专利名称：检测解脲支原体的荧光pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于体外核酸检测领域，尤其涉及一种在临床样本中检测解脲支原体感染 的荧光PCR (聚合酶链式反应)试剂盒。
背景技术：
解脲支原体(ureaplasma urealyticum, UU)又被称为解脲脲原体，是一种原核微 生物，为脲原体属中唯一的一种，因生长需要尿素而得名。解脲支原体可以引起泌尿生殖道 感染，与女性生殖健康密切相关。解脲支原体是人类泌尿生殖道常见的共生微生物，为致病性比较弱的条件致病支 原体。在成人主要通过性接触传播，新生儿则由母亲生殖道分娩时感染。成人男性的感染 部位在尿道粘膜，女性感染部位在宫颈。妇女妊娠后，由于孕激素的增加，抑制了细胞免疫， 集体抵抗力下降，更易受到解脲支原体的感染。主要引起非淋菌性尿道炎、子宫内膜炎、绒 毛膜羊膜炎、自然流产、早产、前列腺炎、睾丸炎、不育症、低体重新生儿、新生儿肺炎、脑膜 炎以及败血症等。荧光PCR技术在1995年由美国PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高灵敏性、DNA 杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接监测PCR过程中的变化。与普 通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了 PCR产物污染的风险。荧光PCR技术的荧光探针以发展形成多种类型，如Taqman探针，FRET探针等，本方 法涉及的是iTaqman探针技术。其工作原理是它能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5’一 3’ 酶切活性所降解，探针的5’端有一荧光报告基团，3’端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互 先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行， 5’端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出 荧光，被信号探测器所捕获。常同探针5’端相结合的基团有FAM(6-羧基荧光素)，TET(四 氯-6-羧基荧光素)，JOE 0，7- 二甲基-4，5- 二氯-6-羧基荧光素)，HEX (六氯-6-甲基荧 光素)或VIC等，常与3’端相结合的荧光淬灭基团常为TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)或 DABCYL(4-(4’ -恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸)等。
发明内容
为克服传统方法(如电泳法等)对UU(解脲支原体)检测的缺点，本发明提供一 种特异性高、成本低并且能够作定性检测的检测产品。本发明提供了 一种定量检测UU (解脲支原体)感染的荧光PCR (聚合酶链式反应) 试剂盒，包括定性参考品、阴性参考品、阳性对照品、UNG酶、Taq聚合酶、荧光PCR反应液，以 及DNA提取液；所述的荧光PCR反应液包括PCR引物、特异性荧光探针。所述的定性参考品为含有插入UU特异序列的PMD18-T载体质粒，所述的插入序列 如下
tgaagttagacgacaagttagggaatgctgaagtaatggacttagttattacaaacgcattaattcttg actacacaggtatctacaaagctgatatcggtattaaaaacggaaaaattg 120bpo所述的阳性参考品为存放浓度为1. OX IO6-L OX IO7拷贝/微升的重组质粒。所述的阴性参考品为PMD18-T空载体质粒稀释液。所述的PCR引物序列如下扩增检测UU 的正向引物 TGAAGTTAGACGACAAGTTAGGGAATG 27 ；扩增检测UU 的反向引物 CAATTTTTCCGTTTTTAATACCGATATC 28;所述的特异性荧光探针序列如下检测UU 的探针TAATGGACTTAGTTATTACAAACG 24;所述的特异性荧光探针为Taqman探针，标记探针5’端的为一种荧光报告基团，可 以是FAM、ΤΕΤ、JOE、VIC、HEX、ROX, TAMRA, CY3、CY5 ；3，端的为一种荧光淬灭基团，可以是 TAMRA、DABCYL、BHQO、BHQ1、BHQ2。本发明与现有技术相比具有以下优点和效果①定量准确，兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优 点，结果直观，能实时监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不 需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了 PCR产物污染的风险；②灵敏度和特异性高。由于采取特异性和引物和探针的双保险设计，灵敏度和特 异性均有很大提高，能在临床症状出现之前检测到病毒的感染；③检测速度快，加上样本提取总共仅需2-3个小时；④步骤简单；⑤可同时进行高通量的样本检测。总之荧光PCR技术灵敏度高，特异性好，可实时监测反应进程，反应时间可控制在 两个半小时以内，而且是闭管操作，无需后续处理，可最大限度避免反应产物污染，可以取 代传统细胞检测或者普通PCR检测进行UU的早期诊断。
图1为UU阳性参考品的荧光PCR扩增曲线曲线为阳性参考品曲线，阴性参考品 曲线；图2为UU临床样本的荧光PCR扩增曲线所测得的阳性参考品Ct值在20 观 之间，阴性参考品Ct值为Undet,阳性样本Ct值在20 38之间。
具体实施例方式应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员 常规采用方法如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂 商所建议的步骤和条件。实施例1 试剂盒的制备1.引物和探针设计与合成使用I^rimer Express 3. 0，针对UU的URE基因区，处于保守区的引物，在选择好的 引物基础上设计UU的探针。引物与探针均委托专业公司(生工)合成，其中引物为PAGE纯化，探针为HPLC纯化，探针5，端标记FAM荧光基团，3，端标记TAMRA荧光基团。扩增序列如表1:表1.特异性探针与引物序列
权利要求
1.一种检测解脲支原体的荧光PCR试剂盒，包括阴性参考品、阳性参考品、UNG酶、Taq 聚合酶、荧光PCR反应液，以及DNA提取液；所述的荧光PCR反应液包括PCR引物、特异性荧 光探针。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性参考品为含有插入解脲支原 体特异序列的PMD18-T载体质粒，所述插入的特异序列如下tgaagttaga cgacaagtta gggaatgctg aagtaatgga cttagttatt acaaacgcattaattcttga ctacacaggt atctacaaag ctgatatcgg tattaaaaac ggaaaaattg 120。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述的阳性参考品为存放浓度为 1. OX IO6-L OX IO7拷贝/微升的重组质粒。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的阴性参考品为PMD18-T空载体质 粒稀释液。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR引物序列如下扩增检测解脲支原体的正向引物TGAAGTTAGACGACAAGTTAGGGAATG 27 ；扩增检测解脲支原体的反向引物CAATTTTTCCGTTTTTAATACCGATATC 28。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性荧光探针序列如下检测解脲支原体的探针TAATGGACTTAGTTATTACAAACG 24。
7.如权利要求1或6所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性荧光探针为Taqman探 针，标记探针5，端的为一种荧光报告基团，可以是FAM、TET、J0E、VIC、HEX、R0X、TAMRA、CY3、 CY5 ；3，端的为一种荧光淬灭基团，可以是TAMRA、DABCYL、BHQ0、BHQ1、BHQ2。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测解脲支原体的荧光PCR试剂盒，属于体外核酸诊断试剂盒领域。该试剂盒包括阳性参考品、阴性参考品、荧光聚合酶链式反应液、PCR引物和特异性荧光探针、PEG沉淀液、裂解液。本发明包括以荧光PCR技术为基础的PCR体系，包含针对解脲支原体URE基因序列的正、反向引物和荧光探针，在适合的PCR条件下可以检测解脲支原体(UU)URE基因的核酸序列；可以简便快速地在临床样本中检测UU感染，特异性高。
文档编号C12Q1/06GK102102121SQ20091020128
公开日2011年6月22日 申请日期2009年12月17日 优先权日2009年12月17日
发明者汪宁梅, 穆宇豪, 穆海东, 黎飒 申请人:上海裕隆临床检验中心有限公司