一种用于肺癌的药物组合物的制作方法
【专利说明】-种用于肺癌的药物组合物
[0001]
技术领域
[0002] 本申请涉及一种用于肺癌的药物组合物，具体地涉及苦鬼白毒和厄洛替尼联合使 用在在人肺癌疾病中的应用，其属于药物化学技术领域。
【背景技术】
[0003] 肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。 近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率 均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚 不完全明确，大量资料表明，长期大量吸烟与肺癌的发生有非常密切的关系。已有的研宄证 明：长期大量吸烟者患肺癌的概率是不吸烟者的10~20倍，开始吸烟的年龄越小，患肺癌的 几率越高。此外，吸烟不仅直接影响本人的身体健康，还对周围人群的健康产生不良影响， 导致被动吸烟者肺癌患病率明显增加。城市居民肺癌的发病率比农村高，这可能与城市大 气污染和烟尘中含有致癌物质有关。因此应该提倡不吸烟，并加强城市环境卫生工作。
[0004] 肺癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，也是目前对人类健康与生命构成威胁最大的 恶性肿瘤。在许多国家，肺癌是首位癌症致死原因，给患者及家庭造成了极大痛苦。肺癌由 遗传和环境等诸多因素相互作用所致，其发展是一个多步骤过程，涉及大量基因结构和表 达调控的改变。
[0005] PPP(苦鬼臼毒）作为靶向IGF1R的小分子抑制剂，研宄发现能增加肺癌细胞放疗 敏感性，II期临床试验表明其联合化疗较单独化疗病人的生存期显著延长，其中78%的鳞 癌及57%的腺癌患者从中获益。PPP现已进入III期临床试验，但目前研宄仅局限于其是否能 增加肺癌放化疗敏感性方面，PPP是否能逆转肺腺癌EGFR-TKI耐药目前尚未见报道。
[0006] 最新研宄发现肺癌中EGFR及IGF1R信号通路相互作用，且是通过Ras/Raf/MAPK 途径来实现其协同作用的。转移性结肠癌患者对于EGFR单抗（西妥昔单抗）的疗效，在 IGF1R高表达者中较好。Y.J.Choi等发现在EGFR-TKI原发性耐药肺癌细胞株H1650中， IGF1R小分子酪氨酸激酶抑制剂a-IR3及AG1024能增加吉非替尼抗肿瘤细胞增殖及促凋 亡作用，并能下调磷酸化Akt，提示其能拮抗EGFR-TKI原发性耐药。
[0007] 伴随着分子生物学、基因组学的不断发展，特别是系统生物学的出现，人们提出了 多组分药物的概念。多组分药物是一种给药方案，区别在于只包含一个化合物的单靶点药 物，其包含多种具有协同药理学作用的化合物，能同时对多个靶点进行干扰，使总效应大于 各单效应之和，以达到最佳的治疗效果。与单组分抗癌药物相比，多组分抗癌药物在治疗时 会产生协同效应，使得总效应大于各单效应之和，进而具有增强药效的特点。此外，多组分 药物还具有降低药物毒性和不易引起耐药性的优势。
[0008] 肺癌的靶向治疗在综合治疗中占据重要部分，厄洛替尼作为EGFR小分子酪氨酸 激酶抑制剂，因其有口服简便、副作用小、易于被患者接受而临床应用广泛。目前研宄的 肺癌生物标志非常多，如：EGFR、VEGFR、PDGFR、C-KIT、PI3K、RAS/RAF/MEK/ERK、mTOF、COX、IGF1R或PKC等。针对这些基因的靶向治疗在临床治疗中显示出了强大的优势，大大提高了 患者的生活质量及总生存期。其中靶向EGFR药物如吉非替尼、厄洛替尼等在肺腺癌治疗中 最为成功。但是研宄显示50%的肺腺癌患者经过EGFR-TKI治疗有效6-12个月后出现获得 性耐药。其耐药原因有很多，主要概括为以下几方面：（1)EGFR基因突变或靶点缺失，常常 与第二位点I790M突变相关；（2)Met扩增；（3)胞内EGFR下游信号蛋白激活；（4)绕开EGFR 通路的其他TK受体的活化，如IGF1R、VEGFR、TOGFR等；（5)肿瘤诱导的血管生成。其中有 部分耐药机制尚未被完全阐明。因此有必要针对这些耐药原因寻找突破，阐明其机制，并积 极寻找新的分子靶向治疗药物来阻止或延迟其耐药。在此，我们选用厄洛替尼诱导建立耐 药株，建立其相应的耐药移植瘤裸鼠模型，寻找PPP对厄洛替尼耐药裸鼠移植瘤生长的影 响，进而提供一种药效好、耐药性低的抗肺肿瘤的药物。
【发明内容】
[0009] 本发明提供一种不具有耐药性、协同作用明显的肺癌活性物质。
[0010] 本发明所提供的一种具有抗癌活性的活性物质，其由PPP和厄洛替尼组成。
[0011] 具体地，上述抗肺癌活性成分中PPP和厄洛替尼的重量份比为1 : 36~1 : 1.0。
[0012] 进一步地，上述抗肺癌活性成分中PPP和厄洛替尼的重量份优选比为1 : 25~1 : 4〇
[0013] 具体地，上述抗肺癌活性成分中PPP和厄洛替尼的重量份比为1 : 16~1 : 10。
[0014] 本发明还提供了上述PPP和厄洛替尼在肺癌疾病中的应用。
[0015] 上述PPP(Picropodophyllotoxin)即为苦鬼白毒素。苦鬼白毒素是小檗科植物八 角莲Dysosmaversipellis(Hance. )M.Cheng的根莖，其系统命名法为：（51?，533,831?，91?)-5, 8, 8a, 9-Tetrahydr〇-9-hydroxy-5-(3, 4, 5-trimethoxyphenyl)furo[3' ,4' :6,7]naph tho[2, 3_d]-1，3-dioxol_6(5aH)_one〇
[0016]膜岛素样生长因子受体 1 (Insulin-likegrowthfactorreceptor1，IGF1R)作 为EGFR的旁路通道，是酪氨酸激酶家族的一员，目前研宄显示已在许多恶性肿瘤如肺癌， 乳腺癌，肝癌，大肠癌，前列腺癌等组织中均表达上调，与肿瘤的恶性转化、增殖、浸润、转移 系密切，还能与其他细胞因子相互作用促进肿瘤的发展。IGF1R定位于15q26染色体，DNA全 长约100kb，21个外显子，为单核基因，编码1367个氨基酸前体蛋白，属于受体酪氨酸激酶 (RTK)成员。它是一个跨膜受体，在各种类型细胞上均有表达。IGF-IR整体结构包括3个 部分：细胞外；跨膜区；酪氨酸蛋白激酶区（即胞浆区），是一种糖蛋白异四聚体，由两个a 亚基（配体结合区，707个氨基酸）及两个0亚基（跨膜及胞内区，626个氨基酸）组成。 其通过与IGF-II结合从而发挥作用。IGF-II与IGF1R的胞外域结合后引起跨膜0亚基结 构的改变，0亚基内酪氨酸激酶即被激活产生自身磷酸化，使下游底物如胰岛素受体底物 (Insulinereceptorsubstrates,IRS)、Src同源胶原（Srchomologycollagen,She)等 发生磷酸化作用，从而启动磷醋酰肌醇-3激酶（Phosphatidylinositol3kinase,PI3K)/ 蛋白激酶B(ProteinkinaseB,PKB)或Ras/促分裂原活化蛋白激酶（Mitogenactivated proteinkinase，MAPK)信号通路，将细胞生长增殖信号持续传至细胞核，使细胞周期调节 失控，加速细胞从G1期进入S期，促进有丝分裂、细胞表型恶性转化、抗凋亡和诱导血管内 皮生长因子（Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)表达等，促进肿瘤的发生发 展。
[0017]IGF1R作为酪氨酸激酶家族的一员，目前已证实其通过其信号转导途径在肺癌的 发生、发展中起重要作用。抑制IGF-IR的活性，可以有效控制肺癌的生长和转移，增强肺癌 对化疗、放疗的敏感性。抑制IGF1R信号通路还可以通过下调VEGFR的表达来抑制血管生 长，从而控制肺癌的生长和转移。IGF1R也早已经成为特异性治疗肺癌的热点靶标。目前 以IGF1R为靶点的治疗方法有许多，包括反义寡核苷酸技术、RNA干扰、单克隆抗体及小分 子激酶抑制剂等。小分子抑制剂是目前临床研宄应用最为广泛。
[0018] 我们在细胞水平通过构建厄洛替尼耐药人肺腺癌细胞模型PC-9/ER，观察单用 EGFR酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼或联合IGF1R酪氨酸激酶抑制剂PPP作用于该细胞后，该 细胞对厄洛替尼耐药性的影响。然后通过建立相应的耐药裸鼠移植瘤模型，随机分为对照 组、厄洛替尼组、PPP组、PPP及厄洛替尼联合组，检测各组移植瘤体积、重量及计算抑瘤率。 通过【具体实施方式】的实验条件成功构建人肺腺癌厄洛替尼耐药细胞株PC-9/ER，同时得到 在亲代及耐药细胞系，厄洛替尼联合PPP组均较其他组更能显著的抑制细胞增殖；此外通 过WesternBlot法结果表明联合用药组EGFR下游磷酸化的Akt、ERK的表达水平明显减 少，厄洛替尼与PPP联用能有效抑制Akt的激活，IGF1R信号通路影响Akt磷酸化在耐药 细胞中发挥更为重要的作用，IGF1R抑制剂PPP通过间接抑制下游靶基因磷酸化而影响细 胞增殖。
[0019] 本发明所提供的抗肺癌活性物质由PPP和厄洛替尼共同组成，其中通过细胞及裸 鼠模型、发现其抗肿瘤的效果优异，同时不产生耐药性。
【附图说明】
[0020] 图1不同组别PC-9和PC-9/ER细胞存活率； 图2PC-9/ER细胞中Akt、ERK、p-Akt及p-ERK蛋白表达水平； 图3给予不同药物后各组裸鼠移植瘤形态比较； 图4给予不同药物后各组裸鼠移植瘤生长曲线。
【具体实施方式】
[0021] 以下通过具体实施例对本申请的技术方案作详细的解释，但所述
【发明内容】
不仅限 于此。
[0022] 本发明通过人肺腺癌细胞株PC-9,建立厄洛替尼耐药株PC-9/ER，观察对照组、厄 洛替尼组、PPP组、厄洛替尼联合PPP组的细胞增殖情况；细胞水平分析PPP逆转厄洛替尼 耐药；WesternBlot分析细胞中p-EGFR、p-IGFlR及下游AKT、ERK、p-AKT及p-ERK的表达； 探讨逆转厄洛替尼耐药发生的机制。然后构建厄洛替尼耐药肺腺癌裸鼠移植瘤模型，观察 对照组、厄洛替尼组、PPP组、厄洛替尼联合PPP组的裸鼠肿瘤生长情况，计算抑瘤率，进一 步证实PPP逆转耐药。
[0023] 以细胞培养、构建耐药株、Westernblot、流式细胞术以及CCK8等细胞学及分子生 物学方法，从分子水平揭示了IGF1R通路与肺腺癌EGFR-TKI获得性耐药的关系，进而使得 PPP联合厄洛替尼在肺癌疾病中有广泛的应用。
[0024] 1细胞研宄（体外实验） 1. 1主要试剂 1640培养基、胎牛血清（FBS)、胰酶均购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒购自日本同 仁公司；Akt、ERK及磷酸化Akt、ERK抗体均购自美国sigma公司；PPP由南通大学附属医院 临床研宄中心馈赠；厄洛替尼购自联科生物有限公司。PPP及厄洛替尼溶解于DMS0,制成浓 度为10ymol/L的溶液，分装后保存于-20°C冰箱中备用。实验时用培养液稀释至目标浓 度，使其DMS0体积分数〈0. 005%。
[0025] 1. 2CCK8法检测细胞增殖 CCK8法测定各组对肺腺癌细胞生长抑制作用：取对数生长期的耐药细胞接种于96孔 培养板内，24h后各组分别加入培养液，PPP(5ymol/L)，厄洛替尼150ymol/L，厄洛替尼 加PPP(厄洛替尼为150ymol/L，PPP为5ymol/L)，48h后向每孔加入10yLCCK-8溶 液，继续培养箱孵育2h后用酶标仪测定在450nm处吸光度，分析