G蛋白偶联受体相关物质和方法

专利名称：G蛋白偶联受体相关物质和方法
技术领域：
本发明一般地涉及内源性大麻素(endocarmabinoicOG蛋白偶联受体55(GPR55) 及其用途。
背景技术：
经典大麻素受体CB1和CB2的药理学已经充分确立。然而，发现了较新的证据表明存在新的大麻素受体，它们具有与CB1和CB2受体不 一致的药理学特征。GPR55先前是一种孤儿GPCR。后来，一篇由GlaxoSmithKline提交的专利显示，在 回肠、脾、扁桃体、睾丸、乳房和脂肪组织中发现了 GPR55表达。发现CB1和CB2与GPR的序 列同源性仅分别为 13. 5%和 14. 4% (Sawzdargo 等，1999 ；Brown and Wise, 2003 ；Ryberg et al.，2007)。新近的一项研究(Johns等，2007)致力于检验下述假说，即GPR55介导CBx激动剂 或非典型大麻素引起的血管舒张。该研究显示GPR55被多种非典型大麻素激活，但并不介 导它们的血管舒张作用。另一项近来的研究(Ryberg等，2007)确定了 GPR55偶联的G蛋白是G13，并发现了 rhoA.racl和cdc42小GTP酶的下游激活。其作者得出结论，GPR55是文献中描述的非CB1 和CB2受体的一个候选物。国际专利申请WO 01/86305 (Glaxo Group Limited)涉及对GPR55活性的调调节 的鉴定。讨论了多种调节剂的测定法。国际专利申请WO 2004/07844(Astrazeneca UK Limited)涉及对GPR55 活性的大 麻素-配体-类型的调制剂的鉴定。讨论了多种调节剂的测定法。

发明内容
本发明人发现GPR55在人攻击性乳腺癌细胞中表达，且表达水平可能与这些细胞 的侵袭性和转移潜力相关。转移是恶性肿瘤向远离原始或原发肿瘤的次发位点的扩散。对于原发肿瘤转移潜 力的早期认识可为临床医师提供可用于治疗和辅助疗法的重要信息。因此，在本发明的不同方面，可将GPR55表达用作涉及乳腺癌肿瘤转移特征的诊 断工具或生物标志。本发明人还发现，攻击性乳腺细胞的迁移可以被靶向该受体的药理学作用剂所修 饰。因此本发明的进一步的方面涉及为了抑制乳腺癌进展和扩散的目的而治疗性靶 向所述受体。本文中还公开了乳腺癌如何向骨转移的可能模型。在此方面(骨转移)的评估和 介入构成了本发明的另外方面的基础。
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因此，在一个方面本发明提供了预测在来自受试者的生物样品中的乳腺癌细胞的 转移潜力或确定其转移预后的方法，所述方法包括评估所述细胞中GPR55表达的水平。在进行所述方法之前可获得原发肿瘤的样品(手术前或手术中的活组织检查)如更加具体地描述的，“表达”水平可根据GPR55核酸或蛋白质的水平来检测。举 例而言，可检测细胞膜、内质网或高尔基体中蛋白质(通过直接结合或通过活性)，或可根 据编码GPR55的mRNA来直接或间接地(例如，通过由其衍生的cDNA)检测核酸。在优选实施方案中，所述评估可为基于免疫测定法的测试。举例而言，可在免疫测 定法中使用标记的抗体以衡量细胞或细胞膜中的GPR55水平。然而，本领域其他众所周知 的方法可包括使用荧光显微镜、Western印迹分析、mRNA Northern和狭缝印迹分析(slot blot analysis),mRNA的酶扩增和分析、荧光激活细胞分选术等。在一个实施方案中，本发明可包括下述步骤(a)将获自癌症患者的生物样品与特异性结合GPR55或GPR55mRNA的结合作用剂 相接触；和(b)检测结合于结合作用剂的GPR55或GPR55mRNA的量；(c)任选地，将GPR55或GPR55mRNA的量与预定的截止值相比较，并由此确定所述 癌细胞的转移潜力。在一个方面，提供了一种方法，其包括(a)使获自癌症患者的生物样品与特异性结合GPR55的结合作用剂相接触；和(b)检测结合于结合作用剂的GPR55的量，(c)任选地，将GPR55的量与预定的截止值相比较，并由此确定所述癌细胞的转移 潜力。所述结合作用剂可特异性结合于GPR55蛋白质的胞外域。优选地，所述作用剂是 抗体，例如，选自下组单克隆抗体，多克隆抗体，单链抗体，Fab，以及抗体的表位结合片段。 可以对所述作用剂进行可检测地标记，例如用放射性标记物，荧光标记物，化学发光标记物 和生物发光标记物可检测地标记。在另一个方面本方法可包括这样的步骤获得包含存在于个体样品中的核酸分子 的测试样品，然后确定所述测试样品中GPR55mRNA的量，并任选地将测试样品中GPR55mRNA 的量与预定的值相比较。确定GPR55mRNA测试样品中的量的步骤可包括将所述测试样品暴露于与所述 GPR55在严格条件下杂交的核酸分子。举例而言，所述方法可使用30个核苷酸左右或更长 的探针，在65"C、0. 5M NaHP04/7% SDS/ImMEDTA中。所述严格条件可包括在68°C在0. SDS/0. IxSSC 中洗涤。更优选地，所述确定测试样品中GPR55mRNA的量的步骤涉及对所述mRNA进行特异 性扩增，然后对所扩增的产物定量，例如，通过在下面实施例中描述的RT-qPCR分析。无论使用何种评估表达的方法，优选将确定到的量针对细胞中的参照基因或蛋白 质进行标准化。本领域技术人员能够确定这样的基因的选择。在下面实施例中所用的参照 基因是 GAPDH。在 Ryberg 等(2007)中使用了 rb36B4。GPR55的(优选经标准化的)表达水平可与对照相比较，所述对照例如人转移细胞 系，和人非转移细胞系。在下面的实施例中测试了多种细胞系。
GPR55的表达可以是相对于CB1和CB2的。如下文提到的，尽管CB1和CB2的表达限 于单一细胞系，但是其结果还表明癌细胞系的相对攻击性与GPR55表达的相对水平相关。本发明的方法可与常规的乳腺癌诊断和分期方法(例如，根据 Μ或AJCC系统) 和对HER2是否存在的测试结合使用。在另一个方面，在生物样品中预测乳腺癌细胞转移潜力或确定转移预后的方法可 用于诊断乳腺癌的风险，或更具体而言，在患者中转移的风险或可能性，例如，如果GPR55 的表达超过预定值的话。在另一个方面，本方法可用于选择接受化合物治疗或接受辅助治疗的个体，例如， 如果GPR55的表达超过预定值的话。在本发明的其他方面，GPR55及其表达可用作生物标志用于选择或监视具体的治 疗方案和化疗组合。因此在一个方面，本发明提供了监视患者中乳腺癌的进展的方法，包括下述步 骤(a)在第一点评估从患者获得的生物样品中GPR55的表达水平；(b)在时间上后续的点使用从患者获得的生物样品重复步骤(a)；和(c)将在步骤(b)中检测出的GPR55表达水平与在步骤(a)中检测出的量相比较， 并由此监视患者中癌症的进展。举例而言，如果表达水平随时间增长，则所述癌症可确定为正在进展，而如果表达 水平保持恒定或随时间减少，所述癌症可能并未进展。在优选的实施方案中，如下所述进行所述方法(a)使在第一点从患者获得的生物样品与特异性结合GPR55的结合作用剂相接 触；(b)检测样品中与所述结合作用剂结合的多肽的量；(c)使用在时间上后续的点从患者获得的生物样品重复步骤(a)和(b)；和(d)将在步骤(C)中检测的多肽表达水平与在步骤(d)中检测的量相比较，并由此 监视患者中癌症的进展，其中如果所述多肽随时间增长，则所述癌症正在进展，而如果所述 多肽保持恒定或随时间减少，则所述癌症并未进展。本发明可用于在患者中随时间监视转移的风险。本发明还可用于确定是否应继续进行治疗性处理，或监视患者正在接受的针对转 移的抗癌疗法的效力。本文中描述的诊断、预后和其他方法可通过使用测试试剂盒进行，这样的试剂盒 构成本发明的另外的方面。因此本发明提供了用于评估或协助任何上述的诊断或预后方法(例如，用于测定 样品中GPR55mRNA存在或量)的测试试剂盒。所述试剂盒可包含(a)包含GPR55核苷酸序列中的至少30个连续核苷酸的核酸分子；和(b)检测所述核酸分子与样品中的GPR55mRNA的结合的工具。所述核酸可以是通过Northern或其他印迹分析而直接分析mRNA的核酸，或可用 于mRNA的酶扩增和分析的核酸(例如，引物)。在其他方面，测试试剂盒可包含
(a)选择性结合GPR55的抗体；(b)检测抗体与GPR55结合的工具。在任一情况下，所述试剂盒可包含对照样品，其包含选自人转移细胞系和人非转 移细胞系的细胞。所述抗体可以是为可用于荧光显微术、Western印迹分析、荧光激活细胞分选或任 何其他免疫分析法的抗体。考虑到本文的公开可见，抑制GPR55对于治疗乳腺癌可能是有用的。因此，本发明的另一个方面提供了包含GPR55抑制剂的组合物，用于在患者中治 疗乳腺癌的方法。所述患者可为如上所述确定的患者。本发明还提供治疗患者中乳腺癌的方法，所述方法包括使肿瘤与GPR55抑制剂接 触的步骤。本发明还提供GPR55抑制剂在制备治疗乳腺癌的药物中的用途。“患者”是哺乳动物，优选为人。"GPR55抑制剂”可通过多种方式达成其效力。举例而言，所述试剂可(a)减少GPR55的表达，举例而言通过siRNA或本文中描述的方法，利用容易获得 的序列信息；(b)直接拮抗受体，或增加受体的脱敏或受体的降解(breakdown)——在本文中描 述了拮抗剂的实例；(c)降低GPR55与其内源配体之间的相互作用，例如在实施例中描述的配体(优选 通过直接结合GPR55)；(d)降低GPR55介导的胞内信号传导，例如通过阻断G蛋白偶联；和/或(e)与内源GPR55竞争内源配体结合；优选的抑制剂可为针对GPR55产生的中和抗体。上述抗体的用途代表本发明的一 个特征方面。其他的抑制剂包括天然或合成拮抗剂，例如大麻二酚(carmabidiol)。非天然出现的抑制剂可能是优选的。举例而言，可对拮抗剂进行优化以实现高度 特异性的结合和治疗用途，同时保持GPR55结合亲和性。根据本发明的抑制剂可以是从其 天然环境中分离和/或纯化后提供的，以基本上纯或均一的形式提供，或者以不含或基本 上不含其来源的物种的其他生物材料的形式提供。当在本文中使用时，术语“分离的”涵盖 所有这些可能性。此外，上述抑制剂的药学上可接受的活性衍生物及其用途落在本发明的范围内。 上述衍生物的实例包括但不仅限于，其盐、溶剂合物、酰胺、酯、醚、N-氧化物、化学保护的形 式和前药。优选地，所述GPR55抑制剂为特异性GPR55抑制剂。特异性GPR55抑制剂为优先靶向GPR55受体的抑制剂，例如，具有比针对CBl或 CB2受体的抑制能力更强的抑制能力的抑制剂。当在本文中使用时，术语“治疗(treatment) ”或“疗法(therapy) ”指任何旨在减 轻受试者中乳腺癌的严重程度的GPR55抑制剂施用，包括旨在治愈所述疾病、缓解所述疾 病的症状、和在有发生所述疾病的风险的个体或具有表明发生了所述疾病的症状的个体中
7预防或阻止该疾病的发生的治疗。优选的治疗可以是使得原发乳腺癌肿瘤转移最小化的治疗，S卩，本发明的方法、用 途和组合物可用于治疗和/或预防乳腺癌的转移。如下文提到的，在具有相对较高GPR55表达的细胞系中，推定的GPR55激动剂(包 括内源性大麻素、N-花生四烯酰乙醇胺(anandamide) (AEA))作为趋化因子发挥作用。发 现用GPR55激动剂CBD预处理可抑制迁移。因此本发明提供了抑制乳腺癌肿瘤转移的方法，所述方法包括使所述肿瘤或由其 衍生的转移灶与GPR55抑制剂相接触的步骤。还提供了 GPR55抑制剂抑制乳腺癌转移的用 途，和GPR55抑制剂在制备用于此目的的药物中的用途。另一种优选的治疗可以是使得原发乳腺癌肿瘤的骨转移最小化的治疗，S卩，本发 明的方法、用途和组合物可用于治疗和/或预防转移性的肿瘤细胞向骨的趋化作用或迁 移。乳腺癌的转移灶常常位于骨组织中。本文中的数据表明，内源性大麻素在骨中产 生，而且它们可充当肿瘤细胞向骨转移的趋化因子。据信这是通过在攻击性、转移性的乳腺 癌中上调的GPR55受体的激活实现的。因此本发明提供了抑制乳腺癌肿瘤向骨转移的方法，所述方法包括使所述肿瘤或 由其衍生的转移灶与GPR55抑制剂相接触的步骤。还提供了 GPR55抑制剂抑制乳腺癌向骨 转移的用途和GPR55抑制剂在制备用于此目的的药物中的用途。本发明还在另一个方面提供了筛选可用于上述任何治疗和抑制方法(例如抑制 乳腺癌的转移和/或抑制转移性肿瘤细胞向骨的趋化作用或迁移)中的物质的方法，所述 方法通常包括评估所述物质对GPR55受体的结合或其抑制GPR55表达的能力。在一个优选的方面，所述方法可包括(i)使包含GPR55的细胞或膜暴露于测试化合物一段预定长度的时间；(ii)检测GPR55的活性或表达；和(iii)将经所述化合物处理的细胞或膜中GPR55的活性和表达与未经所述化合物 处理的对照细胞或膜中发现的活性和表达进行比较，其中具有用于本发明的方法和治疗中的效力的化合物相对于对照减少GPR55的 活性和表达。在一个实施方案中，生产可用于任何上述治疗和抑制方法的物质的方法包括(i)通过使用上述筛选方法鉴定所述物质，(ii)生产所述物质。现在讨论本发明的方法、用途和组合物的其他优选方面或实施方案GPR55抑制剂，无论是本文中所公开的还是使用本文中公开的方法鉴定的，均可存 在于组合物中或配制为组合物用于如上所述的本发明的制药或其他用途。根据本发明的药物组合物除了活性化合物(S卩，GPR55抑制剂)之外，还可包含本 领域技术人员公知的药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或其他物质。上述物质 应当为无毒的，且不应干扰所述活性成分的效力。所述载体或其他物质的确切性质将依给 药途径而定。因此本发明的另一个方面提供了供制备用于上述治疗的药物的工艺(process)，所述工艺包括使用GPR55抑制剂，例如，通过将这样的抑制剂与药学上可接受的成分掺混 以产生适于给药的药物组合物。GPR55抑制剂可单独给药或与其他疗法联合使用，联合使用可以是同时进行，也可 以是顺序进行。本发明抑制乳腺癌肿瘤向骨转移的方法可例如与使用降低雌激素水平的药物的 疗法一同使用。举例而言，模仿赫赛汀(here印tin)的使用，对于检验出GPR55表达水平增加为阳 性的患者，可通过常规的化学疗法治疗，例如，使用多柔比星和环磷酰胺，在此之前和之后 可使用紫杉醇(paciltaxel)和GPR55抑制剂(以及，任选地，如果患者为HER-2阳性，使用 曲妥单抗)。本发明特别地涵盖对于乳腺癌在手术后预防疾病复发和进行的辅助疗法，S卩，所 述GI^R抑制剂可以在这样的治疗中使用，所述治疗包含手术介入，例如，乳房切除术。所述 手术介入在使用Grass抑制剂之前或之后，且其自身并不构成本发明要求保护范围的一部 分。因此，本发明亦涵盖与激素疗法、化学疗法、放射疗法或热疗法的联合疗法，包括 与任选地手术介入结合进行的疗法。其他乳腺癌疗法在本领域是众所周知的，且它们的使 用本身并不构成本发明的一部分。无论如何，将上述疗法与GPR55表达抑制联合使用确实 构成本发明的一部分。依照本发明的相关方面，GPR55抑制剂或包含GPR55抑制剂的组合物被意图给药 于个体。这可以是系统的或局部的。给药优选为以“治疗有效量”进行，其为足以显示对受 试者的益处(例如乳腺癌的减少、缓和/或退行)的量。因此在本发明的另一个方面，上述的治疗方法可包括将有效量的GPR55抑制剂施 与需要治疗的受试者。施用的实际(有效)量，以及给药的速率和时间过程，将最终由医师考虑到具体受 试者(例如，人类患者或动物模型)中疾病的严重程度，和受试者的总体状况来加以判定。 合适的剂量范围通常为0.01-20mg/kg/日的范围，优选为0. l-10mg/kg/日的范围。使用针对GPR55产生的抗体作为依照本发明的抑制剂，可涉及将其以25_5000mg 的量，作为每周一次、每周两次或每周三次(或更多，取决于乳腺癌的严重程度)的剂量，以 可注射的形式进行给药。或者，可使用缓释装置以提供最优的剂量给患者，而无需反复给 药。定义和详细方法现在更加详细地讨论本发明的其他方面和本文中使用的的定义GPR55受体核酸hGPR55的EMBL登录号为BC032694。其拷贝附于本文之后以便参考。评估GPR55mRNA和表达评估GPR55的表达的方法可以是本领域中常规的，例如描述于RybergO007)中的 方法，或在下面实施例中展示的方法。GPR受体激动剂和拮抗剂已知多种作为GPR55受体激动剂起作用的大麻素。这些包括内源性大麻素如AEA
9和大麻的组分，如THC。亦发现天然出现型大麻素的合成衍生物如0-1602和CP55940作为 激动剂起作用。大麻二酚(Cannabidiol，CBD)，其亦为大麻(Cannabis sativa)的组分，被鉴定为 GPR55拮抗剂。

图1总结了一些这些化合物及其作用
权利要求
1.一种在来自个体的生物样品中预测乳腺癌细胞转移潜力或确定乳腺癌细胞转移预 后的方法，所述方法包括评估所述细胞中GPR55表达的水平。
2.如权利要求1所述的方法，其包括下述步骤(a)使所述样品与特异性结合GPR55的结合作用剂相接触；(b)检测结合于所述结合作用剂的GPR55的量；(c)任选地，将GPR55的量与预定的截止值相比较，并由此确定所述癌细胞的转移潜力。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述作用剂是抗体。
4.如权利要求1所述的方法，其包括下述步骤(a)确定所述样品中GPR55mRNA的量；(b)任选地，将在所述测试样品中GPR55mRNA的量与预定值相比较；并由此确定所述癌 细胞的转移潜力。
5.如权利要求4所述的方法，其中在样品中GPR55mRNA的量由RT-qPCR确定。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述生物样品是取自原发肿瘤的样品。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中将GPR55的表达水平相比于细胞中的参 照基因或蛋白质标准化。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中将GPR55的表达水平与对照值相比较。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，用于诊断个体中转移的风险或可能性，或用 于选择进行抗转移治疗的个体。
10.一种监视个体中乳腺癌进展的方法，包括下述步骤(a)在第一点评估从个体获得的生物样品中GPR55的表达水平；(b)使用在时间上的后续点从个体获得的生物样品重复步骤(a)；和(c)将在步骤(b)中检测出的GPR55表达水平与在步骤(a)中检测出的量相比较，由此 监视患者中癌症的进展。
11.如权利要求10所述的方法，用于在个体中随时间监视转移的风险，或用于监视所 述个体正在接受的抗癌治疗的效力。
12.一种用于权利要求1-11中任一项所述的方法的测试试剂盒，其中所述试剂盒包含(a)包含GPR55核苷酸序列中至少30个连续核苷酸的核酸分子；和(b)检测所述核酸分子在样品中与GPR55mRNA的结合的工具； 或所述试剂盒包含(a)选择性结合GPR55的抗体；(b)检测抗体与GPR55结合的工具。
13.—种筛选用于治疗个体中乳腺癌的方法的作用剂的方法，其中所述治疗剂是 GPR55抑制剂，所述方法包括评估所述物质与GPR55受体的结合的步骤或评估其抑制GPR55 表达的能力的步骤。
14.如权利要求13所述的方法，其包括(i)使包含GPR55的细胞或膜暴露于测试化合物经过预定长度的时间；(ii)检测GPR55的活性或表达；(iii)将经所述化合物处理的细胞或膜中GPR55的活性和表达与未经所述化合物处理 的对照细胞或膜中所见的活性和表达进行比较；和(iv)选择相对于对照减少GPR55的活性或表达的作用剂。
15.一种生产用于治疗个体中乳腺癌的方法的药物组合物的工艺，其中该工艺包括(i)使用权利要求13或权利要求14的方法选择作用剂；(ii)产生所述作用剂；(iii)将所述作用剂配制为药物组合物。
16.一种药物组合物，其包含GPR55抑制剂，用于治疗个体中乳腺癌的方法。
17.一种治疗患者中乳腺癌的方法，所述方法包括使所述肿瘤与GPR55抑制剂相接触 的步骤。
18.GPR55抑制剂在制备用于治疗乳腺癌的药物中的用途。
19.如权利要求13-18中任一项所述的工艺、组合物、方法或用途，其中所述GPR55抑制 剂以下述方式中的一种或多种发挥其作用(a)减少GPR55的表达；(b)直接拮抗GPR55，或增加受体脱敏或受体降解；(c)降低GPR55与其内源配体之间的相互作用；(d)降低GPR55介导的胞内信号传导；和/或(e)与内源GPR55竞争内源配体结合。
20.如权利要求13-19中任一项所述的工艺、组合物、方法或用途，其中所述治疗是可 抑制原发乳腺癌肿瘤转移的治疗。
21.如权利要求13-20中任一项所述的工艺、组合物、方法或用途，其中所述治疗是可 抑制原发乳腺癌肿瘤向骨转移的治疗。
22.如权利要求13-21中任一项所述的工艺、组合物、方法或用途，其中所述治疗是可 降低癌症复发风险的辅助疗法。
23.如权利要求13-22中任一项所述的工艺、组合物、方法或用途，其中所述治疗是联 合治疗，其中所述GPR55抑制剂与其他用于治疗乳腺癌的治疗性介入联合，同时使用或顺 序使用。
24.如权利要求23所述的工艺、组合物、方法或用途，其中所述其他治疗性介入包括施 用阿霉素、环磷酰胺、紫杉醇和/或曲妥单抗。
25.如权利要求23所述的工艺、组合物、方法或用途，其中所述其他治疗性介入为手术 介入。
全文摘要
本发明人阐明了G蛋白偶联受体55(GPR55)在人攻击性乳腺癌细胞中高度表达，且所述表达水平可与这些细胞的侵袭性和转移(例如骨转移)潜力相关。在本发明的各个方面中，公开了涉及乳腺癌肿瘤转移特征的诊断工具或生物标志。本发明还涉及为了抑制乳腺癌的进行和扩散的目的靶向该受体的药理作用剂。
文档编号C12Q1/68GK102089445SQ200980127324
公开日2011年6月8日 申请日期2009年5月13日 优先权日2008年5月13日
发明者安克·J·罗洛夫斯, 莱斯利·A·福特, 迈克尔·J·罗杰斯, 鲁思·A·罗斯 申请人:阿伯丁大学理事会