专利名称：一种从花椰菜叶片中提取萝卜硫素的方法
技术领域：
本发明属于农业技术领域，涉及植物体内活性成分的分离提取工艺。
背景技术：
萝卜硫素，又称“莱菔子素”，它是一种高效的化学功能物质，是葡萄糖莱菔子 ^f (glucoraphanin,4-methylsulfinyl"butyl glucosinolate,简称 RAA)经 Il 芥子 Bl (myrosinase)水解或酸水解产生的异硫氰酸盐衍生物，其易溶于水，相对分子量177. 3，分 子式C6Hn&N0。基本结构如图1所示。大量试验证明，萝卜硫素对食道癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌等有很好的防治效果，尤 其是它能够杀灭导致胃溃疡和多数胃癌的螺旋幽门杆菌。Yueshengaiang报道，通过给初生 6d的小雌鼠喂食萝卜硫素则能够在动物机体的各个组织器官内诱导产生II型解毒酶—— 谷光甘肽转移酶(GST)和醌还原酶OiR)，并经过上述免疫保护机制对机体产生作用，从而 消除化学致癌物的侵害。杰德·费伊(1999)也研究表明，在实验室环境下，从西兰花提取 出的化学物质萝卜硫素成功地杀灭了螺旋幽门杆菌。另外，Yuesheng ^ang等(1994)还 报道，将萝卜硫素和其类似物外-2-乙酰基-外-6-异硫氰盐降莰烷分别在暴露于致癌物 质的危害时间内对老鼠进行强饲喂养，老鼠乳腺癌的发生率、复发率和其癌细胞重量都显 著下降，癌细胞生长迟滞。由于近年来，癌症的发病率有逐渐上升的趋势，萝卜硫素具有较 强的抗癌作用，将这种具有很强防治癌症效果的天然物质用于食品和医药行业，对于恶性 肿瘤预防和辅助治疗具有积极意义，而且萝卜硫素是植物活性物质，具有广阔的研究价值 及市场前景。芸薹属蔬菜(花椰菜、青花菜、甘蓝等)中含有较高的萝卜硫素的前体物质——葡 糖莱菔子苷。花椰菜的花球在采收利用后都将产生大量的茎叶废弃物，至今这些废弃物一 直未得到开发利用。而从花椰菜中提取制备萝卜硫素技术的攻关将有效地利用茎叶废弃 物，提高资源利用率和农产品附加值，具有良好的生态效益、社会效益和经济效益。日美等发达国家在大规模提取制备萝卜硫素的方法研究方面已取得了一些进展， 已探索的生产工艺主要有化学合成法和酶法。现有的大多数研究都是从十字花科蔬菜中直 接提取萝卜硫素前体，经水解获得萝卜硫素。Davide Bertelli (1998)等则对花椰菜(花 球、叶子)的葡糖莱菔子苷经有机溶剂萃取得到粗制萝卜硫素，然后利用固相萃取得到精 制萝卜硫素。Nathan等Q001)提出了一种从Brigadier花椰菜的脱脂种子中同时分离纯 化萝卜硫素和萝卜硫素腈的制备液相色谱的方法，所述方法都存在步骤繁琐，耗资大的问 题。
发明内容
为改进现有的以花椰菜为原料提取分离萝卜硫素工艺技术，针对现有的萝卜硫素 的提取分离技术缺陷，本发明提供了一种以花椰菜叶片为原料提取萝卜硫素的工艺技术。本发明解决该技术问题所采用的技术方案是
①叶片的清洗、冻干、粉碎将新鲜叶片，如11月至第二年3月采收的花椰菜的新鲜叶片，采用自来水清洗后 放入超低温冰箱冷冻处理，例如温度范围-65°C -70°C。再经真空冷冻干燥至恒重，然后 取出粉碎成粉末状。②勻浆、酶解反应取出一份叶片干粉，按重量比添加6 10倍的外源黑芥子酶(酶活力单位为 1. Ounits，采用0. 05mM,pH = 7. 0的PBS缓冲液配制)和4 6倍的去离子水或超纯水，旋 涡仪上混合成勻浆，40 50°C水浴处理，充分酶解反应30 40min。③溶剂萃取、过滤酶解反应结束后，按照外源酶和去离子水或超纯水的实际添加量，在勻浆中加入 8 10倍的二氯甲烷萃取，并按照叶片干粉与无水硫酸钠的重量比为5. O 8. O
粉评无* ! = 5. O 8. 0)加入无水硫酸钠干燥脱水，医用脱脂棉过滤，收集滤液。④浓缩、真空冷冻干燥滤液利用旋转蒸发仪(30 40°C水浴、100 120mba真空度)进行减压蒸馏，浓 缩后再经真空冷冻干燥(-35 -40°C，4. O 5. Ombar)至恒重，收集冻干样，即可得到萝卜
硫素ο由于采用了上述技术方案，本发明取得的有益效果是本发明提供的以花椰菜叶片为原料提取萝卜硫素的整套工艺技术，其原料来源丰 富，提取方法简单，更适合于工业化生产；故降低了生产成本，这对于萝卜硫素的推广应用 具有积极意义。该方法不仅能简化现有技术中繁琐的提取步骤，而且能够分离得到纯度较 高的萝卜硫素。
图1是萝卜硫素的化学结构图。图2是本发明的方法流程示意图。
具体实施例方式下面将详细说明本发明技术的技术内容1、清洗、冻干、粉碎花椰菜提取萝卜硫素的原料主要取自于花椰菜花球采收以后的废弃叶片(11月 至第二年3月采收的花椰菜的新鲜叶片)，由于花椰菜主要是露天栽培种植，故需要将采收 的新鲜叶片彻底清洗干净，可采用自来水清洗、冷风吹干、去除叶脉，立即放入超低温冰箱 (_65°C _70°C )冷冻处理。然后取出真空冷冻干燥至恒重，利用粉碎机将叶片打成粉末状 后立即装入密封袋，-40°C低温干燥条件保存。2、勻浆、收集滤液称量一份叶片干粉，按重量比添加6 10倍的外源黑芥子酶(酶活力单位为 1. Ounits,采用0. 05mM, pH = 7. O的PBS缓冲液配制)和4 6倍的去离子水或超纯水 (pH7. O 8. 0)，旋涡仪上充分混合成勻浆，40 50°C水浴处理30 40min，进行酶解反应。3、溶剂萃取、过滤
酶解反应结束后，按照外源酶和去离子水或超纯水的实际添加量，在勻浆中快速 (3 5min)加入8 10倍的二氯甲烷(不限于二氯甲烷，只要是利用相似相溶原理，萃取萝 卜硫素即可)混合摇勻，萃取15 20min，并按照叶片干粉与无水硫酸钠的重量比为5. 0
8.0 (Wme W^KStigtt= 5. 0 8. 0)加入无水硫酸钠(不限于无水硫酸钠，只要使用该物 质不会引入其他的金属离子、影响萝卜硫素的转化率的即可)干燥脱水，医用脱脂棉过滤， 收集滤液。4、浓缩、真空冷冻干燥滤液采用旋转蒸发仪(30°C水浴、IlOmki真空度)进行减压蒸馏，浓缩后再经真空 冷冻干燥(-35 -40°C，4. 0 5. Ombar)至恒重，收集冻干样，即可得到萝卜硫素。实施方式1(1)称取l.Og花椰菜叶片干粉，加入SmL的外源黑芥子酶(酶活力单位为 1. Ounits，采用0. 05mM, pH = 7. O的PBS缓冲液配制)和4mL的去离子水或超纯水(pH7. O 8. 0)，旋涡仪上充分混合成勻浆，40°C水浴处理30min，完成酶解反应。(2)溶剂萃取、过滤酶解反应结束后，按照外源酶和去离子水或超纯水的实际添加量12mL，在勻浆中 快速(3min)加入120mL的二氯甲烷混合摇勻，萃取15min，并按照叶片干粉与无水硫酸钠的 重量比为5. O 8. O (W叶片干粉Wx7mm= 5. O 8. 0)加入6. Og无水硫酸钠干燥脱水，医 用脱脂棉过滤，收集滤液。(3)浓缩、真空冷冻干燥滤液采用BUCHI旋转蒸发仪(30°C水浴、IlOml3a真空度)进行减压蒸馏，浓缩后再 经真空冷冻干燥(-35 -40°C，4. O 5. Ombar)至恒重，收集冻干样，即可得到萝卜硫素。实施方式2(1)称取50. Og花椰菜叶片干粉，加入500mL的外源黑芥子酶(酶活力单位为 1. Ounits，采用0. 05mM，pH = 7. O的PBS缓冲液配制)和200mL的去离子水或超纯水 (pH7. O 8. 0)，旋涡仪上充分混合成勻浆，40°C水浴处理40min，完成酶解反应。(2)溶剂萃取、过滤酶解反应结束后，按照外源酶和去离子水或超纯水的实际添加量700mL，在勻浆中 快速(3min)加入5. 6L的二氯甲烷混合摇勻，萃取20min，并按照叶片干粉与无水硫酸钠的 重量比为5. O 8. O (W叶片干粉W无水硫酸纳=5. O 8. 0)加入300. Og无水硫酸钠干燥脱水， 医用脱脂棉过滤，收集滤液。(3)浓缩、真空冷冻干燥滤液采用BUCHI旋转蒸发仪(40°C水浴、120mba真空度)进行减压蒸馏，浓缩后再 经真空冷冻干燥(-35 -40°C，4. O 5. Ombar)至恒重，收集冻干样，即可得到萝卜硫素。实施方式3(1)称取15. Og 25. Og花椰菜叶片干粉，加入100 250mL的外源黑芥子酶(酶 活力单位为1. Ounits,采用0. 05mM, pH = 7. O的PBS缓冲液配制)和60 150mL的去离 子水或超纯水(pH7. O 8. 0)，旋涡仪上充分混合成勻浆，40°C水浴处理30 50min，完成
酶解反应。(2)溶剂萃取、过滤
酶解反应结束后，按照外源酶和去离子水或超纯水的实际添加量，在勻浆中快速 (3min)加入IOOOmL 4000mL的二氯甲烷混合摇勻，萃取20 30min，并按照叶片干粉与 无水硫酸钠的重量比为5. 0 8. 0 (W叶片干粉W^KStigtt = 5. 0 8. 0)加入无水硫酸钠干燥 脱水，医用脱脂棉过滤，收集滤液。(3)浓缩、真空冷冻干燥滤液采用BUCHI旋转蒸发仪(30°C水浴、IOOmba真空度)进行减压蒸馏，浓缩后再 经真空冷冻干燥(-35 -40°C，4. 0 5. Ombar)至恒重，收集冻干样，即可得到萝卜硫素。上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发 明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的 一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施 例，本领域技术人员根据以上所揭示的内容，在不脱离本发明范畴的情况下所做出的改进 和修改都应该在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种萝卜硫素的提取方法，其特征在于由花椰菜叶片中提取萝卜硫素。
2.根据权利要求1所述的提取工艺，其特征在于包括以下步骤对花椰菜叶片的清 洗、冻干、粉碎；勻浆、酶解反应、溶剂萃取、过滤、浓缩、真空冷冻干燥。
3.根据权利要求1所述的提取工艺，其特征在于包括①叶片的清洗、冻干、粉碎将新鲜叶片洗净后放入超低温冰箱冷冻处理，经真空冷冻干燥至恒重，取出粉碎成粉 末状；②勻浆、酶解反应取出一份叶片干粉，按重量比添加6 10倍的外源黑芥子酶和4 6倍的去离子水或 超纯水，旋涡仪上混合成勻浆，40 50°C水浴处理，充分酶解反应30 40min ；③溶剂萃取、过滤酶解反应结束后，按照外源酶和去离子水或超纯水的实际添加量，加入8 10倍的二 氯甲烷萃取，并加入适量无水硫酸钠干燥脱水，混合均勻后用医用脱脂棉过滤，收集滤液；④浓缩、真空冷冻干燥滤液通过减压蒸馏浓缩后，再经真空冷冻干燥即可得到萝卜硫素。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于其中第②步所用外源酶为特制，酶活 力单位为1. Ounits0
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于其中第④步中减压蒸馏条件为 300C -40°C水浴、真空度 1 OOmba-120mba。
全文摘要
本发明涉及一种从花椰菜叶片中提取萝卜硫素的方法，在花椰菜花球采收后，随即收集废弃的叶片，洗净放入超低温冰箱冷冻处理，再经真空冷冻干燥后均匀粉碎成粉末状，取出一份，按重量比添加6～10倍的外源黑芥子酶和4～6倍的去离子水，充分混合成匀浆，通过酶解反应、溶剂萃取、过滤、浓缩、真空冷冻干燥，可获得具有较高含量的萝卜硫素。本发明的方法其原料来源丰富，提取方法简单，更适合于工业化生产。
文档编号C12P13/00GK102102113SQ20091020139
公开日2011年6月22日 申请日期2009年12月18日 优先权日2009年12月18日
发明者乔勇进, 王海宏, 陈召亮 申请人:上海市农业科学院