calos MP. Directed evolution ofa recombinase for improved genomic integration at a native human sequence. Nucleic Acids Res. 2001,15 ；29 (24) :5044_51o较好的，attB位点和OC31整合酶基因编码序列依次相连。更好的，巨细胞病毒 启动子、attB位点、OC31整合酶基因编码序列和多聚腺嘌呤依次相连。通常可以将巨细胞病毒启动子、attB位点、OC31整合酶基因编码序列和多聚腺 嘌呤均置于pHSV-GFP的酶切位点。巨细胞病毒启动子、attB位点、OC31整合酶基因编码 序列和多聚腺嘌呤的插入应当不影响PHSV-GFP其余元件的功能。例如，本发明的一个实施 例中，将巨细胞病毒启动子、attB位点、Φ031整合酶基因编码序列和多聚腺嘌呤插入XbaI酶切位点处。本发明还提供了上述载体系统的制备方法，包括以下步骤(l)attB位点和OC31整合酶克隆到pCMV载体，attB位点位于巨细胞病毒启动子 和OC31整合酶基因编码序列之间，获得重组质粒pCMV-attb-C31 ；(2)以重组质粒pCMV-attb_C31为模版，进行PCR，获得由CMV调控元件和OC31整 合酶基因及其多聚腺嘌呤元件构成的PCR产物CMV-attb-C31-pA;将CMV-attb-C31-pA克隆 到HSV扩增子载体pHSV-GFP，获得杂合性HSV/OC31扩增子载体pHSV-GFP-CMV-attB_C31 ；(3)将 pHSV-GFP-CMV-attB-C31 质粒与 5 个无辅助病毒包装粘粒 C0S6 Δ a、C0S14、 C0S28、C0S56和C0S48 Δ a混合，即形成如权利要求1所述的杂合性HSV/OC31扩增子载体 系统。其中，步骤WattB位点和C31整合酶编码序列是用PCR方法或者人工合成方法 得到。步骤(1)中，也可以由attb序列插入CMV-C31质粒获得重组CMV-attb_C31质粒。本发明的制备方法中，克隆序列可以采用PCR，人工合成，酶切等方法实现，拼接序 列则可能采用酶切、退火、连接粘性末端等方法实现。本发明的制备方法(1)中，可以首先将attb序列插入CMV-C31质粒获得重组 CMV-Attb-C31质粒，然后用PCR方法或者人工合成方法得到Attb_C31整合酶编码序列。例如，合成带有KpnI/spel酶切点的attB寡核甘酸序列5-ATAATCGGTACCGGGTGCC AGGGCGTGCCCTTGGGCTCCCCGGGCGCGTACTCCATACTAGTTT~3(SEQID NO 2)，在该序列中，下划线 为attb核心序列(44碱基)，两端为KpnI/spel酶切点和保护性碱基。该attB寡核甘酸序列 经退火酶切回收后克隆到CMVC31质粒，得到重组CMV-attb-C31质粒.CMV C31质粒来自美 国 Stanford University 的Michele P. Calos 教授，文章出自"A phage integrase directs efficient site-specificintegration in human cells, PNAS,2000,97,5995-6000，，。步骤(3)中，混合比例按照常规进行。通常5个无辅助病毒包装粘粒用量大体相 同，pHSV-GFP-CMV-attB-C31质粒的摩尔数稍多。pHSV-GFP-CMV-attB_C31质粒的摩尔数 与5个无辅助病毒包装粘粒摩尔数量之比可以是2-4 5。例如，各质粒的混合比例可以为 2:1:1:1:1:1 或者 3:2:2:2:2:2。本发明的位点特异性整合杂合性HSV/OC31扩增子载体系统，可用于将目标基因 导入宿主，并长期稳定表达。例如，应用于基因治疗或者目标基因的研究。本发明所适用宿主包括各种真核生物。本发明中，新型杂合性HSV/c5C31扩增子 载体系统应用的宿主细胞可以是静止细胞或者分裂细胞。其中，静止细胞可以是神经元细 胞、胶质细胞或者成体干细胞和胚胎干细胞。本发明中，静止期细胞也可以是原代细胞。本发明的杂合性HSV/c5C31扩增子载体病毒，其制备及应用方法具体如下①构建杂合性HSV/ Φ C31扩增子载体(pHSV-GFP-CMV-attB_C31)。首先，人工 合成OC31整合酶识别位点attB序列(上海英俊公司合成)，扩增质粒PCMV-C31 (美国 斯坦福大学Calos教授惠赠)，attB序列和质粒pCMV_C31经同一酶切后，连接，转化，克 隆序列分析，获得重组质粒pCMV-attb-C31。以重组质粒为模板，设计引物进行PCR，获得 CMV调控元件和OC31整合酶基因及其polyA(pA)元件的PCR产物(CMV-attb_C31-pA)， 并经酶切回收克隆于携带有编码绿色荧光蛋白基因(GFP)的HSV扩增子载体(pHSV-GFP)(由 _ Bl Flim _ ； 贝曾 flimicbm. uam. es, Aboody-Guterman, K. S. et al。 “ Green fluorescent protein as a reporter for retrovirus and helper virus-freeHSV-1 ampIicon vector-mediated gene transfer into neural cells in culture and in vivo" Neuroreport 1997,8 :3801_3808)，克隆经序列分析，获得杂合性HSV/OC31扩增子 载体 pHSV-GFP-CMV-attB-C31.②「无辅助病毒包装系统由携带有HSV全基因5个粘粒C0S6 Δ a，C0S14, C0S28, C0S56, C0S48Aa 构成(由美国 Fraefel 教授惠赠，Fraefel, C, et al. Helpervirus-free transfer of herpes simplex virus typel plasmid vectors intoneural cells. J.Virol. 1996,70 7190-7197) 产毒细胞为非洲绿肾细胞(Vero) 2-2 细胞，由 Rozanne Sandri-Goldin(University of California, Irvine, CA)提供.③「将杂合性HSV/ Φ C31扩增子载体(pHSV-GFP-CMV-attB_C31)和5个粘粒 C0S6 Δ a, C0S14, C0S28, C0S56, C0S48 Δ a 共转染 VERO 2-2 细胞(Smith, I etal. Evidence that the herpes simplex virusi mmediate early protein ICP27actspost-transcrip tionally during infection to regulate geneexpression. Virology, 1992,186 :74_86)。 杂合性HSV/C31扩增子载体pHSV-GFP-CMV-attB-C31和5个粘粒转染质量比可以为 2:1:1:1:1: 1 ；如在 4X105VER02-2 细胞/60CM 培养皿，pHSV-GFP-CMV-attB-C31 和每个粘粒所需转染质量分别可以是Iug和0. 5ug。共转染方法可以通过脂质体，磷酸钙， PEI等。以一般HSV扩增子载体(pHSV-GFP)做对照，并按上述方法制备病毒。④「在上述DNA加入2-2细胞无血清培养基上37°C培养5小时后，再加入2%胎牛 血清，培养2-3天后，将细胞和上清液收集，反复冻融3次，1500rpm离心5分，收获病毒上 清。⑤将收获病毒上清IOul感染2X104人胚肾293细胞或大鼠神经元细胞(96孔板)。 感染2天，4天，6天和8天后，荧光显微镜观察和流式细胞术检测，分析感染效率。一般 HSV扩增子病毒载体(pHSV-GFP)感染293细胞后，由于不能整合在基因组上，因而，随着细 胞传代，表达绿色荧光蛋白阳性细胞比例逐渐减少。而新型杂合性HSV/c5C31扩增子载体 (pHSV-GFP-CMV-attB-C31)在感染人胚胎肾细胞293后，C31整合酶表达可介导携带GFP基 因整合在基因组中，因而，随着细胞传代，外源基因能长期表达。结果显示，新型杂合性HSV/OC31扩增子载体(pHSV-GFP-CMV-attB_C31)在感染 人胚胎肾293细胞2天后，即可观察到GFP表达，流式细胞术检测显示在感染2天，4天，6 天和8天后，表达绿色荧光蛋白阳性细胞比例分别为35 %，36. 8 %，36. 9 %，37. 6 %，显示出 随着细胞传代，表达绿色荧光蛋白阳性细胞比例并未改变。而对照pHSV-GFP在感染人胚胎 肾293细胞2天后，同样可观察到GFP表达，但流式细胞术检测显示在感染2天，4天，6天 和8天后，表达绿色荧光蛋白阳性细胞比例分别为28. 1%,21%,13.9%,9.6%0该结果提 示新型杂合性HSV/C31扩增子载体(pHSV-GFP-CMV-attB-C31)具有长期稳定表达特性。另外，上述病毒感染神经元细胞后，也观察到表达GFP阳性细胞，但两者并不随着 时间延伸阳性细胞数而减少，其原因为大鼠神经元细胞属于非分裂细胞，而人胚胎肾293 细胞属于分裂细胞，随着细胞传代，整合的病毒并不会丢失如新型杂合性HSV/c5C31扩增 子载体，而非整合病毒将随细胞分裂而会丢失如一般HSV扩增子载体。为了检测新型杂合性HSV/ Φ C31 扩增子载体(pHSV-CMV-attb_C31-UB-EGFP)长期稳定表达是否与C31整合酶介导的位点特异性整合有关，本发明将从上述病毒感 染8天细胞中抽提基因组DNA，基因组DNA抽提试剂盒由碧云天生产，产品货号D0061。 研究证明OC31整合酶在哺乳细胞上介导位点特异性整合，主要整合在哺乳细胞基因 组假 attP 位点 A 点上(psA site, NCBI sequence ID AF333429) (Thyagarajan B, et al.Site-Specific Genomic Integrationin Mammalian Cells Mediated by PhageC31 Integrase.MOLECULARAND CELLULAR BIOLOGY,2001,21.3926-3934).引物 psaF : 5，-GATATGGGAGGCCACAGTTG-3' ； OC31R 5' -ATGCCCGACGAACCTGAACCGGC-3，。PCR 反应参数 为95°C变性 5min 后 30 个循环，94°C 45s, 55°C 40s, 72°C 50s，最后一循环再 72°C IOmin0 PCR产物进行测序并进行生物信息学分析。结果显示，新型杂合性HSV/c5C31扩增子载体病毒感染293系细胞，能扩增出 287bp的条带。生物信息学分析显示该序列包括宿主基因组假attP位点序列、attB序列和 C31序列的一部分。说明新型杂合性HSV/ΦC31扩增子载体病毒感染细胞后特异整合在假 attP位点上，从而导致外源基因长期表达。本发明的位点特异整合性杂合性HSV/c5C31扩增子载体系统，不仅在哺乳动物细 胞中证实了该载体系统具有感染神经元细胞、胶质细胞、巨噬细胞、肝细胞、心肌细胞和各 种干细胞等在内的多种非分裂或静止期细胞能力，而且，病毒载体携带的转基因在OC31 整合酶介导下可稳定整合在基因组假attP位点上；但由于Φ031整合酶基因整合使其失去 LTR的调控作用而失活，因而，可避免Φ031整合酶过表达对细胞的毒性。本发明的位点特 异整合性杂合性HSV/c5C31扩增子载体系统感染细胞后进行整合分析，其结果显示本发明 的位点特异整合性慢病毒载体可插入在基因组假attP位点上。本发明对现有HSV扩增子载体系统进行了遗传改造，获得了位点特异整合性杂合 性HSV/c5C31扩增子载体。经该病毒载体携带的转基因可稳定整合在宿主基因组特定位点 上，克服了 HSV扩增子载体系统不能整合导致外源基因不能长期表达的不足。本发明一方 面可用于鉴定外源基因的功能，尤其是在原代细胞等非分裂细胞中的作用；另一方面本发 明为抑制肿瘤和抗病毒等领域的基因治疗提供了新的更安全更高效的途径。
图1. HSV扩增子载体结构示意图。图2. PCR方法进行基因整合检测结果图。M为DNA分子量标准；1，为新型杂合性 HSV/OC31扩增子载体感染人胚胎肾293细胞8天后，抽提基因组DNA，PCR产物凝胶电泳 图，显示大约290bp阳性电泳条带；2，为一般HSV扩增子载体感染人胚胎肾293细胞8天 后，抽提基因组DNA，PCR产物凝胶电泳图，未显示阳性电泳条带；3，为阴性对照。图3.新型杂合性HSV/OC31扩增子载体结构示意图。图4.新型杂合性HSV/c5C31扩增子载体感染人胚肾293细胞结果图。为了便于 纸质文本打印，将图片进行去色，那么绿色荧光处显示为高亮白色处即为感染成功的细胞。图5新型杂合性HSV/OC31扩增子载体感染大鼠神经元细胞结果图。图6为图5同一视野的黑白图。高亮白色处即绿色荧光处。为了便于纸质文本打 印清晰，将绿色荧光暗场图片进行去色，那么绿色荧光处显示为高亮白色处即为感染成功 的细胞。
图7.HSV/OC31扩增子载体系统设计策略示意图。首先，合成OC31整合酶识 别位点attB序列，并将该位点序列克隆于巨细胞病毒启动子(CMV)调控的编码Φ031整 合酶的质粒PCMV-C31 (美国斯坦福大学Calos教授惠赠)，克隆位点位于CMV与其调控编 码(DC31整合酶之间，获得重组质粒pCMV-attb-C31。然后，以pCMV-attb_C31为模板，设 计引物进行PCR，获得CMV调控元件和OC31整合酶基因及其polyA(pA)元件的PCR产物 (CMV-attb-C31-pA)，并经酶切回收克隆于携带有编码绿色荧光蛋白基因(GFP)的HSV扩增 子载体(PHSV-GFP)，最后，获得杂合性HSV/OC31扩增子载体pHSV-GFP-CMV-attB_C31。
具体实施例方式实施例1新型杂合性HSV/OC31扩增子载体制备方法人工合成Φ C31整合酶识别位点的寡核甘酸核心序列attB (44bp)，退火并经 KpnI/Spel酶切后克隆于质粒pCMV_C31，获得重组质粒pCMV_attb_C31。以重组质粒为模 板，设计引物进行PCR，获得由CMV调控元件和OC31整合酶基因及其polyA (pA)元件的 PCR产物(CMV-attb-C31-pA)，并经XbaI酶切回收克隆于携带有编码绿色荧光蛋白基因 (GFP)的HSV扩增子载体(pHSV-GFP)，克隆经序列分析，最终获得杂合性HSV/C31扩增子载 体 pHSV-GFP-CMV-attB-C31.实施例2新型杂合性HSV/c5C31扩增子载体病毒的制备将杂合性HSV/OC31扩增子载体或一般HSV扩增子载体分别与5个粘粒C0S6 Δ a, C0S14，C0S28，C0S56，C0S48Aa 以 2 1 1 1 1 1 质量比例混合。利用脂质体 LipofectamineTM在VERO 2-2细胞上进行转染。在转染5小时后，再加入2%胎牛血清，培 养2-3天后，将细胞和上清液收集，反复冻融3次，1500rpm离心5分，收获病毒上清。实施例3新型杂合性HSV/c5C31扩增子载体病毒系统感染细胞分析将上述IOul杂合性HSV/OC31扩增子载体病毒感染96孔板上293细胞系.在感 染人胚胎肾293细胞2天后，即可观察到GFP表达，流式细胞术检测显示在感染2天，4天， 6天和8天后，表达绿色荧光蛋白阳性细胞比例分别为35 %，36. 8 %，36. 9 %，37. 6 %，显示 出随着细胞传代，表达绿色荧光蛋白阳性细胞比例并未改变。而对照PHSV-GFP在感染人胚 胎肾293细胞后，同样可观察到GFP表达，但流式细胞术检测显示在感染2天，4天，6天和8 天后，表达绿色荧光蛋白阳性细胞比例逐渐减少。该结果提示新型杂合性HSV/c5C31扩增 子载体(pHSV-GFP-CMV-attB-C31)具有长期稳定表达特性。实施例4新型杂合性HSV/c5C31扩增子载体病毒感染细胞后位点特异整合分析抽提上述被感染细胞基因组DNA，用PCR和序列分析方法鉴定是否病毒基因组 位点特异整合假 attP 位点，引物 psaF :5，-GATATGGGAGGCCACAGTTG-3，(SEQ ID NO 3)； OC31R 5' -GCCTTGTCTTCGTTGGCGCTACGCT-3' (SEQ ID NO 4)。结果显示，新型杂合性 HSV/ OC31扩增子载体病毒感染293系细胞，能扩增出227bp的条带。序列分析见SEQ ID N01, 其中包括宿主基因组假attP位点序列(见SEQ ID NO 5中ntl_97)、attB序列(见SEQ ID NO 5中nt98-127)和部分OC31序列(见SEQ ID NO 5中自ntl28以后序列)。这说明新 型杂合性HSV/c5C31扩增子载体病毒感染细胞后特异整合在假attP位点上。
gatatgggag gccacagttg agatgccttc caatcagagg cttggtgaga ttccaagagg 60
tggtttcaaa tacagcaata gtacttgggt ttccctt^gg ctccccgggc. gcgtactcca 120
180
tactagt atg acacaagggg ttgtgaccgg ggtggacacg tacgcgggtg cttacgaccgtcaRtcRcgc gaRCRCRaRa attcRaRcgc agcaaRccca gcgacac 227
加框标出为宿主基因组假attP位点序列ntl-97，波浪线标出为attB序列(nt98-127)，下划线为部分OC31序列。
序列表
<210>1
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
gtgccagggc gtgcccttgg gctccccggg cgcg 34
<210>2
<211>64
<212>DNA
<213>人工合成
<400>2
ataatcggta ccgggtgcca gggcgtgccc ttgggctccc cgggcgcgta ctccatacta 60
gttt 64
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>3
gatatgggag gccacagttg 20
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成
<400>4
gccttgtctt cgttggcgct acgct 25
<210>5
<211>227
<212>DNA
<213>人工合成
<400>5
gatatgggag gccacagttg agatgccttc caatcagagg cttggtgaga ttccaagagg 60
tggtttcaaa tacagcaata gtacttgggt ttcccttggg ctccccgggc gcgtactcca 120
tactagtatg acacaagggg ttgtgaccgg ggtggacacg tacgcgggtg cttacgaccg 180tcagtcgcgc gagcgcgaga attcgagcgc agcaagccca gcgacac22权利要求
1.一种杂合性HSV/C5C31扩增子载体系统，其特征在于，该载体系统包含杂合性HSV/ OC31扩增子载体及5个无辅助病毒包装粘粒C0S6Aa、C0S14、C0S28、C0S56和C0S48 Δ a ； 杂合性HSV/OC31扩增子载体质粒由HSV扩增子载体pHSV-GFP、巨细胞病毒启动子、attB 位点、OC31整合酶基因编码序列和多聚腺嘌呤组成，attB位点位于巨细胞病毒启动子和 OC31整合酶基因编码序列之间。
2.如权利要求1所述的载体系统，其特征在于，attB位点和Φ031整合酶基因编码序 列依次相连。
3.如权利要求1所述的载体系统，其特征在于，巨细胞病毒启动子、attB位点、Φ031 整合酶基因编码序列和多聚腺嘌呤均位于pHSV-GFP的酶切位点。
4.如权利要求1所述的载体系统，其特征在于，巨细胞病毒启动子、attB位点、Φ031 整合酶基因编码序列和多聚腺嘌呤依次相连。
5.如权利要求1所述的载体系统的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤(1)attB位点和OC31整合酶克隆到pCMV载体，attB位点位于巨细胞病毒启动子和 OC31整合酶基因编码序列之间，获得重组质粒pCMV-attb-C31 ；(2)以重组质粒pCMV-attb-C31为模版，进行PCR，获得由CMV调控元件和OC31整合 酶基因及其多聚腺嘌呤元件构成的PCR产物CMV-attb-C31-pA ；将CMV_attb-C31-pA克隆 到HSV扩增子载体pHSV-GFP，获得杂合性HSV/OC31扩增子载体pHSV-GFP-CMV-attB_C31 ；(3)将pHSV-GFP-CMV-attB-C31质粒与5个无辅助病毒包装粘粒C0S6Aa、C0S14、 C0S28、C0S56和C0S48 Δ a混合，即形成如权利要求1所述的杂合性HSV/OC31扩增子载体 系统。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)attB位点和C31整合酶编码序 列是用PCR方法或者人工合成方法得到。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将attb序列插入CMV-C31 质粒获得重组CMV-attb-C31质粒。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，混合比例为 2:1:1:1:1:1 或者 3:2:2:2:2:2。
全文摘要
本发明属于基因工程领域，涉及一种单纯疱疹病毒(HSV)与phiC31整合酶(ΦC31)杂合扩增子载体系统及其制备方法。该载体系统包含杂合性HSV/ΦC31扩增子载体及5个无辅助病毒包装粘粒COS6Δa、COS14、COS28、COS56和COS48Δa；杂合性HSV/ΦC31扩增子载体质粒由HSV扩增子载体pHSV-GFP、巨细胞病毒启动子、attB位点、ΦC31整合酶基因编码序列和多聚腺嘌呤组成，attB位点位于巨细胞病毒启动子和ΦC31整合酶基因编码序列之间。本发明的载体系统具备位点特异整合性的功能，能够在多种宿主细胞中长期表达外源目的基因，可用于研究外源基因的功能或者基因治疗。
文档编号C12N15/64GK102002514SQ200910201360
公开日2011年4月6日 申请日期2009年12月17日 优先权日2009年12月17日
发明者孔垂瑾, 朱焕章 申请人:复旦大学