专利名称：一种用于肺癌化疗药物敏感性检测的细胞系及其建立的制作方法
技术领域：
本方法涉及一种稳定表达细胞系及其建立，该细胞系能够对现有肺癌化疗药物进行药物 敏感性检测并预测患者的化疗疗效。
背景技术：
肺癌是我国和全世界范围危害人类生命健康的常见肿瘤。在全球，肺癌的发病率和死亡 率均居癌症之首。5年生存率仅约10%，使得肺癌防治成为癌症防治的重中之重、难中之难。 我国肺癌的发病率和死亡率一直呈明显上升趋势。20世纪90年代与70年代相比，我国肺癌的 死亡率上升了111.85%。目前我国肺癌发病率已超过万分之三，达到十万分之三十五，成为 发病率最高的恶性肿瘤。同时肺癌的死亡率已由20世纪70年代位居癌症死因的第4位攀升为 第1位。由于已暴露的人群数目甚大，上升趋势至少要延续20 30年。
肺癌早期少有症状，因症状就诊者多属中晚期，化疗方案虽繁多，但疗效不佳，且毒副 反应严重。因而选择合适的治疗方案以提高化疗疗效是提高肺癌治愈率、降低死亡率的关键 。但是，目前全世界尚没有成熟的肺癌化疗敏感性预测方法。
elF3a是一种新确定的肿瘤相关蛋白，它在肿瘤发生机制，维持恶性生物性状中具有重 要作用，elF3a的高度表达与细胞的分化增殖密切相关。现有研究表明elF3a的表达情况与肺 癌的化疗敏感性相关。因此，体外检测并确定化疗药物疗效与elF3a表达情况的相关性对于 制定肿瘤化学治疗方案具有重要指导意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种能够用于对现有肺癌化疗药物进行药物敏感性检测 并预测患者化疗疗效的稳定表达elF3a的细胞系及其建立的方法。该细胞系的建立方法操作 简便、条件稳定、成本低，建立的细胞系稳定表达，预测效果好。
本发明是通过以下方式实现的。
NIH3T3为小鼠的成纤维细胞系，细胞贴壁生长，呈梭形，生长速度快，2-3天传代一次 ，该细胞系无elF3a的内源性表达，故选择该细胞建系。本发明NIH3T3-elF3a细胞系的具体 建立方法为将NIH3T3细胞使用10。/。的小牛血清加上DMEM (GIBCO， invitrogen公司产品)培 养，置于37。C， 5%(]02培养箱中培养3天，种12孔板，并换上无抗生素培养基继续培养24小时 。使用Lipofectamine 200()TM按照1: 2. 5的比例转染2 y g的elF3a真核表达载体pC P A-elF3a (其具体序列见后序列表)至细胞中。转染后48小时按照1: 10体积比例稀释传代至100mm的细胞培养皿中，其接种量为lml。加入600 u g/ml的G418筛选2个星期，挑选单克隆并扩大培 养。使用Real-time PCR和Western Blot验证后，稳定传代至建立细胞系。所建立的细胞系 使用350y g/ml的G418维持培养。
本发明研究了一种能够用于对现有肺癌化疗药物进行药物敏感性检测并预测患者化疗疗 效的稳定表达elF3a的细胞系及其建立的方法。该细胞系的建立方法操作简便、条件稳定、 成本低，建立的细胞系稳定表达，预测效果好。
图1为NIH3T3-elF3a细胞系的elF3a表达Rea1-1ime PCR检测结果；
图2为NIH3T3-elF3a细胞系的elF3a表达Western Blot检测结果；
S1，S2:两株elF3a过表达的NIH3T3-elF3a细胞系，
Vector:空白载体转染细胞，
Empty:未转染细胞。
具体实施例方式
以下实施例旨在进一步说明本发明，而不是限制本发明。 实施例l:本发明细胞系的建立
将NIH3T3细胞使用10。/。的小牛血清加上DMEM (GIBCO， invitrogen公司产品)培养，置于 37°C， 5%(]02培养箱中培养3天，种12孔板，并换上无抗生素培养基继续培养24小时。使用 Lipofectamine 200C)TM按照1: 2. 5的比例转染2 y g的elF3a真核表达载体pC P A-elF3a，其具 体构建方法为扩增elF3a的cDNA，并且两端带上Not I和Kpn I的酶切位点，然后连接到pC PA空载体上。其具体序列见后序列表)至细胞中。转染后48小时按照1: IO体积比例稀释传 代至100mm的细胞培养皿中，其接种量为lml。加入600 y g/ml的G418筛选2个星期，挑选单 克隆并扩大培养。使用Real-time PCR和Western Blot验证后，稳定传代至建立细胞系。所 建立的细胞系使用350 y g/ml的G418维持培养。
实施例2:具体检测方法
(1) 取对数生长期NIH3T3细胞，调整细胞悬液浓度，种于96孔板，每孔100ul， 5000个
/孔；
(2) 37°C， 5%(]02培养24小时；
(3) 分别加入不同浓度的待测药物(各不同种类的肺癌化疗药物)，继续培养3天。所 使用的浓度为0， 0.01， 0.1， 1， 10， 100uM;
(4) 分别选取第l、 2、 3天的细胞，加入20ul MTT/孔，继续培养4-6小时；(5) 使用酶标仪于490nm处检测吸光值；
(6) 根据不同浓度药物的吸光值绘制剂量-效应曲线，并计算不同组别的IC50，使用方 差分析比较有elF3a表达和无elF3a表达细胞组别的IC50，以确定是否有差别。若有差别则表 示elF3a表达不同的患者对于该药物反应不同，需调整用药。
使用本方法筛査了8种化疗药物的结果如下表所示
_稳定转染elF3a的NIH3T3细胞对化疗药物的敏感性检测_
IC5。 (nM)
药物 未转染组 载体对照组 稳定细胞系1 稳定细胞系2
*p〈0. 05与对照组比较
从上表可以看出，该细胞系可以灵敏的在体外检测出受elF3a表达影响的化疗药物的敏 感性。
133.3±7.30 174.80±19.10 867.67±170.83 127.23±25.% 86.24±10.10
1479.33±147.39
25672.67±322.69 130.3±2.36 175.13±12.46 S78.6吐145.47 142.00±9.47 82.7肚10.22 21.11±4.59 1674.67±89.58
3439.00±211.44* 42.00土2.0W 27.1肚0., 211.43土13W 146.43±9.96 83.45±6.11 24.20±4.21 1664.33±103.25
45.74±11.54，
278.93土6.56， 167.37±15.87 84.24±9.36 25.11±2.09 1443.0肚250.32
素苷碱呤芬
素霉泊碱新喋昔
钻 霉红托春春氨莫
顺阿柔依长长甲他〈110> 〈120> 〈130> 〈160> 〈170> 〈210> 〈211> 〈212> 〈213> 〈220>
〈400> gaattccggc tctcctctcc gccaagatgc cttgaggttg aaacatagaa gtggatcttc caacaggtga gaaaaaactg gataatattc gatcgtactg cagtgtttgg cagcaagctt gacaatttga
￡i￡it C11 ￡i￡it ￡1
agtgctatca ctattctcct gtctcaactg
序列表
中南大学
一种用于肺癌化疗药物敏感性检测的细胞系及其建立
无
1
Patentlii version 3. 3 1
4780 DNA
Artificial
人工序列 1
gcgggcgactgctggcgaggcgcgtgggaccttacgctggttccccttcg60
cggcccgggccactagagagttcgctgacgccgggtgagctgagcctgcc120
cggcctattttc卿ggccgg肌肌tgccctcaaacgcgcc肌cg肌ttt180
gcctgctctggatgttctttatgatgttat240
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ttaaagcagt gaatctgaaa caattttcac acccttaagt ggttgataca tccagcacag 4740
tggcggccgc tcgagcatgc atctagaggg ccctattcta 4了80
权利要求
1.一种用于肺癌化疗药物敏感性检测的细胞系，其特征在于，它是在NIH3T3细胞中含有真核表达载体pCβA-eIF3a，所述的载体pCβA-eIF3a的序列见序列表。
2. 一种用于肺癌化疗药物敏感性检测的细胞系的建立方法，其特征 在于，将NIH3T3细胞使用10。/。的小牛血清加上DMEM培养，置于37。C， 5。/。C02培养箱中培养3天 ，种12孔板，并换上无抗生素培养基继续培养24小时；按照l: 2.5的比例转染2yg的elF3a 真核表达载体pCf3A-elF3a至NIH3T3细胞中；所述的载体pC {3 A-elF3a的序列见序列表；转染 后48小时按照1: 10体积比例稀释传代至100mm的细胞培养皿中，其接种量为lml;加入600 yg/ml的G418筛选2个星期，挑选单克隆并扩大培养，建立细胞系。
全文摘要
本发明提出了一种用于肺癌化疗药物敏感性检测的细胞系及其建立。其将NIH3T3细胞使用10％的小牛血清加上DMEM培养，置于37℃，5％CO<sub>2</sub>培养箱中培养3天，种12孔板，并换上无抗生素培养基继续培养24小时；按照1∶2.5的比例转染2靏的eIF3a真核表达载体pCbA-eIF3a至NIH3T3细胞中；所述的载体pCbA-eIF3a的序列见序列表。转染后48小时按照1∶10体积比例稀释传代至100mm的细胞培养皿中，其接种量为1ml；加入600靏/ml的G418筛选2个星期，挑选单克隆并扩大培养，建立细胞系。该细胞系的建立方法操作简便、条件稳定、成本低，建立的细胞系稳定表达，预测效果好。
文档编号C12N5/10GK101665782SQ20091030697
公开日2010年3月10日 申请日期2009年9月14日 优先权日2009年9月14日
发明者刘昭前, 周宏灏, 尹继业, 张建亭, 欧阳冬生, 琼 黄 申请人:中南大学