药物发现方法和平台的制作方法

专利名称：药物发现方法和平台的制作方法
药物发现方法和平台
背景技术：
制药工业已经消耗了巨大的技术和财政资源来研发新型治疗剂。然而，先导化合物的失败率(大于90%)仍然持续地保持在高水平。通常在临床前模型(例如近交动物模型或少量细胞系)中满足预期的先导药物化合物在向人类临床试验患者群施用时为毒性的或无效的。在大多数目前的药物研发尝试中的主要不足是它们没有在人类患者群的极度遗传多样性环境中评估候选药物的有效性和毒性。换而言之，在目前的药物研发范例中， 药物的有效性和毒性未在人群中存在的许多(如果不是大多数)相关基因型/表型组合中进行测试。事实上，即使在相对小的人类临床试验群体中获得了试验的成功，但一旦将这些药物施用给更广的人类患者群后也可能产生预料不到的副作用。

发明内容
本发明涉及用于识别纠正与健康状况或健康状况的倾向相关的表型的试剂的方法，包括将来自诱导的人多能干细胞系的细胞或从诱导的人多能干细胞系分化的细胞的第一群与候选试剂相接触；将来自诱导的人多能干细胞系的细胞或从诱导的人多能干细胞系分化的细胞的第二群与对照试剂相接触；其中在两个群中的细胞包含至少一个与健康状况或健康状况的倾向相关的内源等位基因；分析两个群，且如果在处理后第一群比第二群更接近于正常表型，则确认候选试剂为纠正该表型。该状况可选自健康状况，例如神经变性疾病、神经障碍、情结障碍、心血管疾病、代谢障碍、呼吸道疾病、药物敏感性状况、眼疾病、 免疫疾病或血液疾病。所述细胞可从诱导的干细胞分化为神经干细胞、神经元、心肌细胞、 肝干细胞或肝细胞。所描述的表型可为细胞凋亡、细胞内钙水平、钙流、蛋白激酶活性、酶活性、细胞形态、受体活化、蛋白质运输、细胞内蛋白质聚集、细胞器组成、运动性、细胞间通讯、蛋白表达或基因表达。本发明还涉及用于识别诊断性细胞表型的方法，包括将来自受试者的一组细胞与来自不具有健康状况的受试者的一组细胞相对比，其中两组细胞均为诱导的多能干细胞或为从诱导的多能干细胞分化的细胞，且其中在计算机上进行该对比。所述细胞可从诱导的干细胞分化为神经干细胞、神经元、心肌细胞、肝干细胞或肝细胞。本发明还涉及用于在受试者中确定健康状况的风险的方法，包括将在来自受试者的第一组细胞中确定的至少一种表型与在来自不具有健康状况的受试者的第二组细胞中确定的该至少一种表型和在来自具有健康状况的受试者的第三组细胞中确定的该至少一种表型相对比；如果在第一组细胞中确定的该至少一种表型与在第二组细胞中确定的该至少一种表型相比更类似于在第三组细胞中确定的该至少一种表型，则表明所述受试者处于该健康状况的高风险中，其中所述第一、第二和第三组细胞为诱导的多能干细胞或为从诱导的多能干细胞分化的细胞，和其中在计算机上进行该对比。本发明还涉及用于在人类受试者中降低药物毒性的风险的方法，包括将从受试者产生的诱导的多能干细胞系分化的一种或多种细胞与一剂药理学试剂相接触，对接触的一种或多种分化的细胞进行毒性分析，且如果和仅当在接触的细胞中毒性分析为阴性，向该受试者指定或施用该药理学试剂。从诱导的多能干细胞系分化的细胞可为肝细胞、心肌细胞或神经元。本发明还涉及用于识别导致人类疾病的候选基因的方法，包括将来自多个健康个体的分化的细胞类型的培养人类细胞的全基因表达谱与来自患有所述人类疾病的多个个体的分化的细胞类型的培养人类细胞的全基因表达谱相对比，识别具有不同表达水平的一个或多个基因为导致所述人类疾病的候选基因，其中在计算机上进行该对比。本发明还公开了从被诊断具有健康状况的受试者产生的或包含至少一个与健康状况或健康状况的倾向相关的内源等位基因的诱导的人多能干细胞系。本发明还公开了包含来自具有至少一个与神经变性疾病、神经障碍或情结障碍相关的内源等位基因的受试者或来自被诊断患有神经变性疾病、神经障碍或情结障碍的受试者的神经干细胞或神经元的分离的人类细胞群。本发明还公开了包含来自具有至少一个与心血管疾病相关的内源等位基因的受试者或来自被诊断患有心血管疾病的受试者的人心脏祖细胞或心肌细胞的分离的人类细胞群。本发明还公开了包含来自具有至少一个与药物敏感性状况相关的内源等位基因的受试者或来自被诊断具有药物敏感性状况的受试者的肝干细胞或肝细胞的分离的人类细胞群。本发明还公开了一组遗传多样性的诱导的人多能干细胞系，包括从多个个体产生的诱导的人多能干细胞系，所述多个个体各携带在该多个个体中独特的至少一个多态性等位基因。援引加入本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用方式结合在本文中，就好像各个出版物、专利和专利申请均具体和单独地通过引用方式结合在本文中。附图简述本发明的新特征通过所附权利要求书详细阐明。通过参照以下给出示例性的实施方式的具体描述和附图还会更好地理解本发明的特征和优势，该示例性的实施方式使用了本发明的原理，且附图包括

图1为传统药物发现方案(左，其中在患者中测试化合物的有效性和安全性之前在异源系统(例如动物模型)中针对疾病靶点测试先导化合物)和新的药物发现方案(右， 首先基于在来自患者的疾病相关的细胞类型中纠正疾病相关细胞表型的有效性识别先导化合物)的对比示意图。图2为用于基于患者iPSC的疾病建模和药物发现的示例性的、非限定性的方案的概要。图3为在来自患者iPSC系的遗传多样性同期组的细胞中，用于基于患者iPSC的先导候选药物的有效性和安全性的测试的示例性的、非限定性的方案的概要。图4为用于基于患者iPSC识别药物有效性和毒性的预测性生物标志物的示例性的、非限定性的方案的概要。这样的生物标志物用于例如候选药物临床试验的患者分层中， 还用于在特定患者或患者群中确定批准的治疗药物的最佳剂量和安全性，这有时候也被称为“个性化医疗”。图5 (上排)显示来自三名SMN1+SMA患者和两名SMNl+健康对照受试者的成纤维细胞的显微照片；(下排)显示由如上排所示的对应SMA病例和对照受试者成纤维细胞产生的iPSC集落的显微照片。图6显示从图5所示的SMA病例和对照iPSC系获得的类胚体的显微照片。图7显示在从SMlOd iPSC分化的细胞中外胚层(TuJl)、中胚层(Desmin)和内胚层(AFP)谱系标志物的染色的免疫荧光显微照片。
具体实施例方式I.介绍人类患者群体中和群体之间的遗传差异(例如多态性等位基因)很大程度上决定了个体对于疾病的倾向、疾病表现、疾病严重性和对治疗(例如对药物治疗)的响应的差异。用于人类疾病和药物发现的普遍的动物和细胞模型不能很好地表现待治疗的患者群中现存的基因型/表型谱。例如，在药物发现中通常使用的小鼠和大鼠种系为高度近交的， 且因此仅代表了小鼠或大鼠中非常窄范围的可能的基因型/表型组合，更不用说人类。同样地，用于药物筛选的相对少数的人类细胞系可以反映它们来源的个体的基因型/表型范围，但不能反映遗传多样性的群体的基因型/表型范围。此外，大多数人类细胞系在产生或表型模拟受特定健康状况影响的特别分化的细胞类型(例如神经元、心肌细胞和肝细胞) 的能力方面受到非常大的限制。此外，由于细胞系已被改变进行无限复制，因此细胞系不能代表受试者中的细胞群。重要的是，在许多情况下，疾病的动物模型或遗传改造细胞模型不能充分地重现在人类患者的细胞中实际出现的细胞疾病表型。因此，典型的临床前药物研发策略忽略了在人群中存在的且将会对候选药物化合物的治疗效果和毒性产生直接影响的许多基因型/表型。这些事实的实际结果是如上所述，尽管先导化合物在动物模型和转化的细胞系模型的临床前试验中获得成功，但往往在人类临床试验中失败。理想地，药物筛选和药物靶点发现在重现人类患者群中存在的遗传和表型多样性以及在细胞水平的适当的疾病状态的生物模型中进行，最好在临床试验阶段前。这些药物发现的范例示意性地显示在图1中。在传统的药物发现模式(左)中，基于在动物模型中其对特定的药物靶点的作用和其有效性/缺乏毒性来选择用于临床试验的候选治疗剂。在替代的药物发现模式 (右)中，如本文所述的来自患者iPSC系的疾病相关细胞是用于基于其在源自患者的细胞中改善疾病相关的细胞表型的能力识别先导化合物的起始点。因此，本发明描述了来自所选择的个体(例如患者)的诱导的人多能干细胞系、这类细胞系的遗传多样性的组、来自这类细胞系的分化的细胞以及其用于疾病建模、药物发现、诊断和个性化治疗的方法。II.定义本文使用的“候选药物化合物”是指待测定其影响功能性终点的能力的任何测试化合物。这样的功能性终点的一些例子为配体与受体的结合、受体拮抗性、受体激动性、蛋白质-蛋白质相互作用、酶活性、转录响应等。本文使用的“纠正”表型是指改变表型以使其更加接近正常表型。本文使用的“iPSC供体”是指由其产生一种或多种诱导的干细胞系的受试者，例如人类患者。一般而言，iPSC系的基因组对应于其iPSC供体的基因组。本文使用的“表型组分析(phenomic analysis) ”是指由特定类型的细胞(例如心肌细胞)表现的表型(例如静息钙水平、基因表达谱、细胞凋亡指数、电生理学特性、对自由基的敏感性、化合物摄取和排出、激酶活性、第二信使通路响应)的分析。本文使用的“表型组(phenome)”是指受试者和细胞类型特异性的表型的组。例如，尽管具有相同的基因组，但是来自同一个体的肝细胞和心肌细胞的表型组截然不同。本文使用的“内源等位基因”是指细胞基因组原始的天然存在的等位基因，即不是通过重组方法引入的等位基因。本文使用的“源自iPSC的细胞”是指通过iPSC的增殖以产生更多iPSC或通过 iPSC分化为不同的细胞类型而从iPSC产生的细胞。源自iPSC的细胞包括不是从iPSC直接分化而是从中间细胞类型(例如神经胶质祖细胞、神经干细胞或心脏祖细胞)分化的细胞。本文使用的“正常”表型是指落入健康个体中发现的表型范围内的或与健康状况无关(例如不预示健康状况)的表型(例如细胞凋亡率、静息钙水平、激酶活性、基因表达水平)。III.用干药物 帝诜和药物革F,点发现力射秀导的干细胞,系L 概沭本发明提供了如下详述的诱导的人多能干细胞(iPSC)系、干细胞系的组及其在药物发现、诊断和治疗方法中使用的方法。本文公开的诱导的多能干细胞系的特征为长期自我更新、正常的染色体组型和分化为多种不同细胞类型(例如神经元、心肌细胞和肝细胞)的发育潜能。诱导的多能干细胞系可分化为所有三个胚层(即外胚层、中胚层和内胚层)的细胞谱系。受试者(例如患者)和从该受试者产生的iPSC系之间存在重要的关联。首先， iPSC系的所有基因型和对应受试者的基因型是相同的。因此，在一者中揭示的基因型-表型相关性对于另一者也提供相应的信息，反之亦然。第二，在活体外源自iPSC系的分化的细胞(例如神经元)将会显示与对应受试者体内分化的细胞的表型非常相似(如果不是相同的话)的全套细胞表型(本文称为“表型组”)。这一点对于发展靶向于不能常规地从患者获得的细胞(例如神经元、心肌细胞、肝细胞或胰腺细胞)的治疗剂是特别有意义的。例如，当患者患有神经变性疾病(例如帕金森氏病)时，通常受该状况影响的多巴胺能神经元可以通过来自该受试者的iPSC系的分化非侵入性地获得，且然后可在多种分析中被筛选。 因此，iPSC系提供了分化的细胞(例如不可获得的分化细胞)的可再生来源，其中可以检查与疾病、细胞类型和个体相关的病理学细胞表型并针对测试化合物进行筛选。用于疾病建模和药物发现的该方法的示例性、非限定性的实施方式示例性地示于图2中。iPSC系和源自iPSC的细胞(例如运动神经元)还可用于预测候选药物化合物在特定个体或个体组中的有效性和/或副作用，如图3示例性地所示。例如，可测试测试化合物在从诱导的多能干细胞的遗传多样性的组分化的肝细胞中的毒性。源自iPSC的肝细胞中的毒性测试可以揭示在目标患者群中测试化合物产生毒性的整体可能性，以及在该群内的特定患者中产生毒性的可能性。事实上，iPSC系和源自iPSC的细胞(例如胰腺细胞)在表型由基因组确定或预定的意义上可作为揭示细胞表型的“细胞化身(avatar) ”，所述表型为疾病、细胞类型和受试者特异性的。总的来说，患者的诱导干细胞系的组代表患者群中宽范围的基因型/表型组合。因此，它们可用于发现在相关目标群体的宽范围内有效和安全的治疗剂，或用于确定
12哪些个体可用特定的治疗剂有效和安全地治疗。B.警试者样品的筛诜和诜择本文描述的一些方法使用来自符合一个或多个预先确定的标准的受试者的诱导的干细胞系或诱导的干细胞系的组。在一些情况下，可以基于一个或多个这样的预先确定的标准选择受试者和来自这样的受试者的细胞样品以用于产生诱导的干细胞系和诱导的干细胞系的组。这些标准包括但不限于受试者中健康状况(例如脊髓性肌萎缩、帕金森氏病或肌萎缩性脊髓侧索硬化)的存在与否、对于健康状况的一个或多个阳性诊断标准、表明健康状况的倾向或复发的家族病史、与健康状况相关的基因型的存在与否，或还未在诱导的干细胞系的组中表示的至少一个多态性等位基因的存在。在一些情况下，诱导的干细胞系的组特别地从被诊断具有健康状况的患者和不具有该健康状况的患者产生。这样的健康状况包括但不限于神经变性疾病；神经障碍，例如认知损害和情结障碍；听觉疾病，例如耳聋；骨质疏松症；心血管疾病；糖尿病；代谢障碍； 呼吸道疾病；药物敏感性状况；眼疾病，例如黄斑变性；免疫疾病；血液疾病；肾脏疾病；增殖性障碍；遗传障碍、外伤性损伤、中风、器官衰竭或肢缺损。神经变性疾病的例子包括但不限于亚历山大病、阿尔珀病(Alper' s disease)、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、共济失调毛细血管扩张症、巴登氏病 (Batten disease)、牛海绵样脑病、卡纳万病(Canavan disease)、科凯恩综合征、皮质基底节变性、克雅氏病、亨廷顿氏病、HIV相关痴呆症、肯尼迪氏病(Kennedy' s disease), 克腊比氏病(Krabbe' s disease)、路易体痴呆、马查多-约瑟夫病(Machado-Jos印h disease)、多发性硬化、多系统萎缩症、发作性睡病、神经疏螺旋体病(neuroborreliosis)、 帕金森氏病、佩-梅氏病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、皮克氏病、原发性侧索硬化症、朊病毒病、植烷酸贮积症、桑德霍夫病(SandhofT ’ s disease)、谢耳德氏病 (Schilder' s disease)、恶性贫血继发的脊髓亚急性混合变性、精神分裂症、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌萎缩、进行性核上性麻痹(Steele-Richardson-Olszewski disease)和脊髓痨。神经障碍的例子包括中风、认知损害和情结障碍。免疫疾病的例子包括但不限于获得性免疫缺陷、白血病、淋巴瘤、超敏(过敏)、 自身免疫性疾病和严重的联合免疫缺陷。自身免疫性疾病的例子包括但不限于急性播散性脑脊髓炎、阿狄森氏病、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、大疱性类天疱疮、乳糜泄、皮肌炎、1型糖尿病、古德帕斯丘综合征、格雷夫斯病、格林巴利综合征 (Guillain-Barre syndrome)、桥本氏病、特发性血小板减少性紫癜、红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、天疱疮、恶性贫血、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、类风湿性关节炎、干燥综合征、颞关节炎(也被称为“巨细胞关节炎”)、血管炎、韦格纳氏肉芽肿病。心血管疾病的例子包括但不限于动脉瘤、心绞痛、心律失常、动脉粥样硬化、心肌病、脑血管意外(中风)、脑血管疾病、先天性心脏病、充血性心力衰竭、心肌炎、冠状动脉瓣膜病(valve diseasecoronary)、扩张性动脉病(artery disease dilated)、心肌病、心脏舒张功能不全、心内膜炎、高血压(高血压症)、肥厚型心肌病、二尖瓣脱垂、心肌梗死(心脏病发作)以及静脉血栓栓塞。
13
代谢障碍的例子包括但不限于酸性脂肪酶病、淀粉样变性、巴氏综合征(Barth Syndrome)、生物素酰胺酶缺乏症(biotinidasedeficiency)、肉毒碱棕榈酰转移酶缺乏症II型、脑桥中央髓鞘溶解症、肌肉的代谢性疾病包括肌肉萎缩症、法勃氏病(Farber' s Disease)、葡萄糖_6_磷酸脱氢酶缺乏症、神经节苷酯贮积症(gangliosidose)、三甲基胺尿症、莱-奈二氏综合征、脂质贮积病、代谢性肌病、甲基丙二酸尿症、线粒体肌病、粘多糖贮积症(mucopolysaccharidoses)、粘脂贮积病(mucolipidoses)、粘脂病、粘多糖症、多种辅酶A羧化酶缺乏症、非酮性高甘氨酸血症、庞贝氏症、丙酸血症、I型糖原贮积病、尿素循环障碍、高草酸尿症和草酸盐沉着症。增殖性障碍的例子包括但不限于以下的一种或多种癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞肿瘤、胚芽瘤(blastic tumor)、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、皮肤黑色素瘤、乳腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌。疾病或障碍的其他例子可参见于2008年6月13日提交的WSGR案卷号 36588-704. 201，第一发明人为 Kazuhiro Sakurada 的美国申请 No. 12/157，967 ；于 2008 年 6月13日提交的WSGR案卷号36588-707. 101，第一发明人为Kazuhiro Sakurada的美国申请No. 61/061，594和于2009年6月12日提交的WSGR案卷号36588-704. 502，第一发明人为Kazuhiro Mkurada的美国申请；且在此通过引用方式将其结合在本文中。还可以预期的是，本发明的方法包括推广和销售用于治疗包括但不限于本文所述的疾病和障碍的产品和服务。这样的受试者可在例如基因相关性研究、临床研究和医院中被识别，优选在已经做出健康状况的最终诊断后。优选地，在包括未受影响的对照个体的基因相关性研究中识别受试者。在其他情况下，从被筛选是否存在与健康状况或健康状况的倾向相关的至少一个等位基因的受试者产生iPSC系。这样的等位基因表明，尽管未显示出健康状况的明显症状，但个体具有发生该健康状况的高风险。例如，BRCAl已被用于表明发生乳腺癌的高可能性。可在来自多种来源(例如血库、精子库、基因相关性研究、医院、临床试验或其他任何来源，只要可从基因分型的个体获得活细胞样品即可)的样品上进行受试者的基因分型。尽管不希望束缚于理论，据认为来自携带与健康状况相关的等位基因的个体的一种或多种该细胞表型将会显示出异常情况，其与基因型结合可用作比单独的基因型更可靠的健康状况的预后性指示。此外，与健康状况相关的特定异常细胞表型的识别可指示用于筛选该健康状况的预防剂和治疗剂的目标途径。持续进行着识别人群中存在的多态性等位基因之间的相关性的尝试，例如单核苷酸多态性(SNP)以及常见健康状况的发生，例如神经变性疾病、精神障碍、代谢障碍和心血管疾病。可在人类基因组中发现各种不同类型的多态性等位基因，如表1所总结的。
权利要求
1.一种用于识别纠正与健康状况或健康状况的倾向相关的表型的试剂的方法，包括 (i)将来自诱导的人多能干细胞系的细胞或从诱导的人多能干细胞系分化的细胞的第一群与候选试剂相接触；( )将来自诱导的人多能干细胞系的细胞或从诱导的人多能干细胞系分化的细胞的第二群与阴性对照试剂相接触；(iii)在所述接触步骤后分析所述第一群和所述第二群的表型；和(iv)如果在所述接触步骤后所述第一群的分析表型比在所述接触步骤后所述第二群的表型更接近正常表型，则确认所述候选试剂纠正所述表型；其中诱导的人多能干细胞的所述第一和第二群中的细胞(a)包含至少一个与所述健康状况或所述健康状况的倾向相关的内源等位基因；或(b)是由具有所述健康状况或所述健康状况的倾向的受试者产生的。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述健康状况为神经变性疾病、神经障碍、情结障碍、心血管疾病、代谢障碍、呼吸道疾病、药物敏感性状况、眼疾病、免疫疾病或血液疾病。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞的第一和第二群为从诱导的人多能干细胞系分化的细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述分化的细胞为神经干细胞、神经元、心肌细胞、 肝干细胞或肝细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述表型为细胞凋亡、细胞内钙水平、钙流、蛋白激酶活性、酶活性、细胞形态、受体活化、蛋白质运输、细胞内蛋白质聚集、细胞器组成、运动性、细胞间通讯、蛋白表达或基因表达。
6.如权利要求1所述的方法，进一步包括将所述诱导的人多能干细胞系基因组中存在的多个多态性等位基因与产生所述诱导的多能干细胞系的该人以外的人的基因组中存在的多个多态性等位基因相对比。
7.如权利要求1所述的方法，还包括就多个多态性对所述诱导的人多能干细胞系进行基因分型。
8.如权利要求1所述的方法，还包括将所述诱导的人多能干细胞系的基因组序列或其部分与产生所述诱导的多能干细胞系的该人以外的人的基因组序列或其部分相对比。
9.如权利要求1所述的方法，还包括测序所述诱导的人多能干细胞系的基因组。
10.一种用于识别诊断性细胞表型的方法，包括将在来自具有健康状况的受试者的第一组细胞中确定的至少一种表型与在来自没有该健康状况的受试者的第二组细胞中确定的该至少一种表型相对比，和如果在所述第一组细胞中确定的所述至少一种表型不同于在所述第二组细胞中确定的所述至少一种表型，则表明所述至少一种表型为诊断性表型，其中所述第一和第二组细胞为诱导的多能干细胞或为从诱导的多能干细胞分化的细胞，和其中所述对比在计算机上进行。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述第一和第二组细胞为从诱导的多能干细胞分化的细胞。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述分化的细胞包括神经元、心肌细胞或肝细胞。
13.如权利要求10所述的方法，还包括确定所述第一或第二组细胞中的该至少一种表型。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述至少一种表型包括基因表达谱。
15.一种用于在受试者中确定健康状况的风险的方法，包括(i)将在来自该受试者的第一组细胞中确定的至少一种表型与在来自没有该健康状况的受试者的第二组细胞中确定的该至少一种表型及在来自具有该健康状况的受试者的第三组细胞中确定的该至少一种表型相对比；和( )如果在所述第一组细胞中确定的所述至少一种表型与在所述第二组细胞中确定的所述至少一种表型相比更类似于在所述第三组细胞中确定的所述至少一种表型，则表明所述受试者处于所述健康状况的高风险中，其中所述第一、第二和第三组细胞为诱导的多能干细胞或为从诱导的多能干细胞分化的细胞，和其中所述对比在计算机上进行。
16.一种用于在人类受试者中降低药物毒性的风险的方法，包括(i)将从所述受试者产生的诱导的多能干细胞系分化的一种或多种细胞与一剂药理学试剂相接触；( )对所述接触的一种或多种分化的细胞进行毒性分析；和(iii)如果且仅当在所述接触的细胞中毒性分析为阴性，则向所述受试者指定或施用所述药理学试剂。
17.如权利要求15所述的方法，其中从所述诱导的多能干细胞系分化的所述一种或多种细胞包括一种或多种肝细胞、心肌细胞或神经元。
18.如权利要求15所述的方法，其中从所述诱导的多能干细胞系分化的所述一种或多种细胞包括一种或多种肝细胞。
19.如权利要求15所述的方法，其中所述分析步骤包括测定细胞凋亡、细胞内钙水平、 钙流、蛋白激酶活性、酶活性、细胞形态、蛋白质运输、细胞内蛋白质聚集、细胞器组成、运动性、离子通道电流、细胞间通讯、蛋白表达、基因表达、线粒体跨膜电势、细胞色素C氧化酶易位、P450酶同种型活性或P450酶同种型表达水平。
20.如权利要求15所述的方法，还包括将所述诱导的人多能干细胞系的基因组中存在的多个多态性等位基因与产生所述诱导的多能干细胞系的该人以外的人的基因组中存在的多个多态性等位基因相对比。
21.如权利要求15所述的方法，还包括就多个多态性对所述诱导的人多能干细胞系进行基因分型。
22.如权利要求15所述的方法，还包括将所述诱导的人多能干细胞系的基因组序列或其部分与产生所述诱导的多能干细胞系的该人以外的人的基因组序列或其部分相对比。
23.如权利要求1所述的方法，还包括测序所述诱导的人多能干细胞系的基因组。
24.一种用于识别导致人类疾病的候选基因的方法，包括将(i)来自多个健康个体的分化的细胞类型的培养的人类细胞的全基因表达谱与( )来自患有所述人类疾病的多个个体的分化的细胞类型的培养的人类细胞的全基因表达谱相对比；和识别在(i)和(ii)中具有不同表达水平的一个或多个基因作为导致所述人类疾病的候选基因，其中所述对比在计算机上进行。
25.如权利要求M所述的方法，其中所述分化的细胞类型包括神经元细胞类型、神经胶质细胞类型、心脏细胞类型、肝细胞类型、肺细胞类型或胰腺细胞类型。
26.如权利要求M所述的方法，还包括确定(i)或(ii)。
27.如权利要求M所述的方法，其中所述健康状况为神经变性疾病、神经障碍、眼疾病、情结障碍、呼吸道疾病、心血管疾病、免疫疾病、血液疾病、代谢障碍或药物敏感性状况。
28.如权利要求M所述的方法，还包括改变所述一个或多个识别的候选基因在如下细胞中的表达水平(i)从诱导的人多能干细胞系分化的细胞，其包含与健康状况或健康状况的倾向相关的至少一个内源等位基因；或( )从诱导的人多能干细胞系分化的细胞，其中所述诱导的人多能干细胞系是从被诊断为具有健康状况的受试者产生的。
29.如权利要求M所述的方法，其中所述多个健康个体包括至少100个个体，和所述具有所述健康状况的多个个体包括至少100个个体。
30.如权利要求四所述的方法，其中所述多个健康个体包括至少500个个体，和所述具有所述健康状况的多个个体包括至少500个个体。
31.如权利要求四所述的方法，其中所述多个健康个体和所述具有所述健康状况的多个个体具有类似的人口构成。
32.从被诊断具有健康状况的受试者产生的诱导的人多能干细胞系。
33.如权利要求32所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述健康状况为神经变性疾病、神经障碍、眼疾病、情结障碍、呼吸道疾病、心血管疾病、免疫疾病、血液疾病、代谢障碍或药物敏感性状况。
34.如权利要求33所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述健康状况为神经变性疾病、神经障碍或情结障碍。
35.从权利要求34所述的诱导的人多能干细胞分化的神经干细胞或神经元。
36.如权利要求33所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述健康状况为心血管疾病。
37.从权利要求36所述的诱导的人多能干细胞分化的心脏祖细胞或心肌细胞。
38.如权利要求33所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述健康状况为代谢障碍。
39.如权利要求33所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述健康状况为药物敏感性状况。
40.如权利要求39所述的诱导的人多能干细胞系，其中与所述健康状况或健康状况的倾向相关的所述内源等位基因为细胞色素P450同种型等位基因。
41.从权利要求39所述的诱导的人多能干细胞分化的肝干细胞或肝细胞。
42.通过权利要求32所述的人多能干细胞分化产生的分化的细胞。
43.如权利要求42所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为神经干细胞或神经元。
44.如权利要求42所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为神经胶质祖细胞或神经胶质细胞。
45.如权利要求42所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为心脏祖细胞或心肌细胞。
46.如权利要求42所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为胰腺β细胞或胰腺祖细胞。
47.如权利要求42所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为肝干细胞或肝细胞。
48.如权利要求42所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为肺祖细胞或肺细胞。
49.包含权利要求42所述的分化的细胞的非人嵌合体哺乳动物。
50.通过权利要求32所述的人多能干细胞分化产生的分化的细胞。
51.一种诱导的人多能干细胞系，包含与健康状况或健康状况的倾向相关的至少一种内源等位基因。
52.如权利要求51所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述与健康状况相关的至少一种内源等位基因包括单核苷酸多态性等位基因、启动子等位基因或编码蛋白质的等位基因。
53.如权利要求51所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述健康状况为神经变性疾病、神经障碍、眼疾病、情结障碍、呼吸道疾病、心血管疾病、免疫疾病、血液疾病、代谢障碍或药物敏感性状况。
54.如权利要求53所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述健康状况为神经变性疾病、神经障碍或情结障碍。
55.从权利要求M所述的诱导的人多能干细胞系分化的神经干细胞或神经元。
56.如权利要求53所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述健康状况为心血管疾病。
57.从权利要求56所述的诱导的人多能干细胞分化的心脏祖细胞或心肌细胞。
58.如权利要求53所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述健康状况为代谢障碍。
59.如权利要求58所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述健康状况为药物敏感性状况。
60.如权利要求59所述的诱导的人多能干细胞系，其中与所述健康状况或健康状况的倾向相关的所述内源等位基因为细胞色素P450同种型等位基因。
61.从权利要求59所述的诱导的人多能干细胞分化的肝干细胞或肝细胞。
62.通过权利要求51所述的人多能干细胞分化产生的分化的细胞。
63.如权利要求62所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为神经干细胞或神经元。
64.如权利要求62所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为神经胶质祖细胞或神经胶质细胞。
65.如权利要求62所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为心脏祖细胞或心肌细胞。
66.如权利要求62所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为胰腺β细胞或胰腺祖细胞。
67.如权利要求62所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为肝干细胞或肝细胞。
68.如权利要求62所述的分化的细胞，其中所述分化的细胞为肺祖细胞或肺细胞。
69.包含权利要求62所述的分化的细胞的非人嵌合体哺乳动物。
70.如权利要求51所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述诱导的人多能干细胞系为雄性的。
71.如权利要求51所述的诱导的人多能干细胞系，其中所述诱导的人多能干细胞系为雌性的。
72.包含来自具有与神经变性疾病、神经障碍或情结障碍相关的至少一种内源等位基因的受试者或来自被诊断为患有神经变性疾病、神经障碍或情结障碍的受试者的神经干细胞或神经元的分离的人类细胞群。
73.用于产生权利要求72所述的分离的人类细胞群的方法，包括从所述人类受试者产生诱导的多能干细胞系。
74.如权利要求73所述的方法，还包括就是否存在所述的至少一种内源等位基因对所述人类受试者进行基因分型。
75.如权利要求73所述的方法，还包括将所述诱导的多能干细胞系分化为包含神经元的细胞群。
76.如权利要求72所述的方法，其中所述人类受试者具有所述的至少一种内源等位基因。
77.如权利要求72所述的方法，其中所述人类受试者被诊断为患有所述神经变性疾病、神经障碍或情结障碍。
78.包含权利要求72所述的分离的人类细胞群的非人嵌合体哺乳动物。
79.包含来自具有与心血管疾病相关的至少一种内源等位基因的受试者或来自被诊断为患有心血管疾病的受试者的人心脏祖细胞或心肌细胞的分离的人类细胞群。
80.用于产生权利要求79所述的分离的人类细胞群的方法，包括从所述人类受试者产生诱导的多能干细胞系。
81.如权利要求80所述的方法，还包括就是否存在所述的至少一种内源等位基因对所述人类受试者进行基因分型。
82.如权利要求80所述的方法，还包括将所述诱导的多能干细胞系分化为包含心脏祖细胞或心肌细胞的细胞群。
83.如权利要求79所述的方法，其中所述人类受试者具有所述的至少一种内源等位基因。
84.如权利要求79所述的方法，其中所述人类受试者被诊断为患有所述心血管疾病。
85.包含权利要求79所述的分离的人类细胞群的非人嵌合体哺乳动物。
86.包含来自具有与药物敏感性状况相关的至少一种内源等位基因的受试者或来自被诊断为具有药物敏感性状况的受试者的肝干细胞或肝细胞的分离的人类细胞群。
87.用于产生权利要求86所述的分离的人类细胞群的方法，包括从所述人类受试者产生诱导的多能干细胞系。
88.如权利要求87所述的方法，还包括就是否存在所述的至少一种内源等位基因对所述人类受试者进行基因分型。
89.如权利要求87所述的方法，还包括将所述诱导的多能干细胞系分化为包含肝干细胞或肝细胞的细胞群。
90.如权利要求86所述的分离的人肝干细胞或肝细胞，其中与药物敏感性状况相关的所述内源等位基因为细胞色素P450同种型等位基因。
91.包含权利要求86所述的肝干细胞或肝细胞群的非人嵌合体哺乳动物。
92.如权利要求86所述的方法，其中所述人类受试者具有所述的至少一种内源等位基因。
93.如权利要求86所述的方法，其中所述人类受试者被诊断为具有所述药物敏感性状况。
94.一组遗传多样性的诱导的人多能干细胞系，包含从多个个体产生的诱导的人多能干细胞系，其中所述多个个体各携带在所述多个个体中独特的至少一个多态性等位基因。
95.如权利要求94所述的组，其中所述至少一个多态性等位基因包括至少50个多态性等位基因。
96.如权利要求95所述的组，其中所述至少50个多态性等位基因包括至少500个多态性等位基因。
97.如权利要求94所述的组，其包含从至少50个个体产生的诱导的人多能干细胞系。
98.如权利要求94所述的组，其包含从至少250个个体产生的诱导的人多能干细胞系。
99.如权利要求94所述的组，其包含从至少1000个个体产生的诱导的人多能干细胞系。
100.如权利要求94所述的组，其中所述多个个体包括至少两个民族的个体。
101.如权利要求94所述的组，其中所述至少一种多态性包括与健康状况或健康状况的倾向相关的多态性。
102.如权利要求100所述的组，其中所述健康状况为神经变性疾病、神经障碍、眼疾病、情结障碍、呼吸道疾病、心血管疾病、免疫疾病、血液疾病、代谢障碍或药物敏感性状况。
103.如权利要求94所述的组，其中所述至少一种多态性包括与至少三种健康状况相关的多态性、与健康状况的倾向相关的多态性或其任意组合。
104.如权利要求103所述的组，其中所述至少三种健康状况选自神经变性疾病、神经障碍、情结障碍、心血管疾病、代谢障碍、药物敏感性状况、眼疾病、呼吸道疾病、免疫疾病或血液疾病。
105.如权利要求94所述的组，其中所述至少一个多态性等位基因包括单核苷酸多态性等位基因、启动子等位基因或编码蛋白质的等位基因。
106.如权利要求94所述的组，其中所述多个个体具有一种或多种健康状况。
107.如权利要求106所述的组，其中所述一种或多种健康状况包括神经变性疾病、神经障碍、情结障碍、心血管疾病、代谢障碍、药物敏感性状况、眼疾病、呼吸道疾病、免疫疾病或血液疾病。
108.如权利要求106所述的组，其中所述多个个体具有至少一种共同的健康状况。
109.如权利要求108所述的组，其中所述至少一种共同的健康状况包括神经变性疾病、神经障碍、情结障碍、心血管疾病、代谢障碍、药物敏感性状况、眼疾病、呼吸道疾病、免疫疾病或血液疾病。
110.包含从权利要求94所述的诱导的人多能干细胞的组分化的细胞的一组分化的人类细胞。
111.如权利要求110所述的分化的人类细胞的组，其中所述分化的人类细胞为神经干细胞、神经元、神经胶质祖细胞、神经胶质细胞、心脏祖细胞、心肌细胞、胰腺祖细胞、胰腺β 细胞、肝干细胞、肝细胞或肺祖细胞。
112.如权利要求110所述的分化的人类细胞的组，其中所述分化的人类细胞为神经干细胞或神经元。
113.如权利要求110所述的分化的人类细胞的组，其中所述分化的人类细胞为心脏祖细胞或心肌细胞。
114.如权利要求110所述的分化的人类细胞的组，其中所述分化的人类细胞为肝干细胞或肝细胞。
全文摘要
本发明涉及用于识别纠正与健康状况或健康状况的倾向相关的表型的试剂的方法。本发明还涉及用于识别诊断性细胞表型、在受试者中确定健康状况的风险的方法、在人类受试者中降低药物毒性的风险的方法和用于识别导致人类疾病的候选基因的方法。本发明还公开了诱导的人多能干细胞系。
文档编号C12N5/071GK102203275SQ200980127502
公开日2011年9月28日 申请日期2009年6月12日 优先权日2008年6月13日
发明者K·J·希登曼, 樱田一洋 申请人:国立大学法人京都大学